Αφηρημένο

Κεφαλής και Τραχήλου πλακωδών κυττάρων Καρκίνωμα (HNSCC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου, που επηρεάζουν κάθε χρόνο πάνω από μισό εκατομμύριο άνθρωποι σε όλο τον κόσμο. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αποδεκτές βιοδεικτών για την κλινική διάγνωση και παρακολούθηση των HNSCC. Σε αυτό το έργο, μια ολοκληρωμένη γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση των επιγενετικών αλλαγών σε πρωτογενείς όγκους HNSCC χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με τα στατιστικά στοιχεία ακραία ειδική για τον καρκίνο να ορίσει νέα γονίδια βιοδείκτη που είναι διαφορικά μεθυλιώνονται σε HNSCC. Οι 37 υποψήφιοι που προσδιορίζονται βιοδεικτών ήταν γονιδίων ακραία κορυφαία σκορ με εξέχουσα διαφορική μεθυλίωση σε όγκους, αλλά χωρίς σήμα σε φυσιολογικούς ιστούς. Αυτές οι υποθετικές υποψήφιοι επικυρώθηκαν σε ανεξάρτητες ομάδες HNSCC από ίδρυμα και TCGA (ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas) μας. Χρησιμοποιώντας τα κορυφαία υποψηφίων,

ZNF14

,

ZNF160

, και

ZNF420

, αναπτύχθηκε μία δοκιμασία για την ανίχνευση του καρκίνου HNSCC σε δείγματα πρωτογενούς ιστού και σιέλου με 100% ειδικότητα όταν σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα ελέγχου. Δεδομένης της υψηλής εξειδίκευσης ανίχνευση, η ανάλυση των ZNF μεθυλίωσης του DNA σε συνδυασμό με άλλους βιοδείκτες μεθυλίωσης του DNA μπορεί να είναι χρήσιμη στο κλινικό περιβάλλον για την ανίχνευση και επιτήρηση HNSCC, ιδιαίτερα σε ασθενείς υψηλού κινδύνου. Αρκετές επιπλέον υποψήφιοι που προσδιορίζονται μέσα από αυτό το έργο μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω προς τη μελλοντική ανάπτυξη ενός πάνελ πολλαπλών γονιδίων των βιοδεικτών για την επιτήρηση και τον εντοπισμό των HNSCC

Παράθεση:. Gaykalova DA, Vatapalli R, Wei Υ, Tsai HL, Wang Η, Zhang C, et al. (2015) Finger ακραίων τιμών Ανάλυση Καθορίζει ψευδάργυρος Gene Οικογένεια μεθυλίωσης του DNA σε όγκους και το σάλιο του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου ασθενείς. PLoS ONE 10 (11): e0142148. doi: 10.1371 /journal.pone.0142148

Επιμέλεια: Kwok-Wai Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10 του Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 18 Οκτώβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Gaykalova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Affymetrix Έκφραση Δεδομένων . διατίθεται σε GEO33205 και Illumina μεθυλίωση δεδομένων σε GEO33202

Χρηματοδότηση: το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής και Κρανιοπροσωπικής Έρευνας και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Challenge Grant (RC1DE020324)? Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής και Κρανιοπροσωπικής Έρευνας και επιχορήγηση του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (Ρ50 DE 019032 καρκίνο κεφαλής και τραχήλου SPORE) με JAC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κεφαλής και Τραχήλου πλακωδών κυττάρων Καρκίνωμα (HNSCC) επηρεάζει περίπου 60.000 άτομα στις Ηνωμένες Πολιτείες και 600.000 άτομα σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο [1, 2]. HNSCC συνήθως προκαλούνται από τον καπνό και την έκθεση αλκοόλ, καθώς επίσης και από ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) [1]. Παρά τις προόδους στην κατανόηση της βιολογίας HNSCC, περίπου το ήμισυ του συνόλου των ασθενών με HNSCC υποκύψει στην ασθένεια εντός πέντε ετών από τη διάγνωση [2-4].

Είναι πλέον ευρέως παρατηρηθεί ότι σε ολόκληρο το γονιδίωμα υπομεθυλίωση, συνοδευόμενη από γονίδιο-ειδικό υπερμεθυλίωση προαγωγού, είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό των συμπαγών όγκων [5, 6]. Ο υποστηρικτής υπερμεθυλίωση έχει περιγραφεί για ένα εκτεταμένο αριθμό γονιδίων, και συνήθως οδηγεί σε ογκοκατασταλτικού γονιδίου μεταγραφική καταστολή [3]. Λόγω του υψηλού ποσοστού των ανωμαλιών μεθυλίωσης του DNA σε καρκινικά κύτταρα καθώς και σταθερότητα σήματος μεθυλίωσης του DNA κατά την κυτταρική διαίρεση, η ανίχνευση της μεθυλίωσης του DNA είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την ανάπτυξη των βιολογικών δεικτών για την ανίχνευση και την πρόγνωση [7-9] καρκίνου. Αρκετές δοκιμασίες μεθυλίωσης ολόκληρου γονιδιώματος έχουν πραγματοποιηθεί για τον καθορισμό της μεθυλίωσης του DNA υπογραφή του HNSCC [5, 10-14]. Μεθυλίωσης του DNA των

DCC

,

EDNRB

,

DAPK

,

CCNA1

,

p16

,

HOXA9

και

KIF1A

γονίδια έχουν ανιχνευθεί σε πρωτογενείς ιστούς και βιολογικά υγρά, συμπεριλαμβανομένου σάλιο και πλάσματος [7, 10, 15, 16], που προέρχονται από ασθενείς HNSCC. Μεθυλίωσης του DNA πολλών άλλων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

MINT31

,

MGMT

,

NID2

,

ERCC1

, και

Timp3

, έχουν έχουν προταθεί ως βιοδεικτών HNSCC που μπορεί να ανιχνευθεί σε Biofluids ενός ασθενούς [11, 16]. Άλλα γονίδια, όπως

CYGB

,

RASSF1A

,

SPARC

,

GSTM1

,

cyclinA1

,

ΜΧ1

,

WIF1

,

GNG7

,

CYP1A1

,

ZNF132

,

ZNF154

, και

ZNF447

έδειξαν υψηλά ποσοστά μεθυλίωσης του DNA σε πρωτογενείς όγκους HNSCC [13, 14, 16-23], και είναι υποψήφιες για περαιτέρω επικύρωση ανίχνευσης μεθυλίωσης του DNA στα σωματικά υγρά. Γονιδίωμα-ευρύ ταυτοποίηση επιγενετικώς μεταβάλλεται γονιδίων σε HNSCC ενισχύει την κατανόηση των μηχανισμών της καρκινογένεσης. Επιπλέον, αυτές οι προσεγγίσεις μπορεί να αποκαλύψει νέες καρκίνο συγκεκριμένα γεγονότα μεθυλίωσης του DNA που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη στρατηγικών μοριακή ανίχνευση σε χειρουργικά όρια ή τα σωματικά υγρά [7, 24-27].

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η ανίχνευση μεθυλίωσης του υποκινητή

EDNRB

και

DCC

σε ασθενείς με υψηλού κινδύνου στοματικές αλλοιώσεις έχει παρόμοια απόδοση στη διάγνωση ως ειδικός κλινική αξιολόγηση [25]. Παρ ‘όλα αυτά, οι δοκιμές χρησιμοποιώντας

DCC

και

EDNRB

μεθυλίωση προαγωγού περιορίζεται στο 46% ευαισθησία και 72% ειδικότητα για την ανίχνευση του καρκίνου σε σιελογόνους εκπλύσεις [25]. Ενώ η χαμηλή ευαισθησία μπορεί να περιορίζεται από τη σπανιότητα των αλλαγών σχετίζονται με τον καρκίνο [11, 25, 28], χαμηλή ειδικότητα εγείρει τεχνικά προβλήματα. Παρά το γεγονός ότι η αύξηση του ορίου ανίχνευσης της δοκιμής μπορούν να αυξήσουν την ειδικότητα [10, 25], αυτό απαιτεί επιπλέον χειρισμούς τιμή αποκοπής που δεν είναι πρακτικό σε κλινικό περιβάλλον. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση νέων δεικτών DNA με απόλυτη εξειδίκευση σε ιστούς του καρκίνου μπορεί να βελτιώσει τις τρέχουσες πάνελ βιοδεικτών και να ενισχύσει την πιθανή κλινική εφαρμογή των στρατηγικών μοριακή ανίχνευση [7, 24-26]. Χαμηλή ευαισθησία των επιμέρους βιοδεικτών που είναι εξαιρετικά ειδικό για τους ιστούς του καρκίνου μπορεί να ξεπεραστεί με το συνδυασμό αρκετών πολύ συγκεκριμένα γονίδια στα πάνελ χωρίς να θυσιάζεται η συνολική ειδικότητα [11].

Λόγω του συνολικού χαρακτήρα του τεχνικές υψηλής απόδοσης, χιλιάδες διαφορικά μεθυλιωμένα περιοχές μπορούν να ανιχνευθούν ενώ συγκρίνοντας όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων [10]. Η ετερογένεια των γενετικών και επιγενετικών αλλαγών σε συμπαγείς όγκους παρουσίασε προκλήσεις στην χρήση συμβατικών στατιστικών προσεγγίσεων, όπως t-δοκιμές ή δοκιμές σήματος προς θόρυβο. Οι δυσκολίες αυτές μπορούν να ελαχιστοποιηθούν με τη χρήση των αναλύσεων ακραία που βασίζονται στην παροχή ενός μέτρου της στατιστικής σημασίας για ετερογενή αλλοιώσεις σε όγκους. Ακραίων τιμών με βάση ανάλυση παρείχε ένα μηχανισμό για τον ορισμό σημαντικές, αλλά διαφορετικές, μεταβολές σε καρκίνους. Η τυπική μέθοδος που χρησιμοποιείται στην έρευνα για τον καρκίνο για ακραία ανάλυση είναι ο καρκίνος ακραίων τιμών Ανάλυση Προφίλ (COPA [29]), η οποία συγκρίνει τις ακραίες τιμές σε μια εμπειρική null. Για την εξάλειψη των ακραίων τιμών με χαμηλό σήμα, το έργο αυτό υλοποιείται στατιστικές COPA-βάση με μια προσέγγιση ακραία rank sum, καθώς και τον καθορισμό ενός ελάχιστου επιπέδου για τη σύγκληση μιας ακραία [30]. Αυτό είναι το πρώτο χαρτί που χρησιμοποιούν την ανάλυση ακραίων τιμών [30] για την ανακάλυψη βιοδεικτών.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Πρωτοβάθμια καρκινικούς ιστούς και τα δείγματα ταιριάζουν σιελογόνων ξέβγαλμα συλλέχθηκαν από HNSCC ασθενών στο Johns Hopkins Hospital μετά από ενημέρωση, λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Johns Διοικητικό Συμβούλιο Εσωτερικής κριτική Hopkins Medicine (JHM IRB) και εκτελείται υπό NA_00036235 ερευνητικό πρωτόκολλο. Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητες ομάδες των δειγμάτων του ασθενούς HNSCC και φυσιολογικά δείγματα ελέγχου. Όλα τα ανθρώπινα υποκείμενα που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη ήταν de-εντοπίστηκαν μετά την συλλογή κλινικών δεδομένων. Η ομάδα ανακάλυψη αποτελείται από 44 πρωτογενείς ιστούς HNSCC και 25 φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου από uvulopalatopharyngoplasty (UPPP) χειρουργικές επεμβάσεις των ασθενών της ομάδας ελέγχου μη-καρκίνου επηρεάζονται από προηγούμενα δημοσιευμένες μελέτες [31-33]. Η ανεξάρτητη ομάδα επικύρωσης περιλαμβάνονται πρωτογενείς ιστούς όγκου και αντίστοιχα δείγματα των σιελογόνων ξέβγαλμα από 59 ασθενείς HNSCC, 31 δείγματα φυσιολογικού ιστού UPPP, και 35 δείγματα των σιελογόνων ξέβγαλμα από μη καρκινικές ασθενείς. Όλα πρωτογενούς ιστού και δείγματα σωματικών υγρών αποθηκεύτηκαν στους -140 ° C μέχρι τη χρήση. Όλα τα δείγματα πρωτογενούς ιστού αναλύθηκαν από ερευνητές από το Τμήμα Παθολογίας του Johns Hopkins Hospital (WHW και JAB). δείγματα όγκου επιβεβαιώθηκαν να είναι HNSCC και στη συνέχεια μικροτομή να αποδώσει τουλάχιστον 75% καθαρότητα του όγκου. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των δύο ομάδες που αναφέρονται στο S1 και S2 πίνακες. Η κατανομή των HNSCC υπο-τύπους και στις δύο ομάδες είναι αντιπροσωπευτική της κατανομής της κεφαλής και του τραχήλου, τόσο στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε όλο τον κόσμο, συμπεριλαμβανομένων των ~ 30% των σχετιζόμενων με τον HPV (HPV +) στοματοφαρυγγική SCC περιπτώσεις. Η ισχύς αυτής της ανακάλυψης ομάδα, και την καταλληλότητά του για πολλαπλές αναλύσεις έχει αποδειχθεί σε πολλές προηγούμενες δημοσιεύσεις [31-34]. Σε μια προσπάθεια να μειωθούν οι προκαταλήψεις και να αποκτήσουν ισχυρή καρκίνο ανεπηρέαστη ελέγχους, ασθενείς της ομάδας ελέγχου επιλέχθηκαν τυχαία από τα διαθέσιμα δείγματα ιστών UPPP και σιελογόνων ξεπλένει, αλλά τα κλινικά χαρακτηριστικά δεν ήταν σε θέση να ταιριάζουν.

προετοιμασία του DNA

μικροδιατομή δείγματα ιστού όγκου ή 250 μΙ κλάσματα του δείγματα σιέλου χωνεύτηκαν σε διάλυμα 1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) (Sigma) και διαλύματος 50 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ (Invitrogen) στους 48 ° C για 48-72 ώρες. DNA καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου και καταβύθιση αιθανόλης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. DNA επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό Lote, και η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Scientific).

παρασκεύασμα RNA

RNA απομονώθηκε από τα δείγματα ιστού μικροδιατομή με την mirVana miRNA κιτ απομόνωσης ( Ambion) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή, και η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το NanoDrop.

Πίνακες

Δέκα μικρογραμμάρια του RNA και του DNA υποβλήθηκαν στην διευκόλυνση Johns Hopkins πυρήνα για το ερώτημα του ελέγχου της ποιότητας και την ανάλυση δειγμάτων από συστοιχίες υψηλής απόδοσης. Τα δείγματα τρέχουν σε Affymetrix HuEx1.0 GeneChips (που περιέχει 1,4 εκατομμύρια ανιχνευτές) για την ανάλυση της έκφρασης και Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChips (διερευνητικά 27578 CpG δινουκλεοτίδια) για την ανάλυση της μεθυλίωσης μετά από μετατροπή διθειώδους. Όλες οι συστοιχίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και τα στοιχεία που αναφέρθηκαν προηγουμένως [31-33]. Affymetrix Έκφραση δεδομένα είναι διαθέσιμα σε GEO33205 και Illumina μεθυλίωση δεδομένα είναι διαθέσιμα σε GEO33202. Και τα δύο σύνολα δεδομένων είναι διαθέσιμα σε GEO superSeries GSE33232. Τα δεδομένα μπορεί να έχει πρόσβαση σε https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE33232.

HPV ανάλυση

εκθέσεις Παθολογίας σχετικά με το HPV καθεστώς της στοματοφαρυγγικής SCC όγκους ελήφθησαν από το Τμήμα Johns Hopkins Hospital Παθολογία. Επιπλέον, η κατάσταση HPV όλων στοματοφαρυγγικής ιστούς πρωτογενούς όγκου SCC επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα με ποσοτική PCR (qPCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές HPV16 και ανιχνευτές για την PCR πραγματικού χρόνου της μηχανής [7] σε σχέση με CaSki κυτταρική γραμμή, που είναι γνωστό ότι έχουν 600 (ATCC) αντίγραφα του HPV16 ανά γονιδίωμα. Δείγματα με αριθμό HPV αντίγραφο ≥ 1 αντίγραφο /γονιδιώματος /κύτταρο ταυτοποιήθηκαν ως HPV θετικά.

κατεργασία όξινου θειώδους και όξινου θειώδους γονιδιωματική αλληλούχιση

Ο EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για να μετατρέψει μη μεθυλιωμένη κυτοσίνες σε γενωμικού DNA σε ουρακίλη. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ενισχύθηκε με εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας MethPrimer [36, 37] (S3 πίνακα). Ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκαν εντός της νησίδος CpG που περιβάλλει την περιοχή του υποκινητή με άμεση γειτνίαση με τους ανιχνευτές συστοιχία μεθυλίωσης. Το αντιπροσωπευτικό δείγμα από την ομάδα ανακάλυψη επιλέχθηκαν με βάση την υψηλότερη διαφορές στην μεθυλίωση και ταυτόχρονη έκφραση όπως υπολογίζεται κατά τη διάρκεια ακραία τιμή ανάλυση για κάθε επιμέρους γονίδιο. Όξινο θειώδες αλληλουχίας επιλέχθηκε για αυτό το στάδιο, προκειμένου να εξακριβωθεί η απόλυτη (δεν συγγενής ή κανονικοποιημένη) κατάσταση μεθυλίωσης των πολλών δινουκλεοτίδια CpG στο νησί CpG κοντά υποκινητή του κάθε γονιδίου. Touch-down PCR διεξήχθη [38]. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το QIAquick 96 PCR Kit Ο καθαρισμός (Qiagen) και καθαρισμένα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας (Genewiz). κατάσταση Gene μεθυλίωσης προσδιορίστηκε ως trichotomous μεταβλητή (μη μεθυλιωμένα, ημι-μεθυλιωμένο, ή υπερμεθυλίωση) σύμφωνα με την αλληλουχία διαβάζει.

Ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR (QMSP)

Για QMSP, εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ειδικώς περιλαμβάνουν δινουκλεοτίδια CpG που έδειχναν αλλαγές στη μεθυλίωση, όπως φαίνεται από όξινο θειώδες αλληλούχιση. QMSP διεξήχθη επί του πραγματικού χρόνου PCR μηχάνημα με κανονικοποίηση προς μη μεθυλιωμένο

έλεγχος

αναφοράς β-ακτίνης [39]. Η μηχανή Taqman ΡΟΚ ορίστηκε σε 38 κύκλους μέγιστο για την εξάλειψη των ψευδώς θετικά σήματα. Όξινο θειώδες μετατρέπεται λευκοκυττάρων DNA από ένα υγιές άτομο χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. Το σχετικό επίπεδο του μεθυλιωμένου DNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε ως η αναλογία του ενισχυμένου γονιδίου σε

β-ακτίνης

[40] και πολλαπλασιάζεται επί 100. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται μπορούν να βρεθούν στο S3 Πίνακα.

αντίστροφη Μεταγραφή και Ποσοτική Real Time PCR

Ένα μg RNA από την ομάδα επικύρωση μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δοκιμασιών έκφρασης γονιδίου-ειδική (S3 Πίνακας) και η Universal PCR Master Mix στην PCR πραγματικού χρόνου μηχανή 7900HT (όλα από την Applied Biosystems) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η έκφραση του γονιδίου που ενδιαφέρει προσδιορίστηκε ποσοτικά εις τριπλούν σε σχέση με το

GAPDH

και

18S

έκφρασης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT [41].

Στατιστική ανάλυση

μεθυλίωσης κανονικοποίηση των δεδομένων.

για τα δεδομένα μεθυλίωση προαγωγού, β τιμές (ποσοστό μεθυλίωσης) υπολογίστηκαν από μη μεθυλιωμένο (U) και μεθυλιωμένα (Μ) μετρήσεων με βάση το επίπεδο του ανιχνευτή. εκτιμήσεις επίπεδο γονιδίου παρήχθησαν επιλέγοντας τα υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ όλων των ανιχνευτών που συνδέονται με το ίδιο γονίδιο (14.477 γονίδια συνολικά).

.

δεδομένα γονιδιακής έκφρασης

Σημαντικές πυρήνα αποφασιστικότητα καθετήρα ομαλοποιήθηκε με ισχυρή multi ανάλυση -array μέσο όρο (RMA) χρησιμοποιώντας το πακέτο Bioconductor ολιγο [42, 43]. εκτιμήσεις επίπεδο γονίδιο που παράγεται από το RMA με τη χρήση των βασικών ανιχνευτών, αποδίδοντας 22.011 γονίδια για την ανάλυση [31, 32].

αποκομμένη ανάλυση.

Η τυπική μέθοδος που χρησιμοποιείται στην έρευνα για τον καρκίνο για ακραία ανάλυση είναι ο καρκίνος ακραία Προφίλ Ανάλυση (COPA), το οποίο συγκρίνει τις κατανομές ακραίων τιμών σε μια εμπειρική null παράγεται από μετάθεση της κατηγορίας ετικέτες [29]. Μια προσέγγιση ποσό ακραία τροποποιημένο βαθμό, όπως τροποποιήθηκε από Ghosh [44], χρησιμοποιήθηκε, στην οποία ελάχιστα επίπεδα αλλαγής τέθηκαν για τον ορισμό ενός ακραία [30]. Αυτό εξαλειφθεί πολλές ακραίες τιμές στις οποίες η αλλαγή δεν ήταν βιολογικά νόημα (π.χ., μεθυλίωση μεταβολή μικρότερη από το 10% μεταξύ οποιωνδήποτε δύο δείγματα). Οι στατιστικές αυτές εφαρμόζονται στο σύνολο δεδομένων μεθυλίωση ανακάλυψη του DNA, που περιέχει 14.477 γονίδια για ιστούς 44 του όγκου, στην οποία σηματοδοτεί από 25 φυσιολογικά δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί το σημείο αποκοπής της γραμμής βάσης για κάθε γονίδιο. Αριστερά-ουρά και δεξιά ουρά ακραίες τιμές προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της rank-sum [45]. Ακραία βαθμολογίες υπολογίστηκαν για τα δύο δεξιά ουρά και αριστερή ουρά περιπτώσεις, η οποία επέτρεψε τον ορισμό των ακραίων τιμών που υπερμεθυλίωση και μεθυλιωμένος σε όγκους, αντίστοιχα [30, 45]. Δεδομένου ότι η ακραία ανάλυση δεν έχει βαθμολογία cut-off, επιλέχθηκε ένα κατώτατο όριο για να αποδώσει περίπου 50 top-βαθμολόγησης γονίδια. Αυτή η βαθμολογία αποκοπής 13,2 εντοπίστηκαν 37 κορυφαία υποψήφιοι για περαιτέρω επικύρωση (S4 Πίνακας).

Έκφραση-μεθυλίωση συσχέτιση.

κανονικοποιημένα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης συσχετίστηκε με τα επίπεδα μεθυλίωσης υποστηρικτής των υποψηφίων μεθυλίωση χρησιμοποιώντας συσχέτισης Spearman rank (πίνακας 1).

η

συσχέτιση και Συμφωνία της ανίχνευσης μεθυλίωσης του DNA.

Οι συσχετίσεις των ZNF σημάτων μεθυλίωσης του DNA μεταξύ πρωτογενών καρκινικών ιστών και των σιελογόνων κοντίσιονερ (ανιχνεύεται με δοκιμασία QMSP ) μεταξύ των ασθενών HNSCC από την ομάδα επικύρωση αξιολογήθηκαν μέσω του συντελεστή και κάπα συντελεστή Spearman του. Συμφωνία συμφωνία υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας στατιστικά στοιχεία κάπα.

Ευαισθησία και Ειδικότητα Ο ποσοτικός προσδιορισμός.

Οι τιμές QMSP μεθυλίωσης για τα δείγματα σιέλου υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια πρότυπη μέθοδο καμπύλης και κανονικοποιήθηκαν σε έλεγχο φόρτωσης μεθυλίωσης του DNA-ανεξάρτητο (

β-ακτίνης

). επίπεδο μεθυλίωση του κάθε γονιδίου υποβλήθηκε σε επεξεργασία ως δυαδική μεταβλητή (μεθυλιωμένο έναντι μη μεθυλιωμένο) με διχοτομηθεί τη μεθυλίωση στο μηδέν ανίχνευση μεθυλίωσης του DNA με QMSP. Τα υποκείμενα με διάγνωση HNSCC ορίστηκαν ως «παρουσία της ασθένειας», και το «απουσία ασθένειας» άτομα ορίστηκαν με φυσιολογικούς μάρτυρες. Αληθινή θετική, αληθινό αρνητικό, ψευδώς θετικά και ψευδώς αρνητικά ποσοστά στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για τα μεμονωμένα γονίδια. Για τον συνδυασμό των δεικτών, ο ασθενής ταξινομήθηκε ως «θετικό τεστ» εάν οποιοδήποτε από τα σημειωτές ήταν θετικές, και «δοκιμή αρνητική» εάν όλες οι δείκτες ήταν αρνητικοί. Η ευαισθησία υπολογίστηκε ως το ποσοστό των ασθενών που ήταν θετικό τεστ μεταξύ εκείνων με νόσο, και ειδικότητα υπολογίστηκε ως το ποσοστό των ασθενών που ήταν αρνητικό τεστ μεταξύ εκείνων χωρίς εξέλιξη της νόσου. Το 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI) για την ευαισθησία και ειδικότητα, όπως υπολογίστηκαν υποθέτοντας διωνυμική κατανομή [46].

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των διαφορικά μετουσιωμένο γονίδιο ακραίες τιμές

Από γονιδίωμα-ευρεία διαφορική ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από 44 πρωτογενείς όγκους και 25 φυσιολογικούς ελέγχους ιστού, οι υποψήφιοι βιοδείκτη επιλέχθηκαν με βάση σχετικά με το καθεστώς φαίνεται στην Εικόνα 1. Με βάση τον αριθμό των δειγμάτων ακραία και η σχετική ένταση του σήματος, 37 από τα κορυφαία υποψηφίων κατάταξης επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (S4 πίνακα). Συσχέτιση των στοιχείων έκφρασης και συστοιχία μεθυλίωση επέτρεψε την ανακάλυψη της 24ης υποψηφίων γονιδίων (από 37 αρχικών γονιδίων) με βιολογικώς σχετικό αρνητική συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης του DNA και γονιδιακή έκφραση (Πίνακας 1). Αξίζει να σημειωθεί ότι όλοι οι 24 υποψήφια γονίδια έδειξαν υπερμεθυλίωση και μειωμένη έκφραση σε δείγματα όγκων. Επιπλέον, όλοι οι υποψήφιοι έδειξαν ελάχιστο σήμα μεθυλίωσης του DNA σε φυσιολογικούς ιστούς, με μέγιστη μέση τιμή β-αξία για φυσιολογικά δείγματα των 0.058, ή 6% μεθυλίωση (S1 Σχ και S5 Πίνακα). Το πρότυπο t-test έδειξαν ότι 23 από τα 24 γονίδια (96%) είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά στο DNA μεθυλίωση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών όλα τα δείγματα και μεταξύ των φυσιολογικών και HPV- δείγματα όγκων. Ένα γονίδιο,

CCND2

, δεν ήταν στατιστικά σημαντική βάση ένα t-test, ωστόσο αυτό έκανε καταδεικνύουν τη διαφορά μεταξύ του όγκου και φυσιολογικά δείγματα από Ακριβής δοκιμασία Fisher βασίζεται στην παρουσία υπερμεθυλιωμένων ακραίων τιμών σε δείγματα όγκων.

Σχηματική σκιαγράφηση της ενιαίας προσέγγισης που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη, η οποία συνδυάζει την διαλογή υψηλής απόδοσης της μεθυλίωσης του DNA και την έκφραση του γονιδίου για την ανακάλυψη κοόρτη του HNSCC: απασχόληση των δεδομένων συστοιχίας μεθυλίωσης του DNA με 27.578 ανιχνευτές συνολικό? κανονικοποίηση των δεδομένων σε R, 14.477 γονίδια σύνολο? ακραία ανάλυση και cut-off για να λάβει περίπου 50 κορυφαία γονίδια (βαθμολογία 13,2 ακραία? 37 κορυφαία γονίδια πέρασε, δείτε Μέθοδοι για λεπτομέρειες)? Ενσωμάτωση των κανονικοποιημένων δεδομένων από τη δοκιμασία έκφρασης (22.011 γονίδια)? υπολογισμοί συντελεστής συσχέτισης του Spearman (24 γονίδια που πέρασε)? 7 ZNFs επικύρωση θειώδους αλληλουχίας? qRT-PCR, 5 ZNFs επικύρωση γονιδιακής έκφρασης? Επικύρωση 3 ανίχνευσης ZNF QMSP σε δείγματα σάλιου και του όγκου σε διάφορες πληθυσμιακές ομάδες.

Η

Η αυξημένη μεθυλίωση και μειωμένη μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης σε οι HPV- ασθενείς

Είναι γνωστό ότι ο HPV + και HPV- περιπτώσεις HNSCC διαφέρουν σε τοπίο τους γενετικών και επιγενετικών αλλαγών [5, 12, 47, 48]. Με το διαχωρισμό 44 ασθενείς HNSCC με βάση την κατάσταση του HPV, προσδιορίστηκε ότι το 92% (22 από 24) γονιδίων είχαν σημαντικά υψηλότερα μεθυλίωση σε HPV- HNSCC, σε σύγκριση με κανονικά δείγματα (S5 πίνακα). Μόνο το 4% (1 από 24) οι υποψήφιοι έπρεπε μεθυλίωσης του DNA σε δείγματα HPV + HNSCC σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με φυσιολογικά δείγματα (S5 Πίνακας). Η πλειοψηφία, 54% (13 από 24) γονιδίων είχαν σημαντικά υψηλότερα μεθυλίωση σε HPV- HNSCC, σε σύγκριση με HPV + δείγματα, σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα στοιχεία [12]. Τα δείγματα όγκων είχαν μια αντίστοιχη μείωση της έκφρασης υποψηφίου γονιδίου (S1 σχήμα και S6 πίνακα). Έτσι, το 71% (17 από 24) των γονιδίων έδειξε μια σημαντική μείωση της έκφρασης του γονιδίου σε όλα τα δείγματα HNSCC σύγκριση με τα φυσιολογικά δείγματα? 75% (18 από 24) γονίδια έδειξαν μια σημαντική μείωση στην έκφραση του γονιδίου σε δείγματα HPV- σύγκριση με τα φυσιολογικά δείγματα? και 21% (5 από 24) γονιδίων είχαν μειωθεί σημαντικά την έκφραση του γονιδίου σε δείγματα HPV- σε σύγκριση με HPV + δείγματα. Η μειωμένη έκφραση του γονιδίου σε δείγματα όγκων ήταν σύμφωνη με τη συνολική αύξηση της μεθυλίωσης προαγωγό σε δείγματα όγκων (S1 Σχήμα και στον Πίνακα 1).

Επικύρωση υπερμεθυλίωση υποστηρικτής των υποψηφίων γονιδίων

Για να επικυρώσετε την διαφορική μεθυλίωση καθεστώς των νησιών CpG κοντά στην περιοχή του υποκινητή των 24 επιλεγμένων υποψήφια γονίδια, διθειώδες αλληλούχιση διεξήχθη επί 5 δειγμάτων αντιπροσωπευτική της κανονικής βλεννογόνου δειγμάτων και 5 δείγματα πρωτογενούς όγκου HNSCC από την αρχική ομάδα ανακάλυψη. Από τους 24 γονίδια, 22 (92%) έδειξε αυξημένη μεθυλίωση σε όγκους σε σχέση με κανονικά δείγματα (Σχήμα 2). Είκοσι υποψήφια γονίδια (84%) παρουσίασαν μεθυλίωση σε περισσότερο από το 50% του πρωτοπαθούς όγκου, συμπεριλαμβανομένων των

ADFP

,

FUZ

,

ZNF71

,

ENPP5

,

ZNF211

,

και ZNF14

(Σχήμα 2). Bisulfite δεδομένα αλληλούχισης συσχετίζεται έντονα με τα αποτελέσματα από τα δεδομένα συστοιχία, στην οποία ελάχιστη μεθυλίωσης του DNA ανιχνεύθηκε σε φυσιολογικά δείγματα (S1 Σχ και Σχήμα 2).

Τα αποτελέσματα αλληλούχισης Bisulfite φαίνεται στο 5 δείγματα όγκων HNSCC και 5 φυσιολογικούς ιστούς από την αρχική ομάδα ανακάλυψη για τους 24 top-βαθμολόγησης υποψήφια γονίδια (Πίνακας 1). Σκιασμένες μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν πλήρως μετουσιωμένο υποστηρικτές, γκρι κουτιά αντιπροσωπεύουν ημι-μεθυλιωμένο υποστηρικτές και λευκά κουτιά αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα υποστηρικτές.

Η

Ψευδάργυρος υποψήφιοι Finger Πρωτεΐνη

Διαπιστώθηκε ότι 7 από τα 24 υποψήφια γονίδια ήταν μέλη της ομάδας δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη (ZNF), και επιπλέον ανάλυση έγινε σε αυτή την ομάδα. Για να επεξεργαστεί σχετικά με τους υποψηφίους ZNF, μεθυλίωση του DNA αναλύθηκε σε ένα ξεχωριστό ομάδα επικύρωσης των 59 όγκων και 31 φυσιολογικούς ιστούς (S2 Πίνακας). Χρησιμοποιώντας μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας διθειώδες, σημαντική αύξηση της μεθυλίωσης του DNA για πέντε από τα γονίδια που ανιχνεύθηκε σε αυτή την ομάδα (S7 πίνακα). Ωστόσο, μειωμένη μεθυλίωση του DNA των

ZNF141

υποστηρικτής στην ομάδα επικύρωσης σε αντίθεση με τα δεδομένα ανακάλυψη ομάδα, και δεν μεθυλίωση του DNA ανιχνεύθηκε σε

ZNF211

σε δείγματα από την ομάδα επικύρωσης. Όλων των υπόλοιπων πέντε γονίδια πρωτεϊνών ZNF,

ZNF14

,

ZNF160

,

ZNF71

,

ZNF420

και

ZNF585B

, η μεθυλίωση του DNA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε δείγματα όγκων, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελέγχους (S7 πίνακα).

ZNF μειορρύθμιση συνδέεται με μεθυλίωση προαγωγού

για να αξιολογηθεί η υπόθεση ότι η έκφραση των μεμονωμένων γονιδίων πρωτεΐνης ZNF επηρεάζεται από μεθυλίωση των υποκινητών τους, ανάλυση qRT-PCR διενεργήθηκε εν συνεχεία για

ZNF14

,

ZNF71

,

ZNF160

,

ZNF420

και

ZNF585B

έκφραση στα δείγματα από μια ανεξάρτητη ομάδα επικύρωσης (S2 σχήμα). Όλες εκτός από

ZNF71

παρουσίασαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης σε δείγματα όγκων συγκριτικά με φυσιολογικούς ιστούς, το οποίο ήταν σύμφωνο με αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης. Ο διαχωρισμός των δειγμάτων του όγκου σύμφωνα με την κατάσταση του HPV όγκου έδειξαν ότι η έκφραση ZNF δεν ήταν σημαντικά διαφορετική σε HPV- και HPV + ασθενής ομάδες (S2 Εικ και S7 Πίνακα).

ZNF ανίχνευση μεθυλίωσης DNA είναι εξαιρετικά ειδικό για την πρωτογενή ιστούς HNSCC

με βάση τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης του DNA, έγινε η υπόθεση ότι ZNF μεθυλίωση θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί ως κλινικά εφαρμόσιμη βιοδείκτη για HNSCC. Έτσι, QMSP εκκινητών και δοκιμασίες ανιχνευτή σχεδιάστηκαν για

ZNF14

,

ZNF160

και

ZNF420

. Ένα εξαιρετικά ειδική δοκιμασία QMSP για

ZNF585B

δεν θα μπορούσε να σχεδιαστεί λόγω της υψηλής πυκνότητας του CpG.

Οι προσδιορισμοί QMSP πρώτα επικυρωθεί και για τα τρία γονίδια ZNF σε δείγματα ιστού. Παρόμοια με όξινο θειώδες αποτελέσματα αλληλουχίας, αναλύσεις QMSP δεν ανιχνεύσει μεθυλίωση του DNA σε οποιαδήποτε φυσιολογικά δείγματα, αλλά μεθυλίωση του DNA ανιχνεύθηκε στο

ZNF14

,

ZNF160

και

ZND420

στο 44,1% , 39% και 32,2% των όγκων, αντίστοιχα. Τουλάχιστον ένας ZNF μεθυλιώθηκε σε 57,6% των καρκινικών ιστών. (Πίνακας 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι το 17% των ασθενών (10 από 59) είχαν μεθυλίωσης ανιχνεύεται σε όλες τις τρεις υποκινητές ZNF. Ελαφρώς υψηλότερα ποσοστά μεθυλίωσης του DNA παρατηρήθηκαν στην ομάδα HPV-, αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 3).

Δεικνύονται ZNF QMSP αποτελέσματα σε 59 δείγματα πρωτογενούς όγκου και των σιελογόνων ξέβγαλμα HNSCC σε σύγκριση με φυσιολογικό πλάσμα και τα δείγματα σιέλου ξέβγαλμα από την ομάδα επικύρωσης. μεθυλίωση προαγωγού ZNF ποσοτικοποιήθηκε σε σχέση με BACT μεθυλίωση και πολλαπλασιάζεται επί 100. Plus (+) ή μείον (-) αναφέρεται σε κατάσταση HPV τους από τους ασθενείς με καρκίνο. NS = δείγμα κανονική σιελογόνους έκπλυσης (n = 35), Ν = φυσιολογικό πρωτεύοντες ιστούς (n = 31), TS = σιαλογόνων έκπλυσης από ασθενείς HNSCC (n = 59, 41 του HPV + [TS +] και 18 του HPV- [TS-] ), T = δείγματα πρωτογενούς όγκου από ασθενείς HNSCC (n = 59). Δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη μεθυλίωση ZNF DNA σε φυσιολογικά δείγματα. Σημαντική (p & lt? 0,05). Διαφορά μεταξύ των ομάδων που σημειώνονται με αστερίσκο (*), όπως υπολογίζεται από την ακριβή δοκιμασία Fisher

Η

ZNF DNA ανίχνευση μεθυλίωσης σε TCGA ομάδα

Για την επικύρωση ZNF μεθυλίωσης του DNA και συσχέτιση με την έκφραση σε διάφορες πληθυσμιακές ομάδες HNSCC, είχαν κατεβάσει τα συστοιχία Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip και RNA-Seq δεδομένων και αναλύονται από την ομάδα HNSCC Cancer Genome Atlas (TCGA), το οποίο περιέχει 279 όγκους HNSCC, συμπεριλαμβανομένων των 36 HPV +, με συμφωνημένα φυσιολογικά δείγματα. ZNF μεθυλίωσης του DNA ήταν ελάχιστη σε TCGA φυσιολογικά δείγματα (S3 Εικ και S10 Πίνακα), σε συμφωνία με τα δεδομένα ανακάλυψη και ομάδα επικύρωσης. Και οι τρεις ZNFs είχαν ισχυρή αρνητική συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA και της έκφρασης, ιδιαίτερα

ZNF420

(S3 Εικ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, από όλους τους ανιχνευτές μεθυλίωσης του DNA που διατίθενται από TCGA, ανιχνευτές μέσα στο

ZNF420

υποκινητή είχε το υψηλότερο ποσοστό μεθυλίωσης του DNA σε δείγματα HNSCC με ελάχιστη ανίχνευση μεθυλίωσης σε φυσιολογικά δείγματα. Συνολικά, παρατηρείται μια υψηλή αντιστοιχία ανάμεσα στην ανακάλυψη, την επικύρωση και ομάδες TCGA για την ανίχνευση της μεθυλίωσης υποστηρικτής ZNF χρησιμοποιώντας τέσσερις διαφορετικές τεχνικές για την ανίχνευση της μεθυλίωσης του DNA (S9 Πίνακας).

ZNF ανίχνευσης μεθυλίωσης του DNA ως υποψήφιους βιοδείκτες HNSCC

για να ελέγξετε την απόδοση των ανεπτυγμένων δοκιμασίες QMSP για ZNFs για την ανίχνευση της μεθυλίωσης του DNA στα σωματικά υγρά, σε συνδυασμό χρησιμοποιήθηκαν δείγματα σιέλου ξέβγαλμα από τους ασθενείς ομάδα επικύρωσης HNSCC. Σύγκριση των σημάτων μεθυλίωσης του DNA στα δείγματα των σιελογόνων ξέβγαλμα των HNSCC και μη-καρκινικές ασθενείς έδειξε ότι η εξειδίκευση της συνδυασμένης πίνακα ZNF να ανιχνεύσει HNSCC σε αυτά τα σωματικά υγρά ήταν 100% (95% CI: 89,9% – 100%), και το ευαισθησία ήταν 22% (95% CI: 12,3% – 34,73%) (Πίνακας 3). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η εξερεύνηση των ZNF μεθυλίωσης συσχέτιση με κλινικά δεδομένα από διάφορες στατιστικές αναλύσεις δεν έδειξαν καμία σημαντική ενώσεις.

Η

Συζήτηση

Παρά την ανάπτυξη της υψηλής τεχνολογίας απόδοσης και τον εντοπισμό των πολλά υποσχόμενων δείκτες της μεθυλίωσης του DNA, κανείς δεν HNSCC βιοδείκτη έχει σήμερα γίνει αποδεκτή για την κλινική διάγνωση και παρακολούθηση. Μια βασική ανησυχία που προτάθηκε πρόσφατα βιοδεικτών HNSCC είναι το υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Όπως HNSCC είναι μια ιδιαίτερα ετερογενής νόσος, είναι δύσκολο να καθοριστεί μια ενιαία βιοδείκτη τόσο με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα [10, 11, 25]. Πολλοί πρότεινε βιοδείκτες έχουν βάσιμες ευαισθησία αλλά σχετικά χαμηλή εξειδίκευση, καθώς και συνδυασμοί αυτών των βιοδεικτών θα ήταν πιθανόν να οδηγήσει σε αύξηση του ποσοστού των ψευδώς θετικών [25]. Χρήση συμβατικών στατιστικών μεθόδων μπορεί να υποτιμούν ετερογενείς μεταβολές στην κακοήθεια? Ωστόσο, αυτές οι προκλήσεις μπορούν να ξεπεραστούν με τη χρήση που αναπτύχθηκε πρόσφατα την ανάλυση ακραίων τιμών προσαρμόστηκε από COPA. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη δημοσιευμένη εργασία που χρησιμοποιεί ακραία ανάλυση για την ανάπτυξη της μεθυλίωσης του DNA βιοδείκτη. Ενώ η ομάδα ZNF των υποψηφίων που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία παρέχεται 100% ειδικότητα, πρόσθετες μελέτες μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία με την επικύρωση περισσότερο μεθυλιωμένα υποψηφίων γονιδίων για την ανάπτυξη μιας μεθυλίωσης που βασίζονται πάνελ πολλαπλών γονιδίων DNA του βιοδεικτών HNSCC.

Υπάρχουν είναι ένας αριθμός δημοσιεύσεων που χρησιμοποιούν υψηλής απόδοσης ανάλυση μεθυλίωσης του DNA, ωστόσο πολλοί έχουν περιορισμένη κοόρτη μεγεθών [11-13]. Αυτή η μελέτη ήταν σε θέση να χρησιμοποιήσει ένα παρελθόν που δημοσιεύθηκε ομάδα που αποτελείται από 44 όγκων και 25 φυσιολογικούς μάρτυρες για την ανακάλυψη πιθανών μετουσιωμένο βιοδεικτών. Επιπλέον, βιοδείκτες έχουν επιπλέον επικυρωθεί σε μια μεγαλύτερη ανεξάρτητη ομάδα (με 59 δείγματα όγκων) και σε TCGA (δείγματα 279 όγκων). Η χρήση του Illumina 27 DNA συστοιχίας μεθυλίωση, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία από άλλους [10-14], επιτρέπεται για τον ορισμό των πολύ ειδικό υποψήφιους βιοδείκτες για HNSCC. Ωστόσο, αναγνωρίζεται ότι πιο ολοκληρωμένη πλατφόρμες μεθυλίωσης του DNA μπορεί να επιτρέψει την ανακάλυψη του μεγαλύτερου αριθμού των υποψηφίων αλλαγές.

Συσχέτιση της μεθυλίωσης και της έκφρασης είναι ένα άλλο ισχυρό εργαλείο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη για τον εντοπισμό βιολογικά σχετικές αλλαγές μεθυλίωσης ότι πιθανό να συμβεί νωρίτερα στην ανάπτυξη του καρκίνου [10, 14]. Μόνο αλλαγές μεθυλίωσης που συμβαίνουν νωρίτερα στην ανάπτυξη του όγκου θα επιτρέψει την ανάπτυξη των μεταγενέστερων αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης. αλλαγές μεθυλίωσης του DNA που δεν σχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου είχαν εξαλειφθεί για να καθορίσουν μια πιο εστιασμένη πίνακα των 24 υποψήφιων μεθυλιωμένο βιοδείκτες γονίδιο. Επιπλέον, η συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA με την έκφραση από το διαθέσιμο φάσμα γονιδιακής έκφρασης βοηθά στη μείωση της ενιαίας προκατάληψη πλατφόρμα. Πολλαπλά στάδια επικύρωσης διεξήχθησαν σε αυτή τη μελέτη η οποία περιελάμβανε συνολικά τρεις ομάδες δειγμάτων HNSCC, καθώς και τέσσερις διαφορετικές τεχνικές ανίχνευσης για μεθυλίωση του DNA (συστοιχίες Illumina 27 και 450, διθειώδες αλληλουχίας και QMSP) και τρεις διαφορετικές τεχνικές για γονιδιακή έκφραση (Affymetrix array, RNA-Seq από TCGA και qRT-PCR). Συνεπής αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μεταξύ των διαφορετικών ομάδων πληθυσμού και τεχνικές (S9 Πίνακας). Αυτά τα βήματα επικύρωση επιβεβαιώθηκε υψηλή εξειδίκευση και αξιοπιστία των ανιχνευόμενων βιοδεικτών μεθυλίωσης που βασίζονται σε DNA ZNF για HNSCC.

παρατηρήθηκαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης προαγωγού σε HPV- ασθενείς σε διάφορες υποθετικές ογκοκατασταλτικά γονίδια, περιλαμβανομένων των μελών της οικογένειας δακτύλου ψευδαργύρου, συνεπής