Αφηρημένο

Η αυτοφαγία είναι μια εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία που είναι υπεύθυνη για την αποδόμηση και την ανακύκλωση των κυτταροπλασματικών συστατικών μέσω autolysosomes. Στόχευση άξονας AR είναι ένα πρότυπο στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, ο ρόλος του AR σε αυτοφαγικά διεργασίες δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι AR έπαιξε αρνητικό ρόλο στην AR degrader celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία. Νοκ ντάουν του AR στο AR-θετικό καρκίνο του προστάτη κυττάρων οδήγησε σε αυξημένη αυτοφαγία. Έκτοπη έκφραση της AR στο AR-αρνητικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη, ή αύξηση της λειτουργίας της σηματοδότησης AR στο AR-θετικά κύτταρα, οδήγησε σε καταστολή της αυτοφαγία. Από miR-101 είναι ένας αναστολέας της αυτοφαγία και η έκφρασή του μειώθηκε μαζί με AR στη διαδικασία της celastrol επαγόμενης αυτοφαγία, υποθέτουμε ότι AR αναστέλλει autophagy μέσω μετενεργοποίησης του

miR-101

. AR θέση δέσμευσης ορίστηκε στα ανάντη του

miR-101

γονίδιο από λουσιφεράσης δημοσιογράφο και το chip. έκφραση MiR-101 συσχετίζονται με την ιδιότητα του AR σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Η αναστολή της celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία από AR ήταν σε κίνδυνο από το κλείδωμα miR-101? ενώ επιμόλυνση miR-101 οδήγησε σε αναστολή της celastrol επαγόμενης αυτοφαγία παρά εξάντληση AR. Επιπλέον, μεταλλαξιγένεση της θέσης δέσμευσης AR στο

miR-101

γονιδίου οδήγησε σε μειωμένη καταστολή της αυτοφαγία από AR. Τέλος, η αναστολή autophagy με miR-101 μιμητικό βρέθηκε ότι ενισχύει την κυτταροτοξική δράση του celastrol σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι AR αναστέλλει αυτοφαγία

μέσω

διενεργοποίησης του

miR-101

, έτσι ο συνδυασμός του miR-101 μιμείται με celastrol μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Παράθεση: Guo J, Huang Χ, Wang η, Yang H (2015) Celastrol Προκαλεί Autophagy από Στόχευση AR /miR-101 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (10): e0140745. doi: 10.1371 /journal.pone.0140745

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 13 Ιούν του 2015? Αποδεκτές: 30η Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Heilongjiang, Κίνα (C201432), καινοτομία Ερευνητικό Πρόγραμμα του Χαρμπίν, Κίνα (2012RFLXS011) και της Επιστημονικής Ίδρυμα Ερευνών για τη επέστρεψε στο εξωτερικό κινέζικα μελετητές, Υπουργείο Παιδείας μέλος

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αυτοφαγία είναι μια συντηρημένη διαδικασία που είναι υπεύθυνη για τον κύκλο εργασιών των μακροχρόνια. έζησε πρωτεΐνες ή αφαίρεση φθαρμένων οργανίδια σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Είναι ρυθμίζεται από σειρά γονιδίων που σχετίζονται με αυτοφαγία (ΑΤΟ) που εμπλέκονται στην έναρξη, autophagosome σχηματισμό και την ωρίμανση [1]. Autophagy κανονικά συμβαίνει σε χαμηλά βασικά επίπεδα, αλλά επάγεται σε απάντηση στο στρες ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων πείνα, υποξία, ή ορμόνη στέρησης [2]. Αυξημένη αυτοφαγία μπορεί να παρέχει ένα όφελος για τα καρκινικά κύτταρα να ασχοληθεί με τις συνθήκες που δεν είναι ευνοϊκές για να επιβιώσουν.

Celastrol, ένα τριτερπενοειδείς απομονωθεί από την παραδοσιακή κινεζική ιατρική «βροντή του Θεού Αμπέλου» έχει δείξει αποτελεσματικότητα έναντι του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη

in vitro

και

in vivo

[3, 4]. Προωθεί αποσταθεροποίηση του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μέσω αναστολής της Hsp90 ή ενεργοποίηση της καλπαΐνης [5, 6]. AR είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας στεροειδούς ενεργοποιημένου συνδέτη παράγοντες μεταγραφής. Παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, έτσι θεραπεία στέρησης ανδρογόνων μέσω της ιατρικής ή χειρουργικό ευνουχισμό είναι ένα πρότυπο στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [7]. Αποκλεισμός μονοπάτι σηματοδότησης AR έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν αυτοφαγία στο AR θετικού καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές, οι οποίες είναι ευνοϊκές για την επιβίωση των κυττάρων ή θάνατο των κυττάρων, ανάλογα με τις εφαρμοζόμενες ειδικών αναστολέων και περιβάλλοντα κυττάρου [8-11]. Επαγωγή αυτοφαγία βρέθηκε να βελτιώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από στέρηση ανδρογόνου και υποξία ή υπό συνθήκες πείνας [8, 9, 11]. AR degrader φάνηκε να προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω επαγωγής της αυτοφαγία [10]. Αρκετά μόρια, όπως Grp78 και AMPK αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση της ανδρογόνου προκαλείται από τη στέρηση αυτοφαγία [8, 9]. Ωστόσο, ως παράγοντα μεταγραφής, ο μηχανισμός με τον οποίο AR ρυθμίζει autophagy δεν έχει πλήρως κατανοηθεί. δεδομένα μικροσυστοιχιών μας έδειξαν ότι έκφραση miR-101 ρυθμισμένα προς τα κάτω όταν autophagy προκλήθηκε με celastrol. MiR-101 έχει αναφερθεί ως αναστολέας της αυτοφαγία, το οποίο καταστέλλει τόσο την επαγωγή και την ωρίμανση των αυτοφαγία με τη στόχευση

ATG4D

,

RAB5A

και

STMN1

[12]. Επιπλέον, μια θέση σύνδεσης AR είχε προβλεφθεί στην ανοδική περιοχή του

miR-101

γονίδιο [13]. Αυτά τα ευρήματα οδήγησαν την υπόθεσή μας, που celastrol προκαλεί αυτοφαγία στοχεύοντας AR /miR-101 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε την θέση δέσμευσης AR στην ανάντη περιοχή του

miR-101

γονίδιο από λουσιφεράσης δημοσιογράφο και το chip. Η έκφραση του miR-101 βρέθηκε να συσχετίζεται με την ιδιότητα AR σε καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Παρά εξάντληση AR με celastrol, επιμόλυνση miR-101 μιμούνται σε κύτταρα LNCaP οδήγησε σε αναστολή της αυτοφαγία. Όταν miR-101 έχει αποκλειστεί, AR αναστολή για αυτοφαγία ανακουφίστηκε. Επιπλέον, η μεταλλαξογένεση της θέσης σύνδεσης AR στην ανοδική περιοχή του

miR-101

γονίδιο οδήγησε σε μειωμένη αναστολή του AR-μεσολάβηση αυτοφαγία.

Υλικά και Μέθοδοι

Chemical και ολιγονουκλεοτίδια

Celastrol αγοράστηκε από την Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια συνετέθησαν με Ribio (Guangzhou, Κίνα) με τις ακόλουθες αλληλουχίες: miR-101 μιμούνται, 5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3 ‘? miRNA μιμούνται αρνητικό μάρτυρα (Ncontrol) # 22: 5’-UUUGUACUACACAAAAGU ACUG-3 ‘, miR-101 αναστολέα: 5′-UUCAGUUAUCACAGUACUGUA-3′? αναστολέας miRNA Ncontrol # 22: 5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3 ‘. siRNA για AR: 5’-GGTGATCACAGGATAGGTATT-3 ‘, siRNA για τον έλεγχο: 5′-GGGCCATGGCA CGTACGGCAAG-3’.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση κυττάρων

Ανθρώπινο προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές LNCaP, 22Rv1 , DU145 και PC-3 ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας (Shanghai, Κίνα), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco BRL Co. Ltd., USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Biological Industries, Israel) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε 37 ° C υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2/95% αέρα.

Για ανδρογόνων πείνα, LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI 1640 (Gibco BRL Co. Ltd., USA) που περιέχει 1% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS (Invitrogen, Eugene, OR, USA) για 24 ώρες πριν από τα πειράματα.

η επιμόλυνση διεξήχθη με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Eugene, OR, ΗΠΑ). Παροδική διαμόλυνση pEGFP-C1-AR ή κενό φορέα (Addgene) πραγματοποιήθηκε σε LNCaP ή PC-3 κύτταρα. Μετά την επιμόλυνση, μεσαίου αντικαταστάθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 1 ηΜ R1881. Σταθερή διαμόλυνση pEGFP-C1-AR ή κενό φορέα διεξήχθη σε κύτταρα DU145. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με R1881 (1 ηΜ) για 24 ώρες πριν από το πείραμα. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με pEGFP-LC3 (Addgene) και επιλέγονται με 0.8 mg /ml G418 (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) για να ληφθούν σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης.

πλασμίδια

pGL3-Basic ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από τον Δρ Li Yu (Harbin Institute of Technology, Κίνα). Για τη δημιουργία κατασκευάσματα ανταποκριτή, pGL3-Β-miR-101-L και pGL3-Β-miR-101-S, ένα θραύσμα DNA 1793 bp στην ανάντη του

miR-101

γονίδιο που περιέχει την προβλεπόμενη αναλυτικό αντιδραστήριο δέσμευσης τόπου και βραχύτερο θραύσμα της με διαγραφή της προβλεπόμενης θέσης δέσμευσης AR ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCT ACAT-3 ‘? 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCCACCCAGCTCACC-3 ‘, και 5′-CGCAC GCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3′? 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCC ACCCAGCTCACC-3 ‘, αντίστοιχα, και κλωνοποιήθηκε σε pGL3-Basic φορέα. Το κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει ένα θραύσμα 300 bp με την προβλεπόμενη θέση AR άγριου τύπου δέσμευσης, pGL3-Β-miR-101-WBS, ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3 ‘, και 5’-CCGCTCGAG CTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC- 3 ‘. Για να μεταλλαχθεί η θέση δέσμευσης προβλεπόμενη AR σε pGL3-Β-miR-101-WBS (ονομαζόμενο pGL3-Β-miR-101-MBS), δύο σταδίων PCR πραγματοποιήθηκε. Για το πρώτο στάδιο της PCR, οι ακόλουθοι εκκινητές (μεταλλαγμένα νουκλεοτίδια υποδεικνύονται με χαμηλότερο περιπτώσεων): 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCC TACAT-3 ‘? 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ‘, 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAA AGTTA-3′? και χρησιμοποιήθηκαν 5’-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3 ‘. Τα προϊόντα PCR που χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για το δεύτερο στάδιο της PCR, χρησιμοποιώντας το εξωτερικό ζεύγος εκκινητών.

κατασκεύασμα pGL3-Β-miR-101W δημιουργήθηκε με PCR ενίσχυση ενός θραύσματος DNA 2166 bp που περιέχει τόσο την θέση πρόσδεσης AR και η αλληλουχία του γονιδίου miR-101 χρησιμοποιώντας εκκινητές 5′-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ‘, 5′-CCGCTCGAGAT GTTACCACGCCATTTA-3′, και κλωνοποίηση εντός του pGL3-Basic φορέα. μεταλλαγμένη μορφή του κατασκευάσματος, pGL3-miR-101m, δημιουργήθηκε με PCR δύο σταδίων όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας δύο ζεύγη εκκινητών που περιέχουν ένα μεταλλαγμένο AR θέση πρόσδεσης 5’-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ‘? 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ‘, και 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAAAGTTA-3′? 5’-CCGCTCGAGATGTT ACCACGCCATTTA-3 ‘. Γράμματα σε πεζά γράμματα δείχνουν τα μεταλλαγμένα νουκλεοτίδια.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Ένα σύνολο 1.0 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για να συνθέσει συμπληρωματικό DNA χρησιμοποιώντας EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (διαγονιδιακής, Beijing, Κίνα). qPCR διεξήχθη για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης του κάθε γονιδίου χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: ATG5: 5′-GCAAGCCAGACAGGAAAAAG-3 ‘, 5′-GACCTTC AGTTGGTCCGGTAA-3′? ATG7: 5’-CAGGAGATTCAACCAGAGAC-3 ‘, 5′-AGAT ACCATCAATTCCACG G-3′? AR: 5’-CAGCAACAGCAGCAGGAAGC-3 ‘? 5’-CTTT TGCATTCGGCCAATGG-3 ‘? GAPDH: 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘? 5’-G GCATGGACTGTGGTCATGAG-3 ‘. Pri-miR-101: 5’-GTATTTCGTAGGACAGG-3 ‘? 5’-TCTACAGGAAGCGAGT-3 ‘. Δεδομένα ομαλοποιήθηκε με τα επίπεδα έκφρασης GAPDH.

έκφραση των miRNAs αναλύθηκε όπως αναφέρθηκε από Shi

et al

[14]. Εν συντομία, ολικό RNA (1 μα) πολυαδενυλιωμένα χρησιμοποιώντας Κιτ Πολυ (Α) ουράς (Ambion Inc, Foster, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο και καταβύθιση με αιθανόλη, το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με EasyScript ανάστροφης μεταγραφάσης (διαγονιδιακής, Beijing, Κίνα) και 0.5 μg πολυ (Τ) προσαρμογέας 5′-GCTGTCA ACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT (24) N (A /C /G ) -3 ‘σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Invitrogen, Eugene, OR, USA). έκφραση MiR-101 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές 5’-GCTGTCAACGATACGCTA-3 ‘και 5′-CAGTACTGTG ATAACTGAA-3’. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται ως μέσος όρος τριών πειραμάτων και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση του ενδογενούς RNA U6 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT.

Western ανάλυση κηλίδος

λύματα πλήρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 10 mM Tris -ΗΟΙ (ρΗ 8.0), 150 mM NaCl, 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο, 0.8% Triton Χ-100 και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Mannheim, Germany). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο [15]. Εν συντομία, 40 έως 100 μg πρωτεϊνών ανά φρεάτιο διαχωρίστηκαν με πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια τα ηλεκτρολογικά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά από 2 ώρες από τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες πλύθηκαν και ανιχνεύθηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-LC3, αντι-Ρ62 ποντικού και αντι-PARP (Cell Signaling Technology, USA), ποντικού αντι-GAPDH (KC-5G4) (KANGCHEN , Σαγκάη, Κίνα), AR ποντίκι (sc-816) και PSA ποντίκι (sc-7316) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). έκφραση της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με ECL (PPLYGEN, Πεκίνο, Κίνα) και εμφανίσθηκε με τη χρήση LI-COR Οδύσσεια 2800 (LI-COR Βιοεπιστημών, Lincoln, NE, USA).

δοκιμασίες λουσιφεράσης

DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (1 χ 10

5 ανά φρεάτιο) για 24 ώρες και συν-επιμολύνθηκαν με 300 ng των κατασκευασμάτων αναφοράς (pGL3-Β-miR-101-L, pGL3-Β-miR -101-S, pGL3-Β-miR-101-WBS, pGL3-Β-miR-101-MBS ή pGL3-Basic), 300 ng pEGFP-C1-AR ή pEGFP-C1 πλασμιδίων και 10 ng του pRLSV40 (Promega , San Luis Obispo, CA, USA) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Μετά την επιμόλυνση, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε R1881 (1 ηΜ) και συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλής λουσιφεράσης δοκιμασία ανταποκριτή (Promega, San Luis Obispo, CA, USA) σε ένα Turner TD20 /20 φωτόμετρο και ομαλοποιήθηκε ως προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Προσδιορισμοί

ChIP

ChIP διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, DU145 ή LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με pEGFP-C1-AR ή pEGFP-C1. Μετά από 24 ώρες διαμόλυνσης, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 1 ηΜ R1881 τη διάρκεια της νύχτας. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και διασυνδεδεμένη με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, και επαναιωρήθηκαν σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα παγωμένο (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl

2 και 10 mM KCl), ακολουθούμενη από ομογενοποίηση. Συνολικές πυρήνες επαναιωρήθηκαν σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα και κατεργασία με υπερήχους σε μέσο μήκος του DNA 200 έως 1000 bp. Κλάσματα (1%) του διατμημένου DNA αφαιρέθηκαν ως πρώτη ύλη, και το υπόλοιπο χρησιμοποιήθηκε για την ατομική αντίδραση ChIP εξίσου. Τα διαλύματα χρωματίνης προδιαυγάστηκαν με προσθήκη πρωτεΐνης Α-Sepharose (GE Healthcare, Fairfield, USA) επί 2 ώρες και επωάζονται με 10 μg του αντισώματος AR ή IgG ως αρνητικός μάρτυρας για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι /ανοσοσύμπλοκα πρωτεΐνη DNA συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στους 4 ° C, πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA και πρωτεΐνη κοκτέιλ αναστολέα), και ρυθμιστικό έκλουσης (0.1 Μ NaHCO

3 και 1% SDS). Πρωτεΐνης /DNA διασυνδέσεις αντιστράφηκαν με προσθήκη NaCl σε τελική συγκέντρωση 200 mM ακολουθούμενη από επώαση στους 65 ° C για 4 ώρες. Μετά τον καθαρισμό του DNA, πραγματοποιήθηκε PCR για την ανίχνευση της έκφρασης miR-101 χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTA CAT-3 ‘, και 5′-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3’. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν επί πηκτωμάτων αγαρόζης (2%) με βρωμιούχο αιθίδιο.

συνεστιακή μικροσκοπία

LNCaP κύτταρα με έκφραση GFP-LC3 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την επεξεργασία celastrol, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και πλύθηκαν με PBS τρεις φορές. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,05% (ν /ν) Triton Χ-100, χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (Invitrogen, Eugene, OR, USA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss, LSM 510). Ο αριθμός των GFP-LC3 στικτή ποσοτικοποιήθηκε. Επιλέχθηκαν θετικά κύτταρα τα οποία περιείχαν πέντε ή περισσότερα puncta. Πενήντα κύτταρα ανά κατάσταση ανά πείραμα αναλύθηκαν.

προσδιορισμούς ΜΤΤ

LNCaP κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (5000 /φρεάτιο). Μετά τις θεραπείες, ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε και επωάστηκε στους 37 ° C για 4 ώρες για να επιτραπεί η πλήρης διάσπαση του άλατος τετραζολίου από μεταβολικώς δραστικά κύτταρα. ρυθμιστικού λύσης κυττάρων (20% SDS, 20 mM HCI) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, ακολουθούμενη από χρωματομετρική ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα iMark Microplate Reader απορρόφηση (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) στα 595 nm.

Colony δοκιμασίες σχηματισμού

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με celastrol με την παρουσία ή απουσία του miR-101 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα ή βαφιλομυκίνης Α1 (Sangon βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα) για 24 ώρες. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα LNCaP (500 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκα έξι φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 15 ημέρες χωρίς ενόχληση. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη σε PBS και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες με πάνω από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση SPSS στατιστικού λογισμικού. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, δύο συγκρίσεις ομάδα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας t-test ζευγών του Student. Τα δεδομένα από πολλές ομάδες αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Dunnett. Για όλες τις δοκιμές, το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε ως * ή #,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Αποτελέσματα

Celastrol προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη

Στόχευση AR με celastrol για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη έχει έχει αποδειχθεί από πολλές ομάδες [3, 5]. Επειδή η αναστολή AR σχετίζεται με την επαγωγή αυτοφαγία, αν celastrol θα μπορούσε να προκαλέσει την αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη προσδιορίστηκε. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, η επαγωγή των γονιδίων autophagy σχετίζονται

ATG5

και

ATG7

παρατηρήθηκε σε πρώιμα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία celastrol σε LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 1Α). ATG7 λειτουργεί ως ουβικιτίνης Ε1-ενζύμου που μοιάζει ενώ ATG5 δρα ως υπόστρωμα ουβικιτινίωση ή Ε3 ένζυμο που μοιάζει στη διαδικασία ουβικιτινίωση δύο σταδίων [1]. Σύμφωνα με τις λειτουργίες τους στην επαγωγή αυτοφαγία,

ATG7

έδειξε υψηλότερη έκφραση και νωρίτερα ανταπόκριση από

ATG5

κατά την αγωγή celastrol (Σχήμα 1Α). Τόσο ATG5 και ATG7 απαιτούνται για την πρόσληψη LC3, σχετιζόμενης με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη η οποία διαχέεται στο κυτταρόπλασμα, να autophagosome μεμβράνη. Για την οπτικοποίηση στρατολόγηση LC3, κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί GFP-tagged LC3. puncta GFP-LC3 παρατηρήθηκαν να αυξάνουν σημαντικά μετά από 6 ώρες θεραπείας με celastrol (Σχήμα 1Β και 1Γ). Σύμφωνα, μετατροπή από LC3-Ι μορφή λιπιδίων του LC3-ΙΙ, το σήμα κατατεθέν της αυτοφαγία, ανιχνεύθηκε μετά από 3-6 θεραπείες h και αύξησε αισθητά μετά από 12-24 h θεραπεία (Εικ 1D). Ρ62 είναι ένας υποδοχέας επί της μεμβράνης autophagosome, το οποίο αποικοδομείται στο λυσόσωμα μετά autophagosome σύντηξη με αυτό [17]. πρωτεϊνικό επίπεδο ρ62 μειώθηκε μετά 6-24 ώρες αγωγή με celastrol (Σχήμα 1D), περαιτέρω επιβεβαιώνοντας ότι επάγεται celastrol αυτοφαγία σε κύτταρα LNCaP.

γονικά κύτταρα LNCaP (A, D) ή τα κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-LC3 (B, C) υποβλήθηκαν σε αγωγή με celastrol σε 2,0 μΜ για ενδεικνυόμενους χρόνους. εκφράσεις mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με autophagy μετρήθηκαν με qPCR (Α). RQ, η σχετική ποσότητα. GFP-LC3 επιμολυσμένα κύτταρα χρωματίστηκαν με DAPI μετά τις θεραπείες. GFP-LC3 puncta παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο συνεστιακό (Β) και ποσοτικοποιείται σε C. επιλέχθηκαν κύτταρα που περιείχαν πάνω από 5 puncta και πενήντα κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε επεξεργασία. D, εκχυλίσματα πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα εναντίον LC3, Ρ62 και GAPDH (έλεγχος φόρτωσης). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημασία σε σύγκριση με τον έλεγχο (0 h). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

επίπεδα έκφρασης AR αντιστρόφως συσχετίζονται με celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία

Στα ίδια δείγματα από πάνω, AR πρωτεΐνη μειώθηκε από celastrol κατά τη διάρκεια των διαδικασιών αυτοφαγία επαγωγή. επεξεργασία Celastrol προκάλεσε σημαντική μείωση στο AR επίπεδα έκφρασης σε 3-6 ώρα h σημεία και μια σχεδόν πλήρη εξάντληση σε 12-24 ώρες Χρόνος σημεία (Σχήμα 2Α). Σύμφωνα με τα παραπάνω ευρήματα, siRNA νοκ ντάουν του AR στο AR θετικά κύτταρα LNCaP οδήγησε σε ~ 2-φορές αύξηση της μετατροπής LC3-Ι LC3-ΙΙ (σχήμα 2Β). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, η πρωτεΐνη ρ62 μειώθηκε κατά AR siRNA (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι AR ρυθμίζεται αρνητικά αυτοφαγία. Συνθετικά ανδρογόνα R1881 χρησιμοποιήθηκε για την ενεργοποίηση ενδογενών σηματοδότηση AR σε κύτταρα LNCaP, η οποία αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης του AR και PSA-στόχο (Σχήμα 2C). Με AR ενεργοποίηση σηματοδότησης, αυτοφαγία ανεστάλη, όπως φαίνεται από την αύξηση του επιπέδου Ρ62 και μισή φορές μείωση της LC3-II /αναλογία LC3-Ι (Σχήμα 2C), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω ότι AR παίζει αρνητικό ρόλο στη ρύθμιση αυτοφαγία. Επιπλέον, ρΕΟΡΡ-AR διαμολύνθηκε σε κύτταρα LNCaP. Μετά τη θεραπεία celastrol, μειωμένη μετατροπή της LC3-Ι-ΙΙ LC3 ανιχνεύθηκε σε ρΕΟΡΡ-AR επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με την ψευδο διαμόλυνση (Σχήμα 2D), υποδεικνύοντας ότι η υπερέκφραση αναγκαστική AR αναστέλλεται autophagy πυροδοτείται από celastrol. Celastrol επίσης επάγεται αυτοφαγία στο AR αρνητικά κύτταρα DU145, η οποία θα μπορούσε να κατασταλεί με εξωγενή AR (Σχήμα 2Ε).

Α, κύτταρα LNCaP υπέστησαν κατεργασία με celastrol σε 2,0 μΜ για υποδεικνυόμενους χρόνους, το επίπεδο της πρωτεΐνης του AR αποκαλύφθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Β, LNCaP κύτταρα επιμολύνονται με AR siRNA ή να ελέγξει siRNA για 24 ώρες, οι επιπτώσεις στην AR νοκ ντάουν και επαγωγή αυτοφαγία επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH (έλεγχος φόρτωσης) αντισώματα AR, LC3, Ρ62 και. C, τα κύτταρα LNCaP υποβλήθηκαν σε ανδρογόνο λιμοκτονία όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι», που ακολουθείται από 1 ηΜ της θεραπείας R1881 για 24 ώρες. AR και PSA-στόχο, καθώς και διαμορφωτές αυτοφαγικά LC3 και ρ62 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH ως ένας έλεγχος φόρτωσης. LNCaP (D) ή DU145 (Ε) κύτταρα επιμολύνθηκαν με pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ή κενό φορέα (EGFP-V). D, μετά την διαμόλυνση, τα κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν στο μέσο που περιέχει R1881 (1 ηΜ) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς celastrol (CEL) στα 2,0 μΜ για 24 ώρες (D). Ε, DU145 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα προκατεργάστηκαν με R1881 (1 ηΜ) για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία celastrol ως D. LC3 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

AR διαμεσολαβεί την καταστολή του miR-101 έκφρασης από celastrol θεραπείες

για να δείτε τη συμμετοχή miRNA στη διαδικασία celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία, LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με celastrol για 12 ώρες για να προκληθεί αυτοφαγία. συστοιχία miRNA πραγματοποιήθηκε και έδειξε ότι η έκφραση του miR-101, έναν αναστολέα αυτοφαγία, μειώθηκε κατά celastrol (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Καταστολή του miR-101 έκφρασης από celastrol επιβεβαιώθηκε με RT-PCR, η οποία αποκάλυψε μια ~ 3-φορές μείωση των pri-miR-101 και ωριμάζουν miR-101 σε κύτταρα LNCaP μετά τη θεραπεία celastrol (Σχήμα 3Α, αριστερά και μέση). Αυτό συνοδεύτηκε από μια σχεδόν πλήρη εξάντληση των AR (Σχήμα 3Α, δεξιά), υποδηλώνοντας μια θετική συσχέτιση μεταξύ του AR και miR-101 έκφρασης μετά τη θεραπεία celastrol. AR είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας και θέση δέσμευσης του έχει προβλεφθεί στην ανοδική περιοχή του

miR-101

γονίδιο [13]. Έτσι, είναι κατανοητό ότι AR είναι ο μεσολαβητής της καταστολής της έκφρασης miR-101 από celastrol. Για να δοκιμάσει αυτή τη δυνατότητα, πρέπει πρώτα να καθοριστεί αν AR θα μπορούσε να συνδεθεί με την ιστοσελίδα προβλεπόμενη AR δεσμευτική στην ανάντη περιοχή του

miR-101

γονίδιο από λουσιφεράσης δημοσιογράφος. Λουσιφεράσης κατασκευάσματα αναφοράς παρήχθησαν όπως φαίνεται στο Σχ 3Β. pGL3-Β-miR-101-S (χωρίς το προβλεπόμενο AR θέση σύνδεσης) έδειξε περίπου 5-φορές μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε σύγκριση με pGL3-Β-miR-101-L (με θραύσματα που περιλαμβάνουν την προβλεπόμενη AR θέση σύνδεσης) (Σχ 3C ). Επιπλέον, pGL3-Β-miR-101-MBS στην οποία η θέση σύνδεσης AR μεταλλάχθηκε έδειξε ~ 5-φορές μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης σε σύγκριση με το pGL3-Β-miR-101-WBS που περιείχε την θέση σύνδεσης άγριου τύπου (σχ 3C) , υποδεικνύοντας ότι η συγκεκριμένη αλληλουχία είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση AR. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασίες τσιπ για να προσδιορισθεί αν AR θα μπορούσε να συνδεθεί με αυτήν την αλληλουχία. κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με pEGFP-AR ή pEGFP-V. Πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν είτε με AR αντίσωμα ή IgG ποντικού ελέγχου. Όπως ήταν αναμενόμενο, θραύσμα miR-101 που περιέχει την θέση σύνδεσης ενισχύθηκε συγκεκριμένα σε κύτταρα επιμολυσμένα με pEGFP-AR (Σχήμα 3D άνω), καταδεικνύοντας ότι AR θα μπορούσε να προσληφθεί σε αυτήν την περιοχή. Σε κύτταρα LNCaP,

miR-101

θραύσμα ενισχύθηκε μετά την παρωδία επιμόλυνση (Σχήμα 3D κάτω), δείχνουν ότι η ενδογενής AR θα μπορούσε να προσληφθεί στο είναι

miR-101

. Τέλος, AR υπερέκφραση εντελώς διασωθεί pri-miR-101 και ωριμάζουν miR-101 εκφράσεις μετά τη θεραπεία celastrol, δείχνοντας AR μεσολάβηση

miR-101 μείωσης

μεταγραφή κατά την αγωγή celastrol (Σχήμα 3Ε).

, miR-101 και AR εκφράσεις μετά celastrol (CEL) θεραπεία. **

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το DMSO. Β Σχηματική απεικόνιση της λουσιφεράσης κατασκευάζει, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Άγριου τύπου και μεταλλαγμένου θέσεις δέσμευσης AR υποδείχθηκαν με πλάγιους παύλα και σταυρό, αντίστοιχα. C, τα κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με ενδεικνυόμενη ρεπόρτερ κατασκευάσματα παρουσία pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ή pEGFP-C1 (EGFP-V) πλασμιδίου για 24 ώρες, και στη συνέχεια ανιχνεύθηκε δραστικότητα λουσιφεράσης. pRLSV40 το πλασμίδιο συν-επιμολύνθηκε για ομαλοποίηση. **

P

& lt? 0,01, μεταξύ EGFP-AR και EGFP-V επιμολύνσεις. D, δοκιμασία chip. Κυτταρικά εκχυλίσματα από κύτταρα DU145 ή LNCaP επιμολυσμένα με pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ή pEGFP-C1 (EGFP-V) ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα AR ή φυσιολογική IgG ποντικού. Εισόδου ήταν 1/100 του σε υπερήχους χρωματίνης πριν από την ανοσοκατακρήμνιση. PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Ε, LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ή κενό φορέα (EGFP-V) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με celastrol (CEL, 2,0 μΜ) ή DMSO για 3 ώρες, PRI-miR-101 και ώριμη miR-101 επίπεδα προσδιορίστηκαν με qPCR. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν τη σημασία των EGFP-AR και EGFP-V επιμολύνσεις. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

AR ρυθμίζει miR-101 έκφρασης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη

AR κατάσταση θα μπορούσε να επηρεάσει το miR-101 έκφρασης σε ανθρώπινα κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Real-Time PCR αποκάλυψε ότι τα επίπεδα έκφρασης του pri-miR-101, καθώς και ώριμα miR-101 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε AR-θετικά LNCaP και κυττάρων 22Rv1 από εκείνο στο AR-αρνητικά DU145 και PC3 κύτταρα (Σχ 4Α). AR χτυπήθηκε κάτω από siRNA σε LNCaP (Σχήμα 4Β, αριστερά) ή κύτταρα 22Rv1 (Σχήμα 4Β, δεξιά). AR νοκ ντάουν οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του ώριμου miR-101, τα οποία ήταν συγκρίσιμη με την μείωση των pri-miR-101 και στις δύο LNCaP και 22Rv1 κύτταρα (Σχήμα 4C). Αναγκαστική έκφραση AR προκάλεσε επίπεδα miR-101 αυξήθηκαν σε DU145 και PC3 κύτταρα AR-αρνητικό (Σχήμα 4D). Ομοίως, η εξωγενής AR αύξησε επίσης miR-101 μετά από θεραπεία εκφράσεις celastrol (Σχήμα 4D). Σε κύτταρα LNCaP, ενδογενή AR επανενεργοποιήθηκε από R1881 μετά ανδρογόνων στέρηση. Με την ενεργοποίηση AR (Σχήμα 4Ε, άνω), τα επίπεδα έκφρασης του miR-101 ήταν απορυθμίζεται (Εικ 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι AR κυρίως ρυθμίζει

miR-101

μεταγραφή, αλλά δεν ωρίμανση.

Α, Εκφράσεις της pri-miR-101 και ωριμάζουν miR-101 προσδιορίστηκαν σε AR θετική ή αρνητική κυτταρική γραμμές με qPCR. **

P

& lt? 0,01 μεταξύ των δύο ομάδων σε σύγκριση. Β, LNCaP ή 22Rv1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με AR siRNA ή ελέγχουν siRNA (Ctrl siRNA). AR νοκ ντάουν αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western. Εκφράσεις του pri-miR-101 και ωριμάζουν miR-101 προσδιορίστηκαν με qPCR (C). *,

P

& lt? 0,05

σε σχέση με τον έλεγχο

siRNA. D, DU145 ή PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ή κενό φορέα (EGFP-V) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή celastrol (CEL, 2 μΜ) για 24 ώρες. Εκφράσεις του ώριμου miR-101 προσδιορίστηκαν με qPCR. *,

P

& lt? 0,05 μεταξύ EGFP-AR και EGFP-V επιμολύνσεις. Ε, LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με R1881 (1 ηΜ) για 24 ώρες μετά ανδρογόνου ασιτία, όπως περιγράφεται στο Σχ 2C. επίπεδα πρωτεΐνης AR προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH ως ένας έλεγχος φόρτωσης. MiR-101 εκφράσεις προσδιορίστηκαν με qPCR. **, P & lt?. 0.01

έναντι

DMSO

Η

AR αναστέλλει celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία μέσω της ρύθμισης του

miR-101

στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

στη συνέχεια, προσδιορίζεται αν AR ρυθμίζει αρνητικά celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία μέσω της αναστολής της έκφρασης miR-101 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. MiR-101 μιμούνται χρησιμοποιήθηκε για να αυξήσει το επίπεδο miR-101 στα κύτταρα LNCaP. Με miR-101 προς τα πάνω ρύθμιση με την προσθήκη του miR-101 μιμούνται (Σχήμα 5Α, άνω), βασικό αυτοφαγία επίπεδο ανεστάλη (αναλογία LC3-II /LC3-Ι μειώθηκε κατά το ήμισυ) (Σχήμα 5Α, κάτω). Αν και AR αναγωγή με celastrol ήταν ευνοϊκό για την επαγωγή αυτοφαγία, προσθήκη miR-101 μιμούνται οδήγησε σε αναστολή autophagy όπως φαίνεται από την μισο-φορές μείωση της LC3-II /αναλογία LC3-Ι και αύξηση του επιπέδου ρ62 (Σχήμα 5Α, κάτω). Σε κύτταρα DU145, σταθερή έκφραση του εξωγενούς AR θα μπορούσε να διεγείρουν την έκφραση του miR-101 και θα μπορούσε να καταστείλει αυτοφαγία προκλήθηκε από celastrol. Όταν miR-101 ανεστάλη με προσθήκη αναστολέα miR-101, όπως προσδιορίζεται με qPCR (Σχήμα 5Β, άνω), autophagy διασώθηκε ανεξάρτητα από AR υπερέκφραση (Σχήμα 5Β, κάτω). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αρνητική AR ρόλο που διαδραματίζει στη ρύθμιση της αυτοφαγία εξαρτάται από μεταγενέστερους στόχους του. Επιπλέον, ένα ζεύγος miR-101 κατασκευασμάτων έκφρασης, pGL3-Β-miR-101-W που περιέχει τον άγριου τύπου, και pGL3-Β-miR-101-M που έχει μεταλλαγμένη ARE παρήχθησαν. pGL3-Β-miR-101-W ενίσχυσε σημαντικά miR-101 έκφραση από pGL3-Β-miR-101-Μ σε συν-επιμόλυνσης με εξωγενή AR σε κύτταρα DU145 με ή χωρίς θεραπεία celastrol (Σχήμα 5C). Σύμφωνα με την επίπεδα miR-101, συν-επιμόλυνση με pGL3-Β-miR-101-W που μπορεί να μετενεργοποιηθεί με AR έδειξε περισσότερο καταστολή επί autophagy στο βασικό επίπεδο ή celastrol επάγεται σε σύγκριση με pGL3-Β-miR-101- Μ, που δεν θα μπορούσε να αναγνωριστεί από AR (Σχήμα 5C), υποδεικνύοντας ότι AR αναστέλλει celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία μέσω της διενεργοποίησης του miR-101.

για να δούμε αν miR-101 θα μπορούσε να επηρεάσει AR καταστολή σε celastrol που προκαλείται από αυτοφαγία, AR θετικά κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με miR-101 μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο (NC) για 24 ώρες (Α), που ακολουθείται από επιπλέον κατεργασία 24 ώρες με celastrol (2,0 μΜ, CEL). επίπεδα MiR-101 προσδιορίστηκαν με RT-PCR. #,

P

& lt? 0,05

έναντι

NC επιμόλυνση χωρίς celastrol treament. **

P

& lt? 0,01 μεταξύ miR-101 και NC επιμολύνσεων με τη θεραπεία celastrol. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της LC3 και ρ62 καθώς και AR προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Β, AR κύτταρα αρνητικά DU145 επιμολύνθηκαν με pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ή κενό φορέα (EGFP-V) υπό την παρουσία του miR-101 αναστολέα (MIR-101 Inh) ή αρνητικό έλεγχο (NC). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε celastrol (2,0 μΜ, CEL) για επιπλέον 24 ώρες. επίπεδα MiR-101 προσδιορίστηκαν με RT-PCR. #,

P

& lt? 0,05

έναντι

EGFP-V συν επιμολύνσεις NC. *,

P

& lt? 0,05 μεταξύ EGFP-V και ΕΟΡΡ- AR παρουσία αναστολέα miR-101. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του AR, LC3and ρ62 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. C, τα κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με pGL3-Β-miR-101-W (με δεσμευτικές άγριου τύπου AR θέση) ή pGL3-Β-miR-101-M (με μεταλλαγμένο AR θέση σύνδεσης), μαζί με τον φορέα έκφρασης AR (EGFP- AR) ή κενό φορέα (EGFP-V) για 24 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή celastrol (CEL, 2,0 μΜ) για επιπλέον 24 ώρες. επίπεδα MiR-101 προσδιορίστηκαν με RT-PCR. #,

P

& lt? 0,05

έναντι

EGFP-V συν pGL3-Β-miR-101-M επιμολύνσεις. *,

P

& lt? 0,05 μεταξύ pGL3-Β-miR-101-M και pGL3-Β-miR-101-W επιμολύνσεις. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του AR, LC3 και ρ62 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας GAPDH ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

AR ρυθμίζει miR-101 έκφρασης χωρίς να επηρεάζουν τον κυτταρικό θάνατο

Από τη μείωση AR επίσης προκαλεί μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, εάν η παρατηρούμενη καταστολή και autophagy επαγωγή miR-101 οφείλονταν σε κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκε. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανταγωνιστή AR MDV3100 (Enzalutamide) για διαφορετικούς χρόνους. Όπως ήταν αναμενόμενο, AR πρωτεΐνη μειώθηκε (Σχήμα 6Α).