Abstract

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το DNA μπορεί να μεταφερθεί από πεθαίνουν τροποποιημένα κύτταρα σε γειτονικά κύτταρα μέσω της φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωμάτων, η οποία οδηγεί σε κυτταρικό μετασχηματισμό. Εδώ, παρέχουμε ενδείξεις μιας πρόσληψης των αποπτωτικών προερχόμενων καρκίνου του τραχήλου κύτταρα από ανθρώπινα μεσεγχυματικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, HeLa (HPV 18+) ή Ca σκι (HPV16 +) κύτταρα, που φέρουν ενσωματωμένη υψηλού κινδύνου HPV DNA αλλά όχι C-33 κύτταρα Α (HPV-), ήταν σε θέση να μετατρέψει τα κύτταρα δέκτες. Ανθρώπινα πρωτογενών ινοβλαστών τυλίχθηκε τα αποπτωτικά σώματα αποτελεσματικά μέσα σε 30 λεπτά μετά την συν-καλλιέργεια. Αυτός ο μηχανισμός είναι ενεργός και περιλαμβάνει την κυτταροσκελετού ακτίνης.

Η in situ υβριδοποίηση

μετασχηματισμένων ινοβλαστών αποκάλυψε την παρουσία HPV DNA στον πυρήνα ενός υποσυνόλου για φαγοκύτωση κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν το HPV16 /18 Ε6 γονιδίου, η οποία συμβάλλει στην διατάραξη του μονοπατιού ρ53 /ρ21, και τα κύτταρα παρουσίασαν ογκογόνο φαινότυπο, συμπεριλαμβανομένης αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού, πολυπλοειδία και ανάπτυξη αγκυροβόλιο ανεξαρτησία. Τέτοια οριζόντια μεταφορά των ιικών ογκογονιδίων σε περιβάλλοντα κύτταρα που στερούνται υποδοχείς για τον HPV θα μπορούσε να διευκολύνει την εμμονή του ιού, ο κύριος παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Αυτή η διαδικασία θα μπορούσε να συμβάλει στην εξέλιξη της νόσου HPV σχετίζεται με

in vivo

Η

Παράθεση:. Gaiffe E, Prétet J-L, Launay S, Jacquin Ε, Saunier Μ, Hetzel G, et al. (2012) Τα αποπτωτικά HPV Θετική Cancer Cells εκθεσιακός Μετασχηματισμός Properties. PLoS ONE 7 (5): e36766. doi: 10.1371 /journal.pone.0036766

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Ιούλ 2011? Αποδεκτές: 6 Απρίλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 4η Μαΐου 2012

Copyright: © 2012 Gaiffe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποτροφίες και έργα που υποστηρίζονται από δημόσιους πόρους από την «Περιοχή ντε Φρανς-Κοντέ,» «Institut National du Cancer» και «Ligue Contre Καρκίνος le, Comité du Doubs.» Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, απόφαση δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιδημιολογικές και πειραματικές μελέτες έχουν τονίσει ότι υψηλού κινδύνου Οι ανθρώπινοι ιοί θηλωμάτων (HPV), ιδιαίτερα HPV 16 και 18, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή καρκινωμάτων του τραχήλου της μήτρας [1], [2]. Οι μηχανιστικές απόψεις του HPV-επαγόμενης καρκινογένεσης πιο συχνά σχετίζονται με διαγραφή της Ε2 ORF, ως συνέπεια της ενσωμάτωσης του ιικού DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή [3]. Αυτό οδηγεί σε μια απορυθμισμένη έκφραση ιικών γονιδίων Ε6 και Ε7, τα οποία αντιπροσωπεύουν τα κύρια γονίδια μετασχηματισμού. Στην καρδιά αυτού του μετασχηματισμού είναι η σύνδεση του Ε6 με το ρ53 και E6AP, η οποία ευνοεί αποικοδόμηση της ρ53 [4] και ο σχηματισμός συμπλόκου Ε7 με την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος pRb [5], με αποτέλεσμα την απορρύθμιση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA και απόπτωση .

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων χάνεται μέσω απόπτωσης [6]. Τέτοια κυτταρικός θάνατος πυροδοτείται από μία ποικιλία εξωκυτταρικών σημάτων, συμπεριλαμβανομένων εξάντληση παράγοντα ανάπτυξης /επιβίωσης, υποξία και την απώλεια των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας, καθώς επίσης και ενδοκυτταρικά σήματα όπως βλάβη του DNA [7]. Τέλος, τα αποπτωτικά κύτταρα εκκαθαρίζονται από εξειδικευμένα φαγοκύτταρα που αδρανοποιούν και αποδομούν τα κυτταρικά συστατικά τους [8]. Ωστόσο, αποπτωτικά κύτταρα μπορούν επίσης να εσωτερικεύεται από μη εξειδικευμένα κύτταρα δέκτες. Έτσι, ινοβλάστες είναι σε θέση να καταπιεί αποπτωτικά ουδετερόφιλα [9], και το συκώτι ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να δεσμεύσει και να φαγοκυτταρώνουν συκώτι αποπτωτικά σώματα [10]. Μέσω αυτής της διαδικασίας ενδοκυτταρικής, αποπτωτικά κύτταρα μπορούν να δρουν ως φορέας DNA, και η οριζόντια μεταφέρονται DNA μπορεί να παράσχει ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για τον αποδέκτη κύτταρο.

Η οριζόντια μεταφορά γονιδίων (HGT) έχει καλώς τεκμηριωθεί σε προκαρυωτικούς και συμβάλλει εξέλιξη, την οικολογία και την αντίσταση στα αντιβιοτικά [αναθεωρηθούν [11], [12]]. Ενώ η οριζόντια μεταφορά της γενετικής πληροφορίας μεταξύ δύο ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχει αναφερθεί σε φυτά [13], [14] και ασπόνδυλα [15], λίγες μελέτες έχουν εστιάσει στην HGT μεταξύ των κυττάρων των θηλαστικών. Η ανταλλαγή γενετικής πληροφορίας που διαμεσολαβείται από αποπτωτικά σώματα έχει αποδειχθεί να συμβεί μεταξύ των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [16]. Τα αποπτωτικά σώματα των μετασχηματισμένων λεμφοειδών κυττάρων που φιλοξενούν ολοκληρωμένα αντίγραφα του ιού Epstein-Barr μπορεί επίσης να μεταφέρει ιικές αλληλουχίες DNA [17]. Ομοίως, οι HIV-1 γονίδια προϊικό μεταφέρεται σε κύτταρα που στερούνται υποδοχείς για την είσοδο του ιού [18]. DNA έχει επίσης αναφερθεί να μεταφερθεί από αποπτωτικά H-ras

V12- και c-myc-επιμολυσμένα κύτταρα να ρ53 – /- εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού, γεγονός που οδηγεί σε μετασχηματισμό τους [19]. Από την άλλη πλευρά, φακοκύττωση κύτταρα που εκφράζουν ρ53 ή ρ21 δεν μετασχηματίζονται, υποδηλώνοντας έναν προστατευτικό μηχανισμό που ελέγχεται από την οδό της ρ53 [20]. Πρόσφατα, Ehnfors J.

et al.

Απέδειξαν ότι οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ικανά για την απόκτηση και την αντιγραφή H-ras

V12 και c-myc DNA όταν αποπτωτικά κύτταρα όγκου περιέχουν ιού πιθήκου 40 μεγάλο Τ ( SV40LT) αντιγόνο [21]. Αυτές οι παρατηρήσεις αποδεικτικά στοιχεία ότι αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού συνδέεται με την έκφραση του p53 SV40LT αναστολής [22]. Επειδή η πλειοψηφία των τραχηλικών καρκινωμάτων εκφράζουν την ιική ογκοπρωτεΐνη Ε6, το οποίο προωθεί την υποβάθμιση του p53, όπως κάνει SV40LT, υποθέσαμε ότι η οριζόντια μεταφορά του HPV ογκογονιδίων θα μπορούσε να είναι ένας εναλλακτικός μηχανισμός της καρκινογένεσης.

Εδώ, σας παρουσιάζουμε αποδείξεις ότι αποπτωτικά κύτταρα που προέρχονται από καρκίνο του τραχήλου προερχόμενα καρκινικών κυττάρων που φιλοξενούν ολοκληρωμένα αντίγραφα του HPV είναι σε θέση να μετατρέψει τα ανθρώπινα πρωτογενείς ινοβλάστες (HPF). Εμείς δεικνύουν περαιτέρω ότι τα κύτταρα αποδέκτη όγκου μπορεί να χαρακτηρίζεται από υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και hyperploidy. Επιπλέον, το ιικό γενετικό αναστολή της οδού ρ53 /ρ21 υλικό εκφράζεται στα μετασχηματισμένα κύτταρα. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά του μετασχηματισμού των ανθρώπινων πρωτογενών κυττάρων μέσω της πρόσληψης του αποπτωτικών σωμάτων από τα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας καρκίνωμα HPV-μόλυνση.

Αποτελέσματα

Κύτταρα τραχηλικού καρκινώματος αποπτωτικά εσωτερικεύεται από ινοβλάστες

Η απόπτωση των κυττάρων του δότη τραχηλικού καρκινώματος προκλήθηκε με UVB ακτινοβολία και έκθεση σταυροσπορίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24] και τεκμηριώθηκε με την ανάλυση της φωσφατιδυλσερίνης έκθεσης (χρώση αννεξίνης V), το περιεχόμενο DNA ( χρώση ιωδιούχου προπιδίου) και πυρηνική κατάτμηση (χρώση ϋΑΡΙ) (Methods S1 και φιγούρα S1A και S1B). Η θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα την απουσία των ζωντανών κυττάρων ικανών πολλαπλασιασμού εντός των αποπτωτικών κυττάρων εναιωρήματα (Methods S1 και φιγούρα S1c και SID). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι αποπτωτικά σώματα που προέρχονται από λεμφοκύτταρα ΕΒν μεταφοράς Β μπορεί να μεταδώσει το DNA από την οριζόντια μεταφορά και ότι EBV-ενσωματωμένο DNA μπορεί να μεταφέρεται κατά προτίμηση σε σχέση με το κυτταρικό DNA [17]. Σε αυτή τη μελέτη, το ερώτημα κατά πόσον HPFS θα μπορούσε να καταπιεί αποπτωτικά κύτταρα που προέρχονται από τις κυτταρικές καρκίνωμα τραχήλου γραμμές HeLa (HPV18), Ca σκι (HPV16) και C-33 A (HPV-), ανεξάρτητα από την ιολογική κατάσταση.

Η παρουσία του φθορίζοντος αποπτωτικών κυττάρων στα κύτταρα δέκτες επιβεβαιώθηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. κύτταρα HeLa αποπτωτικά περιέχουν ΟΝΑ εμπλακεί στο κυτταροσκελετού της ακτίνης των HPFS εντός 48 h (σχήμα 1Α). κύτταρα αποπτωτικών Ca σκι και C-33 Α, επίσης, αναλάβει αποτελεσματικά από τον παραλήπτη (σχήμα 1Β). Η επώαση του HPFS μόνη της ή με το υπερκείμενο των αποπτωτικών κυττάρων δεν οδήγησε σε CFDA, SE (5- (και 6 -) – carboxyfluoresceine ηλεκτριμιδυλεστέρας διοξικής εστέρας) χρώση, υποδηλώνοντας μια σύνδεση μεταξύ πράσινο φθορισμό και την παρουσία αποπτωτικών κυττάρων (σχήμα 1Β ). Παρακολουθώντας τις φθορίζουσες χρωστικές σε πρώιμα χρονικά σημεία (από 1 ώρα έως 3 ώρες), παρατηρήσαμε πρόσληψη ακτίνη όταν αποπτωτικά κύτταρα δεσμεύθηκαν σε HPFS (σχήμα 1 Ci, λευκό βέλος). Η μεμβράνη ινοβλαστών επεκτάθηκε γύρω δύο πλευρές του αποπτωτικού κυττάρου μέσω πολυμερισμού της ακτίνης (Σχήμα 1 CII, λευκά βέλη). F-ακτίνης τότε περιβάλλεται τα αποπτωτικά κύτταρα να σχηματίσουν ένα φαγοκυτταρικά κύπελλο και κλείνει σε ένα δακτύλιο (σχήμα 1Ciii). Αυτές οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις είναι ενδεικτικές της φαγοκυττάρωσης, αν και δεν έχουμε χαρακτηρίζεται ειδικά αυτό το μηχανισμό [25], [26]. Χρησιμοποιώντας συγκεκριμένους δείκτες ενδιάμεσα νημάτια για κάθε κυτταρικό τύπο, επιβεβαιώσαμε ότι τα αποπτωτικά κύτταρα ήσαν επιθηλιακά κύτταρα (κυτοκερατίνη θετικά) που εσωτερικεύεται από ινοβλάστες (βιμεντίνη θετικό) (σχήμα 1D). Χρησιμοποιώντας την ποσοτική προσέγγιση της κυτταρομετρίας ροής, εκτιμήσαμε το ποσοστό των HPFS που έπληξε τα χρωματισμένα κύτταρα αποπτωτικών καρκινώματος. Ανεξάρτητα από τον τύπο των αποπτωτικών κυττάρων που χρησιμοποιούνται, η απόδοση ήταν παρόμοια εσωτερίκευση (12,5% με αποπτωτικά HeLa? 13% με αποπτωτικά Ca σκι? 14.5% με αποπτωτικά C-33 Α) (σχήμα 1 Ε). Ωστόσο, σημειώνεται ότι 12 έως 15% των ινοβλαστών ήταν σε θέση να αναλάβουν τα αποπτωτικά κύτταρα, ενώ ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων σπάρθηκε ήταν δέκα φορές μεγαλύτερη από εκείνη των HPFS. Αυτό υποδηλώνει ότι οι ινοβλάστες έχουν ένα περιορισμένο δυναμικό στην αποτελεσματικότητα και /ή την ποσότητα των αποπτωτικών κυττάρων εσωτερίκευσης. When παραλήπτης κύτταρα συν-επωάστηκαν με αποπτωτικά κύτταρα στους 4 ° C για 48 ώρες, το ποσοστό της εσωτερίκευσης μειώθηκε σημαντικά στο 2%, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαδικασία εσωτερίκευσης ακολουθεί μια ενεργειακά εξαρτώμενες οδού (σχήμα S2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ανθρώπινη πρωτογενών ινοβλαστών μπορεί να καταπιεί αποπτωτικά κύτταρα, ανεξάρτητα από ιολογική κατάσταση τους, μέσα από φαγοκυττάρωση.

(Α) Συν-καλλιέργεια των HPFS και αποπτωτικά κύτταρα HeLa. (Β) HPFS συν-καλλιεργήθηκαν με αποπτωτικά κύτταρα Ca Σκι (άνω αριστερά), αποπτωτικά C-33 κύτταρα Α (άνω δεξιά), μόνο (κάτω αριστερά) και το υπερκείμενο των αποπτωτικών κυττάρων HeLa (κάτω δεξιά). (Γ) HPFS καλλιεργήθηκαν με αποπτωτικά κύτταρα HeLa για διαφορετικά χρονικά διαστήματα: 1 ώρα (Ci), 2 h (CII) και 3 h (CIII). Οι εικόνες δείχνουν την πρόσληψη ακτίνης και το σχηματισμό διαστολής μεμβράνης (βέλη). (D) HPFS, κύτταρα Ca σκι και HPFS συν αποπτωτικά κύτταρα Ca σκι ή HeLa βάφτηκαν με αντι-βιμεντίνη (TRITC) και αντι-κυτοκερατίνης (Cy2) αντισώματα. παρατηρήσεις μικροσκόπιο έγιναν με ομοεστιακό μικροσκόπιο (bar κλίμακας: 1 μm). Όλα τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) HPFS επωάστηκαν με αποπτωτικά HeLa, Ca Ski ή C-33 κύτταρα Α για 48 ώρες και αποπτωτικά εσωτερίκευση των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής.

Η

αποπτωτικών κυττάρων μόνο HPV-θετικών αποτελεσματικά μετασχηματίσουν κύτταρα λήπτη

Ehnfors

et al.

απέδειξαν ότι το DNA από αποπτωτικά κύτταρα ινοσαρκώματος αρουραίου επιμολυσμένα με Η-

ras

V12, C-

myc

και SV40LT μεταφέρεται και μετασχηματίζει πρωτογενείς ινοβλάστες [21]. Επειδή HPV ογκογονίδια, όπως SV40LT, είναι ικανά αποτελεσματικά μετασχηματισμού μολυσμένων κυττάρων και εμποδίζοντας την οδό ρ53, μεταξύ άλλων αποτελεσμάτων, ελέγξαμε εάν ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν με αποπτωτικά κύτταρα ήταν ικανά να αναπτυχθούν με αγκύρωση ανεξαρτησία με μέτρηση της ικανότητάς τους να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ προσδιορισμό, όπως παρατηρείται με το HeLa, Ca σκι και C-33 Α καρκινικά κύτταρα (σχήμα 2Α, ανώτερη γραμμή). Σε αντίθεση, η ανθρώπινη πρωτογενείς ινοβλάστες δεν ήταν σε θέση να αναπτυχθούν χωρίς ένα στερεό πλέγμα (σχήμα 2Α, ανώτερη γραμμή). Αν και οι τρεις τύποι αποπτωτικών σωμάτων ήταν εσωτερικεύονται από ινοβλάστες, μόνο τα αποπτωτικά κύτταρα που φιλοξενούν HPV (κύτταρα HeLa και Ca σκι) μετασχηματίζονται τα HPFS (σχήμα 2Α, μεσαία γραμμή). Οι έλεγχοι με αποπτωτικά κύτταρα από μόνα τους δεν είχε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό αποικίας (σχήμα 2Α, κατώτερη γραμμή). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η επώαση των αποπτωτικών κυττάρων με HPV-ολοκληρωμένο DNA που προκαλείται από την αποτελεσματική αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη του HPFS, ένα σήμα κατατεθέν του μετασχηματισμού και ένα

in vitro

συσχέτιση ογκογένεσης

in vivo

[27 ]. Η κατάσταση μετασχηματισμού των HPFS ελέγχθηκε περαιτέρω με δοκιμασίες οριακής αραίωσης. Πράγματι, σε αντίθεση με πρωτογενείς ινοβλάστες, οι ινοβλάστες μεταμορφωθεί από αποπτωτικά HeLa (FH) και Ca Ski κύτταρα (FC) είχαν την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες πολυστρωματική όταν αναπτύχθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (σχήμα 2Β). Σε αυτό το στάδιο, το FH και FC άρχισαν να εμφανίζουν μετασχηματισμένο φαινότυπο, με μερικά από τα κύτταρα πλευρά φαίνεται στρογγυλεμένες, σε αντίθεση με τα HPFS ελέγχου, το οποίο εμφανίζεται ένα σχήμα ατράκτου (Σχήμα 2C). Επιπλέον, οι μετασχηματισμένες ινοβλάστες αποτελούνταν κυρίως από συσκευασμένα ή συγκεντρωτικών μικρά κύτταρα όπως κύτταρα HeLa και Ca σκι, ενώ οι πρωτογενείς ινοβλάστες σχημάτισε πεπλατυσμένα μονοστιβάδα.

(Α) HPFS και HeLa, Ca σκι και C-33 Α του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα (άνω γραμμή)? HPFS μετά από 48 ώρες έκθεσης σε αποπτωτικά κύτταρα (apo HPF, apo HeLa, apo Ca Ski, Αρο C-33 Α) (μεσαία γραμμή) καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ για 21 ημέρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα μόνο ήταν επίσης καλλιεργήθηκαν ως έλεγχος (κάτω γραμμή). Ελήφθησαν φωτογραφίες με έναν φακό μεγέθυνση 20 ×. (Β και Γ) HPFS, κύτταρα HeLa, κύτταρα Ca σκι και μεταμορφώθηκε ινοβλάστες από αποπτωτικών HeLa (FH) και τα κύτταρα αποπτωτικών Ca σκι (FC) (μετά από επιλογή σε μαλακό άγαρ), αναπτύχθηκαν σε μια οριακή αραίωση για 21 ημέρες. (Β) Οι αποικίες βάφτηκαν με μωβ κρύσταλλο μετρήθηκαν, και η απόδοση επιμετάλλωση (ΡΕ, το ποσοστό των κυττάρων που είναι σε θέση να σχηματίσουν αποικίες? SD, τυπική απόκλιση) υπολογίσθηκε. (C) μεγεθύνσεις Colony φωτογραφήθηκαν με φακό 40 × μεγέθυνση.

Η

Σχήμα 3Α δείχνει ότι μεταμορφωθεί ινοβλάστες, FC και FH, δεν είναι θετική για χρώση κυτοκερατίνη, σε αντίθεση με τα επιθηλιακά κύτταρα HeLa και Ca σκι, ανάκληση η πιθανότητα ότι οι παρατηρούμενες μετασχηματισμένα κύτταρα είναι σπάνια μορφή καρκίνου επιζών κύτταρα και κλωνική εξέλιξη των κυττάρων Ca σκι. Όπως απεικονίζεται στο άνω αριστερό πίνακα του σχήματος 3Β (δείκτης D18S61, ένα παράδειγμα του 20 δείκτες εξακρίβωσης DNA που χρησιμοποιείται), μετασχηματισμένες ινοβλάστες έχουν ένα πρότυπο DNA το οποίο είναι διαφορετικό από τα αρχικά κύτταρα του όγκου. Άλλα αποτελέσματα των πειραμάτων μοριακής τυποποίησης έδειξαν ότι τα κύτταρα FC ήταν διαφορετικά από τα κύτταρα Ca σκι, αλλά περιέχει κάποια αλληλόμορφα από το χιονοδρομικό DNA Ca (TP53 και δεικτών D8S264), αντανακλώντας την μεταφορά μικρών τμημάτων DNA. FC DNA περιέχει επίσης τμήματα χρωμοσωμάτων (δεικτών D17S250), αντανακλώντας τη μεταφορά μεγάλων θραυσμάτων DNA όπως περιγράφεται από τους Holmgren [17], [19]. Αν και αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν την χρωμοσωμική αναδιάταξη (απώλεια και το κέρδος των αλληλόμορφα) των κυττάρων FC, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα διασταυρούμενης μόλυνσης, παρά το γεγονός αυτό είναι εξαιρετικά απίθανο.

(Α) HPFS, Ca σκι, HeLa, FC και FH κύτταρα αναλύθηκαν με immunocytofluorescence για κυτοκερατίνης έκφρασης (γραμμή κλίμακας: 1 μm). (Β) DNA από κύτταρα του σκι και FC Ca ενισχύθηκε με φθορίζουσα PCR χρησιμοποιώντας 20 μικροδορυφόρων. Τα τέσσερα αντιπροσωπευτικά μικροδορυφόρων ενισχύσεις της περιόδου αυτής. Οι διαφορετικοί τύποι του αλληλόμορφου που παρατηρείται με τη χρήση τεσσάρων δεικτών:. D18S61 TP53, D8S264 και D17S250

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της HPF μετασχηματισμού στο ρυθμό πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας μια καμπύλη ανάπτυξης και τα αποτελέσματα από την ΜΤΤ ( 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο bromid) δοκιμασία πολλαπλασιασμού φαίνεται στο Σχ. 4Α και 4Β, αντίστοιχα. Το FH είχε ένα μέσο χρόνο διπλασιασμού του πληθυσμού των 15 h, και το FC έχει μέσο χρόνο 16 ωρών, ενώ ο χρόνος διπλασιασμού HPF ήταν μεγαλύτερη κατά ένα συντελεστή 19 (298 h) (Σχήμα 4Α). Το μιτοχονδριακό δραστηριότητα μετρήθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα της καμπύλης ανάπτυξης (Σχήμα 4Β). Αυτές οι τροποποιήσεις ρυθμός ανάπτυξης υποστηρίζουν την ογκογόνο δυναμικό των προσφάτως μετασχηματισμένων ινοβλαστών. Ως εκ τούτου, δοκιμάζονται κατά πόσον η αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης και ο μετασχηματισμός των δικαιούχων κύτταρα που σχετίζονται με γενετικές τροποποιήσεις που οδηγούν σε hyperploidy. προσδιορισμοί Cytometry έδειξαν ότι η περιεκτικότητα σε DNA αυξήθηκε με τις διόδους των μετασχηματισμένων ινοβλαστών (Σχήμα 4C). Στα πειράματά μας, μία HPF μέση ένταση φθορισμού (MFI) 154 αντιστοιχούσε σε διπλοειδή κύτταρα (Σχήμα 4D). Η MFI αυξήθηκε σε 205 και 250 μετά περάσματα των κυττάρων FH 5 (P5) και 15 (Ρ15), αντίστοιχα. Παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα για τα κύτταρα FC (219 σε P5 και 264 σε Ρ15). Η MFI σε περάσματα 15 της FH και FC εκπροσωπούνται hypertriploidy. Η ανευπλοειδία, όπως φαίνεται στο μοντέλο μας, συχνά προκαλείται από ένα συγκεκριμένο είδος γενετικής αστάθειας και είναι μία από τις πιο κοινές ιδιότητες των καρκίνων [28].

(Α και Β) HPFS και HPFS μεταμορφωθεί από αποπτωτικά HeLa κύτταρα αποπτωτικών Ca σκι (FC) (FH) ή αναπτύχθηκαν για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Το κυτταρικό πολλαπλασιασμό παρακολουθήθηκε κάθε μέρα με απαρίθμηση των συνολικών αριθμών κυττάρων (Α) και με δοκιμασίες ΜΤΤ (Β). Οι γραφικές παραστάσεις παρουσιάζουν την μέση (+/- SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) HPFS, FH και FC στα περάσματα 5 (P5) και 15 (Ρ15) βάφτηκαν (10

6 κύτταρα) με διάλυμα ιωδιούχου προπίδιο, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Δ) Η MFI της κορυφής G0 /G1 (μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων +/- SD) εμφανίζει την πλοειδία του HPF, FH και FC, Ρ5 και FH και FC στο Ρ15.

Η

αποπτωτικά HPV σχετίζεται με τα καρκινικά κύτταρα να μεταφέρει αποτελεσματικά ιικών ογκογονιδίων σε ινοβλάστες

Επειδή μόνο αποπτωτικά κύτταρα δότη HeLa και Ca σκι ήταν σε θέση να μετατρέψει ινοβλάστες, υποθέσαμε ότι οι HPV ογκογονίδια θα μπορούσαν να μεταφερθούν στα κύτταρα δέκτες. συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση μας πρότεινε ότι γενετικό υλικό μεταφέρθηκε από τα αποπτωτικά κύτταρα στους πυρήνες των ινοβλαστών μετά από 6 ώρες συν-καλλιέργειας (Σχήμα 5Α, λευκά βέλη). Η ακτίνη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού φάνηκε να παραδώσει το αποπτωτικό κύτταρο προς τον πυρήνα για τη μεταφορά του DNA, όπως φαίνεται σε μεγάλη μεγέθυνση με την επίθεση που μεταδίδεται φως με phalloidin ή χρώση DAPI εικόνες. Μετά από αυτές τις παρατηρήσεις, ερευνήσαμε τη μεταφορά του DNA του HPV στο ινοβλαστών παραλήπτες χρησιμοποιώντας το

in situ υβριδισμού

(ISH) με έναν ανιχνευτή υβριδοποιήθηκε ειδικά με HPV DNA υψηλού κινδύνου. HeLa και Ca σκι κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Επιβεβαιώνοντας την υπόθεσή μας, τα σήματα υβριδοποίησης παρατηρήθηκαν ως μωβ κηλίδες στα αποπτωτικά κύτταρα και οι πυρήνες των μετασχηματισμένων ινοβλαστών (FH και FC), ενώ δεν ανιχνεύθηκε σήμα στα HPFS (σχήμα 5Β). Αυτά τα στοιχεία επικυρώνουν την υπόθεση της οριζόντιας μεταφοράς των ιικών ογκογονιδίων. Μια δεύτερη προσέγγιση που αποτελείται από την ενίσχυση του DNA Ε6 του HPV 16 και 18 επιβεβαίωσε την παρουσία του DNA του ιού στα μετασχηματισμένα ινοβλάστες (Σχήμα 5C). Αναλύσαμε περαιτέρω την έκφραση του Ε6 HPV16 Ε6 και HPV18 με αντίστροφη μεταγραφάση ακολουθούμενη από πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Το Σχήμα 6Α απεικονίζει ότι οι μεταγραφές Ε6 ανιχνεύθηκαν στα μετασχηματισμένα κύτταρα FH και FC με ωστόσο χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι τα γονικά κύτταρα HeLa και CaSki. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η μεταφορά του ιικών ογκογονιδίων είναι αποτελεσματική και λειτουργική. Να εξετάσει πιο προσεκτικά το ρόλο των μεταβιβασθέντων ογκογονιδίων Ε6 ως αναστολείς της έκφρασης p53, που ανοσοστυπώθηκαν για ρ53 και ένας από τους στόχους της, p21. Συνεπώς, τα επίπεδα ρ53 και ρ21 των μεταμορφωμένων HPFS μειώθηκε σημαντικά, παρόμοιο με την μείωση σε καρκινικά κύτταρα δότη (Σχήμα 6Β). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δίνουν έμφαση έναν κρίσιμο ρόλο των ιικών μεταφορά ογκογονιδίου στο μετασχηματισμό πρωτογενών κυττάρων, μία διαδικασία που παρακάμπτει την οδό ρ53.

(Α) Οι εικόνες απεικονίζουν τη μεταφορά DNA από τα αποπτωτικά κύτταρα στους αποδέκτες ινοβλαστών (βέλη). Μικροσκοπικές παρατηρήσεις έγιναν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (bar κλίμακα: 1 μm). (Β) υψηλού κινδύνου HPV DNA ανιχνεύθηκε από

in situ υβριδισμού

στη γονική και αποπτωτικών HeLa και Ca σκι κύτταρα, FH και FC, αλλά όχι σε HPFS. Τα κύτταρα αντίθετα με εωσίνη (bar κλίμακας: 1 μm). (C) αγαρόζη ηλεκτροφόρηση πηκτής ενισχυμένου ανθρώπινη λευκωματίνη και Ε6 HPV18 και HPV16 Ε6 DNA (ΜΒ: μοριακό βάρος). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

(Α) Ε6 HPV18 και HPV16 Ε6 RNA ποσοτικοποίηση από HPFS, γονικών κυττάρων και ινοβλαστών μεταμορφωθεί από αποπτωτικά κύτταρα HeLa ή αποπτωτικά κύτταρα Ca σκι (το όνομα FH και FC αντίστοιχα) διεξήχθη με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής εξής. Τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (+/- SD). (Β) Ανοσοστύπωμα αναλύσεις ρ53 και ρ21 έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου, HPFS και FH και FC μετασχηματισμένες ινοβλάστες, χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι ρ53 και ρ21. Τα στυπώματα επίσης διερευνήθηκαν με αντίσωμα β-ακτίνης.

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν άμεση απόδειξη της ογκογόνο δυναμικό του HPV θετικά αποπτωτικών κυττάρων. Η μεταφορά του ιικού DNA που προέρχεται από HPV-θετικού καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων μέσω HGT προώθησε την ανάπτυξη και το μετασχηματισμό του HPFS και θα μπορούσε να αποτελέσει έναν εναλλακτικό μηχανισμό για τον HPV-σχετίζεται κυτταρικό μετασχηματισμό. Bergsmedh

et al.

Προηγουμένως αποδειχθεί η οριζόντια μεταφορά ογκογονιδίου μεταξύ ευκαρυωτικά κύτταρα [19]. Στο μοντέλο τους, τα κύτταρα του δότη ήταν πρωτογενών ινοβλαστών τρωκτικών τροποποιημένα ώστε να υπερεκφράζουν C-

myc

και Η-

ras

V12 και υγρομυκίνη ανθεκτικό γονίδιο που επιτρέπει μια πολύ αυστηρή επιλογή των μετασχηματίζονται κύτταρα δέκτες μετά HGT.

Στη μελέτη μας, τα ποσοστά εσωτερίκευση των αποπτωτικών κυττάρων καρκίνου ήταν παρόμοια, ανεξάρτητα από την κατάσταση του HPV. Ωστόσο, το εύρημα ότι μόνο HeLa και Ca σκι καρκίνος κύτταρα που φέρουν φυσικά ολοκληρωμένου HPV ογκογονίδια, αλλά όχι HPV-αρνητικό C-33 κύτταρα Α είναι σε θέση να μετατρέψει φακοκύττωση ινοβλάστες παρέχει υποστήριξη για την υπόθεση ότι το ιικό DNA μεταφέρθηκε με αποπτωτικά κύτταρα μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν και που εκφράζεται από κύτταρα δέκτες.

Το

in vitro

μετασχηματισμό κυττάρων δέκτη από οριζόντια μεταφέρονται DNA, η οποία διευκολύνεται από τον κατακερματισμό του DNA, φάνηκε να εξαρτάται από την p53 [29]. Πράγματι, ρ53- ή p21-ανεπαρκή κύτταρα, αλλά όχι άγριου τύπου ινοβλαστών p53, έγινε όγκο όπως μετά την πρόσληψη τους C-

myc

και Η-

ras

ογκογονίδια V12 , υποδεικνύοντας ότι η οδός σηματοδότησης Chk2 /ρ53 /ρ21 προστατεύει τα κύτταρα κατά της εξάπλωσης των δυνητικά επιβλαβών DNA [19], [20], [30]. Επιπλέον, SV40LT, το οποίο διευκολύνει την υποβάθμιση ρ53, μπορούν να ξεπεράσουν αυτό το γενετικό επιτήρηση τόσο

in vitro

και

in vivo

[21]. Όπως SV40LT, οι ογκοπρωτεΐνες Ε6 του HPV τύπου 16 και 18 είναι φυσικά συνδέεται με άγριου τύπου ρ53 και ευνοούν την υποβάθμιση proteosomal της [αναθεωρηθούν [31]]. Μια ανάλυση των μετασχηματισμένων ινοβλαστών αποκάλυψε ότι περιείχαν Ε6 HPV16 Ε6 ή HPV18 DNA. Επιπλέον, ISH έδειξαν ότι HPV DNA από τα αποπτωτικά κύτταρα καρκίνου μεταφέρθηκε στους πυρήνες των αποδέκτη ινοβλαστών. Μόλις το DNA μεταφέρθηκε, η έκφραση των γονιδίων HPV Ε6 ανιχνεύθηκε σε επίπεδο RNA έως 15 εβδομάδες μετά την έναρξη των πειραμάτων συνκαλλιέργειας. Τα Ε6 που εκφράζουν κύτταρα-δέκτες εμφάνισαν μειωμένα επίπεδα του p53, καθώς και στόχο, p21, το οποίο μπορεί να εξηγήσει εν μέρει τις αλλαγές στο κύκλωμα ελέγχου της ανάπτυξης.

Έχουμε την πρόθεση να επιβεβαιώσει με γονοτυπική που μεταμόρφωσε ινοβλάστες ήταν μοναδική και προήλθαν από πρωτογενείς ινοβλάστες και γονικές καρκινικές κυτταρικές σειρές. Με τη μελέτη αρκετών μικροδορυφόρων, βρήκαμε ότι έφεραν πραγματικά κάποια αλληλόμορφα πανομοιότυπες με εκείνες που προσδιορίζονται στο αποπτωτικών του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, λόγω της απώλειας των πρωτογενών ινοβλαστών για τη γήρανση, ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσουν ότι προέρχονται από πρωτογενείς ινοβλάστες. Εμείς δεν μπορεί να αποκλείσει εντελώς την πιθανότητα διασταυρούμενης μόλυνσης με μια άσχετη κυτταρική γραμμή, ακόμη και αν η δυνατότητα αυτή φαίνεται απίθανο. Ωστόσο, ιούς μεταβληθεί ινοβλάστες που ήταν σε θέση να σχηματίσουν αποικίες αποδεικνύεται ιδιόμορφη μορφολογικά χαρακτηριστικά, υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και ανευπλοειδία. Η μετάβαση από διπλοειδίας να ανευπλοειδία, ένα χαρακτηριστικό που παρατηρείται σε όλες σχεδόν τις καρκίνους [28], έχει σημειωθεί στις αρχές του HPV που σχετίζονται με βλάβες υψηλού κινδύνου του τραχήλου της μήτρας [32] και έχει αποδοθεί στη συνεργιστική δράση των Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών [ ,,,0],αναθεωρηθούν [31]]. Ωστόσο, HPV αθάνατα κύτταρα υψηλού κινδύνου είναι μη-ογκογόνο, και η ενεργοποίηση των κυτταρικών ογκογονιδίων c-

myc

, Η-

ras

και C-

fos

είναι απαραίτητο να ξεπεράσει πλήρως την αντι-ογκογόνο λειτουργία της ρ53 και να έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [33], [34], [35]. Περαιτέρω μελέτη της έκφρασης αυτών των ενδεχομένως ενεργοποιημένου κυτταρικά ογκογονίδια θα βοηθήσει στην κατανόηση του μηχανισμού της μεταμόρφωσης των ινοβλαστών. Παρ ‘όλα αυτά, HPV μετάδοση ογκογονίδιο θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο πιο σημαντικό από ό, τι θεωρείται, από την έκφραση του HPV16 Ε6 ογκογονίδιο σε αρνητικό C 33-κυττάρων του HPV Μια προσδίδει ένα επιθετικό φαινότυπο, όπως φαίνεται από την αντίσταση ακτινοβολίας σε μεταμοσχευμένους όγκους [36].

Αποδράστε από τους μηχανισμούς του ανοσοποιητικού επιτήρησης μπορεί να αντιπροσωπεύει τον κύριο παράγοντα κινδύνου για την επιμονή του HPV DNA και την εξέλιξη της βλάβης, ενώ η ιογενής μεταφορά από αποπτωτικά σώματα σε περιβάλλοντα κύτταρα που δεν έχουν υποδοχείς για τον HPV

in vivo

μπορούσε να διευκολύνει την επιμονή του HPV σε ο τράχηλος. Επιπλέον, η μεταφορά αυτή θα μπορούσε να εξηγήσει την εξάπλωση του ιού HPV σε μεσεγχυματικά κύτταρα, όπως παρατηρήθηκε από ISH σε καρκινώματα του τραχήλου [37], [38], και η πιθανότητα μιας δεξαμενής στρωματικών για τον HPV. Επιπλέον, σε ανθρώπινους στερεούς όγκους, ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων, που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα, τα οποία είναι πιθανόν ξεκίνησε ως αποτέλεσμα της HGT προκαλούν πολύ επιθετικών καρκίνων με υψηλή ροπή προς μεταστατική διάδοση [39]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει τη θετική συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού του εντός του όγκου απόπτωση και διάφορες παραμέτρους του τραχήλου της μήτρας όγκου όπως το μέγεθος του όγκου, το βαθμό της βλάβης, μεταστατικό φαινότυπο και την επιβίωση των ασθενών [7], [40], [41], [42].

Επιπλέον, η αυξημένη επικράτηση των αποπτωτικών κυττάρων μετά από χημειοθεραπεία ή /και ακτινοβολία θεραπεία θα μπορούσε να είναι εν μέρει υπεύθυνη για την επανάληψη του HPV βλαβών επάγοντας τον μετασχηματισμό των νέων κυττάρων στο ίδιο ή διαφορετικά ανατομικά σημεία μήνες ή χρόνια μετά την ύφεση [43 ], [44]. Οι έρευνες της δυνατότητας αυτής δικαιολογείται, εκτός από τις προσπάθειες για την εξεύρεση νέων θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν Ε6 /Ε7 ογκογονίδια να περιορίσει οριζόντια μεταφορά τους και να ελέγχουν την ανάπτυξη των όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και απόπτωση επαγωγή

HPFS απομονώθηκαν από ενήλικα ανθρώπινο δέρμα μετά κοιλιοπλαστική όπως περιγράφηκε προηγουμένως [45] και αναπτύχθηκαν σε πλήρες DMEM (Lonza) που περιείχε 10% FBS (Lonza), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη. HPFS που προέρχονται από χειρουργικές κατάλοιπα δεν υπόκεινται σε επικύρωση από μια επιτροπή δεοντολογίας και συγκατάθεση του ασθενούς σύμφωνα με το νόμο L.1245-2 του «Code de la santé publique» που εφαρμόζεται στη Γαλλία. Επιπλέον, το εργαστήριο της μηχανικής του δέρματος της δερματολογίας Τμήμα καθηγητή Philippe Humbert, παρέχοντας ανθρώπινους ινοβλάστες, διαθέτει έγγραφα χειρόγραφο δηλώνοντας μη διατύπωση αντιρρήσεων του ασθενούς με τη χρήση χειρουργικών υπολειμμάτων του για την ιατρική έρευνα, σύμφωνα με την L.1211-2 νόμο. Ανθρώπινο τραχηλικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (ATCC), HeLa (HPV18, άγριου τύπου ρ53) και C-33 Α (HPV αρνητική, μεταλλαγμένη p53) αναπτύχθηκαν σε πλήρες ΕΜΕΜ (Lonza), και Ca Ski κύτταρα (HPV16, άγριου-τύπου ρ53 ) αναπτύχθηκαν σε πλήρες RPMI (Lonza). Αυτά παρακολουθούνται μηνιαίως και βρέθηκε να είναι απαλλαγμένα από μυκοπλάσματα. Δώδεκα ώρες πριν την επαγωγή της απόπτωσης, τα κύτταρα καρκινώματος σπάρθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα /cm

2. Αυτά στη συνέχεια κατεργάστηκαν με 20 mJ /cm

2 ακτινοβολία UVB που ακολουθείται από 300 ηΜ σταυροσπορίνη (STS) (Sigma Aldrich) για 48 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση του υπερκειμένου στα 300 g για 10 λεπτά. Η ανίχνευση της απόπτωσης διεξήχθη όπως περιγράφεται στις συμπληρωματικές πληροφορίες (Methods S1). Τα αποπτωτικά κύτταρα επωάστηκαν με HPFS σε αναλογία 10:01. Η αναλογία αυτή επιλέχθηκε επειδή μια υψηλότερη αναλογία προκαλεί το θάνατο των ινοβλαστών και μία χαμηλότερη αναλογία μειώνει το ποσοστό της εσωτερίκευσης.

αποπτωτικό κυτταρικό εσωτερικοποίηση ανάλυση

Τα αποπτωτικά κύτταρα βάφτηκαν με 1 μg /ml CFDA, SE (Invitrogen Ltd) αραιωμένο σε ϋΜΕΜ με 2% FBS για 13 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την πλύση, αυτές επωάστηκαν για 48 ώρες με κύτταρα δέκτες. Για ανάλυση κυτταρομετρίας, οι ινοβλάστες επωάστηκαν με τα αποπτωτικά κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Lab Quanta ™ SC κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter). Τα αποπτωτικά κύτταρα σημάνθηκαν με CFDA, SE και HPFS διακρίθηκαν λόγω αποπτωτικού κύτταρα με διάμετρο τους, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Εκδηλώσεις με μικρές διαμέτρους ( , γεγονότα με μεγάλης διαμέτρου (& gt? 13 μm) και αρνητικό για CFDA, SE, ήταν HPFS και εκδηλώσεις με μεγάλη διάμετρο και θετική για CFDA, SE ήταν HPFs με τυλίχθηκε αποπτωτικά κύτταρα.

για συνεστιακή μικροσκοπία, ινοβλάστες που καλλιεργούνται σε coverslides μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά στους 4 ° C και διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.1% Triton Χ100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία (RT). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας TRITC (ισοθειοκυανική τετραμεθυλροδαμίνη-), συζευγμένης phalloidin (Sigma Aldrich) για 30 λεπτά στους 4 ° C και με 300 ηΜ 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, διυδροχλωρική (ϋΑΡΙ? Invitrogen) για 5 λεπτά σε RT. Η 3D εικόνα (z προβολή) ανασυστάθηκε από 32 οριζόντιες φέτες 2D λαμβάνεται με συνεστιακή μικροσκοπία. Ένα άλλο σύνολο των κυττάρων επωάστηκε με δύο πρωτογενή αντισώματα: ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα κυτοκερατίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (κλώνος ΑΕ1 /ΑΕ3, DakoCytomation) που χρησιμοποιούνται στις 1:50 και ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα βιμεντίνη μονοκλωνικό κουνελιού (κλώνος SP20? GeneTex) που χρησιμοποιείται στο 1 :100 αραίωση. Αντίστοιχες δευτερογενή αντισώματα (Jackson ImmunoResearch) συζευγμένο με κυανίνη 2 (CY ™ 2-συζευγμένο AffiniPure Κατσίκας αντι-Ποντικού IgG) ή να ροδαμίνη (ροδαμίνη (TRITC), συζευγμένης AffiniPure όνου κατά IgG κουνελιού) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:50. Οι coverslides τελικά εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus FluoView 1000 μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus).

δοκιμασία σχηματισμού Αποικίας, κυτταρική ανάπτυξη και ανευπλοειδίας ανάλυση

Soft δοκιμασίες άγαρ διεξήχθησαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε ημι -Στερεά μέσων (ϋΜΕΜ, 10% FBS, 0.35% άγαρ? Invitrogen) με 8 × 10

3 και 3 × 10

5 κύτταρα /ml σε μια στρώση βάσης μέσων (RPMI, 10% FBS, 0,5% άγαρ ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 21 ημέρες, και οι αποικίες παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Axiovert 25 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Zeiss) [27]. Οι αποικίες στη συνέχεια συλλέχθηκαν με απόξεση της επιφάνειας του μαλακού άγαρ και δύο κυτταρικές σειρές ινοβλαστών μετασχηματισμένων με αποπτωτική HeLa (FH) και Ca Σκι (FC) κύτταρα προερχόμενα και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

Πρωτογενής ινοβλαστών μετασχηματισμός δοκιμάστηκε επίσης με καλλιέργειες όριο αραίωσης σε πλάκες 6-φρεατίων σε 5 × 10

2 κύτταρα /φρεάτιο για 21 ημέρες. Οι αποικίες στη συνέχεια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα πορφυρό διάλυμα κρυστάλλων (0,1% μωβ κρυστάλλων (w /v), αιθανόλης 5%) και φωτογραφήθηκαν με ένα Nikon Coolpix 4500 ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Nikon) [46].

Ο πολλαπλασιασμός των τα μετασχηματισμένα κύτταρα παρακολουθήθηκε μετρώντας τον συνολικό αριθμό των κυττάρων σε κάθε άτομο ημερησίως για 10 ημέρες με ένα κύτταρο Lab Quanta ™ SC κυτταρόμετρο ροής. Ο πολλαπλασιασμός παρακολουθήθηκε επίσης με τη χρήση της δοκιμής ΜΤΤ με το κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ι (ΜΤΤ) (Roche) για 5 διαδοχικές ημέρες.