Αφηρημένο

Ιστορικό

Ιδιαίτερα ευαίσθητες και ειδικές εξετάσεις ούρων με βάση την ανίχνευση είτε πρωτογενή ή υποτροπιάζοντα καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχουν αποδειχθεί άπιαστο μέχρι σήμερα. συνεχώς αυξανόμενη γνώση μας για τις γονιδιωματικής εκτροπές στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης θα πρέπει να επιτρέπει την ανάπτυξη τέτοιων δοκιμών με βάση την ουρική DNA.

Μέθοδοι

Το DNA που εξάγεται από σφαιρίδια κυττάρου ούρα και PCR χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν τις περιοχές του

TERT

υποκινητή και κωδικές περιοχές των

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

KDM6A

και

ΚΧΚα

οι οποίες μεταλλάσσονται συχνά στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα προϊόντα της PCR ήταν γραμμωτό κωδικό, συνενώθηκαν και αντιστοιχισμένο-άκρο 2 χ 250 αλληλούχιση bp εκτελείται σε Illumina MiSeq. Ακράτεια DNA αναλύθηκε από 20 μάρτυρες μη καρκίνου, 120 ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο της ουροδόχου κύστης (41 pTa, 40 ρΤ1, 39 pT2 +) και 91 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης μετά TURBT (89 χωρίς καρκίνο).

Αποτελέσματα

Παρά τις μικρές ποσότητες DNA που εξάγεται από μερικά σφαιρίδια κυττάρων στα ούρα, 96% των δειγμάτων απέδωσε σημαίνει ανάγνωσης βάθη & gt? 500. Αναλύοντας μόνο έχουν αναφερθεί στο παρελθόν μεταλλάξεις σημείου,

TERT

μεταλλάξεις βρέθηκαν στο 55% των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης (ανεξάρτητα του σταδίου),

FGFR3

μεταλλάξεις σε 30% των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης,

PIK3CA

σε 14% και

ΤΡ53

μεταλλάξεις σε 12% των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Συνολικά, αυτά τα προηγουμένως αναφερθεί κύστη μεταλλάξεις καρκίνος ανιχνεύθηκαν σε 86 από 122 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης (70% ευαισθησία) και σε μόνο 3 από τους 109 ασθενείς χωρίς ανιχνεύσιμη καρκίνο της ουροδόχου κύστης (97% ειδικότητα).

Συμπέρασμα

Αυτή η απλή, οικονομικά αποδοτική προσέγγιση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη μη επεμβατική επιτήρηση των ασθενών με μη-μυών-διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις. Η μέθοδος έχει μια απαίτηση χαμηλών εισροών DNA και μπορεί να ανιχνεύσει χαμηλά επίπεδα μεταλλαγμένου DNA σε μεγάλη περίσσεια του κανονικού DNA. Τα γονίδια αυτά αντιπροσωπεύουν ένα ελάχιστο πίνακα βιοδείκτη στο οποίο θα μπορούσαν να προστεθούν επιπλέον δείκτες για την ανάπτυξη ενός εξαιρετικά ευαίσθητο διαγνωστικό τεστ για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Ward ΓΔ, Baxter L, Gordon NS, Ott S, Savage RS, Beggs μ.Χ. , et al. (2016) Multiplex PCR και Next Generation Sequencing για την ανίχνευση μη επεμβατική καρκίνου της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 11 (2): e0149756. doi: 10.1371 /journal.pone.0149756

Επιμέλεια: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 21 του Σεπτεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 4 του Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Ward et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Το ποσοστό των μεταλλαγμένων διαβάζει χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για όλα τα γραφήματα, τις ευαισθησίες, τις ιδιαιτερότητες, κ.λπ., και αυτά παρουσιάζονται για κάθε θέση σε κάθε δείγμα στον πίνακα S2

Χρηματοδότηση:. το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Wellcome Trust ακολουθούν επιχορήγηση -on-ταμείο που διαχειρίζεται το Πανεπιστήμιο του Birmingham. BCPP χρηματοδοτείται από Cancer Research UK, το Πανεπιστήμιο του Birmingham και το Μπέρμιγχαμ και το The Black Country και West Midlands Βόρεια και Νότια ολοκληρωμένη τοπική ερευνητικών δικτύων, και χρηματοδοτείται από το Πανεπιστήμιο του Birmingham. Η συλλογή biospecimen BCPP υποστηρίζεται από χρηματοδότηση της Μπέρμιγχαμ ECMC. DGW χρηματοδοτείται από μια φιλανθρωπική δωρεά στο Πανεπιστήμιο του Birmingham στην υποστήριξη της έρευνας για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες : NGS, επόμενης γενιάς αλληλουχίας? UBC, urothelial καρκίνου της ουροδόχου κύστης? NMIBC, μη μυών διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης? MIBC, διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Εισαγωγή

Ευέλικτη κυστεοσκόπηση, σε συνδυασμό με την κυτταρολογική εξέταση των ούρων, είναι το χρυσό πρότυπο προσέγγιση για την ανίχνευση όγκων της ουροδόχου κύστης. Μακροχρόνια επιτήρησης για υποτροπή μετά τη θεραπεία είναι τόσο επαχθής για τους ασθενείς και ακριβό για τους παρόχους υγειονομικής περίθαλψης. Από καιρό έχει ελπίσει ότι μία δοκιμή βασισμένη σε μόρια που απελευθερώνονται στα ούρα από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να μειώσει την εξάρτηση από κυστεοσκόπηση, ωστόσο, μέχρι σήμερα επαρκώς ευαίσθητες και ειδικές εξετάσεις δεν έχουν αναπτυχθεί και υιοθετηθεί από τους κλινικούς γιατρούς [1].

Οι υφιστάμενες ουροποιητικού βιοδείκτες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης όπως NMP22 και ΒΤΑ στερούνται ευαισθησίας για χαμηλού βαθμού νόσημα και μπορεί να είναι αυξημένα ψευδώς λόγω μη κακοήθεις συνθήκες και αιματουρία [1]. Μεγάλες προσπάθειες έχουν αναλωθεί στην ανακάλυψη του ουροποιητικού βιοδείκτες για την μη επεμβατική ανίχνευση καρκίνου της ουροδόχου κύστης με ιδιαίτερη επιτυχία επιτυγχάνεται μετρώντας όγκου ειδικές παραλλαγές νουκλεϊκού οξέος [2,3,4]. Πρόσφατες γονιδιωματική και transcriptomic πειράματα έχουν δείξει ότι χαμηλής ποιότητας NMIBC και CIS /HG-NMIBC /MIBC έχουν διακριτά προφίλ μετάλλαξης και γονιδιακής έκφρασης, και ότι ακόμη και μέσα υπάρχει NMIBC σημαντική ετερογένεια (αναθεωρηθούν [5]). Έτσι, φαίνεται πιθανό ότι ένα πάνελ βιοδεικτών που καταγράφει την πολυμορφία των UBC θα απαιτείται για την αξιόπιστη ανίχνευση της νόσου.

Οι εξετάσεις ούρων με βάση DNA δείχνουν σημαντική υπόσχεση για τη μη επεμβατική ανίχνευση των UBC. Θεωρητικά, εάν το DNA όγκος είναι παρόν, μπορεί να ενισχυθεί με PCR και να ανιχνευθεί ειδική για τον καρκίνο αλλοιώσεις. Δύο από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης με hotspots σημείο-μετάλλαξη είναι

FGFR3

[6] και

TERT

[7,8,9,10]. Και οι δύο έχουν αξιολογηθεί ως βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε ουρική DNA σε ξεχωριστές μελέτες [7,11,12], αλλά δεν έχουν συνδυαστεί σε μία δοκιμασία που βασίζεται NGS. Η

TERT

υποκινητής είναι μεταλλαγμένο περίπου στο 65% των όγκων της ουροδόχου κύστης, ανεξάρτητα από το στάδιο και βαθμό [13] και αποτελεί την καλύτερη ενιαία βιοδείκτη για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης με μια πρόσφατη έκθεση του 62% ευαισθησία στο 90% ειδικότητα για ανίχνευση του πρωτογενούς όγκους της ουροδόχου κύστης [7].

Έχουμε αναπτύξει τώρα μια δοκιμασία που χρησιμοποιεί υψηλής thoughput βαθιά αλληλούχιση των περιοχών των 6 UBC σχετίζεται γονίδια, τα οποία περιέχουν hotspots μετάλλαξη και αναλύθηκαν ουροποιητικού DNA από 232 ασθενείς για την αξιολόγηση είναι η ικανότητα να μη επεμβατική ανίχνευση UBC. Θεωρητικά, βαθιά αλληλούχιση πρέπει αξιόπιστα να ανιχνεύσει ακόμη και πολύ χαμηλά επίπεδα του DNA του όγκου σε μεγάλη περίσσεια DNA μη-όγκου. Επιπλέον, αυτή η τεχνολογία ωριμάζει στο σημείο όπου γίνεται μια ρουτίνα προσέγγιση σε κλινικά εργαστήρια γενετικό έλεγχο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα δείγματα ελήφθησαν μετά από γραπτή συγκατάθεση και έγκριση από τα αρμόδια συμβούλια επανεξέταση των εθνικών ερευνητικών ηθικής Ηνωμένο Βασίλειο (αναφορές εθνική Υπηρεσία Ερευνητικής δεοντολογίας που αναφέρονται παρακάτω)? υπογεγραμμένα έντυπα συγκατάθεσης διεξήχθησαν μέσα σε μεμονωμένα αρχεία ασθενών, με τη συγκατάθεση τεκμηριώνεται στις σχετικές βάσεις δεδομένων της μελέτης.

Οι ασθενείς UBC και μη UBC συλλέχθηκαν ως μέρος του προγράμματος καρκίνο της ουροδόχου κύστης πρόγνωση, BCPP (NRES Επιτροπή Ανατολή Midlands- Derby: 06 /MRE04 /65), η οποία ενσωματώθηκε υποψήφιους συλλογή biospecimen για την έρευνα των βιοδεικτών

Μια δεύτερη συλλογή ούρων (NRES Επιτροπή North West-Haydock:. 15 /NW /0079) πραγματοποιήθηκε από ασθενείς που υποβάλλονται σε επιτήρηση μετά TURBT για NMIBC

ασθενείς

Τα ούρα συλλέχθηκαν από τρεις ομάδες ασθενών:. «μη-UBC», «UBC» και «μετα-UBC». Οι ασθενείς UBC και μη UBC συλλέχθηκαν ως μέρος του προγράμματος του West Midlands «καρκίνο της ουροδόχου κύστης πρόγνωση, 2005-11 (BCPP, που περιγράφεται λεπτομερώς εδώ: [14]). Εν συντομία, μέσο του ποταμού ούρων (20-50 ml) συλλέχθηκε κατά τη στιγμή της διάγνωσης από ασθενείς με κυστεοσκοπική ευρήματα ενδεικτικά πρωτοπαθούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης? ούρων φυγοκεντρήθηκε και σφαιρίδιο και το υπερκείμενο αποθηκεύθηκε στους -80 ° C. Μετά τη συλλογή του δείγματος, κάθε ασθενής υποβλήθηκε TURBT και οριστική διάγνωση με ιστοπαθολογική εξέταση του αφαιρεθέντα ιστού. Από πρωτοβάθμια ουροδόχου κύστης

καρκίνωμα in situ

(CIS) είναι μια σπάνια βλάβη στην ομάδα BCPP και αλλού [15], οι ασθενείς με πρωτοπαθή ΚΑΚ αποκλείστηκαν καθώς δεν είχαμε επαρκείς αριθμούς για να είναι σε θέση να αντλήσει έγκυρα συμπεράσματα. Ορισμένοι ασθενείς που προσλαμβάνονται για να BCPP και που έδωσαν δείγματα ούρων στη συνέχεια διαγιγνώσκονται με μη-κακοήθεις ουρολογικές παθήσεις, και περιλαμβάνονται στη μελέτη οι ασθενείς «μη-UBC».

Σε ξεχωριστή είδηση, μια δεύτερη προοπτική συλλογή ούρων διεξήχθη σε το West Midlands κατά τη διάρκεια του 2012 από μια ανεξάρτητη ομάδα 91 ασθενών που υποβλήθηκαν σε επιτήρηση μετά TURBT για NMIBC, και χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο συλλογής ούρων. Με την εξαίρεση των 2 ασθενείς, όλοι οι ασθενείς ήταν απαλλαγμένη από την ασθένεια κατά την ημερομηνία της συλλογής ούρων ( «μετα-UBC ‘ομάδα). Οι 2 ασθενείς με υποτροπιάζουσα νόσο προστέθηκαν στην ομάδα UBC. Μεταγενέστερες κυστεοσκόπηση δεδομένα ήταν διαθέσιμα για 38 ασθενείς του 89 ‘μετά UBC », και δεν παρουσίασαν καμία περαιτέρω υποτροπές σε ένα μέσο όρο 8 μήνες. DNA εκχυλίστηκε από ιζήματα ούρων χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης DNA ούρων για αποφλοιωμένα κύτταρα και βακτήρια (NorgenBiotek.com) και εκλούεται σε 100 μΐ απιονισμένου νερού.

PCR και barcoding

Μια ενιαία ενίσχυση PCR πολυπλέκτη χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει 16 αμπλικόνια στο

TERT

υποκινητή και κωδικές περιοχές των

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

ΚΧΚα

και

KDM6A

(αλληλουχίες εκκινητή στο S1 πίνακα). Η μέθοδος PCR προσαρμόστηκε από Allory

et al

[7], όπως το

TERT

περιοχή του υποκινητή είναι δύσκολο να ενισχύσει και τις αρχικές προσπάθειες που χρησιμοποιούν πολλές άλλες πολυμεράσες απέτυχε. ενισχύσεις PCR αποτελούνταν από 9 μΙ DNA, 10 μΐ KAPA2G Robust DNA πολυμεράσης (KapaBiosystems) και 1 μΙ εκκινητές (0.2 μΜ τελική για κάθε εκκινητή). Το πρόγραμμα PCR ήταν: 95 ° C για 3 λεπτά, 35 x 95 ° C για 15s, 60 ° C για 15s, 72 ° C για 15s που ακολουθείται από 3 λεπτά στους 72 ° C (οι αλληλουχίες εκκινητή που παρέχονται στον Συμπληρωματικές πληροφορίες, Πίνακας S1 ). Τα προϊόντα της PCR αραιωμένο κατά 1/100 με απιονισμένο νερό και 10 barcodes bp προστεθεί από ένα δεύτερο κύκλο 15 PCR χρησιμοποιώντας KAPA2G Στιβαρό DNA πολυμεράσης και μόνο barcodes πρόσβασης κατεύθυνση array για Illumina sequencers (Fluidigm).

αλληλουχίας και ανάλυση δεδομένων

Τα γραμμικό κώδικα PCR προϊόντων αναμίχθηκαν και καθαρίζονται με χάντρες AMPure. Τα συγκεντρωτικά αμπλικόνια αναμίχθηκαν στη συνέχεια 7: 3 με PhiX (Illumina), μετουσιωμένη και συγκεντρωμένα σε 18:00 σε μια κυψελίδα ροής 500 κύκλου Miseq και η αλληλουχία (250 κύκλους προς τα εμπρός, 10 κύκλοι barcode, 250 κύκλοι πίσω). αρχεία Raw ίχνος υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με cutadapt (έκδοση 1.8.1, Python 2.6.6) σε ζεύγη τέλος λειτουργία για να αφαιρέσετε τις αλληλουχίες προσαρμογέα, και να φιλτράρει τα ζεύγη με αλληλουχία & lt? 100 nt να αποκλείσει σύντομο αντικείμενα ανάγνωσης. Τοπικές ευθυγραμμίσεις των διαβάζει στο γονιδίωμα hg19 πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση bowtie2 (έκδοση 2.2.4) σε ζεύγη τέλος λειτουργία. αρχεία ευθυγράμμιση SAM μετατράπηκαν σε αρχεία BAM, διαλογή και ευρετήριο χρησιμοποιώντας samtools (έκδοση 0.1.19). αρχεία BAM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μπαμ-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount), & lt? όριο ποιότητας ελάχιστη βάση οριστεί στο 0