Αφηρημένο

ιστόνης μεθυλίωση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε διάφορες βιολογικές και παθολογικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε ότι JARID2, ένας αλληλεπιδρώντας συστατικό του Polycomb κατασταλτικής συμπλόκου-2 (PRC2) που καταλύει μεθυλίωση της λυσίνης 27 ιστόνης Η3 (H3K27), συμμετείχε σε Transforming Growth Factor-β (TGF-β) επαγόμενης επιθηλιακά -mesenchymal μετάβασης (EMT) της κυτταρικής σειράς Α549 καρκίνου του πνεύμονα και του παχέος εντέρου ΗΤ29 κυτταρική σειρά καρκίνου. Η έκφραση του

JARID2

αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT αυτών των κυτταρικών γραμμών και knockdown του

JARID2

ανέστειλε ΤΟΡ-β επαγόμενη μορφολογική μετατροπή των κυττάρων που συνδέονται με την EMT.

JARID2

νοκ ντάουν η ίδια δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση της EMT που σχετίζονται με τα γονίδια, αλλά ανταγωνίζεται αλλαγές έκφραση TGF-β-εξαρτώμενη της EMT που σχετίζονται με τα γονίδια, όπως

Cdh1

,

Zeb

οικογένεια και

microRNA-200

οικογένεια. αναλύσεις χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι JARID2 είχε εμπλακεί σε TGF-β επαγόμενη μεταγραφική καταστολή του

Cdh1

και

microRNA-200

οικογένεια γονιδίων μέσω της ρύθμισης των ιστονών Η3 μεθυλίωσης και πληρότητες ΕΖΗ2 στις ρυθμιστικές περιοχές τους . Η μελέτη μας έδειξε μια νέα ρόλος του JARID2 πρωτεΐνης, η οποία μπορεί να ελέγχει την πρόσληψη PRC2 και ιστόνης μεθυλίωση κατά την διάρκεια ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT κυτταρικών σειρών πνεύμονα και του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Tange S, D Oktyabri, Terashima Μ, Ishimura Α, Suzuki T (2014) JARID2 εμπλέκεται στη μετατροπή Growth Factor-β-Induced Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση του πνεύμονα και του παχέος εντέρου Γραμμές Cancer Cell. PLoS ONE 9 (12): e115684. doi: 10.1371 /journal.pone.0115684

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, η Κορέα, Δημοκρατία της

Ελήφθη: 16 Σεπ 2014? Αποδεκτές: 25 του Νοέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 Tange et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από επιχορηγήσεις-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα C (αριθμός επιχορήγηση 24.590.346 σε TS) και την Επιστημονική Έρευνα για τα καινοτόμα Περιοχές (αριθμός επιχορήγηση 22.112.010 σε TS) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Λυσίνη (Κ) μεθυλίωση για την αμινο-τερματική ουρά του ιστόνης Η3 (Κ4, Κ9, Κ27 και Κ36) έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό μετα-μεταφραστική τροποποίηση λόγω της ειδικής δυναμική του για μεταγραφική ρύθμιση [1], [2]. Η μεθυλίωση του H3K4 έχει στενά συνδεθεί με ενεργό μεταγραφή, ενώ η μεθυλίωση του H3K9 και H3K27 είναι καταπιεστικά σημάδια της χρωματίνης. Οι τροποποιήσεις αυτές ρυθμίζονται από μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης λυσίνη (KMTs) και demethylases λυσίνη (KDMs). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η απορρύθμιση αυτών των ενζύμων μπορεί να συνεισφέρει στα αναπτυξιακές ανωμαλίες και την παθογένεση των ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [1] – [3].

Για να βρούμε νέα γονίδια εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, έχουμε εκτελείται ρετροϊικό παρεμβατικής μεταλλαξογένεσης σε ποντικούς. Αυτή η οθόνη οδήγησε στην απομόνωση των εκατοντάδων υποψηφίων γονιδίων του καρκίνου συμπεριλαμβανομένων πολλών γονιδίων που κωδικοποιούν KMTs και KDMs [4], [5]. Προηγουμένως, αναφέραμε ότι KDM5B /PLU1 /JARID1B, ένας διμεθυλάση H3K4 και μία από τις υποψήφιες ογκογονιδίων, κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση του

KAT5

και

CD82

γονίδια για την αύξηση της κυτταρικής εισβολής [6] και καταπιεσμένη την έκφραση του

microRNA-200

(

miR-200

) οικογένεια, προωθώντας έτσι επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) των καρκινικών κυττάρων [7]. Έτσι οι μελέτες μας αποκάλυψαν ότι ιστόνης ένζυμα μεθυλ-τροποποίησης ενεπλάκησαν όχι μόνο στην έναρξη του όγκου, αλλά επίσης στην πρόοδο του όγκου.

Η πρόοδος του όγκου έχει συσχετιστεί με την ενεργοποίηση του προγράμματος ΕΜΤ που επάγεται από εξωγενή σήματα όπως Μετασχηματισμός Growth Factor-β (TGF-β) [8], [9]. EMT χαρακτηρίζεται από τις αλλαγές στα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά γονιδιακή έκφραση. Ειδικά, η ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης είναι απαραίτητη για την ΕΜΤ. Αρκετές μεταγραφικοί καταστολείς όπως ZEB1 και ZEB2 εμπλέκονται στην Ε-καδερίνης μεταγραφική καταστολή κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ [10]. Οι αναστρέψιμες ιδιότητες της EMT δείχνουν ότι επιγενετική ρύθμιση, όπως η μεθυλίωση του DNA, την τροποποίηση των ιστονών και microRNA μπορεί να συμμετέχει [11]. Υπάρχουν διάφορα έγγραφα, συμπεριλαμβανομένων μελέτη μας αποδεικνύει τη σύνδεση μεταξύ της Ε-καδερίνης και καταστολή της λειτουργίας των ενζύμων μεθυλ-τροποποίησης ιστόνης [7], [12], [13]. Ωστόσο, ο ρόλος της ιστόνης μεθυλίωσης στο EMT μόλις αρχίζει να αποκαλύπτεται.

JARID2 είναι μία από τις πρωτεΐνες που περιέχουν JARID JmjC (Jumonji C) περιοχή και άγονο (ΑΤ-πλούσια περιοχή αλληλεπίδρασης) [2]. Ωστόσο, JARID2 πρωτεΐνη στερείται ιστόνης χαρακτηριστική δραστηριότητα διμεθυλάση άλλων πρωτεϊνών τομέα JmjC επειδή έχει υποκαταστάσεις αμινοξέων στην συντηρημένη περιοχή [2]. JARID2 έχει αναφερθεί ως εξάρτημα συνιστώσα της Polycomb κατασταλτικών συγκρότημα-2 (PRC2) που ρυθμίζει σημαντικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης [14]. PRC2 περιέχει τις βασικές υπομονάδες: ΕΖΗ2, SUZ12, ΕΤΔ και RBBP4 /7, και είναι υπεύθυνη για την κατασταλτική μεθυλίωση H3K27 [15]. JARID2 φάνηκε να ελέγχει PRC2 πληρότητα και η δραστηριότητα στα γονίδια-στόχους σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΟΚΕ) [16] – [19]. Από την άλλη πλευρά, η απορρύθμιση της δραστηριότητας PRC2 θεωρείται ότι συμβάλλει στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου. ΕΖΗ2, ένα ενζυματικό συστατικό του PRC2, δείχθηκε ότι υπερεκφράζεται σε μεταστατικό καρκίνο, και τα επίπεδα έκφρασης που συνδέονται με την εξέλιξη του όγκου [20], [21]. Ωστόσο, ο ρόλος του JARID2, ενός αλληλεπιδρώντος συστατικού του PRC2, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου παραμένει άγνωστη.

Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε τη λειτουργία του κατά τη διάρκεια της JARID2 ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT του Α549 καρκίνου του πνεύμονα και κυτταρική σειρά κόλου ΗΤ29 καρκινική κυτταρική σειρά. Βρήκαμε ότι οι αλλαγές έκφραση TGF-β-εξαρτώμενη της EMT που σχετίζονται με γονίδια ανεστάλησαν από

JARID2

νοκ ντάουν και ενισχύεται από

JARID2

υπερέκφραση. Μηχανιστικές έρευνες πρότεινε ότι JARID2 είχε εμπλακεί σε TGF-β επαγόμενη μεταγραφική καταστολή του

Cdh1

και

miR-200

οικογένεια γονιδίων μέσω της διαφοροποίησης των ιστονών Η3 μεθυλίωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια

Η μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) εκφράζοντα φορείς ρετροϊού κατασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Οι ακολουθίες αίσθηση σκέλος των ολιγονουκλεοτιδίων έχουν ως εξής:

JARID2

shRNA # 1, 5′-ccgggaaacaggtttctaaggtaaactcgagtttaccttagaaacctgtttcttttt-3 ‘

JARID2

shRNA # 2, 5′-ccgggcccaacagcatggtgtatttctcgagaaatacaccatgctgttgggcttttt-3 ‘

Η αλληλουχία ελέγχου shRNA περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση του

JARID2

ήταν κάτω-ρυθμίζονται με τη μόλυνση τόσο

JARID2

shRNA εκφράζουν ρετροϊούς ακόμη και με την παρουσία του ΤΟΡ-β με ποσοτική RT-PCR (QRT-PCR ) και στύπωμα Western (S1 Εικ.). Μπορούμε επίσης επιβεβαίωσε ότι οι δύο

JARID2

Τα siRNAs προκάλεσε τα ίδια αποτελέσματα σε μελέτες EMT μας (S2 Εικ.), Και έτσι παρουσιάσαμε τα στοιχεία του

JARID2

shRNA # 1 ως εκπρόσωπος αποτέλεσμα (που περιγράφεται όπως JARID2 KD). Ανθρώπινα

JARID2

cDNA έγινε με ετικέτα FLAG-6xHis-tag, και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε pDON-5 Νέο πλασμίδιο (Takara) για να παράγουν ρετροϊούς που εκφράζουν JARID2.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

Α549 ανθρώπινου πνεύμονα γραμμή κυττάρων καρκίνου και ΗΤ29 ανθρώπινου κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Υ Endo (Cancer Research Institute, Kanazawa Univ.) και διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) με 10% FBS, 2 mM γλουταμίνη και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Sigma) στους 37 ° C σε 5% CO2. Για την επαγωγή ΕΜΤ, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ng /ml ΤΟΡ-β (R &? D Systems) για 12 έως 72 ώρες, ενώ ΗΤ29 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ng /ml ΤΟΡ-β. Η μόλυνση οι διαδικασίες του shRNA ή cDNA που εκφράζουν ρετροϊοί παραγωγή και περιγράφηκαν προηγουμένως [6].

ποσοτική PCR

παρασκεύασμα RNA και ποσοτική ανάλυση RT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [6] . δεδομένα PCR κανονικοποιήθηκαν αναφορικά με τον έλεγχο της έκφρασης του ανθρώπου GAPDH. Οι μέσοι όροι από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται με τις τυπικές αποκλίσεις.

P

-τιμές υπολογίστηκαν μεταξύ του ελέγχου και τα δείγματα με τη χρήση t-test του Student. Εναρκτήρες που χρησιμοποιούνται για την ποσοτική PCR έχουν περιγραφεί προηγουμένως [6], [7] και σχεδιάστηκε ως εξής:

Ανθρώπινο

JARID2

, 5′- gagcatgtgtttcagcaagg-3 ‘και 5’-cttctcttccactagcctccag-3 «

Ανθρώπινο

JARID1A

, 5′-tgaacttctgtactgctgactgg-3 ‘και 5′-agccccacatctaagcattc-3’

Ανθρώπινο

JARID1C

, 5′-ctacggaggaaccacagca -3 ‘και 5′-agcaggcagaagatgtggtag-3’

Ανθρώπινο

JARID1D

, 5′-tcacagcagtgcccagttta-3 ‘και 5′-ggggtggtaacaagcagaag-3’

Ανθρώπινο

βιμεντίνης

, 5′-tacaggaagctgctggaagg-3 ‘και 5’ -accagagggagtgaatccag-3 ‘

για microRNA ποσοτικοποίηση, TaqMan microRNA Αναλύσεις (Applied Biosystems) για

miR-200a

(# 000502) και

χρησιμοποιήθηκαν miR-200c

(# 002300). Όλα τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε σχέση με

RNU6B

(# 001093) έκφραση.

ανοσοαποτύπωσης, χρώση των κυττάρων και ανοσο-φθορισμού ανίχνευση

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [7] . Anti-JARID2 (# NB100-2214, Novus Biologicals), αντι-Ε-cadherin (# 610181, BD Transduction Lab), αντι-Φιμπρονεκτίνης (SAB4500974, Sigma), αντι-βιμεντίνη (ab8069, Abcam), αντι-ZEB1 (# 3396, Cell Signaling), αντι-ZEB2 (# 61096, Active Motif), αντι-φωσφορυλιωμένο Smad3 (ab51451, Abcam) και αντι-GAPDH (6C5, χρησιμοποιήθηκαν Millipore) αντισώματα. Για να ανιχνευθούν οι μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων, Α549 ή ΗΤ29 κύτταρα χρωματίστηκαν με 0.4% κρυσταλλικό ιώδες (Waldeck). Για να επιτρέπουν την άμεση φθορισμός ακτίνης του κυτταροσκελετού, τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.25 μΜ ισοθειοκυανική τετραμεθυλοροδαμίνη (TRITC), συζευγμένης phalloidin (Sigma). Για έμμεσο ανοσοφθορισμό, τα δείγματα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Alexa546-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG αντίσωμα (Invitrogen). Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ).

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες

πειράματα ChIP διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [22] . Τα εγκάρσια συνδεδεμένα χρωματίνη ήταν ανοσοϊζηματοποιούνται με αντίσωμα ποντικού (anti-H3K27me3, αντι-H3K4me3 [22], αντι-ΕΖΗ2 (# 17 – 662, Millipore) και αντι-FLAG (Μ2, # F1804, Sigma)). Ο εμπλουτισμός της ειδικής ενισχυμένης περιοχής αναλύθηκε με ποσοτική PCR και το ποσοστό εμπλουτισμό του κάθε τροποποίηση άνω είσοδο της χρωματίνης του DNA που φαίνεται. Εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την ποσοτική PCR αντιστοιχεί στην περιοχή Α του

Cdh1

γονιδίου, περιοχής β του

miR-200b /α /429

γονιδίου, περιοχής β του

miR-200c /141

γονίδιο και την περιοχή α του

GAPDH

γονίδιο, αντιστοίχως, όπως περιγράφεται προηγουμένως [7].

Αποτελέσματα

Η έκφραση του JARID2 αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της ΤΟΡ-SS- επαγόμενη EMT

Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι KDM5B /PLU1 /JARID1B έπαιξε σημαντικό ρόλο στην EMT των καρκινικών κυττάρων [7]. JARID 1Β είναι μία από τις πρωτεΐνες που περιέχουν JARID JmjC τομέα και άγονες. Για να διερευνηθεί η εμπλοκή των άλλων πρωτεϊνών JARID στο EMT, εξετάσαμε για πρώτη φορά τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση του

JARID

μέλη κατά τη διάρκεια της διαδικασίας EMT. Χρησιμοποιήσαμε μία κυτταρική γραμμή καρκίνου του πνεύμονα, Α549, επειδή είναι ένα καλό σύστημα μοντέλο ΕΜΤ που δείχνει σαφή μορφολογικές μεταβολές κατά τη διάρκεια ΕΜΤ προκαλούνται από ΤΟΡ-β θεραπεία [23]. Ποσοτική RT-PCR (QRT-PCR) έδειξε ότι

JARID1B

έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα Α549 μετά την επεξεργασία του 1 ng /ml ΤΟΡ-β (Σχ. 1 Β), επιβεβαιώνοντας την προηγούμενη αποτέλεσμα [7] . Για την έκφραση του

JARID1A

,

JARID1C

και

JARID1D

, δεν παρατηρήσαμε οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές (Εικ. 1Α, 1C και 1D). Ωστόσο,

JARID2

έκφραση φάνηκε ξεκάθαρα αυξήθηκε κατά TGF-β (Σχ. 1Ε). Εξετάσαμε επίσης τις αλλαγές της έκφρασης πρωτεΐνης για JARID2. κηλίδα Western έδειξε ότι η ενδογενής έκφραση του JARID2 πρωτείνης ήταν σημαντικά αυξημένη μετά ΤΟΡ-β θεραπεία (Εικ. 1 F), γεγονός που υποδηλώνει πιθανή ρόλο της στην ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT.

ανάλυση QRT-PCR για την ανίχνευση έκφραση του

JARID1A

(Α),

JARID1B

(Β),

JARID1C

(C),

JARID1D

(D) και

JARID2

(Ε) σε κύτταρα Α549 πριν και μετά την αγωγή του 1 ng /ml ΤΟΡ-β (12 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες) (*,

P

& lt? 0,01 συγκρίνοντας ελέγχω). (F) στύπωμα Western διεξήχθη για την ανίχνευση της έκφρασης των πρωτεϊνών κατά την διάρκεια JARID2 ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT. Ως μάρτυρας, αντι-GAPDH αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να δείξει ότι ίσες ποσότητες πρωτεϊνών φορτώθηκαν στη γέλη.

Η

εξόντωση JARID2 ανέστειλε μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων που επάγεται από ΤΟΡ-β

Για να διευκρινιστεί η λειτουργία της JARID2 στο EMT, εξετάσαμε αν νοκ ντάουν του

JARID2

θα επηρεάσει τη διαδικασία EMT που προκαλείται από τον TGF-β. Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με το ρετροϊό ελέγχου ή ρετροϊού που εκφράζει

JARID2

shRNA, και τα μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΤΟΡ-β. Μετά την επεξεργασία ΤΟΡ-β, τα κύτταρα ελέγχου διεσπάρησαν, επιμήκη και προσλάβει μοιάζουν με ινοβλάστες εμφάνιση που σχετίζονται με EMT (Εικ. 2Α).

JARID2

knockdown μόνη της δεν άλλαξε σημαντικά τα σχήματα των κυττάρων, αλλά ανέστειλε μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων που επάγεται από ΤΟΡ-β (Σχ. 2Α). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον Ε-καδερίνης, ένα επιθηλιακό κύτταρο δείκτη. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Α549 ελέγχου έδειξε ετερογενή χρώση Ε-καδερίνης, και αυτό χρώση σχεδόν χαθεί σε κύτταρα ΤΟΡ-β-επεξεργασία όπως περιγράφεται προηγουμένως (Εικ. 2Β) [23]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, χρώση Ε-καδερίνης ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν σε

JARID2

knockdown κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς ΤΟΡ-β, υποδηλώνοντας ότι η επιθηλιακή ιδιότητα θα μπορούσε να διατηρηθεί σε

JARID2

knockdown κυττάρων ακόμη και μετά από ΤΟΡ-β θεραπεία. Εξετάσαμε περαιτέρω την κατάσταση των ακτίνης στα κύτταρα με χρώση TRITC-συζευγμένο φαλλοϊδίνη, αφού αναδιοργάνωση ακτίνης συμβαίνει κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ΕΜΤ [8]. Σε αντίθεση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, ΤΟΡ-β δραματικά επάγεται σχηματισμός ινών ακτίνης χαρακτηριστική EMT (Σχ. 2C). Ωστόσο, σε

JARID2

knockdown κυττάρων, δεν παρατηρήσαμε σχηματισμό ινών ακτίνης ακόμη και με την παρουσία του ΤΟΡ-β (Σχ. 2C).

(Α) Cell μορφολογικές μεταβολές των Α549 κυττάρων μετά TGF-β θεραπεία. Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ρετροϊούς που εκφράζουν ελέγχου shRNA ή

JARID2

shRNA (που περιγράφεται ως

JARID2

KD) χωρίς ή με την αγωγή του 1 ng /ml ΤΟΡ-β για 48 ώρες. εικόνες (Β) ανοσοφθορισμού των κυττάρων που δείχνει την εντόπιση της Ε-καδερίνης. Τα πάνελ των κυττάρων Α549 με την ίδια διάταξη με (Α) βάφτηκαν με αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης και με DAPI. (C) εικόνες φθορισμού των κυττάρων που δείχνουν αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης με χρώση με ΤΚΙΤΟφαλλοειδίνη (ακτίνη) και με DAPI. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm

Η

Θα εξεταστεί επίσης εάν

JARID2

νοκ ντάουν θα προκαλούσε παρόμοια αποτελέσματα σε ένα άλλο μοντέλο EMT.. Χρησιμοποιήσαμε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, ΗΤ29, επειδή ανταποκρίνεται σε ΤΟΡ-β για ΕΜΤ [7]. Για την έκφραση του

JARID1A

,

JARID1B

,

JARID1C

και

JARID1D

, QRT-PCR έδειξε ότι μόνο το

JARID1B

έκφρασης ήταν σημαντικά αυξημένη μετά την επεξεργασία των 5 ng /ml του ΤΟΡ-β (Σχ. 3Β). Η έκφραση του

JARID1D

δεν ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ΗΤ29, επειδή

JARID1D

γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα Υ-και τα κύτταρα ΗΤ29 προέρχονται από ένα θηλυκό ασθενή με καρκίνο του παχέος εντέρου. QRT-PCR και στυπώματος Western αποκάλυψαν ότι

JARID2

έκφραση ήταν επίσης αυξημένη στα κύτταρα ΗΤ29 μετά ΤΟΡ-β θεραπεία (Εικ. 3D και 3Ε). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, η θεραπεία ΤΟΡ-β επαγόμενη μορφολογικές αλλαγές, εξαφάνιση της χρώσης Ε-καδερίνης και το σχηματισμό ακτίνης ινιδίων του στρες σε κύτταρα ΗΤ29.

JARID2

ίδια νοκ ντάουν δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αλλά ανταγωνίζεται αυτούς τους TGF-β επαγόμενη φαινοτύπων (Εικ. 4). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξουδετέρωση του

JARID2

εξουδετερώθηκαν ΤΟΡ-β επαγόμενη μορφολογικές αλλαγές και αναδιατάξεις του κυτταροσκελετού των Α549 και ο καρκίνος ΗΤ29 κύτταρα χαρακτηριστικά του ΕΜΤ.

ανάλυση QRT-PCR για την ανίχνευση η έκφραση του

JARID1A

(Α),

JARID1B

(Β),

JARID1C

(C) και

JARID2

(D) σε κύτταρα ΗΤ29 πριν και μετά την επεξεργασία των 5 ng /ml ΤΟΡ-β (12 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες) (*,

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο). (Ε) στύπωμα Western διεξήχθη για την ανίχνευση της έκφρασης των πρωτεϊνών κατά την διάρκεια JARID2 ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT. Ως μάρτυρας, χρησιμοποιήθηκε αντι-GAPDH αντίσωμα.

Η

(Α) Cell μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων ΗΤ29 μετά τη θεραπεία ΤΟΡ-β. ΗΤ29 κύτταρα μολύνθηκαν με ρετροϊούς που εκφράζουν ελέγχου shRNA ή

JARID2

shRNA (που περιγράφεται ως

JARID2

KD) χωρίς ή με την επεξεργασία των 5 ng /ml ΤΟΡ-β για 72 ώρες. εικόνες (Β) ανοσοφθορισμού των κυττάρων που δείχνει την εντόπιση της Ε-καδερίνης. Τα πάνελ των κυττάρων ΗΤ29 με την ίδια διάταξη με (Α) βάφτηκαν με αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης και με DAPI. (C) εικόνες φθορισμού των κυττάρων που δείχνουν αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης με χρώση με ΤΚΙΤΟφαλλοειδίνη (ακτίνη) και με DAPI. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm

Η

εξόντωση JARID2 επηρέασαν τις αλλαγές στην έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων που προκαλείται από τον TGF-β

ΕΜΤ χαρακτηρίζεται από τις αλλαγές στα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά δείκτη. γονιδιακή έκφραση [8]. Έτσι, αναλύσαμε την έκφραση της επιθηλιακής δείκτη,

Cdh1 /E-cadherin

, και μεσεγχυματικά δείκτες,

FN1 /Ινονεκτίνης

και

βιμεντίνης

στο

JARID2

νοκ ντάουν κύτταρα. QRT-PCR έδειξε ότι ο TGF-β μείωσε την έκφραση του

Cdh1 /Ε-καδερίνης

mRNA σε κύτταρα Α549 (Σχ. 5Α), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23].

JARID2

νοκ ντάουν η ίδια δεν είχε καμία επίδραση στο

Cdh1

έκφρασης, αλλά ανέστειλε την καταστολή των

Cdh1

που προκαλείται από τον TGF-β (Σχ. 5Α). Για

FN1 /Fibronectin

και

βιμεντίνης

των οποίων οι εκφράσεις πάνω ρυθμισμένα με ΤΟΡ-β,

JARID2

knockdown ανταγωνίστηκε την επίδραση του ΤΟΡ-β (Σχ. 5Β και 5C ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι

JARID2

knockdown ανέστειλαν το πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης του TGF-β επαγόμενη EMT σε κύτταρα Α549.

ανάλυση QRT-PCR για να ανιχνευθεί η έκφραση του

Cdh1 /E-cadherin

(Α),

FN1 /Φιμπρονεκτίνης

(Β),

βιμεντίνης

(C),

ZEB1

(D),

ZEB2

(Ε),

miR-200a

(F),

miR-200c

(G) και

JARID1B

(H) σε κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ρετροϊούς που εκφράζουν ελέγχου shRNA ή

JARID2

shRNA με ή χωρίς την κατεργασία του 1 ng /ml ΤΟΡ-β για 24 ώρες (*,

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο). (Ι) στύπωμα Western διεξήχθη για να ανιχνευθεί η έκφραση της Ε-καδερίνης, ινωδονεκτίνη βιμεντίνης, ZEB1, ZEB2, φωσφορυλιωμένη Smad3 (Ρ-Smad3) και πρωτεΐνες GAPDH με τη χρήση των αντίστοιχων αντισωμάτων.

Η

Κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ διαδικασία, έχει αναφερθεί ότι η έκφραση Ε-καδερίνης ρυθμίζεται από τις μεταγραφικοί καταστολείς όπως ZEB1 και ZEB2 [10]. Έτσι, αναλύσαμε την έκφραση της Zeb καταστολείς της οικογένειας μεταγραφή στα

JARID2

νοκ ντάουν κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5D και 5Ε, θεραπεία TGF-β up-ρύθμιση της έκφρασης του

ZEB1

και

ZEB2

σε κύτταρα Α549.

JARID2

ίδια νοκ ντάουν δεν επηρέασε την έκφραση του

ZEB1

και

ZEB2

σημαντικά, αλλά ανέστειλε την TGF-β-εξαρτώμενη αύξηση των δύο μεταγραφές (Εικ. 5D και 5Ε ). Η διαπίστωση αυτή μας οδήγησε να διερευνήσει την πιθανότητα ότι το αποτέλεσμα θα μπορούσε να οφείλεται στην ρύθμιση του

miR-200

οικογένεια των microRNAs. Η

miR-200

οικογένεια έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει ZEB1 και ZEB2 ειδικά κατά τη διάρκεια της EMT [24], [25]. Έτσι, εξετάσαμε αν η

JARID2

νοκ ντάουν θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση των δύο αντιπροσωπευτικών miRNAs,

miR-200a

και

miR-200c

. Συνεπής με τις προηγούμενες εκθέσεις [24], η θεραπεία TGF-β είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη έκφραση του

miR-200a

και

miR-200c

σε κύτταρα Α549 (Εικ. 5F και 5G).

JARID2

knockdown μόνη της δεν επηρέασε την έκφραση, αλλά ανέστειλε την μειορύθμιση των δύο microRNAs που επάγεται από ΤΟΡ-β (Σχ. 5F και 5G). Στη συνέχεια εξετάστηκε η έκφραση

JARID1B

στο

JARID2

νοκ ντάουν κύτταρα, γιατί

JARID1B

βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά από TGF-β θεραπεία και να εμπλέκονται σε EMT [7]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Η,

JARID2

ίδια νοκ ντάουν δεν επηρέασε

σημαντικά την έκφραση του

JARID1B, αλλά ανέστειλε την TGF-β-εξαρτώμενη αύξηση του

JARID1B

μεταγραφή.

Αναλύσαμε επίσης τις αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης για ορισμένες από τις ΕΜΤ-συναφή προϊόντα γονιδίου σε κύτταρα Α549.

JARID2

ακυρωθεί knockdown ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη μείωση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης και αύξηση της φιβρονεκτίνης, βιμεντίνη, ZEB1 και ZEB2 πρωτεΐνες (Εικ. 5θ), η οποία μας επέτρεψε να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα QRT-PCR. Στη συνέχεια προσπάθησε να εξετάσει κατά πόσον TGF-β μονοπατιού σηματοδότησης θα απομειωθεί ή όχι το

JARID2

νοκ ντάουν κύτταρα με την ανίχνευση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών Smad3 μετά TGF-β θεραπεία [9]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Θ, οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες Smad3 προκλήθηκαν από τον TGF-β και τα επίπεδά τους ήταν παρόμοια στα κύτταρα ελέγχου και

JARID2

νοκ ντάουν κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα κατάντη Smad3 με σήμα TGF-β δεν θα επηρεαστεί από

JARID2

νοκ ντάουν. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματα του

JARID2

knockdown στη ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με ΕΜΤ-σε άλλο κυτταρική σειρά καρκίνου, ΗΤ29 (Εικ. 6). QRT-PCR αποκάλυψε ότι

JARID2

νοκ ντάουν αναστέλλεται ομοίως TGF-β-μεταβολές που προκαλούνται από

Cdh1 /E-cadherin

,

FN1 /Ινωδονεκτίνης

,

ZEB1

,

miR-200a

,

miR-200c

και

JARID1B

έκφρασης σε κύτταρα ΗΤ29 (Εικ. 6A-F), και κηλίδα Western μας έδωσε τη δυνατότητα να επιβεβαιώσει την QRT -PCR αποτελέσματα (Σχ. 6G). Αυτά τα αποτελέσματα μαζί πρότειναν ότι JARID2 δεν επηρέασε την ενεργοποίηση των κατάντη παραγόντων μεταγραφής από το σήμα ΤΟΡ-β αλλά συμμετείχε σε ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων στην κυτταρική σειρά Α549 καρκίνου του πνεύμονα και του κόλου ΗΤ29 κυτταρική γραμμή καρκίνου.

ανάλυση QRT-PCR για την ανίχνευση της έκφρασης του

Cdh1 /E-cadherin

(Α),

FN1 /Φιμπρονεκτίνης

(Β),

ZEB1

(C),

miR-200a

(D),

miR-200c

(Ε) και

JARID1B

(F) στα κύτταρα ΗΤ29 μολυσμένα με ρετροϊούς που εκφράζουν ελέγχου shRNA ή

JARID2

shRNA με ή χωρίς την κατεργασία του 5 ng /ml ΤΟΡ-β για 24 ώρες (*,

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο). Η έκφραση του

βιμεντίνης

και

ZEB2

ήταν αρχικά χαμηλή ή δεν ανιχνεύεται σε κύτταρα ΗΤ29. (G) στύπωμα Western διεξήχθη για να ανιχνευθεί η έκφραση της Ε-καδερίνης, ινωδονεκτίνη ZEB1 και πρωτεΐνες GAPDH με τη χρήση των αντίστοιχων αντισωμάτων.

Η

JARID2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της μεταγραφής Cdh1 και miR-200 οικογένεια γονίδιο από τον TGF-β μέσω της μετατροπής των ιστονών Η3 μεθυλίωσης

JARID2 είναι ένας σημαντικός συμπαράγοντας του συμπλόκου ενζύμου PRC2 που καταλύει τη μεθυλίωση της H3K27 [14], [15] και να συμμετέχουν στην μεταγραφική καταστολή στην ΟΚΕ [16] – [19]. Έτσι εξετάσαμε την μεθυλιωμένη κατάσταση της ιστόνης Η3 στις ρυθμιστικές περιοχές του

Cdh1

και

miR-200

οικογένεια γονιδίων, τα οποία μεταγραφικά κατασταλεί κατά τη διάρκεια της ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT, με χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση ( ChIP) δοκιμασία. Γενετικά, η

miR-200

οικογένεια ομαδοποιούνται σε δύο πολυκιστρονικών μονάδες:

miR-200b /200A /429

και

miR-200c /141

[26]. Μετά την ανοσοκαταβύθιση, οι ομάδες εναρκτήρα τοποθετείται ανοδικά από τις θέσεις έναρξης μεταγραφής του

Cdh1

γονίδιο και δύο συστάδες microRNA χρησιμοποιήθηκαν σε ποσοτική PCR [7].

Επειδή JARID2 μπορούν να προσλάβουν συγκρότημα PRC2 στην χρωματίνη στην ΟΚΕ [16] – [19], αναλύσαμε πρώτα την μεταγραφικά κατασταλτικά τρι-μεθυλιωμένο H3K27 (H3K27me3) κατάσταση σε κύτταρα Α549. Σχετικά με τις ρυθμιστικές περιοχές του

Cdh1

,

miR-200b /200A /429

και

miR-200c /141

γονίδια, τα επίπεδα της H3K27me3 αυξήθηκαν σημαντικά μετά ΤΟΡ θεραπεία ß (Εικ. 7), η οποία συσχετίζεται με τη μεταγραφική καταστολή των γονιδίων αυτών. Από την άλλη πλευρά, μεταγραφικά ενεργή σήματα H3K4me3 μειώθηκαν σημαντικά σε αυτές τις ρυθμιστικές περιοχές από τον TGF-β (Εικ. 7). Το πιο σημαντικό, παρατηρήσαμε την ενισχυμένη πρόσληψη ΕΖΗ2, μια καταλυτική υπομονάδα συγκρότημα PRC2, στις ακόλουθες ρυθμιστικές περιοχές μετά την αγωγή ΤΟΡ-β (Εικ. 7). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ο ΤΟΡ-β επαγόμενη πρόσληψη ΕΖΗ2 στις ρυθμιστικές περιοχές μπορεί να είναι υπεύθυνα για τη μεταγραφική καταστολή σε κύτταρα Α549.

JARID2

ίδια νοκ ντάουν δεν προκάλεσε καμία αλλαγή της ιστόνης μεθυλίωσης και πληρότητες ΕΖΗ2 σε αυτές τις περιοχές. Επιπλέον, η θεραπεία ΤΟΡ-β σε

JARID2

knockdown κυττάρων δεν έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του H3K27me3, τη μείωση του H3K4me3 και η αύξηση του ΕΖΗ2 προσλήψεων (Εικ. 7). Αυτή η παρατήρηση συσχετίστηκε με την αναστολή των TGF-β-εξαρτώμενη μεταγραφική καταστολή του

Cdh1

και

miR-200

οικογένεια γονιδίων στο

JARID2

νοκ ντάουν κύτταρα (Εικ. 5Α, 5F και 5G). Εμείς δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει την πρόσληψη ενδογενούς πρωτεΐνης JARID2 στις ρυθμιστικές περιοχές με δοκιμασία τσιπ με το αντίσωμα αντι-JARID2, πιθανώς λόγω της χαμηλής αντιδραστικότητάς του για ανοσοκαθίζηση. Ωστόσο, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι JARID2 ήταν υπεύθυνη για τον ΤΟΡ-β επαγόμενη μεταγραφική καταστολή του

Cdh1

και

miR-200

οικογένεια γονιδίων κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ των κυττάρων Α549 και ότι η λειτουργία του συνδέθηκε με το ρύθμιση της πρόσληψης της ΕΖΗ2 στο χρωματίνης για ιστόνης μεθυλίωση. Ως πείραμα ελέγχου, πραγματοποιήσαμε ανάλυση τσιπ στην ρυθμιστική περιοχή των μη συνδεδεμένων

GAPDH

γονιδίου στα κύτταρα Α549. Δεν υπήρχαν σημαντικές αλλαγές στην H3K27 και H3K4 μεθυλίωση και ΕΖΗ2 πληρότητες στην ρυθμιστική περιοχή του

GAPDH

γονίδιο από JARID2 νοκ ντάουν ή /και TGF-β θεραπεία (S3 Εικ.). Αυτό έδειξε ότι JARID2 αλλαγές που προκαλούνται από ιστόνης Η3 μεθυλίωσης και την πρόσληψη ΕΖΗ2 μπορεί να είναι ειδικές για τα γονίδια-στόχους που ρυθμίζονται από JARID2 και TGF-β, η οποία συσχετίζεται με την εξειδίκευση της μεταγραφικής ρύθμισης.

ChIP αναλύσεις H3K27me3, H3K4me3 και ΕΖΗ2 στις ρυθμιστικές περιοχές των

Cdh1

(Α),

miR-200b /200A /429

(Β) και

miR-200c /141

γονίδια (C ) σε κύτταρα Α549 δείχνονται. Οι πληρότητες των μετουσιωμένο ιστονών ή πρωτεΐνη ΕΖΗ2 στις περιοχές αναλύθηκαν με ποσοτική PCR (*,

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο) .

η

Επιπλέον, εξετάσαμε επίσης τα αποτελέσματα των

JARID2

νοκ ντάουν στην κατάσταση της ιστόνης Η3 μεθυλίωσης και πρόσληψης ΕΖΗ2 στις ρυθμιστικές περιοχές των

Cdh1

και

miR-200

οικογένεια γονιδίων σε ένα άλλο κυτταρική σειρά καρκίνου, ΗΤ29 (Εικ. 8). αναλύσεις ChIP αποκάλυψε ότι

JARID2

νοκ ντάουν τον ίδιο τρόπο αναστέλλεται TGF-β-εξαρτώμενη αύξηση των H3K27me3 και ΕΖΗ2 πληρότητες και μείωση των H3K4me3 σε αυτές τις ρυθμιστικές περιοχές (Εικ. 8). Αυτά JARID2 μεσολάβηση Δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις στην ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου GAPDH (S4 Εικ.). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά μαζί πρότεινε ότι JARID2 ήταν απαραίτητη για TGF-β-εξαρτώμενη αλλαγές των ιστονών Η3 μεθυλίωσης και πρόσληψης ΕΖΗ2 για τα συγκεκριμένα γονίδια-στόχους κατά τη διάρκεια της TGF-β επαγόμενη διαδικασία EMT των κυτταρικών σειρών Α549 και ο καρκίνος ΗΤ29.

ChIP αναλύσεις H3K27me3, H3K4me3 και ΕΖΗ2 στις ρυθμιστικές περιοχές των

Cdh1

(Α),

miR-200b /200A /429

(Β) και

miR-200c /141

τα γονίδια (C) σε κύτταρα ΗΤ29 απεικονίζεται. Οι πληρότητες των μετουσιωμένο ιστονών ή πρωτεΐνη ΕΖΗ2 στις περιοχές αναλύθηκαν με ποσοτική PCR (*,

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο) .

η

η υπερέκφραση του JARID2 ενισχυμένη TGF-β-εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση της EMT που σχετίζονται με γονίδια

για να επεκτείνει την κατανόησή μας για τη ρύθμιση των EMT από JARID2, εξετάσαμε τις επιδράσεις του

JARID2

υπερ-έκφραση σε κύτταρα Α549. Υπερέκφραση του

JARID2

επιβεβαιώθηκε από QRT-PCR και κηλίδος Western και το επίπεδο των υπερ-εκφράζεται

JARID2

δεν μεταβλήθηκε σημαντικά πριν και μετά TGF-β θεραπεία (S5 εικ.) . Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση του

Cdh1 /E-cadherin

,

FN1 /Ινωδονεκτίνης

,

βιμεντίνης

,

ZEB1, ZEB2, miR-200A

και

miR-200c

σε κύτταρα Α549 με

JARID2

υπερ-έκφραση.

JARID2

υπερέκφραση ίδια δεν δείχνουν οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των ΕΜΤ-συναφή γονίδια, αλλά ενίσχυσε τις επιδράσεις του ΤΟΡ-β στην έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων (Σχ. 9Α-G). Στο

JARID2

πάνω-κύτταρα που εκφράζουν, η έκφραση του

Cdh1, miR-200a

και

miR-200c

είχε κατασταλεί περισσότερο από τον TGF-β, και η έκφραση των

FN1

,

ZEB1

και

ZEB2

ενεργοποιήθηκε περισσότερο από τον TGF-β (Σχ. 9Α-G). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι

JARID2

υπερέκφραση ενισχυθεί το TGF-β-εξαρτώμενη μείωση της πρωτεΐνης E-cadherin και την αύξηση της Ινωδονεκτίνης, βιμεντίνη, ZEB1 και ZEB2 πρωτεϊνών (Εικ. 9Η). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του

JARID2

ενισχύεται ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ΕΜΤ των κυττάρων Α549.

ανάλυση QRT-PCR για να ανιχνευθεί η έκφραση του

Cdh1 /E-cadherin

(Α),

FN1 /Φιμπρονεκτίνης

(Β),

βιμεντίνης

(C),

ZEB1

(D),

ZEB2

(Ε),

miR-200a

(F) και

miR-200c

(G) σε κύτταρα Α549 που έχουν μολυνθεί με τα ρετροϊό ελέγχου ή ρετροϊού που εκφράζουν

JARID2

με ή χωρίς επεξεργασία του TGF-β για 24 ώρες (*,

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο? *** ,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο των συν TGF-β). (H) στύπωμα Western διεξήχθη για να ανιχνευθεί η έκφραση της Ε-καδερίνης, ινωδονεκτίνη βιμεντίνης, ZEB1, ZEB2 και πρωτεΐνες GAPDH με τη χρήση των αντίστοιχων αντισωμάτων.

Η

επόμενο προσπαθήσαμε να εξεταστεί αν

JARID2

υπερ-έκφραση σε κύτταρα Α549 θα επηρεάσει το μετουσιωμένο κατάσταση των ιστονών Η3 και την πρόσληψη ΕΖΗ2 στις ρυθμιστικές περιοχές των

Cdh1

,

miR-200b /200A /429

και

miR-200c /141

γονιδίων με ανάλυση chip. Σε αυτές τις ρυθμιστικές περιοχές,

JARID2

υπερέκφραση μόνη της δεν άλλαξε τα επίπεδα της H3K27me3 και H3K4me3 σημαντικά, αλλά ενίσχυσε τις επιδράσεις του ΤΟΡ-β και στις δύο τροποποιήσεις (σχ. 10), το οποίο συσχετίζεται καλά με την επίπεδα έκφρασης του

Cdh1

και

miR-200

οικογένεια γονιδίων. Επιπλέον,

JARID2

υπερ-έκφραση η ίδια είχε μικρή επίδραση στην ΕΖΗ2 πληρότητες, αλλά ενισχυμένη πρόσληψη ΕΖΗ2 σε αυτές τις ρυθμιστικές περιοχές μετά TGF-β θεραπεία (Εικ. 10). Θα μπορούσαμε επίσης να ανιχνεύσει την αυξημένη πρόσληψη FLAG-tagged πρωτεΐνες JARID2 στις περιφέρειες μόνο με την παρουσία του ΤΟΡ-β (Εικ. 10).