είναι

Αφηρημένο

Ιστορικό

Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) μεταλλάξεις που αναφέρθηκαν σε διαφορετικούς όγκους. Ωστόσο, δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με τη χρονική εξέλιξη του mtDNA μεταλλάξεις /αλλοίωση περιεχόμενο και την έκταση τους σε φυσιολογικό και μη φυσιολογικό βλεννογόνο συνεχώς εκτεθειμένα στον καπνό σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Μεθοδολογία

Εξετάσαμε το πρότυπο του mtDNA αλλαγή (μετάλλαξη mtDNA και ο δείκτης περιεχομένου) σε βιοψίες βλεννογόνου 25 αεραγωγών, που αντιστοιχεί όγκων και των φυσιολογικών λεμφαδένων που προέρχονται από τρεις ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, εξετάσαμε το πρότυπο της μετάλλαξης mtDNA σε αντίστοιχες όγκους και φυσιολογικούς λεμφαδένες που λαμβάνονται από οκτώ άλλους ασθενείς με πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα. Το σύνολο 16,5 kb μιτοχονδριακό γονιδίωμα αλληλουχήθηκε στην πλατφόρμα αλληλούχιση v2.0 Affymetrix Mitochip σε κάθε δείγμα. Να εξετάσει δείκτης περιεχομένου mtDNA, πραγματοποιήσαμε σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR.

Κύρια Ευρήματα

Οι βλεννογόνου βιοψίες των αεραγωγών που προέρχονται από τρεις ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ήταν ιστοπαθολογικά αρνητικά, αλλά παρουσίασαν πολλαπλές κλωνική μεταλλάξεις του mtDNA ανιχνεύσιμη στο αντίστοιχο όγκων. Ένας από τους ασθενείς λειτούργησε δύο φορές για την απομάκρυνση του όγκου από τη δεξιά άνω και αριστερά κάτω λοβό αντίστοιχα μέσα σε διάστημα δύο ετών. Και οι δύο από αυτούς τους όγκους παρουσίασαν είκοσι πανομοιότυπες μεταλλάξεις του mtDNA. περιεχομένου του μιτοχονδριακού DNA αυξήθηκε σημαντικά (P & lt? 0.001) στον καρκίνο του πνεύμονα και όλα τα ιστολογικά αρνητική βλεννογόνου βιοψίες εκτός από ένα σε σχέση με το λεμφικό έλεγχο κόμβο

Συμπεράσματα /Σημασία:.

Τα αποτελέσματά μας τεκμηριώνει την έκταση μαζικών κλωνικού μπαλώματα που αναπτύσσονται σε καπνιστές διάρκεια ζωής και τελικά να οδηγήσει σε κλινικά σημαντικές καρκίνους. Αυτές οι παρατηρήσεις ρίξει φως σχετικά με την έκταση της νόσου στον αεραγωγό των καπνιστών ανιχνεύσιμα μέσω μετάλλαξης mtDNA. μετάλλαξη του μιτοχονδριακού DNA θα μπορούσε να είναι ένα αξιόπιστο εργαλείο για τη μοριακή αξιολόγηση του αναπνευστικού επιθηλίου που εκτίθενται σε συνεχή καπνού, καθώς και την ανίχνευση της νόσου και την παρακολούθηση. Λειτουργική ανάλυση των παθογόνων μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA μπορεί να είναι χρήσιμο να κατανοήσουν τον ρόλο τους στην πνευμονική ογκογένεση

Παράθεση:. Dasgupta S, Yung RC, Westra WH, Ρήνης DA, Brandes J, Sidransky D (2009) Μετά μιτοχονδριακού Footprints μέσω ένα μακρύ βλεννογόνου Διαδρομή για τον Καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 4 (8): e6533. doi: 10.1371 /journal.pone.0006533

Συντάκτης: Amanda Ewart Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 16, 2009? Αποδεκτές: 6, Ιουλίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 6 Αύγ 2009

Copyright: © 2009 Dasgupta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από EDRN UO1CA084986 επιχορήγησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ανθρώπινο μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) είναι ένα 16,5 kb δίκλωνου κλειστό κυκλικό μόριο το οποίο κωδικοποιεί για τα 12S και 16S rRNAs, 22 tRNAs και 13 πρωτεΐνες απαραίτητες για την μιτοχονδριακής αναπνευστικής συγκρότημα [1] – [2]. Τα περισσότερα ανθρώπινα κύτταρα περιέχουν εκατοντάδες αντίτυπα του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) και σχεδόν όλα αυτά τα αντίγραφα mtDNA είναι πανομοιότυπα δηλαδή ομοπλασμικά κατά τη γέννηση [1] – [2]. ρυθμός μετάλλαξης στο mtDNA είναι περίπου 10 φορές μεγαλύτερη από την πυρηνική γονιδιακό DNA (nDNA) [1]. Μέχρι σήμερα, έχουν κλωνική μεταλλάξεις mtDNA έχουν αναφερθεί σε διαφορετικούς όγκους [3]. δεν υπάρχουν πολλές πληροφορίες σχετικά με τη χρονική εξέλιξη αυτών των μεταλλάξεων και της έκτασής τους σε φυσιολογικό και μη φυσιολογικό βλεννογόνο που εκτίθενται στον καπνό του τσιγάρου.

Ο καρκίνος του πνεύμονα σκοτώνει περισσότερους από 1 εκατομμύριο άνθρωποι σε όλο τον κόσμο με το κάπνισμα είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας κινδύνου [4] . Στις Ηνωμένες Πολιτείες, υπήρχαν πάνω από 215.020 περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα και εκτιμάται ότι ο θάνατος των 161.840 το 2008 [4]. Παρά τη σημαντική βελτίωση στην θεραπευτικούς τρόπους συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης, χημειοθεραπεία βασισμένη στο λευκόχρυσο και μόνη ή σε συνδυασμό ακτινοθεραπεία, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι μόνο 15% [4]. Ογδόντα πέντε τοις εκατό των καρκίνων του πνεύμονα εμφανίζονται σε καπνιστές καπνού [4]. Επιπλέον, οι ασθενείς που επηρεάζονται παραμένουν σε σημαντικό κίνδυνο για την ανάπτυξη του δεύτερου πρωτοπαθούς όγκου καθ ‘όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Έτσι, η ανάπτυξη κατάλληλων μεθόδων για την έγκαιρη διάγνωση της νόσου, την παρακολούθηση και τη συνεχή αξιολόγηση των αεραγωγών σε ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα είναι υψίστης σημασίας.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το πρότυπο του mtDNA αλλαγή (μετάλλαξη και το περιεχόμενο DNA) σε βιοψίες βλεννογόνου του αεραγωγού που λαμβάνεται από την παρακολούθηση των ασθενών με πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα. Αντίστοιχες όγκων και φυσιολογικούς λεμφαδένες Εξετάστηκαν επίσης από αυτούς τους ασθενείς. Όλες οι βιοψίες εμφανίστηκε ύποπτες και μη φυσιολογικά κάτω από βρογχοσκόπηση auto-φθορισμού, ωστόσο, ήταν ιστολογικά αρνητικά. Όμως ο χάρτης των αλλαγών mtDNA σε αυτές τις βιοψίες ήταν εντυπωσιακή και παρέχει μια μοναδική εικόνα για το βαθμό δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων και αυξάνοντας τον κίνδυνο κακοήθειας σε ασθενείς που συνεχίζουν να καπνίζουν.

Αποτελέσματα

Ρυθμός mtDNA μετάλλαξη στο ασθενείς

το Σχήμα 1 δείχνει το πρότυπο των μεταλλάξεων mtDNA σε ασθενή 1. ο ασθενής αυτός λειτουργεί δύο φορές μέσα σε ένα διάστημα δύο ετών και στις δύο πνεύμονες. Το πρώτο όγκου (Τ1) αφαιρέθηκε χειρουργικά το 2002 από τη δεξιά άνω λοβό που ακολουθείται από την απομάκρυνση του δεύτερου όγκου (Τ2) το 2004 από το αριστερό κάτω λοβό. Πέντε αεραγωγών βιοψίες βλεννογόνου ελήφθησαν από την κύρια τρόπιδα (M1), δεξιά κάτω (Μ2 και Μ3) και αριστερά άνω λοβό (Μ4 και Μ5) που περιβάλλει τα πρωτογενή καρκινικές θέσεις και στις δύο πνεύμονες όπως απεικονίζεται. Οι βλεννογόνου βιοψίες ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης αυτού του ασθενούς μετά από χειρουργική αφαίρεση του δεύτερου όγκου από το αριστερό κάτω λοβό. Και οι πέντε βλεννογόνου βιοψίες ήταν ιστοπαθολογικά χωρίς ενδείξεις δυσπλασία, και όμως παρουσίασαν μια σειρά από 3-11 μεταλλάξεις mtDNA (Εικ. 1). Ένα σύνολο 16 μεταλλάξεων mtDNA ανιχνεύθηκαν στο βλεννογόνο αυτού του ασθενούς. Η πρώτη βιοψία από την κύρια τρόπιδα εμφάνισαν 3 μεταλλάξεις mtDNA (Μ1, Σχ. 1Α). Η δεύτερη βιοψία εκτίθενται 5 μεταλλάξεις των οποίων 2 επικάλυψη μεταλλάξεις με Μ1 (

A2249C

,

A8341C

, σε συνδυασμό χρώμα, Σχ. 1 Α-Β). Η τρίτη βιοψία εκτίθενται 7 μεταλλάξεις του mtDNA, συμπεριλαμβανομένων 3 επικάλυψη μεταλλάξεις με Μ2 (

A3742C

,

G8836C

και

T15982G

, σε συνδυασμό χρώμα, Σχ. 1 Β-C). Η τέταρτη βιοψία έτρεφε 7 μεταλλάξεις του mtDNA, συμπεριλαμβανομένων επικάλυψη μεταλλάξεις με Μ3 (

A3742C

,

T3756C

,

G6035C

,

G8836C

και

T15402A

, σε συνδυασμό χρώμα, Σχ. 1Α-D), Μ2 (

A3742C

,

A8341C

και

G8836C

, σε συνδυασμό χρώμα, Εικ. 2Β και Δ) και M1 (

A8341C

, σε συνδυασμό χρώμα, Σχ. 1Α-D). Η βιοψία λαμβάνεται δίπλα στον όγκο στο αριστερό κάτω λοβό παρουσίασαν 11 μεταλλάξεις του mtDNA συμπεριλαμβανομένων των επικαλυπτόμενων μεταλλάξεις με Μ1 (

A2249C

,

T2516C

και

A8341C

), Μ2 (

A2249C

,

A8341C

,

G8836C

και

T15982C

), M3 (

C4014A

,

G8836C

και

T15982G

) και Μ4 (

A8341C

και

G8836C

) βιοψίες (Εικ. 1Α-Ε, σε συνδυασμό χρώματος). Αμφότερες οι επιθετικοί όγκοι (Τ1 και Τ2) εμφάνισαν 20 πανομοιότυπες μεταλλάξεις mtDNA συμπεριλαμβανομένων όλων των 16 μεταλλάξεις ανιχνεύονται στη γύρω 5 φυσιολογικού βλεννογόνου (Σχ. 1Ε-F) (Αποδόσεις αναλογία 6,9 × 10

10:01). Δεκατρία από αυτά τα 20 (65%) μεταλλάξεις ήταν σε περιοχές κωδικοποίησης (COI, COII, ATP6, ND1, ND4 και CytB) και 7 (35%) συνέβησαν σε μη κωδικές περιοχές (12SrRNA, 16SrRNA, tRNA-λυσίνη, D-loop ) (Σχ. 1, F, κάτω ορθογώνιο). Οι επιπλέον 4 μεταλλάξεις που ανιχνεύονται στους όγκους εκπροσωπήθηκαν στο Σχ. 1E (Κάτω ορθογώνιο, μαύρο, υπογραμμισμένη). Δύο (

G8836C

και

A8341C

) σε τρεις μεταλλάξεις του mtDNA (

A2249C

,

A3742C

και

T15982G

) ήταν παρούσα σε 4/5 και 3/5 αντίστοιχα βλεννογόνο και στις δύο όγκους (Σχ. 1). Αντιπροσωπευτικά ιστολογικές φωτομικρογραφίες του βλεννογόνου και του όγκου φαίνεται στα Σχ. 1Α και 1 F. Διαφορετικούς κωδικούς χρώμα αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριμένο μεταλλαγμένο μοτίβο mtDNA που δείχνει την κλωνική εξάπλωση της μετάλλαξης mtDNA σε όλη τη βλεννογόνο και τελικά οδήγησαν σε γενετικά σχετίζονται με όγκους (Περικυκλωμένη).

Ο ασθενής χειρουργήθηκε δύο φορές το 2002 και το 2004 με αφαίρεση των όγκων από τα δεξιά επάνω (Τ1) και αριστερού κάτω λοβού (Τ2) αντίστοιχα. Πέντε βρογχοσκοπικά ανώμαλη βιοψίες βλεννογόνου του αεραγωγού ελήφθησαν μετά από δεύτερη χειρουργική επέμβαση (Τ2) του παρόντος ασθενούς από την κύρια τρόπιδα (Μ1), του δεξιού άνω λοβού (Μ2 και Μ3) και αριστερού κάτω λοβού (Μ3 και Μ4) που περιβάλλει τόσο τους όγκους όπως απεικονίζεται (Πίνακας Α -ΜΙ). Οι βιοψίες βλεννογόνου εμφάνισαν ένα εύρος 3-11 μεταλλάξεων mtDNA όπως παριστάνεται σε διαφορετικό χρώμα (Πίνακας Α-Ε). Ταυτόσημα μεταλλάξεις εμφανίζονται στο ίδιο χρώμα σε διαφορετικές βιοψίες και του όγκου. Ένα διαφορετικό κωδικό χρώματος χρησιμοποιήθηκε επίσης για κάθε βλεννογόνο για να δείξει την κλωνική εξέλιξη των αλλοιώσεων τόσο στους πνεύμονες με συσσωρευμένες μεταλλάξεις του mtDNA. Αντιπροσωπευτικά ιστολογική φωτομικρογραφία του βλεννογόνου και του όγκου έχει δειχθεί στο πλαίσιο Α και F. Τόσο οι όγκοι Τ1 και Τ2 παρουσίασαν είκοσι πανομοιότυπες μεταλλάξεις mtDNA (Ε-Ρ, Κάτω ορθογώνιο) συμπεριλαμβανομένων όλων των 16 μεταλλάξεων που παρουσιάζονται από τους πέντε βλεννογόνου βιοψίες (Αντιστοιχισμένα χρώμα). Οι επιπλέον 4 mtDNA μεταλλάξεις που ανιχνεύονται στους όγκους εκπροσωπούνται υπογραμμίζεται σε μαύρο χρώμα στο κάτω ορθογώνιο (Panel Ε-Ρ). Δύο μεταλλάξεις του mtDNA (

G8836C

και

A8341C

) ήταν παρόντες στο 4/5 και 3 άλλες μεταλλάξεις (

A2249C

,

A3742C

και

T15982G

) ήταν παρόντες στο 3/5 του βλεννογόνου βιοψίες. Οι όγκοι περικυκλώνεται να δείξει την ανάπτυξή τους από τις κλωνική βλεννογόνου μπαλώματα. T1: όγκου από το δεξιό άνω λοβό? Τ2: όγκου από το αριστερό κάτω λοβό? Μ:. Βλεννογόνου

Η

Ο ασθενής υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση το 2005 για χειρουργική αφαίρεση του όγκου από το δεξιό άνω λοβό. Πέντε βρογχοσκοπικά ανώμαλη βιοψίες βλεννογόνου του αεραγωγού ελήφθησαν από την κύρια τρόπιδα (Μ1), δεξιό κάτω λοβό (Μ2 και Μ3) και του δεξιού άνω λοβού (Μ3 και Μ4) που περιβάλλουν τους όγκους όπως απεικονίζεται (Πίνακας Α-Ε). Οι βιοψίες βλεννογόνου παρουσίασαν μια σειρά από 2-5 μεταλλάξεων mtDNA όπως παριστάνεται σε διαφορετικό χρώμα (Πίνακας Α-Ε). Ταυτόσημα μεταλλάξεις εμφανίζονται στο ίδιο χρώμα σε διαφορετικές βιοψίες και του όγκου. Ένα διαφορετικό κωδικό χρώματος χρησιμοποιήθηκε επίσης για κάθε βλεννογόνο για να δείξει την κλωνική εξέλιξη των βλαβών με συσσωρευμένες μεταλλάξεις του mtDNA. Εκπρόσωπος ιστολογική μικροφωτογραφία του όγκου και φυσιολογικό βλεννογόνο παρουσιάζονται στον Πίνακα Α και D. Τα καρκινικά παρουσίασαν 9 μεταλλάξεις του mtDNA (που εκπροσωπούνται στην Κάτω ορθογώνιο), συμπεριλαμβανομένων όλων των 8 μεταλλάξεις εκτίθενται από τις πέντε βλεννογόνου βιοψίες (Συμφωνήθηκε χρώμα). Μια επιπλέον μετάλλαξη μιτοχονδριακού DNA (

T7001C

) ανιχνεύονται στον όγκο υπογραμμίζεται σε μαύρο χρώμα στο κάτω μέρος ορθογώνιο. Όγκου περικυκλωμένη να υποδείξει την ανάπτυξή της από τις κλωνική βλεννογόνου μπαλώματα. Μ:. Βλεννογόνου

Η

Στον ασθενή 2, πέντε βλεννογόνου βιοψίες ελήφθησαν από την κύρια τρόπιδα (Μ1), δεξιό κάτω λοβό (Μ2 και Μ3) και του δεξιού άνω λοβού (Μ3 και Μ4) που περιβάλλει την κύρια όγκου στο δεξιό πνεύμονα όπως φαίνεται στην Εικόνα 2. Όλες οι 5 αλλοιώσεις ήταν ιστοπαθολογικά φυσιολογική όπως φαίνεται στον ασθενή 1, αλλά επέδειξαν μια σειρά από 2-8 μεταλλάξεων mtDNA. Η πρώτη βλάβη εκτίθενται 2 μεταλλάξεις, όπου ως η δεύτερη εμφάνισε 3 με ένα πανομοιότυπο μετάλλαξη από κοινού με Μ1 (

A10995C

, Σχ. 2Α-Β, ταιριάζουν χρώμα). Η τρίτη βλάβη (Μ3) εμφάνισαν 3 μεταλλάξεις του mtDNA με μία επικαλυπτόμενη μετάλλαξη με Μ2 (

A14917C

) και M1 (

G8836C

) (Σχ. 2Α-C, συμφωνημένα χρώμα). Στο εμπρός βλάβης (Μ4), 3 μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν με μία επικάλυψη μετάλλαξη (

G8836C

) με Μ3 και Μ1 (Σχ. 2Α-D, ταιριάζει χρώμα). Η πέμπτη βλεννογόνου βλάβη (Μ5) εμφάνισαν 5 μεταλλάξεις συμπεριλαμβανομένου επικάλυψη μεταλλάξεις M4 (

A3984C

και

G8836C

), M3 (

A6831C

,

G8836C

και

A14917C

), Μ2 (A14917C) και M1 (

G8836C

) (Εικ. 2Α-Ε, σε συνδυασμό χρώματος). Η πρωτογενής όγκος εκτομήθηκε από το δεξιό άνω λοβό αυτού του ασθενούς εμφάνισε 9 μεταλλάξεις mtDNA συμπεριλαμβανομένων όλων των 8 μεταλλάξεις ανιχνεύονται στα περιβάλλοντα 5 προφανώς δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Όλες αυτές οι μεταλλάξεις (9/9) ήταν στο μιτοχονδριακό κωδικές περιοχές (ND1, COI, ATP6, ND4, ND5 και CytB) του mtDNA (Σχ. 2Ε, κάτω ορθογώνιο). Η πρόσθετη μετάλλαξη (

T7001C

) ανιχνεύθηκε στον όγκο παρουσιάζεται στην Εικόνα 2Ε (κάτω δεξιά ορθογώνιο, μαύρο, υπογραμμισμένη). Ένα mtDNA μετάλλαξη (

G8836C

) ήταν παρούσα στο 4/5 και μια άλλη μετάλλαξη (A14917C) ήταν παρούσα σε 3/5 δείγματα βλεννογόνου ιστού (Εικ. 2). Και οι δύο από αυτές τις μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν επίσης στο αντίστοιχο όγκου (Σχ. 2Ε). Αντιπροσωπευτικά ιστολογικές φωτομικρογραφίες του βλεννογόνου και του όγκου που φαίνεται στο Σχ. 2Α και Ε). Διαφορετικούς κωδικούς χρώμα αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριμένο μεταλλαγμένο μοτίβο mtDNA που δείχνει την κλωνική εξάπλωση της μετάλλαξης mtDNA σε όλη τη βλεννογόνο και τελικά οδήγησε σε γενετικώς σχετική όγκου (Περικυκλωμένη). Τέσσερις μεταλλάξεις του mtDNA (

G8836C

,

T3756C

,

A3984C

και

A7251C

) ήταν ίδιες μεταξύ των ασθενών 1 και 2 (Εικ. 1-2) .

Ο ασθενής 3 ήταν ένα μη καπνιστή με ένα καρκίνωμα βρογχοκυψελιδικό και παρουσίασαν μόνο 2 μεταλλάξεις του mtDNA του όγκου (Πίνακας 1). Δεν μετάλλαξη ανιχνεύθηκε στο φυσιολογικό βλεννογόνο. Ένα περιθώριο με μεταπλασία από αυτόν τον ασθενή, επίσης, δεν έδειξε καμία μετάλλαξη mtDNA (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια θεμελιώδη διαφορά στον τομέα σχηματισμός καρκίνου και την έκταση των κλωνική μπαλώματα μεταξύ ενός όγκου μη-καπνιστή. Εμείς αλληλουχία 8 άλλους ασθενείς για μετάλλαξη mtDNA και βρήκε μια σειρά από 1-9 μεταλλάξεων στα πρωτογενείς όγκους σε σύγκριση με τον έλεγχο, τα περισσότερα των οποίων ήταν από τις περιοχές κωδικοποίησης του mtDNA (Πίνακας 2). Άλλα από σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA, ανιχνεύσαμε επίσης μερικά βλαστικής mtDNA ακολουθία παραλλαγές στους όγκους και τα αντίστοιχα βλεννογόνου βιοψίες όλων των ασθενών (Πίνακας 3).

Η

Η

Η αλλοίωση του περιεχομένου mtDNA στον πνεύμονα ασθενών με καρκίνο

Πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR για να προσδιοριστεί το περιεχόμενο mtDNA σε βλεννογόνο ασθενών, που αντιστοιχεί όγκους και μη νεοπλαστικά λεμφαδένες. Με μία μόνο εξαίρεση σε μία βιοψία (Ασθενής 1, Μ1) περιεκτικότητα mtDNA ήταν σημαντικά υψηλότερη (Ρ & lt? 0.001) στον καρκίνο του πνεύμονα και όλα τα ιστολογικά φυσιολογικό βλεννογόνου βιοψίες σε σύγκριση με το λεμφικό ελέγχου κόμβου (Εικ. 3). Το ίδιο ίσχυε και στο βλεννογόνο και μεταπλαστικών περιθώριο που προσδιορίζονται σε 3 ασθενείς, ο μη καπνιστής (Εικ. 4). περιεχόμενο του μιτοχονδριακού DNA αυξήθηκε χωρίς αντίστοιχη mtDNA μετάλλαξη (Εικ. 4). Έτσι, η αυξημένη περιεκτικότητα σε mtDNA είναι ένα χαρακτηριστικό σε εκτεταμένες βλεννογόνου πεδία από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα τόσο καπνίζοντες και μη καπνίζοντες.

περιεχόμενο μιτοχονδριακού DNA μετρήθηκε με multiplex PCR πραγματικού χρόνου με τη χρήση της πυρηνικής κωδικοποιημένα β-ακτίνης και τα μιτοχόνδρια κωδικοποιημένα COI γονίδιο . Μια αναλογία COI /β-ακτίνη αντιστοιχεί στη στάνη διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο. περιεχόμενο του μιτοχονδριακού DNA αυξήθηκε σημαντικά (Ρ & lt? 0.001) στις βιοψίες βλεννογόνου και των αντίστοιχων όγκων σε σύγκριση με τον κανονικό έλεγχο και στις δύο ασθενείς όπως υποδεικνύεται. N: Κανονική λεμφαδένων? Μ: βλεννογόνου? Τ: Tumor. * P τιμή & lt?. 0.05 σε σύγκριση με το φυσιολογικό λεμφαδένα

Η

περιεχόμενο mtDNA αυξήθηκε σημαντικά (P & lt? 0,05) στο βλεννογόνο (Μ), παρακείμενο φυσιολογικό (ΝΤ) και στην μεταπλαστικού περιθωρίου (MT) σε σύγκριση με την κανονική λεμφαδένα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

η

Συζήτηση

μεταλλάξεις

μιτοχονδριακού DNA είναι συχνά σε διάφορους τύπους όγκων [3], και ανιχνεύονται σε προνεοπλασματικές αλλοιώσεις υποδεικνύοντας έτσι την εμφάνισή τους στα πρώιμα στάδια του πολυσταδιακής προόδου των όγκων [5]. Ανίχνευση της μετάλλαξης mtDNA είναι ευκολότερη και πιο αξιόπιστη σε σύγκριση με το πυρηνικό DNA, λόγω του υψηλού αριθμού αντιγράφων τους σε καρκινικά κύτταρα [6] – [7]. Ως εκ τούτου, εξέταση mtDNA μεταλλάξεις σε ένα μικρό αριθμό κυττάρων σε διάφορα στάδια της εξέλιξης του όγκου είναι δυνατή. Για να χρησιμοποιήσετε μετάλλαξη mtDNA ως μια αμερόληπτη εργαλείο για την ανίχνευση των κυτταρικών πληθυσμών κλωνικής, αλληλούχιση ολόκληρου μιτοχονδριακό γονιδίωμα είναι αναγκαία και θα πρέπει να γίνει σε συνδυασμό με ένα κατάλληλο μη νεοπλασματικά έλεγχο λόγω της υψηλής πολυμορφικής φύσης του mtDNA [7]. Στην παρούσα μελέτη, η ενίσχυση του σημαντική ποσότητα mtDNA από πολύ μικρά βλεννογόνου βιοψίες, όγκου και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί μας επέτρεψε να σαρώσει το σύνολο μιτοχονδριακό γονιδίωμα. Αυτό επιτεύχθηκε εύκολα στην πλατφόρμα αλληλούχισης Mitochip v2.0 υψηλής απόδοσης Affymetrix δειχθεί προηγουμένως ότι είναι ένα αξιόπιστο εργαλείο για την ανίχνευση μετάλλαξης mtDNA [5], [8]. Αυτή η πρόσφατη έκδοση του Mitochip (σε σύγκριση με Mitochip v1.0) δεν έχει μόνο μια υψηλή ευαισθησία για ανίχνευση μετάλλαξης που εκτείνονται σε ολόκληρο μιτοχονδριακό γονιδίωμα αλλά επίσης επιτρέπει τον προσδιορισμό ετεροπλασμικά μετάλλαξης mtDNA [8] – [9]. Η παρατηρούμενη μετάλλαξη μπορεί επίσης να ελεγχθεί με συμβατικές αλληλουχίας. Ωστόσο, Mitochip v2.0 δεν μπορεί να ανιχνεύσει μικρές εισαγωγής /διαγραφής όπως έχει σχεδιαστεί κυρίως για την ανίχνευση μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA. Οι μεταλλάξεις που ανιχνεύονται στην παρούσα μελέτη ήταν σωματικά ή βλαστικά γραμμή στη φύση και επιβεβαιώθηκε ότι δεν οφείλεται σε οποιαδήποτε haplotypic παραλλαγή [5], [8] – [9]. Έτσι, όλες οι de novo μεταλλάξεις που ανιχνεύονται και αναφέρθηκαν σε αυτή τη μελέτη που σχετίζεται με τον φαινότυπο όγκου.

Στον ασθενή 1, μικρό παρακολούθησης βιοψίες ελήφθησαν από περιοχές του βλεννογόνου των αεραγωγών η οποία εμφανίστηκε ανώμαλη υπό αυτοφθορισμός-βρογχοσκόπηση. Παρά το γεγονός ότι όλοι οι βιοψίες ήταν ιστοπαθολογικά αρνητικά και χωρίς δυσπλαστικών αλλαγών, εμφάνισαν πολλαπλές μεταλλάξεις του mtDNA μερικά από τα οποία μοιράστηκαν σε μεγάλα κομμάτια του επιθηλίου των αεραγωγών. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την κλωνική εξάπλωση των πολλαπλών μεταλλάξεων mtDNA σε όλη τη βλεννογόνο του αναπνευστικού. Κλωνική εξάπλωση της μετάλλαξης ρ53 και μικροδορυφορικών μετατροπές (LOH και ΜΑ) σε πολλαπλές εστίες σε φυσιολογικά εμφανίζονται βρογχικό επιθήλιο έχει αναφερθεί παλαιότερα [10] – [12]. Στην παρούσα μελέτη, δραματική επέκταση των μεταλλαγμένων βρογχικών επιθηλιακών κλώνων ήταν ανιχνεύσιμα μέσω mtDNA μετάλλαξη με μεγάλη ακρίβεια και κατά τρόπο αμερόληπτο με αλληλούχιση ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε κάθε δείγμα.

Είναι πιθανό ότι οι βιοψίες που περιέχονται ετερογενή μπαλώματα των κυττάρων με κλωνική αλλαγές που αποκτήθηκαν με τυχαία μιτοχονδριακή γενετική παρέκκλιση [7]. Όπως στον ασθενή 1, τα περισσότερα από τους κλώνους μοιράζονται έναν αριθμό πανομοιότυπων μεταλλάξεων mtDNA μαζί με πρόσθετες μεταλλάξεις είναι αναγκαία για την κλωνική επέκταση (Εικ. 5). Οι ισχυρότερου κλώνους που φιλοξενούσαν πιο συμφέρουσα μεταλλάξεις του mtDNA /nDNA προχώρησε μέσω του βλεννογόνου και τελικά οδήγησε σε δύο φαινομενικά ανεξάρτητες πρωτοπαθείς όγκους που είναι, ωστόσο, σίγουρα συνδέονται με πανομοιότυπες μεταλλάξεις του mtDNA [7], [13]. Ανίχνευση όλων των μεταλλάξεων του βλεννογόνου του mtDNA και στα δύο όγκους εκτομή μέσα σε ένα διάστημα 2 ετών υποστηρίζει σθεναρά κλωνική προέλευση τους. Επιπλέον, έχουμε επίσης δείξει ότι οι δύο χωριστές όγκους από τα απέναντι πνεύμονες εκτίθενται πολλαπλές μεταλλάξεις ταυτόσημες mtDNA? οι πιθανότητες να συμβεί αυτό κατά τύχη είναι vanishingly χαμηλά. Η πρώτη του όγκου πιθανότατα αναπτύχθηκε από ένα από τα πιο κυρίαρχη κλώνους διάσπαρτα στο δεξιό πνεύμονα, μετά την απόκτηση των απαραίτητων mtDNA /nDNA αλλαγές επαρκείς για την προώθηση της ογκογένεσης. Η δεύτερη όγκος πιθανό αναπτύχθηκε με τον ίδιο τρόπο για το αριστερό πνεύμονα αλλά αποκτώνται nDNA μεταλλάξεων χτυπήματα αρκετούς μήνες αργότερα ή αλλιώς θα μπορούσε ενδεχομένως να είναι μια πνευμονική μετάσταση. Τα δεδομένα από τον ασθενή 2 υποστηρίξει επίσης την εκτεταμένη κλωνική εξάπλωση των μεταλλάξεων mtDNA και της ανάπτυξης τα επόμενα όγκου μετά την απόκτηση επαρκών mtDNA ή /και nDNA αλλαγές. Ένα γονιδίωμα υψηλής ανάλυσης ευρεία ανάλυση αυτών των βιοψιών και των αντίστοιχων όγκων αποκάλυψε κλωνική μεταβολή ενός αριθμού βασικών nDNA κωδικοποιούνται γονίδια σε αυτούς τους ασθενείς (Ανέκδοτες παρατήρηση) περαιτέρω στήριξη αυτής της έννοιας. Ωστόσο, λόγω της μη διαθεσιμότητας, δεν θα μπορούσαμε να εξετάσουμε το πρότυπο του φάσματος αλλοίωση mtDNA σε ένα σχετικά μεγάλο αριθμό ασθενών.

Πιθανή κλωνική εξέλιξη των όγκων του πνεύμονα έχει απεικονιστεί. Κάθε βλεννογόνου βιοψία (σε κύκλο, M1-M5) μοιράζονται κάποια όμοια μεταλλάξεις του mtDNA (Συμφωνήθηκε χρώμα) μαζί με πρόσθετες μεταλλάξεις στον τομέα ετερογενή βλεννογόνου. Οι ισχυρότερου κλώνοι εμφανίστηκαν στις πρωτογενείς όγκους (Τ1-Τ2) με τις πιο επιλεκτική μεταλλάξεις του mtDNA (Σύνολο 20 μεταλλάξεις του mtDNA, 16 μοιράστηκαν ανάμεσα M1-M5, όπως στο Σχήμα 1).

Η

Η παρουσία του συχνή βλαστικής mtDNA παραλλαγές αλληλουχίας προτάθηκε ως δείκτης υψηλής ευαισθησίας γενετικό υπόβαθρο που μπορεί να διευκολύνει την ταυτόχρονη σωματική μετάλλαξη σε mtDNA και nDNA [14]. Ανίχνευση κλωνική αλληλουχίας βλαστικής παραλλαγές και ταυτόχρονη σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA σε όγκους και βλεννογόνο των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα υποστηρίζουμε σθεναρά αυτή την ιδέα.

Οι παθογόνοι μεταλλάξεις μιτοχονδριακού DNA μπορεί να αποτελεί ένδειξη για τη λειτουργική συμβολή τους στην εξέλιξη των όγκων. Μεταξύ των μεταλλάξεων mtDNA που παρατηρούνται σε αυτούς τους ασθενείς, η κωδικοποιητική G8836C (ATP6) μετάλλαξη πρόσφατα αναφερθεί σε ασθενείς με Leber κληρονομική οπτική νευροπάθεια (LHON) -όπως σύνδρομο και θυρεοειδούς [15] – [16]. Η διατήρηση μεταξύ των ειδών της παρούσας νουκλεοτιδίων είναι υψηλή και η μετάλλαξη αυτή έχει προβλεφθεί να είναι παθογόνα [15]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η μετάλλαξη αυτή mtDNA ανιχνεύθηκε σε 8/10 του βλεννογόνου βιοψίες και οι 3 όγκων που έχουν εξετασθεί από τους δύο ασθενείς που υποστηρίζουν μια λειτουργική συμβολή στην ογκογένεση. Ωστόσο, περαιτέρω λειτουργική ανάλυση είναι απαραίτητη για να σχεδιάσετε ένα πιο οριστικό συμπέρασμα. Μιτοχονδριακού DNA μετάλλαξη στη θέση νουκλεοτιδίου πανομοιότυπα μεταξύ διαφορετικών ασθενών πνεύμονα και καρκίνο του νεφρού έχουν αναφερθεί παλαιότερα [16]. Υπό το φως των παθογόνων /συμβάλλοντας μετάλλαξη μιτοχονδριακού DNA, μια συγκεκριμένη μετάλλαξη mtDNA φαίνεται να έχουν επιλεγεί σε διαφορετικούς τύπους όγκων. Κάναμε παρόμοια παρατήρηση στην παρούσα μελέτη και έτσι, εμφάνιση του παθογόνου G8836C και άλλες μεταλλάξεις ταυτόσημα mtDNA παρατηρήθηκε μεταξύ των διαφορετικών ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα είναι απίθανο να οφείλονται σε δείγμα μόλυνσης. Συγκεκριμένα, ο G8836C παθογόνος μετάλλαξη mtDNA ανιχνεύθηκαν σε LHON και καρκίνο του θυρεοειδούς [15] – [16] και συχνά στη μελέτη μας δείχνει για ένα λειτουργικό ρόλο στην πρόοδο του καρκίνου του πνεύμονα

Οι περισσότερες από αυτές τις μεταλλάξεις βρέθηκαν στο κωδικοποίησης. περιοχές του mtDNA που θα μπορούσε ενδεχομένως να οδηγήσει σε μια διαταραχή του αναπνευστικού συγκρότημα και να οδηγήσει σε αύξηση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις mtDNA οδηγήσει σε αύξηση των ROS και την προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [17] – [20]. Μία μελέτη έχει δείξει μια αύξηση του αριθμού αντιγράφων mtDNA σε ινοβλάστες πνεύμονα ως ένα πρώιμο συμβάν σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες [21]. Πρόσφατα, μια αύξηση στην περιεκτικότητα mtDNA ταυτίστηκε με τη γήρανση και τις συναφείς κάπνισμα πνεύμονα ιστών και πρωτογενείς κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματα [22] – [23]. Ιστολογικά αρνητική βλεννογόνου βιοψίες, καθώς οι όγκοι των δύο ασθενείς εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα της περιεκτικότητας μιτοχονδριακού DNA. Έτσι, φαίνεται ότι με την εξέλιξη της ομοπλασμικά μετάλλαξης mtDNA και κλωνική εξάπλωση, το περιεχόμενο του mtDNA αυξάνεται επίσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι μερικές μεταλλάξεις (συμπεριλαμβανομένων των

G8836C

) ήταν ίδιες και στις δύο ασθενείς που ήταν τακτικοί καπνιστές, γεγονός που υποδηλώνει τα αποτελέσματα των κοινών στόχων από καρκινογόνες ουσίες του καπνού στο mtDNA. Η υψηλή συχνότητα των mtDNA μεταλλάξεις μεταξύ των καπνιστών προτείνει επίσης καθοριστικό ρόλο για τις αρχές του μιτοχονδριακού γενετικού αλλαγές στην εξέλιξη των όγκων τους.

Στην παρούσα μελέτη, κλωνική εξέλιξη των ιστολογικά κανονική εμφάνιση του αναπνευστικού βλεννογόνου σε όγκο ήταν ανιχνεύσιμα μέσω mtDNA μεταλλάξεις. Αυτή είναι η πιο οριστική μελέτη για να αποδείξει ότι οι 2 όγκοι στα απέναντι θέσεις σε έναν ασθενή (ασθενής 1) έχουν κλωνική σχέση. Ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να εξετάσουμε περισσότερο την παρακολούθηση των ασθενών λόγω της έλλειψης των βιολογικών δειγμάτων. Τεκμηρίωση αυτών των εκτεταμένων κλωνικών πληθυσμών με μεταλλάξεις μιτοχονδριακού DNA ρίχνει φως στις προκλήσεις των προσεγγίσεων έγκαιρης ανίχνευσης. Επιπλέον, στόχευση αυτών των μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA μπορεί να είναι χρήσιμη με βάση την μοριακή ανίχνευση στα πτύελα και το DNA του αίματος στις προσεγγίσεις χημειοπροφύλαξη και νέες βιολογικές θεραπευτικής. Περαιτέρω λειτουργική ανάλυση των κοινών μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA θα μας επιτρέψει να κατανοήσουμε καλύτερα το συγκεκριμένο ρόλο τους στην εξέλιξη του καρκίνου και χημειοαντίσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών ιστορίας και του πνεύμονα δείγματα

τρεις ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα συνέχεια εξετάστηκαν για μετάλλαξη του mtDNA με υπογράφεται ενημερωμένη συγκατάθεση σε ένα Johns Hopkins IRB εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Ασθενής 1 ήταν μια 75χρονη γυναίκα η οποία υπέστη μια δεξιά άνω λοβεκτομή το 2002 για ένα στάδιο ΙΙΒ κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (T3N0MX). Το 2004, υποβλήθηκε σε αριστερό κάτω λοβεκτομή για ένα δεύτερο στάδιο ΙΙΒ (T2N0MX) καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων. Ο ασθενής 2 ήταν ένας 58χρονος άνδρας, ο οποίος το 2005 υπέστη μια δεξιά άνω λοβεκτομή για ένα στάδιο ΙΑ (T1N0MX) μετρίως διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Και οι δύο ασθενείς ήταν τακτικοί καπνιστές για περισσότερο από 10 χρόνια. Ασθενής 3 ήταν 48 ετών θηλυκό που υποβλήθηκαν σε μια δεξιά άνω λοβεκτομή για ένα στάδιο καρκίνωμα ΙΑ (T1N0MX) βρογχιολοκυψελιδικό. Αυτός ο ασθενής ήταν ένας μη καπνιστής. Κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, βιοψίες βλεννογόνου των αεραγωγών ελήφθησαν από περιοχές ύποπτες για ήπια έως μέτρια έως σοβαρή δυσπλασία ή καρκίνωμα in situ (CIS) με βάση Auto-φθορισμού-βρογχοσκόπηση (Κ.Υ. και J. Β). Όλα τα δείγματα βιοψίας ελήφθησαν ταυτόχρονα. Βιοψίες ιστολογικά αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο του πνεύμονα (W.H.W). Τα χειρουργικά όγκοι του πνεύμονα ελήφθησαν επίσης από κάθε ασθενή. Ως μάρτυρας, συμφωνημένα κανονική λεμφαδένα χωρίς όγκο χρησιμοποιήθηκε σε κάθε περίπτωση. Επιπλέον, μπορούμε επίσης η αλληλουχία συμφωνημένα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών από 8 άλλους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας 4).

Η

μιτοχονδριακού ολόκληρο ενίσχυση γονιδιώματος και αλληλούχιση

Γονιδιωματικό ϋΝΑ εξήχθη σύμφωνα με μας πρότυπο πρωτόκολλο από το μικροδιατομή καρκινικούς ιστούς και άλλα δείγματα [5]. Εμείς ενισχυμένο ολόκληρο το μιτοχονδριακό γενωμικό DNA από 10 ng γονιδιωματικού εκμαγείου DNA χρησιμοποιώντας REPLI-g kit μιτοχονδριακό ενίσχυση DNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή όπως περιγράφεται προηγουμένως [8]. Το ενισχυμένο DNA κατόπιν καθαρίζεται χρησιμοποιώντας κιτ DNA MINIAMP καθαρισμού (Qiagen, Valencia). Εξετάσαμε την καθαρότητα του ενισχυμένου mtDNA και πυρηνικού DNA μόλυνση με ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας εκκινητή ειδικό για μιτοχόνδρια κωδικοποιείται COXI /COXII και πυρηνικά κωδικοποιημένα β-ακτίνης. Τέσσερις έως πεντακόσια νανογραμμάρια του καθαρισμένου μιτοχονδριακού DNA χρησιμοποιήθηκε για αλληλούχιση στην πλατφόρμα Affymetrix MitochipV2.0 [5], [8].

Mitochip v2.0 ανάλυση της σειράς αλληλουχίας

Πραγματοποιήσαμε κατακερματισμού, επισήμανση και Chip υβριδισμού του mtDNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο Affymetrix με κατάλληλους ελέγχους, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5], [8]. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Affymetrix GSEQ και η Αναθεωρημένη Cambridge ακολουθία αναφοράς (RCRS) χρησιμοποιήθηκε ως αλληλουχία αναφοράς [24]. Το λογισμικό MitoAnalyzer χρησιμοποιήθηκε επίσης για την επαλήθευση των μεταλλάξεων mtDNA σε διαφορετικές θέσεις νουκλεοτιδίων όπως περιγράφηκε νωρίτερα [5], [8] .Somatic μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν ως μεταβολές ζευγών βάσεων σε mtDNA σε σύγκριση με την κανονική αλληλουχία mtDNA βρέθηκαν σε λεμφαδένες χωρίς όγκου. μεταλλάξεις γραμμή Germ ταυτοποιήθηκαν ως μεταβολές ζευγών βάσεων που υπάρχουν στα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα, καθώς και καρκινικούς ιστούς και /ή τα δείγματα περιθώριο σε σύγκριση με την RCRS [14]. Μια παραλλαγή αλληλουχίας βλαστικής ορίστηκε ως νέα όταν απουσιάζει στο ανθρώπινο μιτοχονδριακό βάση δεδομένων και άλλες σχετικές μελέτες στο ίδιο απλοομάδων [14], [25]. Ακολουθία των παραλλαγών που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου χαρακτηρίζονται ως παθογόνα [14], [25]

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Για να εξετάσει το περιεχόμενο του mtDNA, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα ανίχνευσης. 7900HT ακολουθία (Applied Biosystems, Foster City, CA) για την ενίσχυση των πυρηνικών DNA (nDNA) που κωδικοποιείται β-ακτίνης και mtDNA που κωδικοποιείται κυτοχρώματος C οξειδάσης Ι (COI) χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA μήτρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Στατιστική ανάλυση

Φοιτητών

t-test

πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. τιμή Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι τιμές P παράγεται ήταν δύο όψεων.

Αποδόσεις αναλογία

Οι πιθανότητες των 20 τυχαίων πανομοιότυπες μεταλλάξεις του mtDNA που συμβαίνουν κατά τύχη σε δύο ξεχωριστές όγκους εντοπίζεται στα απέναντι στους πνεύμονες του ίδιου ασθενούς υπολογίστηκαν ως [ ,,,0],(μέγεθος γονιδιώματος) × (μεταλλάξεις)] × [(μέγεθος γονιδιώματος) × (μεταλλάξεις)], δηλαδή [16,499:1 × 20] × [16,499:1 × 20] = 6,9 × 10

10:01 [27].