Αφηρημένο

EGFR

μεταλλάξεις συσχετίζονται με βελτιωμένη κλινική έκβαση, ενώ

Οι KRAS

μεταλλάξεις που σχετίζονται με έλλειψη απόκρισης σε αναστολείς της τυροσινικής κινάσης σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνου (NSCLC). Ενδοβρογχικούς υπερήχων (EBUS) -transbronchial αναρρόφηση με βελόνα (ΤΒΝΑ) χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο στη διαχείριση των NSCLC. Συν-ενίσχυση σε χαμηλότερη θερμοκρασία μετουσίωσης (COLD)-πολυμεράσης αλυσιδωτή αντίδραση (PCR) (κρύο-PCR) είναι μια ευαίσθητη δοκιμασία για την ανίχνευση γενετικών μεταλλάξεων σε συμπαγείς όγκους. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τη σκοπιμότητα της χρήσης ΚΡΥΟ-PCR για την οθόνη για

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις σε κυτταρολογικά δείγματα που λαμβάνονται από EBUS-TBNA στην καθημερινή κλινική πρακτική. Τα δείγματα που λαμβάνονται από ασθενείς που υποβάλλονται σε NSCLC EBUS-TBNA αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τα πρότυπα των κλινικών πρωτοκόλλων μας. DNA που εξάγεται από τα δείγματα αυτά υποβλήθηκε σε COLD-PCR για την ενίσχυση εξόνια 18-21 του

EGFR

και εξώνια δύο και τρία του

KRAS

ακολουθείται από άμεση αλληλούχιση. ανάλυση μετάλλαξης διεξήχθη σε 131 από 132 (99,3%) των ασθενών με NSCLC (70F /62M) με επιβεβαιωμένη μεταστάσεις στους λεμφαδένες (94/132 (71,2%) αδενοκαρκίνωμα? 17/132 (12,8%) πλακωδών κυττάρων? 2/132 (0,15% ) μεγάλων κυττάρων νευροενδοκρινείς? 1/132 (0,07%) μεγάλο καρκίνωμα? 18/132 (13,6%) NSCL-δεν ορίζεται διαφορετικά (NOS)). Μοριακή ανάλυση όλων

EGFR

και

KRAS

αλληλουχίες στόχους επιτεύχθηκε σε 126 από 132 (95,5%) και 130 132 (98,4%) των περιπτώσεων αντίστοιχα.

EGFR

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 13 (10,5%) των πλήρως αξιολογηθεί περιπτώσεις (11 στο αδενοκαρκίνωμα και δύο στον NSCLC-NOS), συμπεριλαμβανομένων δύο νέων μεταλλάξεων.

KRAS

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 23 (17,5%) των πλήρως αναλύθηκαν δείγματα των ασθενών (18 αδενοκαρκίνωμα και πέντε NSCLC-NOS). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι EBUS-TBNA των λεμφαδένων διεισδύσει με NSCLC μπορεί να παρέχει επαρκές υλικό όγκου για

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης στους περισσότερους ασθενείς, και ότι ΚΡΥΟ-PCR και αλληλούχιση είναι μια ισχυρή προβολή δοκιμασία για

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης σε αυτό το κλινικό πλαίσιο

Παράθεση:. Santis G, Angell R, Nickless G, Κουίν Α, Herbert Α, Cane P, et al. (2011) Έλεγχος για

EGFR

και

KRAS

Μεταλλάξεις σε Ενδοβρογχική υπερήχων Προέρχεται διαβρογχική Βελόνα αναρροφήματα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα με κρύο-PCR. PLoS ONE 6 (9): e25191. doi: 10.1371 /journal.pone.0025191

Συντάκτης: Melanie Königshoff, Περιεκτική Πνευμονολογίας Κέντρο, Γερμανία

Ελήφθη: 19, Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 29, Αύγ του 2011? Δημοσιεύθηκε: 19 Σεπτέμβρη του 2011

Copyright: © 2011 Santis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από τον Βιοτεχνολογίας και Βιολογικών Επιστημών Συμβούλιο Έρευνας (BBSRC? BB /G006911 /1 έως GS), από το Υπουργείο Υγείας, μέσω του Εθνικού Ινστιτούτου Ερευνών Υγείας ολοκληρωμένη βραβείο Βιοϊατρικής Κέντρο Ερευνών για την Εθνική Υπηρεσία Υγείας Guy και St Thomas ‘ Foundation Trust σε συνεργασία με το Βασιλικό Κολέγιο του Λονδίνου (σε GS & amp? JS), και από το Cancer Centre Δίκτυο Ιατρικής Πειραματική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέα ErbB, ένας ρυθμιστής κλειδί του πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων [1]. EGFR αποτελείται από μια εξωκυτταρική περιοχή, μία διαμεμβρανική περιοχή και κυτταροπλασματική καταλυτική περιοχή που περιλαμβάνει το πεδίο κινάσης τυροσίνης [1]. Η υπερβολική σηματοδότηση EGFR ανατρέπει την ισορροπία μεταξύ της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης συμβάλλουν στην ογκογένεση σε μια ευρεία ποικιλία στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [2]. Αυτό μπορεί να προκύψει από υπερέκφραση του EGFR, οι εταίροι της σηματοδότησης, ή δύο συνδετών του, EGF και ΤΟΡ-α [3], [4]. Συστατική ενεργοποίηση της δραστικότητας κινάσης τυροσίνης του EGFR μπορεί να επιφέρεται με σωματικές μεταλλάξεις στο πεδίο κινάσης τυροσίνης του EGFR [5], [6], [7]. Αναδρομικές και προοπτικές μελέτες σε ασθενείς με ασιατικές και ευρωπαϊκές με NSCLC έχουν δείξει ότι η παρουσία του

EGFR

μεταλλάξεις στα εξώνια 18-21 συσχετίζεται με την ανώτερη κλινική έκβαση σε αναστολείς gefitanib EGFR κινάσης τυροσίνης και erlotinib [8], [9] , [10]. Οι περισσότεροι NSCLC-ειδική

EGFR

μεταλλάξεις είναι είτε μια απλή υποκατάσταση αμινοξέος στο κωδικόνιο 858 (λευκίνη προς Argine? L858R), ή μεταλλάξεις διαγραφής στο εξώνιο 19 που επηρεάζουν το συντηρημένο μοτίβο LREA [11]. Οι μεταλλάξεις αυτές βρίσκονται σε μια μειοψηφία των Καυκάσιων ασθενών με NSCLC, αλλά όσο το 60% της Ανατολής Ασιάτες με αδενοκαρκίνωμα [8], [12], [13], [14]. Μια ξεχωριστή ομάδα του

EGFR

μεταλλάξεις που σχετίζονται με την πρωτογενή όσο και επίκτητη αντοχή στην erlotinib και gefitinib, και αυτά τα cluster στο εξόνιο 20 του

EGFR

γονίδιο [15], [16].

Μερικές NSCLC φιλοξενούν επίσης μεταλλάξεις στο Kirsten σάρκωμα αρουραίου ιικό ογκογονίδιο ομόλογο

(KRAS)

κωδικοποιεί μια ΘΤΡάσης κατάντη του EGFR [17], [18], [19]. Αυτές οι μεταλλάξεις συσσωρεύονται στο εξόνιο δύο από

KRAS

, εμφανίζονται σε 15-30% των μη επιλεγμένων NSCLC [20], και φαίνεται να είναι αμοιβαία αποκλειόμενα στο

EGFR

μεταλλάξεις σε NSCLC [21]. Έχει προταθεί ότι οι μεταλλάξεις στο

KRAS

σχετίζονται με

de novo

αντίσταση στην gefitinib και erlotinib [21]. Σε αντίθεση με

EGFR

μεταλλάξεις, οι οποίες αποτελούν ένα θετικό προγνωστικό παράγοντα,

KRAS

μεταλλάξεις σε εκτομή NSCLC συσχετίστηκαν με μικρότερη συνολική επιβίωση από αυτούς με

EGFR

μεταλλάξεις [17], [ ,,,0],18], [19]. Στο σύνολό τους τα τρέχοντα στοιχεία δείχνουν ότι

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις καθορίζουν διακριτές υποομάδες ασθενών με NSCLC, με διαφορετικές απαντήσεις σε EGFR- στοχευμένες θεραπείες.

Οι περισσότεροι ασθενείς με ΜΜΚΠ παρούσα σε προχωρημένο στάδιο και παθολογική διάγνωση γίνεται συχνά από μικρές βρογχοσκόπηση, διαθωρακική πυρήνα βιοψίες ή κυτταρολογικά δείγματα. Οι περισσότερες αναλύσεις γενετική μετάλλαξη βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για ενίσχυση αλληλουχιών στόχου. Σε αντίθεση με πρότυπο PCR, συν-ενίσχυσης σε χαμηλότερη θερμοκρασία μετουσίωσης-PCR (COLD-PCR) κατά προτίμηση ενισχύει μεταλλαγμένες αλληλουχίες και επομένως αυξάνει την ευαισθησία ανίχνευσης γενετικών μεταλλάξεων [22]. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την ανάλυση της παρουσίας γενετικών μεταλλάξεων σε στερεά καρκινικούς ιστούς, όπου τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αναμιχθούν με στρωματικά και άλλα μη κακοήθη ιστό. Δεδομένου ότι περιγράφηκε για πρώτη φορά, COLD-PCR έχει αποδειχθεί ότι είναι ανώτερη από τις συμβατικές PCR σε μια σειρά από εφαρμογές που έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε μικτά δείγματα [22], [23], [24], [25].

Ενδοβρογχική υπερήχων (EBUS) -transbronchial αναρρόφηση με βελόνα (ΤΒΝΑ) είναι μια πρόσφατα ανεπτυγμένη τεχνική που επιτρέπει στους υπερήχους καθοδηγούμενη αναρρόφηση του μεσοθωρακίου και πυλαία λεμφαδένες και μάζες. Αύξηση των δεδομένων υποστηρίζει τη χρήση της στη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα και στάσης ως εναλλακτική λύση στην mediastinoscopy [26], [27], [28], [29], [30], ωστόσο υπάρχουν ανησυχίες ότι αυτές οι μικρές κυτταρολογικά δείγματα ενδέχεται να αποδειχθούν ανεπαρκείς υλικό όγκου για μοριακή διάγνωση, μια περιοχή της όλο και μεγαλύτερη σημασία στη διαχείριση NSCLC. Αυτό αντανακλάται σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη δήλωση συναίνεσης για

EGFR

δοκιμές μετάλλαξης η οποία συνιστά ότι τα δείγματα βιοψίας ιστού πρέπει να χρησιμοποιείται κατά προτίμηση σε κυτταρολογικά δείγματα όποτε είναι δυνατόν, έως ότου περαιτέρω έρευνα καθορίζει την αξιοπιστία των μεταλλάξεων των δεδομένων που λαμβάνονται από κυτταρολογικά δείγματα [ ,,,0],31]. Εδώ έχουμε αντιμετωπίσει το θέμα αυτό με διαλογή για

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις σε 193 EBUS-TBNA δείγματα που προέρχονται κυτταρολογική εξέταση από μεταστατικούς λεμφαδένες σε 132 ασθενείς με ΜΜΚΠ στην καθημερινή κλινική πρακτική χρησιμοποιώντας μια απλή δοκιμασία που βασίζεται στις αρχές του κρύου-PCR και άμεση αλληλούχιση.

Αποτελέσματα

EBUS-TBNA

Η

132 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με NSCLC χρήση EBUS-TBNA μεταξύ Μαΐου 2009 και τον Φεβρουάριο του 2011 (125 Καυκάσιος, τέσσερις ασιατικές και τρεις Βρετανοί Μαύρο) συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη αυτή. Όλοι οι ασθενείς (n = 65) με NSCLC, ανεξαρτήτως των ιστολογικών υπο-τύπου μεταξύ του Μαΐου 2009 και Φεβρουαρίου 2010 είχαν συμπεριληφθεί σε αυτή τη μελέτη. Οι υπόλοιποι 67 ασθενείς (Μάρτιος 2010 – Φεβρουάριος 2011) αντιπροσωπεύουν διαδοχικούς ασθενείς με NSCLC, μη πλακώδους υπο-τύπου. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και το στάδιο της νόσου που φαίνονται στον Πίνακα 1. Καμία από τις ασθενείς είχαν λάβει αγωγή πριν από τη διαδικασία. Ελήφθησαν αναρροφήματα από 193 λεμφαδένες από τους σταθμούς δύο έως 11 (διάμετρος μικρού άξονα ήταν 1,2 +/- 0,5 cm) σε 132 ασθενείς (Πίνακας 1). Ο διάμεσος αριθμός των περασμάτων ανά σταθμό λεμφαδένα ήταν 4.6 (εύρος: 1-10)? Αυτό είναι παρόμοιο με το μέσο αριθμό των περασμάτων ανά σταθμό των λεμφαδένων (3,8) που ελήφθη στο 972 ασθενείς διερευνήθηκαν στο κέντρο μας με EBUS-TBNA μεταξύ Φεβρουαρίου 2008 και Φεβρουαρίου 2011 (αδημοσίευτες παρατηρήσεις).

Η

Μορφολογικά διάγνωση και immunoprofile

η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε με επιτυχία σε 131 από 132 ασθενείς. Ανεπαρκείς υλικό ήταν διαθέσιμο από έναν ασθενή. Ιστολογικός τύπος προσδιορίστηκε με συνδυασμό μορφολογία (κυτταρολογικές slides και τα τμήματα cellblock) και ανοσοϊστοχημικές προφίλ. Στην περίπτωση του αδενοκαρκινώματος, διάγνωση υποστηρίχθηκε από την έκφραση του tTF-1, CK7 ή BerEP4 και αρνητικότητα για CK5 και ρ63. Cytomorphology και έκφραση CK5 και p63 ευνοούνται πλακώδες καρκίνωμα διάγνωση, ενώ η έκφραση των δεικτών neuroendocine (CD56, χρωμογρανίνη και συναπτοφυσίνη) και την κατάλληλη μορφολογία καθιέρωσε την διάγνωση των μεγάλων καρκίνωμα νευροενδοκρινείς. Μη διαφοροποιημένα NSCLC με μορφολογία που στερούνταν επίσης έκφραση δεικτών διαφοροποίησης CK5, CK7, CD56, TTF-1, p63, BerEP4 οδήγησε στη διάγνωση του NSCLC που δεν ορίζεται διαφορετικά (NSCLC-NOS). Με βάση αυτά τα κριτήρια, 94 από τους 132 ασθενείς (71,2%) είχαν διαγνωστεί με αδενοκαρκίνωμα, 17 (12,8%) με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, δύο με καρκίνωμα μεγάλο νευροενδοκρινών κυττάρων (0.15%), το ένα με καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (0,07%), και 18 (13,6%) με NSCLC-NOS (Πίνακας 1).

Μετάλλαξη Ανάλυση

Το πρωτόκολλο COLD-PCR και αλληλούχιση έχει βελτιστοποιηθεί για την ενίσχυση και την αλληλουχία εξώνια 18 έως 21 του

EGFR

και κωδικόνια 12, 13 και 61 του

KRAS

με σκοπό τον εντοπισμό

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξης με ευαισθησία της τάξης του 5-10% (συχνότητες μετάλλαξης του 10% εντοπίστηκαν σε όλα τα κρύα-PCR τρέχει, ενώ οι συχνότητες μετάλλαξη του 5% εντοπίστηκαν σε δύο από κάθε τρία τρεξίματα) σε σύγκριση με την ευαισθησία μετάλλαξη του 30% για το πρωτόκολλο πρότυπο-PCR μας.

Ένα από τα 132 δείγματα απέτυχαν να ενισχύσουν το DNA στόχο και, ως εκ τούτου

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης διεξήχθη σε 131 από 132 δείγματα (99,3%). Το δείγμα των ασθενών που απέτυχαν ενίσχυση του DNA περιείχε μόνο 100 κύτταρα /ενότητα [32]. Το πρωτόκολλο COLD-PCR ενισχυμένο με επιτυχία εξώνια 18-21 σε 126 από 131 ασθενείς (95,5%), στους οποίους το DNA ήταν διαθέσιμο. Η ενίσχυση του εξωνίου 21 απέτυχε σε τρεις δείγματα ασθενών (δύο αδενοκαρκινώματα και ένα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων)? ένα από αυτά τα δείγματα επίσης απέτυχε ενίσχυση του εξωνίου 20. Δύο επιπλέον δείγματα ασθενών απέτυχε ενίσχυση του εξωνίου 18. Sequencing ήταν επιτυχής για όλα τα ενισχυμένων αλληλουχιών? Ως εκ τούτου, πλήρη μοριακή ανάλυση των τεσσάρων

EGFR

εξώνια στόχος ήταν διαθέσιμα σε 126 από τους 132 ασθενείς (95,4%) και τη μερική μοριακή ανάλυση σε 131 από 132 ασθενείς που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη αυτή (99%).

χρησιμοποιώντας κρύο-PCR ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει

EGFR

μεταλλάξεις σε 13 από τους 126 ασθενείς (10,3%), στους οποίους η πλήρης μοριακή ανάλυση ήταν διαθέσιμη (Πίνακας 2). Ένα δείγμα ασθενούς περιείχε δύο εξόνιο 21 μεταλλάξεις (Πίνακας 3). Επαναλαμβάνοντας το κρύο-PCR και το πρωτόκολλο αλληλουχίας από μια δεύτερη cellblock επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα όλες τις μεταλλάξεις. Μεταλλάξεις βρέθηκαν σχεδόν αποκλειστικά σε αδενοκαρκίνωμα υπο-τύπου (11 από 13? 85%? P & lt? 0.001). Ένα μεγάλο διαγραφή εντός πλαισίου στο εξόνιο 19 και η μετάλλαξη L858R ανιχνεύθηκαν σε δύο ασθενείς με NSCLC-NOS. Όχι

EGFR

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 17 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα μεταξύ Μαΐου 2009 και Φεβρουάριος 2010? ανάλυση μετάλλαξης στη συνέχεια εκτελούνται μόνο σε ασθενείς με διάγνωση NSCLC μη πλακώδους ιστολογία.

EGFR

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 11 από 89 (12,3%) αδενοκαρκινώματα και 13 110 (12%) μη πλακώδη ιστολογία. Η μετάλλαξη L858R αντιπροσώπευαν τέσσερις από 13 (31%). Ταυτοποιήσαμε μόνο μια διαγραφή εντός πλαισίου στο εξόνιο 19 (Δ2481-2495) (Πίνακας 3). Εμείς εντοπίστηκαν επίσης δύο νέους

EGFR

μεταλλάξεις? και οι δύο ήταν απλές υποκαταστάσεις αμινοξέων, το ένα στο εξόνιο 19 (V760M) και ένα άλλο στο εξόνιο 20 (H805L). Υπήρχε ένα πολύπλοκο μετάλλαξη (L833V + L858R). Υπάρχει η πιθανότητα ότι οι νέες μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε αυτή τη μελέτη είναι υλικά? αυτό έχει συνδεθεί με PCR με φορμαλίνη-embedded ιστό [33], [34]. Επιπλέον, COLD-PCR, καθώς και ένα πρωτόκολλο πρότυπο-PCR είναι ευαίσθητη σε σφάλματα πολυμεράσης που προκαλείται. Στη μελέτη μας AmpliTaq Gold χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει αλληλουχίες στόχους, σε αντίθεση με υψηλής πιστότητας πολυμεράση Taq χρησιμοποιείται από Li

et al.

[22], [23], [24] Χρησιμοποιώντας υψηλής πιστότητας Taq πολυμεράση θα μπορούσε να αποφύγει την δυνατότητα PCR εμπλουτισμού των σφαλμάτων PCR. Ωστόσο, είναι απίθανο ότι τα νέα μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε μελέτη μας οφείλονται σε σφάλματα COLD-PCR, όπως όλες οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν σε ξεχωριστές αντιδράσεις και δεν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε DNA άγριου τύπου που χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος σε όλες τις αντιδράσεις. Αυτό δείχνουν θα επίσης ότι AmpliTaq Gold δεν εμπλουτίζουν αμπλικόνια με τεχνητό μεταλλάξεις.

Η

Εντοπίσαμε επίσης τη λιγότερο συχνή

EGFR

μεταλλάξεις G719A, P733S, L747P και L861Q. Ένα άλλο ασυνήθιστο μετάλλαξη (L833V) βρέθηκε μαζί με μετάλλαξη L858R. MassArray (Sequenom Inc) και Scorpion ενισχύθηκε πυρίμαχο σύστημα μετάλλαξη (SARMS) (DSX

EGFR

PCR kit ανάλυση μετάλλαξης? QIAGEN). Τεχνολογίες δεν θα ανιχνεύονται μεταλλάξεις P733S, L747P, V760M, H805L και L833V

KRAS

ανάλυση μεταλλάξεων ήταν επιτυχής σε 130 από 132 όγκους (98,4%). Ένα δείγμα που έδωσε uninformative ακολουθία παρέλειψε, επίσης,

EGFR

ανάλυση μετάλλαξης λόγω της σπανιότητας των υλικών όγκου. απλές υποκαταστάσεις αμινοξέων που περιλαμβάνει κωδικόνια 12, 13 και 61 του

KRAS

εντοπίστηκαν σε 23 από 130 NSCLC (17,7%) συνολικά (18 από 93 αδενοκαρκινώματα (19%) και πέντε από 18 NSCLC-NOS (27,7% )) (Πίνακας 3). Κανένας βρέθηκαν σε ασθενείς με όγκους πλακωδών κυττάρων ή σε ασθενείς οι οποίοι φέρουν

EGFR

μεταλλάξεις.

Οι προηγούμενες μελέτες και τα δικά πειράματα επικύρωσης μας δείξει αυξημένη ευαισθησία του κρύου-PCR σε σύγκριση με πρότυπα πρωτόκολλα PCR [22 ], [23], [24], [25], [35]. Εδώ πραγματοποιήσαμε επίσης μια περιορισμένη σύγκριση της ικανότητας του κρύου-PCR για την ανίχνευση

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις σε 25 EBUS που προέρχονται από αναρροφήσεις αδενοκαρκίνωμα κυτταρολογική με εκείνη του προτύπου-PCR. Αυτά τα δείγματα αναλύθηκαν επίσης παράλληλα με ψυχρή-PCR και SARMS (κιτ DxS EGFR PCR, QIAGEN) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Βρήκαμε πρότυπο-PCR και μετέπειτα αλληλούχιση ανιχνεύονται όλα τα

EGFR

μεταλλάξεις που είχαν εντοπιστεί από το κρύο-PCR (L858R, Δ2481-2495 και H805L). Η κορυφή μετάλλαξη ήταν πιο σαφώς ορατή μετά την ενίσχυση COLD-PCR, όπως φαίνεται για την μετάλλαξη L858R (Σχήμα 1Α). Πρότυπο-PCR απέτυχε να ανιχνεύσει το

KRAS

G12C μετάλλαξη (Εικόνα 1Β). Αυτή η διαφορά στην ανίχνευση μετάλλαξης μεταξύ ΚΡΥΟ-PCR και πρότυπο PCR δεν ήταν σημαντική (p = 0,5). Χρησιμοποιώντας SARMS, βρήκαμε κανένα πρόσθετο

EGFR

μεταλλάξεις μεταξύ αυτών EBUS που προέρχονται από αναρροφήσεις αδενοκαρκίνωμα. SARMS επιβεβαίωσε επίσης την μετάλλαξη L858R που είχαν αρχικά εντοπιστεί από το κρύο-PCR.

Ανάλυση ακολουθίας electrogramme της συγκριτικής ανάλυσης των COLD-PCR και ενίσχυση πρότυπο-PCR του

EGFR

εξόνιο 19 και

KRAS

εξώνιο 2. Α: άνω και κάτω φύλλα είναι κρύο και τυπική PCR ενίσχυση εξόνιο 21 του

EGFR

από EBUS που προέρχονται από αναρροφήσεις από λεμφαδένες διεισδύσει με μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, αντίστοιχα. Μια αντικατάσταση δείχνει θυμιδίνης (Τ) με κυτοσίνη (C) στο εξόνιο 21 του

EGFR

για να δημιουργήσει μετάλλαξη L858R που είναι εμφανής στην αντίδραση COLD-PCR ενίσχυση (βέλος) καθώς και το πρότυπο αντίδραση PCR. Η κορυφή μετάλλαξη είναι πιο ευδιάκριτη στο κρύο-PCR (άνω πάνελ) σε σύγκριση με την αντίδραση πρότυπο-PCR (κάτω πίνακας). Β άνω και κάτω φύλλα είναι κρύο και τυπική ενίσχυση PCR του

KRAS

εξώνιο 2. Το άνω πάνελ δείχνει την υποκατάσταση γουανίνης (C) από θυμιδίνης (Τ) για τη δημιουργία G12C μετάλλαξη που εντοπίστηκε από την ενίσχυση ΚΡΥΑ-PCR ( βέλος). Η μετάλλαξη δεν ήταν εμφανές στην αντίδραση πρότυπο-PCR (κάτω πάνελ).

Η

Συζήτηση

Εδώ θα υποβάλει έκθεση σχετικά με τη σκοπιμότητα της χρήσης ΚΡΥΟ-PCR για την οθόνη για

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις σε 132 ασθενείς που είχαν δειγματοληψία από EBUS-TBNA σύμφωνα με τα πρότυπα των κλινικών πρωτοκόλλων μας. Αυτό αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο κοόρτη των ασθενών αυτών που αναφέρθηκαν. Έχουμε αποδείξει την πλήρη αξιολόγηση της εξώνια 18 έως 21 στο 95,5% των

EGFR

και εξώνια δύο και τρία στο 98,4% των

KRAS

μεταξύ EBUS-TBNA αναρροφήσεις. Τα αποτελέσματά μας συγκρίνονται ευνοϊκά με τρεις προηγούμενες μελέτες που προβλήθηκε EBUS που προέρχονται από αναρροφήσεις για

EGFR

μεταλλάξεις. Γκαρσία-Olive

et al

και Nakajima

et al

αναλύονται με επιτυχία εξώνια 19 και 21 του

EGFR

στο 72% (26/36) και 93% (43/46 ) των δειγμάτων των ασθενών, αντίστοιχα [36], [37]. Schuurbier

et al

αναλύονται με επιτυχία 77% όλων των δειγμάτων με πρότυπες PCR και αλληλούχιση του εξόνια 18-21 του

EGFR

[38]. Εμείς δειγματοληψία σε γενικές γραμμές παρόμοιο μεγέθους των λεμφαδένων όπως αυτές αξιολογούνται στις άλλες τρεις μελέτες και εκτελείται ένα διάμεσο 4,5 περάσματα ανά λεμφαδένα δείγμα? Ο αριθμός των περασμάτων είναι παρόμοιο με τα τρία-προς-τέσσερα περάσματα ανά κόμβο συμβουλεύονται να τεκμηριωθεί η διάγνωση της κακοήθειας [28], [30]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα από αυτό και προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι EBUS-TBNA μπορεί να παρέχει επαρκές υλικό όγκου για

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης στην καθημερινή κλινική πρακτική αποφεύγοντας έτσι την ανάγκη για πιο επεμβατικές χειρουργικές δειγματοληψίας σε αυτές ασθενών.

υπάρχουν επί του παρόντος μια σειρά από μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί για την οθόνη για

EGFR

μεταλλάξεις σε δείγματα NSCLC όπου μεταλλαγμένο DNA αντιπροσωπεύει μόνο ένα κλάσμα του συνολικού καθαρισμένου DNA [7]. Ορισμένες δοκιμασίες όπως SARMS και οθόνη MassArray για συγκεκριμένες μεταλλάξεις με ευαισθησίες 1% και 10% αντίστοιχα. Άλλες στρατηγικές που βασίζονται σε τεχνικές όπως η υψηλή τήξης ανάλυση και τη μετουσίωση της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης εντοπίσετε τις περισσότερες μεταλλάξεις χωρίς να προσδιορίζει την αντικατάσταση ακριβή αμινοξύ [7]. Σε ορισμένες μελέτες, μικροανατομή του DNA όγκου από δείγματα ιστού διεξήχθη πριν από την ενίσχυση του DNA [39]. Σήμερα δεν υπάρχει γενική συμφωνία για το ποια από αυτά αποτελεί την καλύτερη μέθοδο για την ανάλυση μετάλλαξης σε NSCLC [31]. Ωστόσο, οι στρατηγικές που βασίζονται στην ενίσχυση του DNA και την άμεση αλληλούχιση είναι η πιο ολοκληρωμένη, δεδομένου ότι μπορούν οθόνη, όχι μόνο για τους γνωστούς αλλά και νέες μεταλλάξεις. Συνιστάται ότι τουλάχιστον το 30% καρκινικά κύτταρα πρέπει να είναι παρόντες με περισσότερο από 10% μεταλλαγμένο DNA για την αποτελεσματική διαλογή μετάλλαξη εξαρτώνται από πρότυπα πρωτόκολλα PCR και αλληλούχιση [7].

Η δοκιμασία COLD-PCR που χρησιμοποιούνται σε αυτό μελέτη ανιχνεύεται

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις που υπάρχουν στο DNA του όγκου που περιλαμβάνει τόσο λίγο όσο 5-10% του συνολικού δείγματος DNA. Είναι πιθανό ότι, με την χρησιμοποίηση ενός ενιαίου κρίσιμη θερμοκρασία μετουσίωσης ΚΡΥΟ-PCR για ορισμένες από τις αμπλικονίων δοκιμάστηκαν υπάρχει ουσιαστική εμπλουτισμού (όπως δεικνύει η Εικ. 1 δείχνει), ενώ για τους άλλους υπάρχει μικρή ή καθόλου εμπλουτισμός. Η ευαισθησία έτσι ορίζεται ψυχρού-PCR δοκιμασία μας θα μπορούσε, ως εκ τούτου βελτιώθηκαν περαιτέρω για την ανίχνευση συχνότητες μετάλλαξης μικρότερη από 5% είχε αναπτύξαμε ένα amplicon-ειδική δοκιμασία χρησιμοποιώντας τη βέλτιστη ανόπτησης ετεροδιπλό και μετουσίωσης θερμοκρασίες για κάθε αμπλικόνιο. Ευαισθησία θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω με τη χρήση πιο ευαίσθητη αμπλικονίου ειδικές δοκιμασίες ΚΡΥΟ-PCR, όπως αυτή που περιγράφεται από Galbiati

et al

[40], ή η βελτιωμένη και Ολοκλήρωση Εμπλουτισμός-ΚΡΥΟ-PCR (

πάγο

Ψυχρό-PCR) πλατφόρμα που μπορεί να ανιχνεύσει συχνότητες μετάλλαξης τόσο χαμηλά όσο 0,1%, [41]. Κατά την άποψή μας, ωστόσο, ότι χρησιμοποιώντας δοκιμασίες αμπλικονίου-ειδικών είναι απίθανο να είναι εφικτή για ρουτίνας διαγνωστική χρήση στην ανίχνευση πολλαπλών μεταλλάξεων και μπορεί καλύτερα να χρησιμοποιηθεί όταν το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου είναι χαμηλότερη από το κατώτατο όριο ευαισθησίας 5-10% της τρέχουσας δοκιμασίας μας. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε πρόσφατα ότι αυτό είναι ένα ασυνήθιστο κλινικό σενάριο [32]. Για παράδειγμα, βρήκαμε ότι η διάμεσος αριθμός των κυττάρων του όγκου σε EBUS προερχόμενα αναρροφήσεις λεμφαδένων ήταν 2,525 (εύρος 65 – 39800) και η διάμεση ποσοστό του όγκου ήταν 70% (εύρος 10-95%). Αυτή ήταν συγκρίσιμη με την απόδοση από βρογχοσκοπική βιοψίες και ανώτερη με την απόδοση από τον υπολογιστή τομογραφία καθοδηγούμενη βιοψίες βελόνα του περιφερικού πρωτογενών όγκων του πνεύμονα. Στην πραγματικότητα, το ποσοστό περιεκτικότητας όγκου σε όλους τους τύπους δείγματος που μελετήθηκε ήταν 5% ή υψηλότερο [32]. Όπως κλινικά δείγματα προερχόμενα EBUS μπορεί να αποτελείται από καρκινικά κύτταρα λιγότερο από 30%, πρότυπο-PCR μπορεί να μην είναι αρκετά ευαίσθητες για την ανίχνευση επαρκώς ευαίσθητες για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε αυτά τα δείγματα. Προς υποστήριξη αυτού, μια περιορισμένη σύγκριση ΚΡΥΟ-PCR

vs

πρότυπο-PCR έδειξε ότι πρότυπο-PCR απέτυχε να ανιχνεύσει μία από τις τέσσερις μεταλλάξεις εντοπίστηκαν από το κρύο-PCR, η οποία έδειξε επίσης υψηλότερες κορυφές μετάλλαξη (Εικόνα 1Α & amp ? 1Β). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης αυξημένη ευαισθησία του κρύου-PCR σε σύγκριση με το πρότυπο PCR πρωτόκολλα [22], [23], [24], [25], [35]. Όπως COLD-PCR δεν έχει κανένα επιπλέον κόστος, είμαστε υπέρ της χρήσης του σε πρότυπο-PCR για την οθόνη για

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις σε αυτά τα κλινικά δείγματα.

Βρήκαμε ότι η συχνότητα των

EGFR

μεταλλάξεις σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και μη-πλακώδες NSCLC ήταν σε γενικές γραμμές σύμφωνα με τα αποτελέσματα από προηγούμενες δύο μεγάλες μελέτες σε ευρωπαϊκό ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα που βρέθηκαν

EGFR

μεταλλάξεις στο 10% και 16,6% των ασθενών, με το εξόνιο 19 διαγραφές που αντιπροσωπεύουν το 46% και το 62% του συνόλου

EGFR

μεταλλάξεις [12], [14]. Δύο από τις μεταλλάξεις (V760M και H805L) ανιχνεύθηκε σε ομάδα μας ασθενή ήταν μυθιστόρημα και δύο άλλοι (P733S, L747P) δεν θα είχαν ανιχνευθεί από SARMS (DX Quiagen) ή με MassArray δοκιμασίες (Sequenom Inc). Η διάκριση μυθιστόρημα

EGFR

μεταλλάξεις που είναι κλινικά σημαντικές από αυτές που είναι λειτουργικά σιωπηλές ή αντικείμενα είναι σαφώς σημαντικό, ιδιαίτερα η θεραπεία τόσο διαφορετικές απαντήσεις σε αναστολέας της τυροσινικής κινάσης του EGFR (TKI) των ασθενών με NSCLC υπόθαλψη ασυνήθιστο

EGFR

μεταλλάξεις πρόσφατα αναφερθεί [42]. Οι λιγότερο συχνές G719A και L861Q μεταλλάξεις που βρέθηκαν στην ομάδα μας ασθενή δείχθηκε ότι είναι ευαίσθητη στη θεραπεία EFFR ΤΚΙ και ως εκ τούτου είναι κλινικά σημαντικές [42]. Η μετάλλαξη L747P έχει συνδεθεί με την κακή ανταπόκριση στη θεραπεία με αναστολείς του EGFR ΤΚΙ, ενώ μία άλλη μετάλλαξη στο ίδιο κωδικόνιο (L747S) έχει συνδεθεί με την επίκτητη αντοχή στην ΤΚΙ θεραπεία. Το εξόνιο 20 παρεμβολές, όπως η 2319insertionGAC2320 βρέθηκαν σε ομάδα μας, συνδέονται επίσης με φτωχή ανταπόκριση στη θεραπεία EGFR ΤΚΙ [43]. Εντοπίσαμε επίσης μια μετάλλαξη δυάδα (L833V σε συνδυασμό με L858R). μεταλλάξεις διπλή αντιπροσώπευαν το 6% των

EGFR

μεταλλάξεις, με περίπου τα μισά από αυτά που συμβαίνουν σε πέντε κωδικόνια [44]. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ότι L833V σε συνδυασμό με την H835L εξόνιο 21 μετάλλαξη έχει συνδεθεί με την ευνοϊκή ανταπόκριση στο gefitinib [45]. Δεν έχουμε καμία πληροφορία σχετικά με την ανταπόκριση των H833V + L858R μετάλλαξη μας σε ΤΚΙ θεραπεία.

Βρήκαμε μόνο μία απαλοιφή στο εξώνιο 19 που αντιπροσώπευε το 7% του συνόλου

EGFR

μεταλλάξεις. Αυτό είναι σημαντικά χαμηλότερη (p & lt? 0,01) από τις συχνότητες 36% των

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφές στον NSCLC δείγματα πρωτογενούς όγκου που αναλύθηκαν από το κρύο-PCR και άμεση αλληλούχιση των εξώνια 18-21 στο θεσμικό μας όργανο (αδημοσίευτη). Η παρατήρηση αυτή εγείρει την πιθανότητα ότι το εξώνιο 19 διαγραφές μπορεί να υποεκπροσωπούνται σε μεταστατικούς λεμφαδένες σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους. Πάρκο

et al

αναφερθεί ασυμφωνία μεταξύ του πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων λεμφαδένων στο NSCLC ιδιαίτερα για μεταλλάξεις στο εξόνιο 19 [46]. Επιπλέον, η Nakajima

et al

ανέφεραν μόνο ένα εξόνιο 19 απαλοιφή μεταξύ 11 (9,9%)

EGFR

μεταλλάξεις σε 43 EBUS-TBNA αδενοκαρκινώματα μεταστατικό πνεύμονα στην Ανατολική-Ασιάτες ασθενείς [37], ενώ σε πρωτογενή αδενοκαρκινώματα πνεύμονα εξώνιο 19 διαγραφές αντιπροσωπεύουν όσο το 53% των μεταλλάξεων σε ασθενείς Ανατολικής Ασίας [47]. Απώλεια

EGFR

μεταλλάξεις στο μεταστατικό αδενοκαρκινώματα πνεύμονα σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους έχει επίσης αναφερθεί [48]. Οι μεγαλύτερες προοπτικές μελέτες που ταιριάζουν ανάλυση του πρωτογενούς όγκου και λεμφαδενικές μεταστάσεις που απαιτούνται για να αξιολογηθεί κατά πόσο

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφές, ή άλλες μεταλλάξεις, υποεκπροσωπούνται σε μεταστατικούς λεμφαδένες είτε κατά τη στιγμή της διάγνωσης ή στην ανταπόκριση στη θεραπεία.

σε αυτή τη μελέτη αξιολόγησε επίσης EBUS που προέρχονται από αναρροφήσεις βελόνα για

KRAS

μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας κρύο-PCR και βρήκε αυτά στο 19% των αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και το 27,7% των NSCLC-NOS. COLD-PCR είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι ενισχύει

KRAS

ευαισθησία ανίχνευσης μετάλλαξης σε σύγκριση με συνήθη PCR, σε μια ποικιλία κλινικών δειγμάτων [25]. Η συχνότητα των

KRAS

μεταλλάξεις στα δείγματα EBUS-TBNA αναλύονται σε αυτή τη μελέτη είναι σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν

KRAS

συχνότητα μετάλλαξης έως και 22%, κυρίως σε αδενοκαρκινώματα [20] είναι σημαντικό ότι,

KRAS

μεταλλάξεις σχετίζονται με την έλλειψη ανταπόκρισης στη θεραπεία με αναστολείς του EGFR στο ΜΜΚΠ [21]. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι με το συνδυασμό

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης σε ασθενείς NSCLC με μη-ιστολογία εκ πλακώδους επιθηλίου, οι αποφάσεις σχετικά με την καταλληλότητα της θεραπείας EGFR ΤΚΙ μπορεί να γίνει σε 27% των ομάδα μας ασθενή.

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι EBUS-TBNA των λεμφαδένων του μεσοθωρακίου διεισδύσει NSCLC μπορεί να παρέχει επαρκές υλικό όγκου για

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης στη μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών χωρίς την ανάγκη να καταφύγουμε σε πιο επεμβατικές χειρουργικές μεσοθωρακοσκόπηση. Μπορούμε επίσης να συμπεράνουμε ότι ΚΡΥΟ-PCR και πρωτόκολλα προσδιορισμού αλληλουχίας θα πρέπει να θεωρείται ως μια πιθανή δοκιμασία διαλογής για πολλαπλές

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης σε αυτό το κλινικό πλαίσιο. Η ικανότητα να ανιχνεύει μυθιστόρημα

EGFR

μεταλλάξεις, όπως δείξαμε στη μελέτη αυτή, μπορεί επίσης να αποδειχθεί χρήσιμη στον έλεγχο των κεκτημένων

EGFR

μεταλλάξεις αντίστασης, ένα ζήτημα των αναδυόμενων κλινικής σημασίας σε NSCLC. Serial δειγματοληψία και την αξιολόγηση του καρκινικού ιστού που λαμβάνονται ταυτόχρονα όλο και περισσότερο αναγνωρίζεται ως σημαντική στην κλινική χρήση των θεραπειών που στοχεύουν EGFR. EBUS-TBNA είναι μια ασφαλής και ελάχιστα επεμβατική τεχνική που είναι πιθανό να ισχύει κατ ‘εξοχήν σε αυτό το πλαίσιο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή ήταν μια μελέτη παρατήρησης που εκτελούνται σύμφωνα με τα πρότυπα των κλινικών πρωτοκόλλων μας. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν την έγγραφη συγκατάθεσή τους για να υποβληθούν σε EBUS-TBNA και για το υλικό του δείγματος που πρόκειται να αναλυθεί σύμφωνα με την εγκεκριμένη κλινική πρωτόκολλα. EBUS-TBNA εγκρίθηκε ως νέα δοκιμαζόμενα διαδικασία από τον Guy της & amp? Επιτροπή Κλινική Διακυβέρνηση St Thomas ‘Hospital και αποτελεί μέρος του προτύπου της φροντίδας των ασθενών με NSCLC. COLD-PCR είναι η εγκεκριμένη μέθοδος για

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης στο ίδρυμά μας.

EGFR

και

KRAS

ανάλυση μετάλλαξη είναι μέρος του προτύπου της φροντίδας των ασθενών με NSCLC στο ίδρυμα μας.

EBUS-TBNA

EBUS-TBNA εκτελέστηκε από δύο συμβούλους Πνευμονολογίας χρησιμοποιώντας ένα βρογχοσκόπιο με ενσωματωμένο γραμμικό καθετήρα υπερήχων (Όλυμπος 260F) και τον επεξεργαστή υπερήχων C200 σε 128 ασθενείς και το άλφα επεξεργαστή πέντε υπερήχων σε τέσσερις. Η διαδικασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ενσυνείδητη καταστολή. 22G βελόνα χρησιμοποιείται για την αναρρόφηση κάθε κόμβο. Ένα ξηραίνεται στον αέρα και μία αλκοόλη σταθερό συμβατικό επίχρισμα παρασκευάζεται από κάθε πέρασμα από μια βιοϊατρική επιστήμονας και βελόνα πλύσεις ξεπλύθηκαν με ισορροπημένο διάλυμα άλατος: Aqsia ™ (Bausch & amp? Lomb, Kingston-upon-Thames, Ηνωμένο Βασίλειο). Ξηραίνεται στον αέρα επιχρίσματα βάφτηκαν με Hemacolor ™ (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, Ηνωμένο Βασίλειο) για την άμεση εκτίμηση και διαφάνειες αλκοόλ σταθερό διατηρούνται για αργότερα χρώση Papanicoloau. Επί τόπου αξιολόγηση (ROSE) με μία κυτταροπαθολόγο σύμβουλος παρέχεται εκτίμηση σε πραγματικό χρόνο των αναρρόφησης και διαλογή των κυτταρικών εναιωρημάτων για cellblocks, κυτταρομετρία ροής ή μικροβιολογία όπως υπαγορεύεται από μικροσκοπία. Πολλαπλά αναρροφήσεις από μεμονωμένους κόμβους από κάθε κομβικό σταθμό ομαδοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Το ίδιο παθολογοανατόμος εξέτασε όλες τις διαφάνειες και τα επόμενα τμήματα cellblock, εξέδωσε μια διάγνωση και προωθούνται cellblocks στο εργαστήριο μοριακής παθολογίας για ανάλυση μετάλλαξης. Διαφάνειες και όλα cellblocks επίσης αναθεωρηθεί, σύμφωνα με τις τοπικές κλινικές οδηγίες μας, από πίνακα της θωρακικής ιστοπαθολόγους και κυτταροπαθολόγους. Τελική διάγνωση και το στάδιο της νόσου [49] συμφωνήθηκε μετά από συζήτηση στο Θώρακος Καρκίνοι διεπιστημονική σύσκεψη. Όλες οι διαδοχικοί ασθενείς που υποβάλλονται σε EBUS-TBNA μεταξύ Μαΐου 2009 και Φεβρουαρίου 2010, οι οποίοι είχαν διαγνωστεί με NSCLC ή οργανώθηκαν για τους γνωστούς τους NSCLC συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Μεταξύ Μαρτίου 2010 και το Φεβρουάριο του 2011 όλοι οι διαδοχικοί ασθενείς με μη-πλακώδες NSCLC αξιολογήθηκαν.

Μετάλλαξη Ανάλυση

Η επεξεργασία των δειγμάτων και προετοιμασία μπλοκ των κυττάρων για την εκχύλιση του DNA.

Τρεις 10 micron τμήματα από αυτές τις ενσωματωμένες σε παραφίνη cellblocks EBUS αποπαραφινοποιήθηκαν και DNA απομονώθηκε από τους ιστούς χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης Qiagen DNA με ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο. Εν συντομία, αφαιρείται η παραφίνη ιστοί αιωρήθηκαν σε 180 μ ρυθμιστικού διαλυτοποίησης ιστού και 70 μΙ πρωτεϊνάσης Κ ενζύμου και επωάζονται στους 56 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την προσθήκη 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης του DNA, το μίγμα επωάστηκε στους 70 ° C για 10 λεπτά ακολουθούμενη από 100 μΐ ισοπροπανόλης και φυγοκέντρηση στα 16 kg για 1 λεπτό για να εξαλειφθούν τα υπολείμματα ιστού. Η ποιότητα του DNA και την καταλληλότητά του για ενίσχυση PCR εκτιμήθηκε με κιτ DNA-ΟΚ PCR, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

COLD-PCR

COLD-PCR διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που επινοήθηκε από Li J

κ.ά.

[22] με μικρές τροποποιήσεις Πολλαπλά αρχικά τεμάχια (οκτώ-δέκα τοις amplicon) σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν για να ενισχύσουν εξόνια 18-21 του

EGFR

και κωδικόνια 12, 13 και 61 του

KRAS

. Μεταλλαγμένο DNA για κάθε ένα από τα αμπλικόνια-στόχος συντέθηκε και σειριακά αραιώνονται με DNA άγριου τύπου μέχρι τη μέγιστη αραίωση του 5% (μεταλλαγμένη σε άγριου τύπου DNA). αντιδράσεις Standard and COLD-PCR διεξήχθησαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας διαφορετικές ανόπτησης και μετουσίωσης θερμοκρασίες με κάθε ζεύγος εκκινητή. Το ετεροδιπλό θερμοκρασία σχηματισμού όφειλε να είναι σημαντικά υψηλότερη από τη θερμοκρασία ανόπτησης των εκκινητών να αποφευχθεί η πρόωρη επέκταση.