Αφηρημένο

Η ενεργοποίηση του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt έχει παρατηρηθεί σε τουλάχιστον 1 /3 του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC), καθώς και ένα σημαντικό αριθμό από αυτά έχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο β-κατενίνης. Ως εκ τούτου, η αποτελεσματική αναστολή αυτής της οδού θα μπορούσε να παρέχει μία νέα μέθοδο για τη θεραπεία της HCC. Η εσκεμμένο αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει αν FH535, η οποία προηγουμένως αποδείχθηκε ότι μπλοκάρουν την οδό β-κατενίνης, θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση β-κατενίνης των γονιδίων στόχων και την αναστολή του πολλαπλασιασμού του καρκίνου ήπατος βλαστικά κύτταρα (LCSC) και κυτταρικές σειρές HCC. Χρησιμοποιώντας β-κατενίνης γονίδια αποκρίνεται ρεπόρτερ, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι FH535 μπορεί να αναστέλλει την ενεργοποίηση του γονιδίου-στόχου από ενδογενείς και εξωγενώς εξέφρασαν β-κατενίνης, συμπεριλαμβανομένης της συστατικώς δραστική μορφή της β-κατενίνης που περιέχει μια μετάλλαξη Serine37Alanine. Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι ο πολλαπλασιασμός των LCSC και HCC γραμμές αναστέλλεται από FH535 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και ότι αυτό συσχετίζεται με μία μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση S. Τέλος, δείχνουμε επίσης ότι η έκφραση του δύο καλά χαρακτηρισμένα στόχους του β-κατενίνης, η κυκλίνη D1 και την Σουρβιβίνη, μειώνεται κατά FH535. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι FH535 έχει πιθανή θεραπευτική αξία στη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος. Είναι σημαντικό, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι αυτή η θεραπεία μπορεί να είναι αποτελεσματική σε διάφορα επίπεδα στοχεύοντας τόσο HCC και LCSC

Παράθεση:. Gedaly R, Galuppo R, Καθημερινή MF, Shah M, Maynard E, Chen C, et al. (2014) Στόχευση της Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης στον καρκίνο του ήπατος Βλαστοκύτταρα και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυτταρικών γραμμών με FH535. PLoS ONE 9 (6): e99272. doi: 10.1371 /journal.pone.0099272

Επιμέλεια: Zhiyuan Γκονγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 30 Οκτ, 2013? Αποδεκτές: 12 του Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούνη 2014

Copyright: © 2014 Gedaly et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα δημοσίευση υποστηρίχθηκε από τον αριθμό επιχορήγηση UL1RR033173 [ΤΕ1 RR033172, KL2 RR033171] από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων (NCRR), DK074816 (BTS) που χρηματοδοτείται από το Γραφείο του διευθυντή, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH), και υποστηρίζεται από το ΝΙΗ χάρτη πορείας Ιατρικής Έρευνας. Η έρευνα επίσης υποστηρίχθηκε από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και διαλογή κυττάρων κοινόχρηστο πόρο του Πανεπιστημίου του Κεντάκι Markey Κέντρο Καρκίνου (P30CA177558). Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις της NCRR και ΝΙΗ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), η πιο κοινή μορφή καρκίνου του ήπατος, είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η τρίτη κατά σειρά αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1] – [2]. Η ανησυχητική αύξηση του HCC επίπτωση στην Ευρώπη και τη Βόρεια Αμερική τα τελευταία χρόνια σχετίζεται κυρίως με λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C, αν και άλλοι παράγοντες, όπως η υπερβολική κατανάλωση αλκοόλ και η παχυσαρκία συμβάλλει επίσης στην αύξηση αυτή [3]. Η αιτιολογία του HCC είναι πολύπλοκο και περιλαμβάνει πολυάριθμες γενετικές και επιγενετικές μεταβολές και τη διατάραξη των διαφόρων οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένης της Wnt /β-κατενίνης, Ras /Raf /MAPK, PI3K /AKT /mTOR, HGF /c-met, IGF, VEGF και μονοπάτια PDGF. Μεταξύ αυτών, η οδός /β-κατενίνης Wnt θεωρείται ένα από τα πιο δύσκολα να αναστέλλουν [4]. Επί του παρόντος, λίγοι χημικών παραγόντων που στοχεύουν το μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης είναι διαθέσιμες ή υπό έρευνα [5].

Η ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt περιλαμβάνει την πρόσδεση των πρωτεϊνών Wnt στην κυτταρική επιφάνεια frizzled υποδοχείς και LRP5 /6 συν-υποδοχείς. Σε περίπτωση απουσίας των πρωτεϊνών Wnt, ένα μεγάλο μέρος της κυτταρικής β-κατενίνης είναι συνδεδεμένο με Ε-καδερίνης στην κυτταρική μεμβράνη. Κυτοσολίου β-κατενίνης είναι ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη σε συγκεκριμένα υπολείμματα σερίνης με ενζυματική συγκρότημα που περιλαμβάνει αδενοματώδη πολυποδίαση coli (APC), Axin, και τις κινάσες γλυκογόνο συνθάσης κινάσης-3β (GSK-3β) και κινάσης της καζεΐνης, τη σήμανση το για ουβικιτίνη διαμεσολαβείται πρωτεόλυση. Υπό αυτές τις συνθήκες, το TCF /οι παράγοντες μεταγραφής LEF δεσμεύεται στο συγγενές στοιχεία αναγνώρισης DNA τους, μαζί με τα μέλη της οικογένειας του Groucho συν-καταστολείς, η ασφάλιση της μεταγραφική αποσιώπηση γονιδίων στόχων β-κατενίνης. Δέσμευση πρωτεϊνών Wnt με την Frizzled υποδοχέα ενεργοποιεί την πρωτεΐνη Dishevelled, με αποτέλεσμα την διάσπαση του κυτοσολίου καταστροφική συγκρότημα και η αναστολή της GSK-3β. Αυτό οδηγεί στη σταθεροποίηση και τη συσσώρευση κυτταροπλασματικής β-κατενίνης, η οποία στη συνέχεια εισέρχεται στον πυρήνα, δεσμεύει LEF πρωτεΐνες /TCF και οδηγεί στην επακόλουθη διάσπαση του groucho συν-καταστολείς, πρόσληψη του p300 συνενεργοποιητή και ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων β-κατενίνης [ ,,,0],6] – [9]. Πολλοί από τους στόχους β-κατενίνης, συμπεριλαμβανομένων Κυκλίνη D1, c-myc και Σουρβιβίνη, την προώθηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και αναστέλλει την απόπτωση [10] – [12]. Συνεπής με αυτά τα δεδομένα, η ενεργοποίηση του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt φαίνεται σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων HCC. Η ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt έχει παρατηρηθεί σε τουλάχιστον 1/3 του HCC, και περίπου το 20% των HCCs έχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο β-κατενίνης. Περισσότερο από το 50% των όγκων HCC εμφανίζει πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης υποδεικνύοντας ότι άλλοι παράγοντες μπορεί να εμπλέκονται, όπως παρεκκλίνουσα μεθυλίωση της APC καταστολείς όγκων και E-cadherin, η απενεργοποίηση της κινάσης της καζεΐνης και GSK-3β, ή αυξημένη έκκριση Wnt ligants [4] – [5].

υπάρχουν έχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για το ρόλο του καρκίνου του ήπατος βλαστικά κύτταρα (LCSC) στην ογκογένεση, την εξέλιξη του όγκου, εισβολή και μεταστάσεις. Η θεωρία του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων υποδηλώνει ότι ένας όγκος αποτελείται από έναν ετερογενή πληθυσμό κυττάρων που σχηματίζουν ένα διακριτό κυτταρικό ιεραρχία. Πρόσφατες μελέτες έχουν παράσχει πειστικές αποδείξεις ότι αυτά τα κύτταρα υπάρχουν σε στερεούς όγκους πολλών τύπων, συμπεριλαμβανομένων, του εγκεφάλου, του μαστού, του παχέος εντέρου, του ήπατος, του παγκρέατος και καρκίνοι του προστάτη. Το 2006, δύο διαφορετικές ομάδες απομονωθεί ένα CD133 + υποπληθυσμό από κυτταρικές σειρές HCC και περιγράφονται υψηλότερη πολλαπλασιαστική και ογκογόνο δυναμικό, συνεπές με τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων. CD44 βρέθηκε επίσης ως ένα σημαντικό δείκτη που χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλους δείκτες αρχέγονων κυττάρων για να ορισθεί καλύτερα η επιφάνεια φαινότυπο LCSC. Έχει αποδειχθεί ότι τα κύτταρα CD133 + και CD90 + συνεκφράζουν CD44 + είναι πιο επιθετικοί από εκείνα που εκφράζουν CD133 ή CD90 μόνα [13] – [14]

Οι χημικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται για τη στόχευση Wnt- μονοπάτι /β-κατενίνης. είναι στα επίπεδα της μεμβράνης, κυτοσόλιο και παράγοντα μεταγραφής [5]. Το μικρό μοριακό παράγων FH535 είναι ένας διπλός αναστολέας του ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα (PPAR) και β-κατενίνης /TCF /LEF. FH535 έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των HCC και ηπατοβλάστωμα κυτταρικές σειρές και την εξειδίκευση της στην αναστολή του β-κατενίνης δραστηριότητα /TCF /LEF απεικονίστηκε σε ηπατοβλάστωμα κυτταρική γραμμή HepG2 [15].

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν για να προσδιοριστεί εάν FH535 μπορούν να αναστείλουν την ενεργοποίηση των γονιδίων β-κατενίνη ρυθμίζεται από ενδογενή και εκτοπικά εκφραζόμενη β-κατενίνης στις κυτταρικές γραμμές HCC Huh7, Hep3B και PLC και καρκίνο του ήπατος βλαστοκύτταρα (LCSC). Η ειδικότητα της FH535 στην αναστολή της β-κατενίνης μέσω ενεργοποίησης TCF /LEF αναλύθηκε σε διπλή αναφοράς λουσιφεράσης επιμολυσμένα σε LCSC και σε κύτταρα HCC. Πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου, και άλλες στοχευμένες γονίδια και πρωτεΐνες αναλύθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Κυτταρική καλλιέργεια

Το HCC κυτταρική σειρά Huh7 [16] ήταν ένα δώρο από τον Ο Δρ Guangxiang Luo (Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα – Birmingham). Οι κυτταρικές σειρές HCC Hep3B και PLC αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). Hep3B και PLC δύο εκφράζουν το αντιγόνο επιφανείας του HBV, και Huh7 εκφράζουν το αντιγόνο της ηπατίτιδας δέλτα. Το Hep3B είναι p53 αρνητική, ο PLC έχει μειωμένη έκφραση ρ53, και Huh7 έχει αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης p53 [17] – [18]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagles Medium (DMEM? Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), γλουταμίνη και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Οι καρκίνο του ήπατος βλαστικά κύτταρα (LCSC? Catalog # 36116-43, CelProgen, San Pedro, CA, USA) επεκτάθηκαν μέχρι και χρησιμοποιούνται εντός των πρώτων 4 περάσματα σε CelProgen πλήρες μέσο ανάπτυξης με 10% FBS σε εξωκυττάρια μήτρα (ECM ) με επικάλυψη φιάλες (CelProgen). Η κυτταρομετρία ροής προφίλ και ογκογονικότητα του LCSC δείχνονται στα Σχήματα S1 και S2. Άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε πρότυπο πλαστικών ειδών χωρίς επικάλυψη ECM. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε NuAire θερμοκοιτίδα (Plymouth, MI, USA) στους 37 ° C με 5% CO

2.

2.2 Χημικά

FH535, XAV939 και LiCl αγοράστηκαν από την Sigma- Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Μεθυλο

3Η-θυμιδίνης (2 Ci /mM) ήταν από βουλευτής Biomedicals (Costa Mesa, CA, USA). Το X-Treme Gene 9 και Turbofect αντιδραστήρια διαμόλυνσης ήταν από τη Roche (Indianapolis, ΙΝ, USA) και Thermo Scientific (Waltham, ΜΑ, USA), αντίστοιχα. Το κιτ ανάλυση κυτταρικού κύκλου ιωδιούχο προπίδιο-based ήταν από GenScript (Piscataway, NJ, USA). Όλα τα άλλα χημικά ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA).

2.3 Πλασμίδια

Το γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης TOPFlash, το οποίο περιέχει 3 αντίγραφα ενός site /LEF πρόσδεσης TCF , και FOPFlash αναφοράς λουσιφεράσης, πανομοιότυπο με TOPFlash εκτός των χώρων TCF /LEF έχουν μεταλλαχθεί, αγοράστηκαν από την Addgene (Cambridge, ΜΑ, USA) [19]. Ο φορέας λουσιφεράσης Renilla pRL ήταν από την Promega (Madison, WI, USA). Φορείς έκφρασης για άγριου τύπου β-κατενίνης και βCatS37A δόθηκαν από τον S. Byers [20] και Ε3-pGL3 που περιέχει ποντικού α-φετοπρωτεΐνης ενισχυτή E3 συγχωνευμένο με pGL3-προαγωγό, περιγράφηκε προηγουμένως [21].

2,4

3Η-θυμιδίνης δοκιμασία ενσωμάτωσης

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως από δημοσιευμένη μέθοδο μας και από άλλους ερευνητές [22] – [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 1,000-5000 κυττάρων /φρεάτιο σε 0.2 ml ϋΜΕΜ + 10% FBS και αντιμετωπίζονται εις διπλούν με διαφορετικές συγκεντρώσεις FH535 για 72 ώρες. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με

3Η-θυμιδίνης σε 1 μϋί /φρεάτιο για 4 ώρες. Εναλλακτικά, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 2500 κύτταρα /φρεάτιο σε 0.1 ml μέσου για 24 ώρες, ακολουθούμενη από την ταυτόχρονη προσθήκη FH535 (0-15 μΜ) και

3Η-θυμιδίνης (1 μΟί /φρεάτιο) σε έναν τελικό όγκο 0,2 ml /φρεάτιο., που ακολουθείται από επώαση για επιπλέον 18 ώρες. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν και στερεώθηκαν σε 0.3 ml 10% τριχλωροοξικού οξέος (TCA) για 12 λεπτά. Μετά την αναρρόφηση του TCA, τα κύτταρα λύθηκαν σε 0,2 Μ NaOH /0.2% SDS για 40 λεπτά.

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης μετρήθηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμού σε Packard Scintillation Analyzer (Covina, CA, USA). Δεν εκτελέσει ΜΤΤ δοκιμασία για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μπορεί να συγκριθεί με

3Η-θυμιδίνης διότι υπάρχει αντίδραση χρώματος μεταξύ FH535 και το αντιδραστήριο ΜΤΤ δοκιμασία (θειαζολυλο μπλε βρωμιούχο τετραζόλιο). Η συγκέντρωση του FH535 να προκαλέσει 50% αναστολή της κυτταρικής καλλιεργούνται (IC

50) προσδιορίστηκε με την ακόλουθη μέθοδο. No-φάρμακο δεδομένα χρησιμοποιήθηκε ως 100% στο άξονα Υ, και από αυτό προσδιορίζεται μια αναστολή 50% επί του Υ-άξονα. Από το σημείο αξία 50%, εφιστούμε μια παράλληλη γραμμή με το X-άξονα (ο άξονας συγκέντρωση του φαρμάκου) για να προσδιορίσει το σταυρό σημείο της καμπύλης συγκέντρωσης. Από το σταυρό σημείο εφιστούμε μια παράλληλη γραμμή προς την Υ-άξονα, και να βρει το σταυρό σημείο του Χ-άξονα. Αυτό το σταυρό σημείο στον άξονα Χ είναι το IC

50 σημείο. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

2.5 παροδικές επιμολύνσεις και Dual λουσιφεράσης Δοκιμασίες

Για επιμολύνσεις, Huh7, PLC και LCSC απλώθηκαν σε 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 1 ml μέσου καλλιέργειας σε 12 πηγαδιών πλάκες? Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με TOPFlash /pRL φορείς (αναλογία DNA 10:01) ή φορείς FOPFlash /pRL (αναλογία DNA 10:01) χρησιμοποιώντας Gene X-treme 9 (Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA) αντιδραστήριο επιμόλυνσης μετά από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 6 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα προστέθηκαν με 1 ml μέσου καλλιέργειας που περιέχει διαφορετικές συγκεντρώσεις του FH535, DMSO μόνο (όχημα), και /ή 10 mM LiCl. Σε όλες τις περιπτώσεις, η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν 0,08%. Η ποσότητα του φορέα DMSO διατηρήθηκε σταθερή σε φαρμακευτικές θεραπείες και η τελική συγκέντρωση του DMSO σε κάθε επεξεργασία ήταν η ίδια και σχεδιάστηκε σε λιγότερο από 0,1%. Μετά από 36 ώρες, η διπλή δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν με τη διπλή Σύστημα Promega Luciferase Assay (Madison, WI, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε στο Lumat LB 9507 φωτόμετρο (Berthold Technologies, Oak Ridge, ΤΝ, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με αποστειρωμένο PBS και υπέστησαν λύση σε διάλυμα 1 χ λύσης (Promega) (0,25 κ.εκ. /φρεάτιο) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Δέκα μΐ ακάθαρτου προϊόντος λύσης κυττάρου (που παρασκευάζεται σύμφωνα με Promega Protocol) προστέθηκε σε 50 μΐ υποστρώματος LARII δοκιμασίας λουσιφεράσης σε ένα σωλήνα πολυστυρενίου 12 Χ 75 mm (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA) για να μετρηθεί η δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας, που ακολουθείται από προσθήκη 50 μΙ Διακοπή και Glo υπόστρωμα για τη μέτρηση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης της Renilla. Η μετρούμενη δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την μετρούμενη δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας.

Για συν-επιμολύνσεις με φορείς έκφρασης β-κατενίνης, κύτταρα απλώθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 24 φρεατίων πλακών. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 340 ng πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης, 170 ng πλασμιδίου έκφρασης β-κατενίνης, και 10 ng pRL /φρεάτιο χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Turbofect (Pittsburg, ΡΑ, USA). Μετά από 5-6 ώρες, FH535 (ή DMSO έλεγχο οχήματος) προστέθηκε. Μετά επιπλέον 36 ώρες, εκχυλίσματα κυττάρου (που παρασκευάζεται σύμφωνα με το πρωτόκολλο Promega) παρασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν αμέσως ή αποθηκεύονται στους -80 ° C. Όλες οι επιμολύνσεις έγιναν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές. Λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν με κυτταρικά εκχυλίσματα χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλής Δοκιμασίας Λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε εις διπλούν.

Κύκλος

2.6 Κυττάρων ανάλυση

κύτταρα Huh7 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με DMEM ελεύθερο ορού 3 φορές, στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 0.1% FBS για 24 ώρες για το συγχρονισμό των κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS με διαφορετικές συγκεντρώσεις FH535 για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με το πρωτόκολλο GenScript. LCSC καλλιεργήθηκαν σε CelProgen πλήρες μέσο ανάπτυξης και αντιμετωπίζονται με τον ίδιο τρόπο όπως αναφέρεται παραπάνω.

2.7 RT-PCR και ανάλυση Western

RT-PCR.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS σε δίσκους καλλιέργειας ιστού 100 χιλιοστά μέχρι ~ 70% συρροή και κατόπιν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO μόνο του ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις FH535 σε DMSO για 38 ώρες. Για την ανάλυση του RNA, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και cDNA παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται [21]. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR πράσινο χρησιμοποιώντας το θερμικό ανακυκλωτή Bio-Rad MyiQ με τους ακόλουθους εκκινητές: Σουρβιβίνη (BIRC5, CAAGGAGCTGGAAGGCTGG και GTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCC), Κυκλίνη D1 (CCND1: GGATGCTGGAGGTCTGCGA και TAGAGGCCACGAACATGCAAGT), και β2-μικροσφαιρίνη (Β2Μ: GACTTTGTCACAGCCCAAGATAG και TCCAATCCAAATGCGGCATCTTC ).

Western Blot.

κύτταρα Huh7 (5 × 10

5) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS σε δίσκους καλλιέργειας ιστού 100 mm για 72 ώρες. Μετά από αλλαγή με φρέσκο ​​μέσο, ​​τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 2,5, 5, και 10 μΜ FH535 για 38 ώρες. DMSO (& lt? 0,1%) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του οχήματος. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με μικρο κιτ δοκιμασίας BCA πρωτεΐνης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του παρόχου (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Ειδικά αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). πυκνότητα ταινίας Western Blot αναλύθηκε με λογισμικό ΝΙΗ ImageJ (Bethesda, Maryland, USA), και κανονικοποιήθηκαν με β-ακτίνη. Όλες οι άλλες διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

2.8 Στατιστική ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS έκδοση 20 (International Business Machines Corporation, Endicott, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) . Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από διόρθωση Tukey χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν τα μέσα. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

3.1 FH535 αναστέλλει μεταγραφική ενεργοποίηση που προκαλείται από άγριου τύπου και ουσιαστικά δραστική β-κατενίνης

FH535 έχει δειχθεί ότι μπλοκάρει σηματοδότηση μέσω ενδογενούς β-κατενίνης σε αρκετές κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένης της ηπατοβλάστωμα κυτταρική γραμμή HepG2 [15]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω αυτόν τον κανονισμό και να ελέγξετε εάν FH535 θα μπορούσαν να μπλοκάρουν έκτοπη β-κατενίνης, συν-επιμολύνσεις με φορείς έκφρασης β-κατενίνης και του διανύσματος αναφοράς της λουσιφεράσης TCF4-εξαρτώμενη TOPFlash πραγματοποιήθηκαν στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC Huh7 και Hep3B (Εικ. 1 ). Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, συν-επιμολύνθηκαν φορέα έκφρασης β-κατενίνης άγριου τύπου αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης από TOPFlash σχεδόν 15 φορές σε σύγκριση με κύτταρα συν-επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα (Ε.ν.) έλεγχος. Αυτή β-κατενίνης εξαρτώμενη αύξηση ανεστάλη με FH535 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. β-κατενίνης είναι συχνά μεταλλάσσεται σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου HCC. Ένα φυσικό μετάλλαξη αλλάζει την σερίνη στη θέση 37? Αυτή η τροποποιημένη μορφή του β-κατενίνης είναι ανθεκτική σε αποικοδόμηση από το σύμπλοκο APC και επομένως έχει μεγαλύτερη σταθερότητα. Για να ελεγχθεί αν αυτή η μορφή της ενεργοποιημένης μορφής της β-κατενίνης μπορεί επίσης να αποκλειστεί από FH535, ένα φορέα έκφρασης για βCatS37A, στο οποίο η σερίνη στη θέση 37 έχει αλλάξει σε μία αλανίνη, συν-επιμολυσμένα με TOPFlash. Όπως αναμενόταν, βCatS37A μεσολάβηση μετενεργοποίηση TOPFlash ήταν σημαντικά υψηλότερη από μετενεργοποίηση με άγριου τύπου β-κατενίνης. Ωστόσο, και στις δύο κυτταρικές σειρές, βCatS37A μεσολάβηση μετενεργοποίηση ανεστάλη σημαντικά από FH535. Ως έλεγχοι, τα κύτταρα επίσης συν-επιμολύνθηκαν με FOPFlash, το οποίο είναι πανομοιότυπο με TOPFlash εκτός από το ότι οι θέσεις TCF4 μεταλλαχθεί και ως εκ τούτου δεν είναι πλέον αποκρίνονται σε β-κατενίνης? FOPFlash δεν ενεργοποιήθηκε με άγριου τύπου β-κατενίνης ή βCatS37A όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.

Huh7 (Πίνακας Α) και Hep3B κύτταρα (Πίνακας Β) HCC επιμολύνθηκαν με τα γονίδια λουσιφεράσης TOPFlash (αριστερά πάνελ) , το οποίο περιέχει τρεις θέσεις σύνδεσης TCF, ή Ε3-pGL3 (δεξιά πάνελ), το οποίο περιέχει το AFP Ε3 στοιχείο ενισχυτή που έχει μια εξαιρετικά διατηρημένη θέση TCF. Τα κύτταρα επιπλέον συν-επιμολύνθηκαν με έναν φορέα έκφρασης που περιείχε κανένα ένθετο (έλεγχος με κενό φορέα, Ε.ν.), άγριου τύπου β-κατενίνης (β-κατενίνης), ή ένα ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή της β-κατενίνης (βcatS37A). Renilla λουσιφεράση χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για τις διακυμάνσεις στην αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Έξι ώρες μετά την προσθήκη του DNA, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO μόνο (χωρίς θεραπεία) ή αυξανόμενες ποσότητες FH535. Μετά από 48 ώρες, τα επίπεδα λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν? λουσιφεράση πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε σε Renilla. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, FH535 ανέστειλε β-κατενίνης εξαρτώμενη ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων. *

P

& lt? 0,05. Το πείραμα έγινε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

TOPFlash περιέχει τρία μοτίβα πρόσδεσης συναίνεση TCF4 που προσδίδουν αποκρισιμότητα σε β-κατενίνης. Για να ελεγχθεί αν FH535 θα μπορούσε επίσης να μπλοκάρουν β-κατενίνης μεσολάβηση μετενεργοποίηση ενός μοτίβου TCF4 στο πλαίσιο ενός φυσικού ρυθμιστικής περιοχής, συν-μορφομετατροπές διεξήχθησαν με Ε3-pGL3. Ε3 είναι ένα θραύσμα ~340 bp το οποίο περιέχει α-φετοπρωτεΐνης (AFP) στοιχείο ενισχυτή Ε3, ένας από τους τρεις ενισχυτές που ελέγχουν την ηπατική έκφραση του γονιδίου AFP ποντικού. Ε3 περιέχει θέσεις σύνδεσης για πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων Foxa /HNF6, Ο /ΕΒΡ, ορφανοί πυρηνικοί υποδοχείς, και TCF4 [26] – [27]. Πρόσφατα έδειξε ότι αυτή η ενισχυτής ρυθμίζεται από β-κατενίνης σε κύτταρα και διαγονιδιακά ποντίκια [21]. Ε3-pGL3 ήταν μετενεργοποίησε με β-κατενίνης και σε μεγαλύτερο βαθμό από βCatS37A (Εικ. 1). Ωστόσο, αυτή η μετενεργοποίηση τόσο από άγριου τύπου και τις μορφές S37A του β-κατενίνης εμποδίστηκε από FH535 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

3.2 FH535 αναστέλλει β-κατενίνης μεσολαβεί στην μεταγραφική ενεργοποίηση LCSC

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η σηματοδότηση β-κατενίνης είναι αυξημένη σε ΕρΟΑΜ θετικά κύτταρα με ιδιότητες LCSC [28]. Έχουμε προηγουμένως περιγραφεί ότι CD133 +, CD44 +, CD24 + LCSC σχηματίσουν επιθετικά όγκους όταν οι μικροί αριθμοί των κυττάρων αυτών με ένεση σε γυμνά ποντίκια [29]. Για να δοκιμαστεί η ικανότητα του να αναστέλλει FH535 β-κατενίνης σε αυτές LCSCs, παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με TOPFlash. Ως έλεγχοι, TOPFlash επίσης διαμολύνθηκε στην κυτταρική σειρές HCC Huh7 και PLC (Σχ. 2). Και στις τρεις πληθυσμούς, μη κατεργασμένα κύτταρα παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα λουσιφεράσης. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον αναστολέα GSK-3β LiCl, η οποία οδηγεί σε ενδογενή ενεργοποίηση β-κατενίνης [30], η δραστηριότητα TOPFlash αυξηθεί δραματικά. FH535 μπλοκάρει αποτελεσματικά LiCl διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της TOPFlash με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι ενδιαφέρον, αυτή η αναστολή ήταν πιο ισχυρή στην LCSC από ό, τι σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά HCC. Ως έλεγχος, επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης με FOPFlash, η οποία δεν είναι πλέον αποκρίνεται σε β-κατενίνης. Όπως αναμενόταν, η δραστικότητα λουσιφεράσης σε FOPFlash-επιμολυσμένα κύτταρα, ούτε αυξήθηκε κατά LiCl ούτε αναστέλλεται από FH535.

LCSC (αριστερό πάνελ), Huh7 (μεσαίο πλαίσιο) και HPLC (δεξί πάνελ) κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με TOPFlash ή FOPFlash γονίδια λουσιφεράσης μαζί με λουσιφεράσης Renilla. Μετά από 6 ώρες, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (χωρίς θεραπεία) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με LiCl μόνη ή LiCl με αυξανόμενες ποσότητες FH535. LiCl είναι ένας γνωστός ενεργοποιητής του β-κατενίνης. Μετά επιπλέον 36 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα λουσιφεράσης? λουσιφεράση πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε σε Renilla. TOPFlash δραστηριότητα ήταν ιδιαίτερα επάγεται και στις τρεις κυτταρικούς πληθυσμούς? αυτή η ενεργοποίηση αναστέλλεται από FH535. Το αρνητικό FOPFlash ελέγχου έδειξε ελάχιστη αντίδραση σε LiCl ή FH535. TOPFlash αναστολή από FH535 ήταν πιο ισχυρή στην LCSC από ό, τι σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά HCC. *

P

& lt? 0.003, # Ρ & lt? 0.001. Το πείραμα έγινε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

3.3 FH535 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών LCSC και HCC

Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η β-κατενίνης παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της κανονικής ανάπτυξη και σε κυτταρικό μετασχηματισμό σε πολλούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του ήπατος. ανάπτυξη του ήπατος είναι εξασθενημένη σε απουσία β-κατενίνης, καθώς και οι μεταλλάξεις που ενεργοποιούν το μονοπάτι β-κατενίνης βρέθηκαν σε περίπου 1/3 του HCC [4] – [5]. Επιπλέον, η ανάπτυξη του ενήλικου ήπατος προγονικών βλαστοκυττάρων (οβάλ κύτταρα) μπορεί να ανασταλεί με την παρεμπόδιση της οδού β-κατενίνης. Από τα δεδομένα μας έδειξαν ότι FH535 μπορούν να μπλοκάρουν β-κατενίνης μεσολάβηση μεταγραφική ενεργοποίηση, ελέγξαμε επίσης αν πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών LCSC και HCC επηρεάστηκε από την ένωση αυτή. LCSC καλλιεργήθηκαν παρουσία 10% ή 1% ορό και με μεταξύ 5 μΜ και 30 μΜ FH535 για 72 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων παρακολουθήθηκε με

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης (Σχ. 3Α και 3Β, αντιστοίχως). Πολλαπλασιασμός μειώθηκε με αυξανόμενες ποσότητες FH535, με πιο δραματική μείωση που παρατηρήθηκε σε κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία του κατώτερου ορού? η συγκέντρωση του FH535 να προκαλέσει 50% αναστολή της κυτταρικής καλλιεργούνται (IC

50) ήταν 13,8 μΜ για κύτταρα που αναπτύσσονται σε 10% ορό και 5,1 μΜ για τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 1% ορό. Αυτή η αναστολή ήταν πιο ισχυρή από αυτή που παρατηρείται με XAV939 (IC

50 = 55 μΜ), η οποία αναστέλλει τανκυράσης, σταθεροποιώντας έτσι αξίνη και την προώθηση της αποδόμησης β-κατενίνης (Εικ. 3C) [31]. FH535 επίσης μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC σε συγκεντρώσεις που ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με LCSC (IC

50 10,9 μΜ, 9,25 μΜ και 6,6 μΜ για Huh7, PLC και Hep3B, αντίστοιχα? Σχήμα 3D). Για να επιβεβαιωθεί ότι FH535 πράγματι πολλαπλασιασμό των κυττάρων και παρεμπόδισε δεν οδήγησε σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο, FH535 και

3Η-θυμιδίνης προστέθηκαν ταυτόχρονα σε κύτταρα Huh7, τα οποία στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες. Σε αυτό το σενάριο, παρατηρήσαμε μια σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού στα 2,5, 5, 10 και 15 μΜ της θεραπείας FH535 σε σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,05, η = 6), με FH535 στους 15 μΜ που προκαλεί μια αναστολή 41% (Εικόνα S3 ). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι FH535 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρά στην αύξηση του κυτταρικού θανάτου.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 0.2 ml μέσου όπως περιγράφεται κατωτέρω επί 72 ώρες, ακολουθούμενη από την προσθήκη του

3Η -θυμιδίνη σε 1 μΟί /φρεάτιο για 4 ώρες. Ενσωμάτωση των

3Η-θυμιδίνης προσδιορίστηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμών. Στο πάνελ Α, Β και D, η τελική συγκέντρωση του DMSO σε κάθε φρεάτιο ήταν 0,05%? στον πίνακα C, η τελική συγκέντρωση DMSO σε κάθε φρεάτιο ήταν 0,1%. (

A

) LCSCs απλώθηκαν σε 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 10% FBS, μαζί με μόνη DMSO ή με αυξανόμενες ποσότητες FH535. (

Β

). LCSCs απλώθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 1% FBS μόνο με DMSO ή με αυξανόμενες συγκεντρώσεις FH535. (

C

). LCSCs απλώθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS στα 1000 κύτταρα /φρεάτιο με μόνη DMSO ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις XAV939. (

D

). Huh7, Hep3B και PLC κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS σε 1.000, 2.500, και 5.000 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως, με μόνη DMSO ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις FH535.

P

αξίες για όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με FH535 συγκρίνονται με τους ελέγχους. Το πείραμα έγινε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

3.4 FH535 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην κυτταρική γραμμή HCC Huh7 και σε LCSC

Η ικανότητα των FH535 να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μας ώθησε να διερευνηθεί η κατανομή του κυτταρικού κύκλου μετά τη θεραπεία. κύτταρα Huh7 συγχρονίστηκαν με ανάπτυξη σε 0,1% FBS για 24 ώρες και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία 10% FBS και χωρίς FH535 ή FH535 στα 7.5 μΜ και 15 μΜ. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Με την παρουσία του FH535, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε G0 /G1 και μία αντίστοιχη μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία του FH535 (Σχ. 4Α). Ο αριθμός των κυττάρων σε G2 δεν επηρεάσθηκε σημαντικά από FH535. Επιπλέον, δεν υπήρχε κορυφή υπο-G1 ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής, δείχνοντας ότι FH535 δεν προωθούσε απόπτωση στις συγκεντρώσεις που είναι σε χρήση (βλέπε Σχήμα S4). Κάναμε επίσης την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε LCSC μετά τη θεραπεία FH535 και βρήκε FH535 σε 15 μΜ σημαντικά προκάλεσε τη σύλληψη φάση G1 στην LCSC (P = 0,012). FH535 επίσης μείωσε σημαντικά G2 /M φάση στην LCSC μετά από 24 ώρες από 7,5 μΜ και 15 μΜ θεραπεία FH535 (Ρ = 0,038 και Ρ & lt? 0,001 αντιστοίχως), δεν παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή φάση S παρατηρήθηκε σε LCSC (p = 0,446) (Σχ. 4Β.). Τα δεδομένα μας είναι παρόμοια με προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα και αντανακλά ρύθμιση β-κατενίνης του κυτταρικού κύκλου είναι διαφορετική σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [32] – [33]. ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου (κυκλινών, CDKs και ρυθμιστές) μπορεί να ποικίλει σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, τα οποία θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε διαφορετικές απαντήσεις μετά τη θεραπεία FH535. Αυτό μπορεί να αξίζει να εξεταστούν στο μέλλον μελέτη μας.

Α. κύτταρα Huh7 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με DMEM ελεύθερο ορού 3 φορές, στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 0.1% FBS για 24 ώρες για το συγχρονισμό των κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS, μαζί με διαφορετικές συγκεντρώσεις FH535 για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με το πρωτόκολλο GenScript (Piscataway, NJ, USA). Η θεραπεία με FH535 αύξησε το ποσοστό των κυττάρων σε G1 και μείωσε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S. Το πείραμα έγινε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. κύτταρα Β LCSC καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο CelProgen LCSC καλλιέργειας για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με μέσο ελεύθερο ορού CelProgen 3 φορές και καλλιεργούνται σε CelProgen Medium + 0,1% FBS για 24 ώρες για το συγχρονισμό των κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρέφονται στο CelProgen Πλήρες Μέσο + 10% FBS με διαφορετικές συγκεντρώσεις FH535 για 24 ώρες. κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε ανά Huh7 παραπάνω.

Η

3.5 Έκφραση των γονιδίων στόχων β-κατενίνης Κυκλίνη D1 και Σουρβιβίνης αναστέλλεται από FH535

β-κατενίνης ελέγχους κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης από ρυθμίζουν την έκφραση πολλών γονιδίων στόχων. Δύο καθιερωμένη στόχοι είναι τα γονίδια που κωδικοποιούν την Σουρβιβίνη (Birc5) και κυκλίνης D1 (CCND1). Survivin είναι ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη η οποία ρυθμίζει επίσης την εξέλιξη μέσα από τη μίτωση [34]? Η κυκλίνη D1 ελέγχει τον πολλαπλασιασμό με την ενεργοποίηση του G1 κινάσες cdk4 και cdk6 [35]. Survivin και κυκλίνης D1 μεταγραφή ρυθμίζονται μέσω των στοιχείων TCF σε περιοχές υποκινητών τους [36]. Για να ελεγχθεί αν FH535 αναστέλλει την έκφραση αυτών των δύο γονιδίων-στόχων β-κατενίνης, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκε με LCSC και HCC κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες ποσότητες FH535. επίπεδα κυκλίνης D1 και Survivin mRNA μειώθηκαν κατά FH535 στις τρεις πληθυσμούς κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5). Για να επιβεβαιωθεί ότι αυτή η μείωση των επιπέδων του mRNA οδήγησε επίσης σε χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης, ανάλυση Western εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ολόκληρα κυτταρικά εκχυλίσματα από κύτταρα Huh7. Και τα δύο επίπεδα πρωτεΐνης Κυκλίνη D1 και Σουρβιβίνης μειώθηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με τη μεγαλύτερη μείωση παρατηρείται με την παρουσία 10 μΜ FH535 (Εικ. 6.). Η πυκνομετρική ανάλυση έδειξε ότι FH535 στα 5 και 10 μΜ ανέστειλε Κυκλίνη D1 28% και 64% αντίστοιχα? FH535 στα 5 και 10 μΜ ανέστειλε επιζούν 24% και 48% αντίστοιχα (Εικ. 6).

LCSCs, Huh7 και Hep3B κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με DMSO ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις του FH535 για 38-χρόνου PCR για την έκφραση της Κυκλίνη D1 (Panel Α) ή Survivin (Πίνακας Β). Και στις δύο περιπτώσεις, τα επίπεδα mRNA απεικονίσθηκαν σε σχέση με την β

2-μικροσφαιρίνη. Το πείραμα έγινε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με DMSO ή αυξανόμενες ποσότητες FH535 για 38-PAGE και μεταφέρθηκαν για ανάλυση Western με αντισώματα εναντίον Κυκλίνη D1, Survivin, και β ακτίνης. Η κορυφή του δείχνει η εικόνα κηλίδος western? το γράφημα κάτω δείχνει πυκνομετρική ανάλυση των δυτικών στοιχείων. Αυτή η πυκνομετρική ανάλυση έδειξε ότι FH535 στα 5 και 10 μΜ ανέστειλε επίπεδα πρωτεΐνης Κυκλίνη D1 28% και 64% αντίστοιχα? FH535 στα 5 και 10 μΜ ανέστειλε επίπεδα πρωτεΐνης Σουρβιβίνης 24% και 48% αντίστοιχα. Το πείραμα έγινε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Συζήτηση

Τα τελευταία χρόνια, πολλές οδοί σηματοδότησης έχουν εμπλακεί σε ηπατική καρκινογένεση. Η οδός β-κατενίνη είναι απαραίτητη σε βλαστικά κύτταρα για την αυτο-ανανέωση και τη συντήρηση των ιδιοτήτων των αρχέγονων κυττάρων. Η διακοπή αυτής της ισορροπίας οδηγεί σε δύο γενετικές και επιγενετικές μεταβολές, που βρίσκεται σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου και HCC [4]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε FH535 ως αναστολέας του μονοπατιού β-κατενίνης. Αυτή η ένωση έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για να αναστείλουν την έκφραση β-κατενίνης σε κύτταρα από κόλον και του πνεύμονα καθώς και σε κύτταρα από ηπατοβλάστωμα και HCC [15]. Στην έκθεση αυτή, οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι FH535 ήταν τοξική σε μια σειρά κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των Huh7.