Αφηρημένο

Ιστορικό

πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs) είναι στοιχεία ελέγχου σηματοδότηση Wnt, τα οποία δεσμεύονται εξωκυτταρικά να Wnt συνδετήρες και να ρυθμίζουν την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με υποδοχείς μεταγωγή σήματος στην κυτταρική επιφάνεια. Sulf-1 και Sulf-2 είναι νέα εξωκυττάρια σουλφατάσες που δρουν στις εσωτερικές γλυκοζαμίνη-6-θειική (6S) τροποποιήσεις εντός HSPGs και έτσι να ρυθμίζουν αλληλεπιδράσεις HSPG με διάφορα μόρια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου συνδέτες Wnt. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν τη σημασία της επανενεργοποιηθεί σηματοδότηση Wnt σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα.

Αρχή Εκτίμηση

Και οι δύο πρωτεΐνες είχαν Sulf ρυθμίζεται αυξητικά σε ανθρώπινους όγκους του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα και έγιναν ευρέως εκφράζεται σε ανθρώπινα παγκρεατικά αδενοκαρκινώματος κυτταρικές γραμμές. Η έκφραση της ανθρώπινης εξωκυτταρικής σουλφατάσες Sulf-1 και Sulf-2 ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt σε ένα ανασυνδυασμένο σύστημα. Τρεις από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος που εξετάστηκαν παρουσίασαν αυτοκρινείς σηματοδότηση Wnt, το γεγονός ότι εξωκυττάριο συνδέτες Wnt ήταν υποχρεωμένη να κινήσει προς τα κάτω σηματοδότηση Wnt. Η έκθεση αυτών των παγκρεατικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος σε ένα καταλυτικά ανενεργό μορφή Sulf-2 ή siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση του ενδογενούς Sulf-2 ανέστειλε τόσο την Wnt ανάπτυξη σηματοδότησης και των κυττάρων. Θειο-2 αποσιώπηση σε δύο από αυτές τις γραμμές είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένη ογκογένεση σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε εντοπίσει το Sulfs ως ενισχυτές της αυτοκρινείς σηματοδότηση Wnt σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και να έχουν κατέδειξαν τη συμβολή τους στην ανάπτυξη και την ογκογονικότητα αυτών των κυττάρων. Δεδομένου ότι οι Sulfs είναι εξωκυτταρικά ένζυμα, θα είναι ελκυστικοί στόχοι για θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Τα αποτελέσματά μας έρχονται σε αντίθεση με την επικρατούσα άποψη στη βιβλιογραφία ότι οι Sulfs είναι αρνητικοί ρυθμιστές της ογκογένεσης

Παράθεση:. Nawroth R, van Ζάκυνθος Α, Θερβάντες S, M McManus, Hebrok Μ, Rosen SD (2007) Εξωκυττάρια σουλφατάσες, Στοιχεία της Wnt μονοπάτι σηματοδότησης, Θετικά ρυθμίζουν την αύξηση και ογκογονικότητα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 2 (4): e392. doi: 10.1371 /journal.pone.0000392

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Μιχαήλ Blagosklonny, Ordway Research Institute, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Μαρτίου του 2007? Αποδεκτές: 28 Μαρ 2007? Δημοσιεύθηκε: 25 Απριλίου 2007

Copyright: © 2007 Nawroth et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια μαστού Susan Komen του Καρκίνου Ίδρυμα Grant PDF0402844 (RN και SDR), το γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών Grant NA439 /1-1 (RN), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte της ισπανικής κυβέρνησης (SC) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορηγήσεις GM57411 (SDR), CA122025 (SDR), HL075602 (SDR) και CA112537 (ΜΗ). Η προετοιμασία των φακοϊών επιχορηγήθηκε από το Μηχανισμό Sandler Lentivirus πυρήνα στο UCSF. Οι χορηγοί δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό και τη διεξαγωγή της μελέτης, στη συλλογή, ανάλυση και ερμηνεία των δεδομένων, καθώς και στην προετοιμασία, την αναθεώρηση ή την έγκριση του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του παγκρέατος και μια από τις πιο θανατηφόρες κακοήθειες, με ποσοστό επιβίωσης πέντε χρόνια από 3% και μια μέση επιβίωση από λιγότερο από 6 μήνες [1]. Υπήρξε πρόσφατο ενδιαφέρον για το ρόλο των οδών εμβρυϊκών σηματοδότησης στον καρκίνο. Σημαντική απόδειξη έχει αποδείξει ότι αυτές οι οδοί παραμένουν σε λειτουργία σε ένα περιορισμένο αριθμό κυττάρων εντός του ενήλικα και ότι απορύθμιση αυτών των οδών συμβάλλει στο σχηματισμό και την επιμονή των όγκων [2], [3]. Σε αυτό το πλαίσιο, η επανενεργοποίηση του Notch, Hedgehog και Wnt μονοπάτια έχουν προσελκύσει πρόσφατο ενδιαφέρον σε καρκίνους του γαστρεντερικού σωλήνα, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα [2], [4], [5].

Η απορύθμιση της σηματοδότησης Wnt στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος είναι το επίκεντρο της παρούσας μελέτης. Wnts περιλαμβάνουν μια μεγάλη οικογένεια εκκρινόμενων πρωτεϊνών, τα οποία ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη, την απόπτωση, την κινητικότητα και τη διαφοροποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης [3]. Εν συντομία, η ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού Wnt αρχίζει με σύνδεση συνδετήρων Wnt να σηματοδοτήσει υποδοχείς μεταγωγή στην επιφάνεια του κυττάρου, η οποία οδηγεί στη συσσώρευση μη φωσφορυλιωμένο β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα. Μετά τη μετατόπιση του προς τον πυρήνα, β-κατενίνης σχηματίζει ένα σύμπλοκο με μέλη της οικογένειας TCF /LEF μεταγραφικών παραγόντων, και ενεργοποιεί γονίδια στόχους [3].

σηματοδότηση Wnt πρώτη φορά εμπλέκονται στον καρκίνο μέσω της ανάλυσης μαστικού αδένα ογκογένεση που προκαλείται από τον ιό μαστικού όγκου ποντικού (MMTV) [6]. Ένα υψηλό ποσοστό των όγκων ήταν λόγω της ενεργοποίησης της έκφρασης Wnt1 μέσω εισαγωγής του προϊού ΜΜΤν στο

wnt1

γονίδιο. Ογκογένεση πιστεύεται ότι βασίζεται σε μια αυτοκρινή Wnt μονοπάτι μετασχηματισμού στα οποία η έκφραση συνδέτη Wnt από επιθηλιακά κύτταρα μαστού παρέχει ένα ερέθισμα ανάπτυξης στα ίδια κύτταρα. Πρόσφατα αυτοκρινείς σηματοδότηση Wnt αποδείχθηκε σε καρκίνο του μαστού, των ωοθηκών καρκίνο και κυτταρικές γραμμές μυελώματος, [7], [8]. Ο μηχανισμός αυτός, στον οποίο εξωκυττάρια προσδέματα Wnt παρέχουν την απαραίτητη ερέθισμα για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, είναι διαφορετική από εκείνη που βρίσκονται συνήθως σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και διάφορες άλλες μορφές καρκίνου, στην οποία συστατική ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt είναι συνέπεια μεταλλάξεων στο κατάντη κυτταροπλασματική στοιχεία όπως όπως

APC, CTNN1

(που κωδικοποιεί β-κατενίνης) ή

AXIN2

[3].

Αυτές οι χαρακτηριστικές μεταλλάξεις στα κατάντη Wnt μόρια σηματοδότησης είναι πολύ σπάνια σε αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος [9 ]. Ωστόσο, ανώμαλη ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα του ανθρώπου, όπως αποκαλύπτεται από τον πυρηνικό εντοπισμό της β-κατενίνης σε ένα σημαντικό κλάσμα (30-65%) των όγκων [9], [10]. Σύμφωνα με την ιστοχημική απόδειξη, βιοχημική ανάλυση απέδειξε μια σημαντική αύξηση του συνολικού αριθμού των β-κατενίνης και αύξησε τον πυρηνικό εντοπισμό της σε δύο τρίτα των παγκρεατικών αδενοκαρκινώματα [9]. Επιπλέον, σε μηχανιστικές μελέτες με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές, η αναστολή της σηματοδότησης Wnt οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση in vitro [11].

Μια περιοχή τρέχοντος ενδιαφέροντος είναι τα εξωκυττάρια ρυθμιστικά στοιχεία στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Μεταξύ αυτών εκκρίνονται Wnt ανταγωνιστές όπως σχετίζονται Frizzled πρωτεΐνες (sFRP), Wnt ανασταλτικό παράγοντα (WIF) και την οικογένεια Dickkopf (DKK) [12]. Προς τα κάτω ρύθμιση οποιουδήποτε από αυτούς τους ανταγωνιστές εκκινεί ενεργοποίηση Wnt και συμβάλλει σε αρκετές μορφές καρκίνου [12]. Μια κατηγορία εξωκυτταρικών πρωτεϊνών που ρυθμίζει θετικά Wnt δραστηριότητας είναι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs). Glypicans, για παράδειγμα, απαιτούνται για σηματοδότηση Wnt κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στη Drosophila και των σπονδυλωτών [13]. HSPGs είναι επίσης αναγκαία παραδείγματα σχηματισμού Wnt-εξαρτώμενη όγκου [14], [15]. Οι μυριάδες λειτουργίες του HSPGs στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων [16] με τη μεσολάβηση της ικανότητάς τους να προσδένονται σε ένα ποικίλο ρεπερτόριο των αυξητικών παραγόντων και μορφογόνων. Δεσμευτική εξαρτάται από το πρότυπο θείωση της γλυκοζαμίνης (Ν-, 3-Ο, και των θέσεων 6-Ο) και ουρονικού οξέος (2-O-θέση) στο συνημμένο αλυσίδων θειικής ηπαράνης. [16]. 6-Ο-θείωση (6S) γλυκοζαμίνης έχει ιδιαίτερη σημασία στη δέσμευση πολλών σημαντικών προσδεμάτων HPSGs, συμπεριλαμβανομένης της Wnts [17] – [19]. Ένα πρόσφατα εκτιμηθεί μηχανισμός για τη ρύθμιση σηματοδότηση από αυτούς τους συνδετήρες είναι με μετα-συνθετικά «επεξεργασία» του προτύπου 6S του HSPGs μέσω της δράσης μιας κατηγορίας εξωκυτταρικό σουλφατάσες γνωστή ως Sulfs [20].

QSulf-1 , το πρώτο μέλος της οικογένειας Sulf που θα περιγραφεί, ανακαλύφθηκε σε μια ανάλυση της μυϊκής ανάπτυξης στο έμβρυο ορτυκιού [20]. Αυτό ακολουθήθηκε από την περιγραφή των ορθόλογα του σε αρουραίους [21], το ποντίκι και τον άνθρωπο [22] και η ανακάλυψη του στενά συνδεδεμένες ομόλογο, Sulf-2 [22]. Οι Sulfs είναι ουδέτερο pH βέλτιστη endosulfatases που αφαιρούν 6-Ο-θειικού από την εσωτερική υπολείμματα γλυκοζαμίνης σε εξαιρετικά θειωμένων υποτομείς της ηπαρίνης /HSPGs [18], [19], [22], [23]. Οι αρχικές μελέτες του QSulf-1 αποκάλυψε ένα θετικό ρόλο στη ρύθμιση της Wnt σηματοδότησης κατά τη διάρκεια των μυών προδιαγραφές στο έμβρυο ορτυκιού [20]. Αυτή η δραστηριότητα εξαρτάται από την ικανότητα του QSulf-1 για τη μείωση της αλληλεπίδρασης προσδεμάτων Wnt με HSPGs. Οι συγγραφείς πρότεινε δύο κρατών μοντέλο στο οποίο οι αλυσίδες HS σχηματίσουν μια υψηλή συγγένεια HS-Wnt συγκρότημα, το οποίο απομονώνει Wnt από την αλληλεπίδραση με τους υποδοχείς μεταγωγής σήματος του. Η συγγένεια των Wnt ΕΣ εξασθενεί όταν QSulf-1 τροποποιεί το πρότυπο 6S των αλυσίδων HS, επιτρέποντας την έναρξη σηματοδότηση Wnt [19].

Sulf εξαρτώμενη προώθηση σηματοδότηση Wnt έχει επίσης παρατηρηθεί σε άλλα αναπτυξιακά γεγονότα [24]. In vitro στοιχεία δείχνουν ότι οι Sulfs μπορούν να προωθήσουν άλλα μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων της αγγειογένεσης και της BMP σηματοδότησης [23], [25]. Είναι σημαντικό ότι,

θειο

null ποντίκια δείχνουν μειωμένη μάζα σώματος [26], [27]. Αυτός ο φαινότυπος είναι συνεπής με θετικό ρυθμιστικό ρόλο για τις Sulfs κατά τη διάρκεια της κανονικής ανάπτυξης.

Η ανακάλυψη ότι κανονική Wnt σηματοδότηση ενεργοποιείται σε αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (βλέπε παραπάνω) έχει εστιάσει την προσοχή μας σχετικά με την πιθανή εμπλοκή του Sulfs σε αυτού του καρκίνου . Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε προς τα πάνω ρύθμιση αμφοτέρων των πρωτεϊνών Sulf σε παγκρεατικά καρκινώματα αδενοκαρκίνωμα. Χρησιμοποιώντας ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος, έχουμε καθιερώσει ένα ρόλο για Sulf-2 στην προαγωγή αυτοκρινή σηματοδότηση Wnt, in vitro ανάπτυξη των κυττάρων και την γένεσιν όγκων. Αυτή η θετική συμβολή ενός Sulf στην ανάπτυξη Wnt-εξαρτώμενη όγκος είναι σε πλήρη αντίθεση με αρκετές αναφορές στις οποίες η εκτέλεση έκφραση Sulfs ανταγωνίζεται άλλες οδούς σηματοδότησης (π.χ. FGF-2, και HGF) σε κύτταρα όγκου και καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων [28] – [34].

Αποτελέσματα

τα θειο-1 και θειο-2 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος

Εξόρυξη σύνολα δεδομένων δημόσια DNA μικροσυστοιχιών και ποσοτική μελέτη PCR αποδείξει ότι

οι SULF1

μεταγραφές ρυθμίζεται αυξητικά σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου (Πίνακας 1). Η τελευταία μελέτη διαπίστωσε ότι το μέσο επίπεδο του

SULF1

mRNA ήταν 22.5 φορές μεγαλύτερη στον καρκινικό ιστό (n = 31) σε σχέση με την κανονική του παγκρέατος (η = 19) [31].

In situ υβριδισμού

εντοπισμένη έκφραση

SULF1

σε σωληνοειδείς δομές, πιθανότατα αντιπροσωπεύουν διηθητικό καρκίνωμα.

Η

Για να προσδιορίσετε αν θειο πρωτεΐνες που εκφράζονται από αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος σε χειρουργικά δείγματα , εμείς χρωματισμένες τομές από επτά αρχειοθετηθεί περιπτώσεις με Sulf-1 και Sulf-2 αντισώματα και ενός IgG ελέγχου (Σχέδιο 1 Α και Β). Καλοήθης interlobular αγωγών στις ίδιες τομές ιστών όπως το επιθετικό καρκίνωμα χρησίμευσε ως εσωτερικός μάρτυρας. Σε 7/7 περιπτώσεις, τα κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα γενικώς εμφάνισαν μέτρια έως ισχυρή χρώση για Sulf-1 (Σχήμα 1Β). Για θειο-2, 4/7 περιπτώσεις έδειξαν ισχυρή χρώση των κυττάρων αυτών, 2/7 περιπτώσεις είχαν μέτρια χρώση και 1 περίπτωση ήταν αρνητική. Οι περισσότεροι καλοήθεις αγωγοί δεν έδειξε καμία χρώση ή μόνο ίχνη χρώση για Sulf-1 (≈54%) ή Sulf-2 (≈88%). Εστιακή χρώση για θειο-1 ή θειο-2 παρατηρήθηκε σε μια μειοψηφία των καλοήθων αγωγών. Η διάχυτη ασθενής χρώση των ινοβλαστών τόσο για Sulfs παρατηρήθηκε σε ορισμένες περιοχές του στρώματος, συνήθως σε συνδυασμό με φλεγμονώδη κύτταρα. Δεν υπήρξε καμία χρώση με τον έλεγχο IgG

Α:. Αντιπροσωπευτικά σειριακές τομές από παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα βάφτηκαν με Sulf-1, Sulf-2 και IgG μάρτυρα. Καλοήθης αγωγοί συγκρίθηκαν με περιοχές του διηθητικού καρκινώματος στο ίδιο τμήμα. Β: Ποσοτική παρουσίαση των θειο ανοσοϊστοχημεία αποτελέσματα σε παγκρεατικά περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος (0 = καθόλου ή χρώση ίχνος, 1 = μέτρια χρώση, 2 = έντονη χρώση, ND = δεν έχει προσδιοριστεί). C: RNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές 24 αδενοκαρκίνωμα, παρασκευάστηκε cDNA, και υποβλήθηκε σε PCR με εκκινητές για

SULF1

και

SULF2

και β-

ACTIN

ως έλεγχος φόρτωσης . D: ανοσοστυπώματα εκτελέσθηκαν επί κυτταρολύματα και ρυθμισμένο μέσο (CM) χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι Sulf-1 (άνω πάνελ) και Sulf-2 (μέση και κάτω πάνελ). Μόνο πρωτεΐνη Sulf-2 ανιχνεύθηκε στο CM.

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η έκφραση των Sulfs στο ανθρώπινο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές με τη χρησιμοποίηση RT-PCR για να ερευνήσει ένα πάνελ 24 κυτταρικών σειρών. Αυτά προέρχονται είτε από πρωτογενείς ή μεταστατικούς παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα [5].

SULF1

μεταγραφές ανιχνεύτηκαν με RT-PCR σε 12/24 και

SULF2

μεταγραφές σε 21/24 των γραμμών αυτών (Σχήμα 1 C). Για να εξεταστεί η έκφραση στο επίπεδο της πρωτεΐνης, διερευνήσαμε 4 από αυτές τις κυτταρικές σειρές, 3 από τα οποία ήταν θετικά τόσο για

θειο

μεταγραφές (CFPAC-1, HS766T, L3.6sl) και 1 η οποία ήταν θετική για μόνο

SULF2

(BxPC-3). Πραγματοποιήσαμε ανοσοστυπώματα για απορρυπαντικά προϊόντα λύσεως και ρυθμισμένο μέσο (CM) που προέρχεται από αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 1 D). Sulf-1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε μόνο σε μία κυτταρική σειρά (κύτταρα HS766T), ενώ πρωτεΐνη Sulf-2 ήταν παρόν σε όλα τα λύματα 4. Στο απορρυπαντικό, το μοριακό βάρος των κύριων ειδών ήταν 130 kDa, που αντιστοιχεί σε μη επεξεργασμένη μορφή, τόσο για πρωτεΐνες [22]. πρωτεΐνη θειο-2 κυκλοφόρησε στο CM από όλες τις κυτταρικές σειρές 4. Σε αντίθεση, Sulf-1 δεν ανιχνεύθηκε σε HS766T CM. Όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως για αρκετές κυτταρικές σειρές καρκινώματος του μαστού [25], πρωτεΐνη Sulf-2 ανιχνεύθηκε σε CM ως μεταποιημένα συστατικό 75 kDa.

Sulf-1 και Sulf-2 προάγουν σηματοδότηση Wnt

QSulf-1 έχει αποδειχθεί ότι προάγει την ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης Wnt σε απόκριση σε εξωγενή Wnt συνδέτες [20]. Επιλέξαμε να μελετήσουμε τις επιδράσεις της ανθρώπινης Sulfs για σηματοδότηση Wnt σε ένα παρόμοιο ανασυνδυασμένο σύστημα [20]. Εμείς υπερεκφράζεται το Sulfs σε ΗΕΚ