Αφηρημένο

Η μόλυνση των φυσιολογικών κυττάρων είναι σχεδόν πάντα παρούσα σε δείγματα όγκων και επηρεάζει μοριακές αναλύσεις τους. μεθυλίωσης του DNA, ένα σταθερό επιγενετική τροποποίηση, είναι κυτταρικό τύπο-εξαρτώμενη, και διαφορετικές μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα. Εδώ, έχουμε ως στόχο να αποδείξει ότι το DNA μεθυλίωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου, χρησιμοποιώντας οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) ως παράδειγμα. Κατ ‘αρχάς, από μια σειρά Infinium HumanMethylation450 BeadChip, απομονώσαμε τρεις περιοχές του γονιδιώματος (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, και

RAPGEFL1

) i) πολύ μεθυλιώνονται σε τέσσερις κυτταρικές σειρές ESCC, ii) μετά βίας μεθυλιώνεται σε ένα ενοποιημένο δείγμα των μη-καρκινικές βλεννογόνων, ομαδοποιημένο δείγμα από φυσιολογικό οισοφαγικό βλεννογόνων, και περιφερικά λευκοκύτταρα, και iii) συχνά μεθυλιώνονται σε 28 ESCCs (

TFAP2B

, 24/28?

ARHGEF4

, 20/28? και

RAPGEFL1

, 19/28). Δεύτερον, χρησιμοποιώντας οκτώ ζεύγη κυτταρικών δειγμάτων καρκίνου και μη καρκίνου παρασκευάζονται με σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής, επιβεβαιώσαμε ότι τουλάχιστον μία από τις τρεις περιοχές ήταν σχεδόν πλήρως μεθυλιωθεί σε κύτταρα ESCC, και οι τρεις περιοχές ήταν σχεδόν πλήρως μη μεθυλιωμένη σε μη καρκινικό κύτταρα. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι ο αριθμός αντιγράφων του DNA αλλοιώσεις από τις τρεις περιοχές σε 15 δείγματα ESCC ήταν σπάνια, και δεν επηρέασε την εκτίμηση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων. Στη συνέχεια, το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου ορίστηκε ως το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης των τριών περιοχών, και επιβεβαιώσαμε υψηλή συσχέτιση μεταξύ του κλάσματος αξιολογήθηκε από το δείκτη κλάσμα μεθυλίωσης του DNA και το κλάσμα που αξιολογείται από έναν παθολόγο (r = 0,85? p & lt? 0.001). Τέλος, παρατηρήθηκε ότι, με διόρθωση της περιεκτικότητας σε καρκινικό κύτταρο, CpG νησίδων σε περιοχές προαγωγού των γονιδίων καταστολής όγκων ήταν σχεδόν πλήρως μεθυλιωμένα. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το DNA μεθυλίωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου.

Παράθεση: Takahashi T, Matsuda Υ, Yamashita S, Hattori Ν, Kushima R, Lee Υ-C, et al. (2013) Εκτίμηση του κλάσματος των κυττάρων του καρκίνου σε έναν όγκο DNA δείγματος Χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης του DNA. PLoS ONE 8 (12): e82302. doi: 10.1371 /journal.pone.0082302

Επιμέλεια: Qian Τάο, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 6 του Ιούνη του 2013? Αποδεκτές: 22 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Δεκεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Takahashi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Τρίτο διάρκειας Comprehensive Cancer στρατηγική ελέγχου από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας (https://www.mhlw.go.jp), και από το Project για την Ανάπτυξη Καινοτόμων Έρευνας για τον Καρκίνο Therapeutics (P- ΑΜΕΣΗ) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία (https://p-direct.mext.go.jp). Τ.Τ. και Υ.Μ. είναι αποδέκτες μιας έρευνας Resident υποτροφία από το Ίδρυμα Προώθησης Έρευνας για τον Καρκίνο (https://www.fpcr.or.jp). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μόλυνση των φυσιολογικών κυττάρων, όπως φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, και περιφερικά λευκοκύτταρα, είναι σχεδόν πάντα παρούσα σε δείγματα όγκων. Η μόλυνση αυτή επηρεάζει τα αποτελέσματα των αναλύσεων του γονιδιώματος του καρκίνου [1-4], και η ανάλυση της έκφρασης του RNA [5,6]. Αν το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου μπορεί να εκτιμηθεί εύκολα, μπορούμε να διεξάγει ακριβέστερη ανάλυση εξαιρώντας τα δείγματα με εξαιρετικά χαμηλή περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου, και με κανονικοποίηση των πρώτων στοιχεία βασίζονται στο κλάσμα των καρκινικών κυττάρων. Παραδοσιακά, ένα κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα όγκου έχει αξιολογηθεί από παθολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας γειτονικά τμήματα. Ωστόσο, η προετοιμασία των τμημάτων αυτών είναι μερικές φορές δύσκολο ή αδύνατο λόγω της διαθεσιμότητας του δείγματος, και, πάνω απ ‘όλα, οι παθολόγοι εμπειρογνώμονας είναι απαραίτητα για μια τέτοια ανάλυση.

Για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα, τις τεχνολογίες για να εκτιμηθεί ένα κλάσμα καρκινικά κύτταρα που αναπτύχθηκαν πρόσφατα με τη χρήση πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) μικροσυστοιχιών και αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) [7-10]. Με SNP μικροσυστοιχίας, το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων μπορεί να υπολογιστεί με ανίχνευση γονιδιωματικών περιοχών με τον αριθμό αντιγράφων μετατροπές και μέτρηση του βαθμού αλληλόμορφων ανισορροπίας χρησιμοποιώντας SNPs στις γονιδιωματικές περιοχές [7-9]. Με NGS, όγκου-ειδικές μεταλλάξεις μπορούν να ταυτοποιηθούν, και το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων μπορεί να υπολογιστεί με βάση το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα [10]. Δεδομένου ότι αυτές οι τεχνολογίες αναπτύχθηκαν αρχικά για την ανάλυση των SNPs ή μεταλλάξεων, πάσχουν από πολύπλοκες τύπους υπολογισμού, δαπανηρά αντιδραστήρια, και την αναγκαιότητα της ανάλυσης ζεύγη κανονικών δειγμάτων.

Η μεθυλίωση του DNA είναι ένα σταθερό επιγενετική τροποποίηση, και ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος είναι μετουσιωμένο σε έναν τύπο-εξαρτώμενο τρόπο κυττάρων [11-13]. Μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα, πολλές περιοχές του γονιδιώματος που αναφέρεται ότι μεθυλιωμένα διαφορικά σε πολλούς τύπους καρκίνων, και ορισμένες από αυτές είναι αιτιολογικά συμμετέχουν στην ανάπτυξη και την πρόοδο [14-18] του καρκίνου. Μεταξύ αυτών των διαφορικά μεθυλιωμένα γονιδιωματικές περιοχές, ορισμένες συγκεκριμένες γενωμικές περιοχές μπορεί να είναι εντελώς μεθυλιωμένη σε καρκινικά κύτταρα αλλά ακόμη εντελώς μη μεθυλιωμένη σε φυσιολογικά κύτταρα, όπως φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, και περιφερικά λευκοκύτταρα. Εάν ναι, τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA των συγκεκριμένων γενωμικών περιοχών μπορεί να αντανακλά το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα (Σχήμα 1Α), και τέτοια εκτίμηση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση μεθυλίωσης του DNA μπορεί να γίνει μια χρήσιμη μέθοδος για μελέτες του καρκίνου.

(Α) Η έννοια της εκτίμησης του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης του DNA. (Β) Επιλογή των ειδικών γονιδιωματικών περιοχών, οι οποίες ήταν εντελώς μεθυλιωμένη σε κύτταρα ESCC και εντελώς μη μεθυλιωμένη σε διάφορα φυσιολογικά κύτταρα, με ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδιώματος σε επίπεδο χρησιμοποιώντας μία συστοιχία Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Δεκατέσσερις CpG θέσεις επελέγησαν τελικά, και εκείνων που προέρχονται από 11 περιοχές του γονιδιώματος. (Γ) Τρεις περιοχές του γονιδιώματος (TFAP2B,

ARHGEF4

, και

RAPGEFL1

) επιλέγεται ως συστατικά ενός δείκτη κλάσμα. δομή γονιδίων και η θέση ενός νησιού CpG δείχνονται στην κορυφή, και οι τιμές β των θέσεων CpG που αναλύθηκαν από τη συστοιχία χάντρα Infinium απεικονίζεται. Η ιστοσελίδα CpG που προσδιορίζονται από τη συστοιχία χάντρα Infinium έχει εγκλωβιστούμε από ένα ορθογώνιο με διακεκομμένη γραμμή. Ένας χάρτης CpG γύρω από το σημείο (-α) CpG προσδιορίζονται δείχνεται στο κάτω μέρος. Κάθετες γραμμές (στερεά και σπασμένα) δείχνουν CpG θέσεις και διακεκομμένες γραμμές δείχνουν CpG περιοχές των οποίων β τιμές μετρήθηκαν με τη συστοιχία χάντρα. Κλειστά τα βέλη δείχνουν εκκινητές για το MS-HRMA.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να αποδείξει ότι η μεθυλίωση του DNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης κλάσμα για την εκτίμηση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου, χρησιμοποιώντας οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) δείγματα ως παράδειγμα. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδιώματος-ευρεία για να αναζητήσετε συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος πλήρως μετουσιωμένο σε κύτταρα ESCC και εντελώς μη μεθυλιωμένη σε διάφορα φυσιολογικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του Διοικητικού Συμβουλίου Institutional Review του Εθνικού Κέντρου Καρκίνου Νοσοκομείο, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Osaka City, και η εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Ταϊβάν. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλα τα άτομα.

Δείγματα και ESCC τηλέφωνα Γραμμές

Ένα σύνολο 160 δειγμάτων ESCC συλλέχθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Νοσοκομείο, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Osaka City, και το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο. Τα δείγματα 160 ESCC αποτελούνταν από 39 δείγματα βιοψίας και 121 χειρουργικά δείγματα. Τα δείγματα βιοψίας προήλθαν από 39 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ενδοσκοπική βιοψία και διαγνώστηκαν να έχουν ESCC (33 άνδρες και 6 θηλυκά? Μέση ηλικία = 63, εύρος = 30-78). Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) στους -80 ° C. Τα χειρουργικά δείγματα προήλθαν από 121 ασθενείς που διαγνώστηκαν να έχουν ιστολογικά επεμβατική ESCC και είχαν υποβληθεί σε οισοφαγεκτομή (98 άνδρες και 23 θηλυκά? Μέση ηλικία = 65, εύρος = 41 – 82). Μεταξύ των 121 χειρουργικά δείγματα, 25 δείγματα ελήφθησαν από δείγματα ενσωματωμένα σε παραφίνη μπλοκ κηρού μετά από στερέωση με φορμόλη ή 70% αιθανόλη, και τα άλλα 96 δείγματα ελήφθησαν από δείγματα που αποθηκεύθηκαν σε RNAlater (Applied Biosystems) μετά την εκτομή. Επιπλέον, η σύλληψη λέιζερ μικροανατομή (LCM) πραγματοποιήθηκε για οκτώ χειρουργικά δείγματα, ενσωματώνονται σε παραφίνη μπλοκ κερί χρησιμοποιώντας LM200 (Αρκτούρος, Mount View, CA, USA) όπως περιγράφεται [19].

Τέσσερις κυτταρικές σειρές ESCC KYSE30, KYSE50, KYSE220 και KYSE270 [20] αγοράστηκαν από την Health Science Research Τράπεζα Πόρων (Osaka, Japan). Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε με τη χρήση της μεθόδου φαινόλης /χλωροφορμίου.

Γονιδίωμα-ευρύ μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

Γονιδίωμα-ευρύ έλεγχο των διαφορικά μεθυλιωμένων CpG θέσεων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια σειρά Infinium HumanMethylation450 BeadChip, η οποία κάλυψε 482.421 περιοχές CpG (Illumina, San Diego, CA, USA ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. 11551 CpG θέσεις επί των φυλετικά χρωμοσώματα αποκλείστηκαν, και οι υπόλοιπες 470.870 θέσεις CpG χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση. Το επίπεδο της μεθυλίωσης του κάθε τόπου CpG εκπροσωπήθηκε από μια τιμή β, η οποία κυμαινόταν από 0 (εντελώς μη μεθυλιωμένα) έως 1 (πλήρως μετουσιωμένο).

Η μεθυλίωση ευαίσθητα High Resolution Melting Ανάλυση (MS-HRMA)

Για το MS-HRMA, πρώτη, 1 μg του DNA χωνεύεται με

Bam

ΗΙ υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο και αιωρήθηκε σε 40 μΐ ΤΕ ρυθμιστικού όπως περιγράφεται [22]. Δεύτερον, η PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας κατάλληλη ποσότητα 1 μL του κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA νάτριο, εκκινητές ικανοί να ενισχύουν τόσο μεθυλιωμένου και μη μεθυλιωμένου DNA (Πίνακας S1) [23], SYBR Green Ι (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, MD, USA), και θερμικό κυκλοποιητή iCycler (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Τρίτον, HRMA του προϊόντος PCR διεξήχθη για να αποκτήσετε το προφίλ τήξης του προϊόντος PCR με τη γραφική αναπαράσταση την αρνητική παράγωγο του φθορισμού πάνω από τη θερμοκρασία (-dF /d

T

εναντίον

T

), χρησιμοποιώντας το λογισμικό Thermal Cycler iCycler (Bio-Rad Laboratories, Ver. 2.1). Τέλος, το επίπεδο μεθυλίωσης ενός δείγματος εκτιμήθηκε με σύγκριση του προφίλ τήξης του με εκείνες των πλήρως μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων ελέγχων, μαζί με μίγματα 0, 20, 40, 60, 80, και 100% μεθυλιωμένα ελέγχους. Ως πλήρως μεθυλιωμένα ελέγχου, γενωμικό DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με

Sss

Ι μεθυλάση (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε. Ως πλήρως μη μεθυλιωμένη ελέγχου, χρησιμοποιήθηκε όξινο θειώδες νάτριο-τροποποιημένα DNAs που λαμβάνεται από μη-καρκινικές οισοφαγικού βλεννογόνου χωρίς μεθυλίωση των αναλύθηκαν περιφερειών.

Ανάλυση Αριθμός Γενωμικό DNA αντιγραφής

Αντιγραφή αριθμός μεταβολών των γονιδιωματικών περιοχών αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας θερμικό κυκλοποιητή iCycler (Bio-Rad Laboratories) με SYBR Green Ι (BioWhittaker Molecular εφαρμογές). Ο αριθμός των μορίων του DNA σε ένα δείγμα μετρήθηκε για τρεις περιοχές που πλευρίζουν τα υποψήφια γονίδια και γονίδια ελέγχου [

ALB

(4q13.3),

GAPDH

(12p13) και

KCNA1

(12p13.32)] που βρίσκεται στην χρωμοσωμικές περιοχές με αριθμό σπάνιο αντίγραφο αλλαγές. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S2. Ο αριθμός των μορίων του DNA από τα τρία υποψήφια γονίδια ομαλοποιήθηκε με εκείνες των γονιδίων ελέγχου. Η κανονικοποιημένη αριθμός των μορίων του DNA σε ένα δείγμα συγκρίθηκε με εκείνη στο ανθρώπινο DNA λευκοκυττάρων για να ληφθεί αριθμός αντιγράφων αλλοιώσεις. Όλες οι αναλύσεις διεξήχθη εις τριπλούν. Σημαντικές αλλαγές αντίγραφο αριθμό (κέρδος ή ζημία) ορίστηκαν ως κάτι περισσότερο από μια αύξηση κατά 1,5 φορές ή λιγότερο από 0,67 φορές μείωση.

Παθολογική Ανάλυση του κλάσματος των κυττάρων του καρκίνου

Από χειρουργικά δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες, σειριακές τομές φέτα με πάχος 3-μm παρασκευάστηκαν. Ένα τμήμα χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη-ηωσίνη, και τα υπόλοιπα τμήματα χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση του DNA. Ένας έμπειρος παθολόγος (R. Κ) υπολογίζεται το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων με μικροσκοπική εξέταση.

Στατιστικές Αναλύσεις

Η συσχέτιση μεταξύ του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων υπολογίζεται από τον δείκτη κλάσμα και ότι αξιολογείται από τον παθολογοανατόμο αναλύθηκε χρησιμοποιώντας συντελεστές συσχέτισης προϊόντος στιγμή Pearson ‘s. Μια διαφορά στη μέση κλάσματα των καρκινικών κυττάρων αναλύθηκε με τεστ t του Student, και η διαφορά στις διακυμάνσεις του κλάσματος καρκινικού κυττάρου αναλύθηκε με έλεγχος Levene. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση στατιστικών PASW έκδοση 18.0 (SPSS Inc. Ιαπωνία, Tokyo, Japan), και τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν οι τιμές ρ & lt? 0,05 ελήφθησαν με μία δοκιμή διπλής όψης.

Αποτελέσματα

Η επιλογή των συγκεκριμένων περιοχών από Γονιδίωμα-ευρύ Screening

Γονιδίωμα-ευρύ ανάλυση μεθυλίωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DNA του i) 28 ESCCs λαμβάνεται με ενδοσκοπική βιοψία, ii) τέσσερις κυτταρικές γραμμές ESCC (KYSE30, KYSE50, KYSE220, και KYSE270), iii) περιφερικά λευκοκύτταρα του ενός υγιούς εθελοντή, iv) μία λίμνη κανονικών οισοφαγικού βλεννογόνου από τέσσερις υγιείς εθελοντές, και ν) μια δεξαμενή μη-καρκινικές οισοφαγικού βλεννογόνου του οκτώ ESCC ασθενείς. Ψάξαμε για τις περιοχές CpG που ήταν ιδιαίτερα μεθυλιώνονται (β τιμή & gt? 0,8) σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές ESCC και μετά βίας μεθυλιωμένο (αξία β & lt? 0,1) σε περιφερικά λευκοκύτταρα, την πισίνα του φυσιολογικού βλεννογόνου, και την πισίνα των μη-καρκινικές βλεννογόνων, και απομονωμένα 2752 CpG τοποθεσίες από 470.870 ενημερωτικά sites CpG. Από τις 2.752 θέσεις CpG, επιλέξαμε 14 CpG θέσεις στις οποίες η επίπτωση της υπερμεθυλίωσης (τιμή β & gt? 0,5) στις 28 ESCCs ήταν περισσότερο από 50% (Σχήμα 1 Β).

Οι 14 περιοχές CpG προήλθαν από 11 περιοχές του γονιδιώματος, η οποία ορίσαμε ως περιοχές εντός 500 bp για την εξυπηρέτησή (Πίνακας 1). Από τις 11 περιοχές του γονιδιώματος, θα αποκλείονται

SOX2OT

, που αναφέρθηκε να είναι ιδιαίτερα ενισχυμένο σε κύτταρα ESCC [24], και τρεις περιοχές χωρίς γνωστά γονίδια. Για τις επτά υπόλοιπες περιοχές, επιχειρήσαμε να σχεδιάσουμε εναύσματα για MS-HRMA, η οποία είναι γνωστή ως ευαίσθητη και ειδική μέθοδος για την εκτίμηση των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA [25]. Ήμασταν σε θέση να σχεδιάσουμε εναύσματα για τρεις περιοχές (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, και

RAPGEFL1

) (Εικόνα 1Γ).

No.

Gene σύμβολο

όνομα Gene

Χρ

nt, αριθμός

Probe ID

Σχέση με το νησί CpG

Θέση στο γονίδιο

Συχνότητα

a

1

TFAP2B

** παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-2 beta650791202cg27260772IslandBody2450791419cg22248052IslandBody142

SOX2OT

SOX2 επικαλυπτόμενες transcript3181438216cg05513806S_ShoreBody223

ARHGEF4

** Rho παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEF) 42131792772cg13024709IslandBody204

RAPGEFL1

** παράγοντας Rap γουανίνης ανταλλαγής νουκλεοτιδίων (GEF) -όπως 11738347603cg20668644IslandBody1938347968cg24903006S_ShoreBody1938347710cg00129651IslandBody145

GRK7

*G κινάση υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη 73141516705cg25640519S_ShoreBody186

–

2200327334cg07835424Island-187

–

2119607885cg09385093Island-188

KCNA3

*Potassium τασεοελεγχόμενων κανάλι, σέικερ που σχετίζονται με υπο-οικογένεια, μέλος 31111217194cg20302133Island1stExon159

BCAT1

* διακλαδισμένης αλυσίδας αμινοξέων τρανσαμινάση 1, cytosolic1225055967cg20399616IslandBody1410

KLF16

* Kruppel-σαν παράγοντας 16191857004cg04998634IslandBody1411

–

1170630558cg23089825Island -14Table 1. περιοχές του γονιδιώματος που προσδιορίζονται από beadchip ανάλυση

ΣΗΜΕΙΩΣΗ:

μια

Επίπτωση της συχνότητας των υπερμεθυλίωση (βvalue & gt? 0,5) σε 28 ESCCs.. ** Αστάρια για HRMA επιτυχία σχεδιαστεί. * Εκκινητές για HRMA δεν θα μπορούσε να σχεδιαστεί. CSV Λήψη CSV

Αξιολόγηση των τριών περιοχών ως κλάσμα δείκτης

Για να επιβεβαιώσετε ότι οι τρεις περιοχές ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένα σε μη-καρκινικά κύτταρα, και πλήρως μετουσιωμένο σε καρκινικά κύτταρα, αναλύσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης τους στο i ) οκτώ δείγματα κυττάρων μη καρκινικό LCM-καθαρισμένο από οκτώ ESCCs, ii) οκτώ δείγματα καρκινικού κυττάρου LCM-καθαρίζονται από τα οκτώ ESCCs, iii) τα οκτώ ESCCs πριν LCM, iv) περιφερικά λευκοκύτταρα του ενός υγιούς εθελοντή, και ν) ο τέσσερα κυτταρικές γραμμές ESCC (Σχήμα 2Α).

(Α) επίπεδα μεθυλίωσης από τις τρεις περιοχές αναλύθηκαν σε i) οκτώ δείγματα κυττάρων μη καρκινικό LCM-καθαρισμένο από τρία ESCCs, ii) οκτώ δείγματα καρκινικού κυττάρου LCM-καθαρίζονται από τα τρία ESCCs, iii) οκτώ ESCCs πριν από LCM, iv) περιφερικά λευκοκύτταρα ενός υγιούς εθελοντή, και v) τέσσερις κυτταρικές σειρές ESCC. Μία ή περισσότερες από τις τρεις περιοχές είχαν σχεδόν πλήρως μεθυλιωμένα σε καθαρισμένη καρκινικά κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές, και όλα ήταν δύσκολα μεθυλιωμένα σε μη καρκινικά κύτταρα. αριθμός (Β) Αντίγραφο μεταβολές από τις τρεις περιοχές αναλύθηκαν με ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας 15 ESCCs.

Η

Στις οκτώ δείγματα κυττάρων μη καρκινικό LCM-καθαριστεί και τα περιφερικά λευκοκύτταρα, και τα τρία περιοχές ήταν σχεδόν πλήρως μη μεθυλιωμένη, και στις τέσσερις κυτταρικές σειρές ESCC, όλοι τους ήταν εντελώς μεθυλιωμένη. Στις οκτώ δείγματα καρκινικού κυττάρου LCM-καθαρισμένο, τουλάχιστον μία από τις τρεις περιοχές ήταν σχεδόν εντελώς μεθυλιωμένη. Ωστόσο,

TFAP2B

στο Et5T δείγμα,

ARHGEF4

στο Et1T, Et2T, Et4T και Et5T, και

RAPGEFL1

στο Et2T δεν ήταν πλήρως μεθυλιωμένη, πιθανώς λόγω της ετερογένειας μεταξύ των τα καρκινικά κύτταρα. Τέτοιες περιοχές δεν ήταν κατάλληλες ως δείκτης κλάσμα για ορισμένα ειδικά δείγματα. Παράλληλα, η περιοχή με το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης στα δείγματα καρκινικών κυττάρων LCM-καθαρίζεται έδειξε επίσης το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης στα ESCCs πριν LCM. Ως εκ τούτου, το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης των τριών περιοχών θεωρήθηκε ότι αντανακλά το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων στο ESCCs.

Το επίπεδο μεθυλίωση μιας περιοχής σε ένα δείγμα μπορεί να επηρεαστεί από έναν αριθμό αντιγράφων αλλοίωση της περιοχής. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε αριθμό αντιγράφων αλλοιώσεις από τις τρεις περιοχές χρησιμοποιώντας 15 ESCCs (Σχήμα 2Β). Για

ARHGEF4

, δεν παρατηρήθηκαν ορισμένες σημαντικές αλλαγές αντίγραφο. Αντίθετα, για

TFAP2B

και

RAPGEFL1

, αριθμός σημαντικά αντίγραφο αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν σε χαμηλές συχνότητες (

TFAP2B

, 1,64 έως 1,65 φορές οι αλλαγές σε τρεις από τις 15 ESCCs?

RAPGEFL1

, 0,60 φορές η αλλαγή σε ένα από τα 15 ESCCs). Υποθέτοντας ότι το 2-πλάσιο ή 0,5-πλάσιο του αριθμού αντιγράφων αλλοιώσεις ήταν παρούσες σε καρκινικά κύτταρα, μια απόκλιση της μετρούμενης επίπεδο μεθυλίωσης από την πραγματική κλάσμα των καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε ότι είναι μικρότερη από 17,2% (Σχήμα S1). Επίσης, η συχνότητα εμφάνισης του αριθμού σημαντικών αντίγραφο αλλαγές του

TFAP2B

και

RAPGEFL1

ήταν χαμηλή (

TFAP2B

, 20%?

RAPGEFL1

, 6,7%) . Ως εκ τούτου, η επίδραση του αριθμού αντιγράφων μεταβολές του

TFAP2B

, και

RAPGEFL1

θεωρήθηκε να είναι ελάχιστη στην εκτίμηση ενός κλάσματος των καρκινικών κυττάρων. Τέλος, ορίσαμε το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων ως το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης από τις τρεις περιοχές.

ανάλυση της ακρίβειας του κλάσματος Marker

Στη συνέχεια, ανέλυσε το αν το κλάσμα καρκινικών κυττάρων υπολογίζεται από τον δείκτη κλάσμα αντανακλάται πραγματικά το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων εκτιμάται με μικροσκοπική εξέταση. Μετρήσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης από τις τρεις περιοχές σε 20 ESCCs (Σχήμα 3Α), και εκτιμάται ότι το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε κάθε δείγμα, χρησιμοποιώντας την υψηλότερη τιμή από τις τρεις περιοχές. Στις 20 ESCCs,

TFAP2B

,

ARHGEF4

, και

RAPGEFL1

παρουσίασαν τις υψηλότερες τιμές σε εννέα, εννέα και δύο δείγματα, αντίστοιχα. Ανεξάρτητα, το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε με μικροσκοπική εξέταση διαδοχικών τομών. Ήμασταν σε θέση να τηρήσει μια καλή συσχέτιση μεταξύ των δύο μεθόδων (r = 0,85? P & lt? 0.001) (Σχήμα 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαίωσε ότι το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων υπολογίζεται από τον δείκτη κλάσμα αντανακλάται με ακρίβεια την πραγματική κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα όγκου.

(Α) επίπεδα μεθυλίωσης από τις τρεις περιοχές αναλύθηκαν σε 20 ESCCs από το MS-HRMA. Το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε κάθε δείγμα ορίστηκε ως το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης από τις τρεις περιοχές. (Β) Συσχέτιση μεταξύ του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων υπολογίζεται από τον δείκτη κλάσμα και ότι αξιολογούνται με μικροσκοπική εξέταση. Ο συσχετισμός μεταξύ των δύο μεθόδων, που υπολογίζεται χρησιμοποιώντας συντελεστή συσχέτισης προϊόντος στιγμή του Pearson, ήταν αρκούντως υψηλή (r = 0,85).

Η

Εφαρμογή του κλάσματος Marker

Εφαρμόσαμε το δείκτη κλάσμα να συγκρίνετε τα κλάσματα των καρκινικών κυττάρων μεταξύ δειγμάτων βιοψίας και χειρουργικά δείγματα. Τα κλάσματα των καρκινικών κυττάρων σε 39 δείγματα βιοψίας και 96 χειρουργικά δείγματα αξιολογήθηκαν με χρήση του δείκτη κλάσμα. Μεταξύ των 135 δειγμάτων,

TFAP2B

,

ARHGEF4

, και

RAPGEFL1

είχαν τις υψηλότερες τιμές σε 60, 37, και 38 δείγματα, αντίστοιχα, και τις υψηλότερες τιμές ορίστηκαν ως τα κλάσματα των καρκινικών κυττάρων στα δείγματα. Η μέση κλάσμα των καρκινικών κυττάρων στα δείγματα βιοψίας (μέση ± SD, 53,5 ± 17,1%? Εύρος, 7,3 έως 86,7%) δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από ότι στα χειρουργικά δείγματα (56,7 ± 18,9%? 14,0 έως 87,3%) (p = 0,377) (Σχήμα 4Α). Οι διακυμάνσεις ήταν μεγάλα τόσο στα δείγματα βιοψίας και στα χειρουργικά δείγματα, και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των δειγμάτων βιοψίας και χειρουργικά δείγματα (p = 0.076). Αυτό επιβεβαίωσε ότι η μόλυνση των φυσιολογικών κυττάρων, πρέπει να ληφθεί μέριμνα για την ανάλυση των δειγμάτων DNA όγκου με άγνωστο περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων.

(Α) Εφαρμογή του δείκτη κλάσματος προς σύγκριση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων μεταξύ δειγμάτων βιοψίας και χειρουργικά δείγματα. Κλάσματα καρκινικών κυττάρων σε 39 δείγματα βιοψίας και 96 χειρουργικά δείγματα εκτιμήθηκαν με τον δείκτη κλάσμα, και δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά. (Β) Η εφαρμογή του δείκτη κλάσματος σε ανάλυση μεθυλίωσης του DNA. Πρώτες τιμές β των δύο χώρων CpG [cg22879515 (MIR34B), cg23180938 (CDO1)] διορθώθηκαν από το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων σε 28 ESCCs. Μερικά ESCCs είχε σχεδόν ολοκληρωθεί η μεθυλίωση (αξία β ≥ 0.8).

Η

Ο δείκτης κλάσμα εφαρμόστηκε επίσης να αποκλειστεί η επίδραση της μόλυνσης των φυσιολογικών κυττάρων στην ανάλυση μεθυλίωσης του DNA. Για το σκοπό αυτό, έχουμε επιλέξει CpG θέσεις σε απόσταση 200 bp από θέσεις έναρξης της μεταγραφής (TSS200) για δύο ογκοκατασταλτικών γονιδίων (cg22879515 (

MIR34B

) [26], και cg23180938 (

CDO1

) [27]), και αξιολογούνται κατανομές των τιμών β τους που λαμβάνονται στο αρχικό γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση μεθυλίωσης. CpG τοποθεσίες σε TSS200 των ογκοκατασταλτικών γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν από τότε που αναμένεται να έχει καμία ή πλήρη μεθυλίωσης σε δείγματα καρκίνου λόγω του πλεονεκτήματος της ανάπτυξης που παρέχει η μεθυλίωση τους. Οι βvalues ​​από τις δύο θέσεις CpG ήταν μικρότερη από 0,1 στα περιφερικά λευκοκύτταρα, η λίμνη κανονικών βλεννογόνων, και η ομάδα των μη-καρκινικές βλεννογόνων, και οι δύο θέσεις CpG θεωρήθηκαν σχεδόν πλήρως μη μεθυλιωμένη σε φυσιολογικά κύτταρα. Πρώτες τιμές β από τις δύο θέσεις CpG και βvalues ​​διορθωμένο για το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων [Διορθωμένη β value = β τιμή /(ένα κλάσμα των κυττάρων ESCC στο δείγμα (%) /100)] στη συνέχεια συγκρίθηκαν (Σχήμα 4Β). Χρησιμοποιώντας τις τιμές β διορθωθεί από το δείκτη κλάσμα, μερικά δείγματα έδειξαν πλήρη μεθυλίωση (β τιμή ≥ 0,8), μερικά δείγματα έδειξαν σχεδόν καμία μεθυλίωσης (β αξία & lt? 0,2). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι με τη χρήση του δείκτη κλάσμα, ήμασταν σε θέση να ελαχιστοποιήσει την επίδραση της μόλυνσης των φυσιολογικών DNA των κυττάρων σε δείγματα DNA όγκου για ανάλυση μεθυλίωσης.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα ESCC επιτυχία εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA ως δείκτη κλάσμα. Για να επιτευχθεί αυτό, απομονώσαμε τρεις περιοχές του γονιδιώματος (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, και

RAPGEFL1

) που είχαν υψηλή και συχνά μεθυλιώνονται σε κύτταρα ESCC, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα , με ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδιώματος-ευρεία. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη στην οποία ένα κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας DNA μεθυλίωση. Πρόσφατα, διαφορικά μεθυλιωμένα γονιδιωματικές περιοχές μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνων [14-18]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να περιμένουμε για τον εντοπισμό συγκεκριμένων γενωμικών περιοχών υψηλής και συχνά μεθυλιώνεται στους άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα. Με τη μέτρηση των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA αυτών των ειδικών γονιδιωματικών περιοχών, το κλάσμα των καρκινικών κυττάρων μπορεί να υπολογίζεται επίσης σε δείγματα DNA από άλλους τύπους καρκίνων.

Η ακρίβεια του δείκτη κλάσμα επαληθεύτηκε με σύγκριση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων υπολογίζεται από τον δείκτη κλάσμα με ότι εκτιμάται με μικροσκοπική εξέταση. Μία υψηλή ακρίβεια υποστηρίχθηκε από μια καλή συσχέτιση μεταξύ των κλασμάτων των καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε από τις δύο μεθόδους (r = 0,85). Επίσης, τα επίπεδα μεθυλίωσης του δύο θέσεις CpG σε TSS200 δύο γονιδίων καταστολής όγκων (

MIR34B

και

CDO1

) διορθώθηκαν, και μερικά δείγματα του καρκίνου έδειξε σχεδόν πλήρη μεθυλίωση. Scatter ανάλυση διάγραμμα των τιμών β πριν και μετά τη διόρθωση έδειξε ότι ορισμένα από τα δείγματα με χαμηλές τιμές β είχε μεγάλες αυξήσεις (Εικόνα S2). Πρακτικά, δείκτης κλάσμα μας έχει το πλεονέκτημα έναντι μικροσκοπική εξέταση, επειδή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για δείγματα μόνο με το DNA και την αφιέρωση των έμπειρων παθολόγων δεν είναι απαραίτητη. δείκτης κλάσμα μας έχει επίσης ένα πλεονέκτημα σε σχέση με τη χρήση προσεγγίσεων SNP μικροσυστοιχιών και NGS, επειδή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ακόμη και χωρίς ζεύγη φυσιολογικά δείγματα, και μπορούν να αναλυθούν σχετικά εύκολα και ανέξοδα. Επομένως, η χρήση ενός δείκτη κλάσμα έχει λογική ακρίβεια, και πρακτικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις άλλες μεθόδους.

Ένας περιορισμός δείκτη κλάσματος μας είναι ότι η εκτίμηση μπορεί να επηρεαστεί από ετερογένεια μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, επειδή οι τρεις περιοχές δεν είναι πάντα εντελώς μεθυλιωμένα σε καρκινικά κύτταρα. Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι θεωρητικά κλωνική, η ετερογένεια θεωρήθηκε ότι οφείλεται σε μεθυλίωση ή απομεθυλίωση κατά την διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Για να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση της ετερογένειας μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, επιλέχθηκαν τρεις περιοχές όπως αυτές με την υψηλότερη επίπτωση της υπερμεθυλίωσης (βvalue & gt? 0,5) μεταξύ των 28 ESCCs. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι, χρησιμοποιώντας οκτώ ζεύγη καρκίνου και μη καρκινικό κύτταρο δείγματα LCM-καθαρισμένο, τουλάχιστον μία από τις τρεις περιοχές ήταν σχεδόν πλήρως μεθυλιωθεί σε οποιαδήποτε καρκινικά κύτταρα. Ένας άλλος περιορισμός είναι ότι αριθμός αντιγράφου μεταβολές μπορούν να επηρεάσουν την εκτίμηση. Για να αποκλεισθεί η επιδράσεις του αριθμού αντιγράφων μεταβολές στην εκτίμηση, διερευνήσαμε επίσης αριθμό αντιγράφων μεταβολές από τις τρεις περιοχές σε 15 ESCCs, και επιβεβαιώθηκε ότι ο αριθμός αντιγράφων αλλοιώσεις που θα μπορούσαν να προκαλέσουν μεγάλη απόκλιση της εκτίμησης του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων δεν παρατηρήθηκαν στις τρεις περιοχές. Λόγω αυτών των χαρακτηριστικών, ο δείκτης κλάσμα από τις τρεις περιοχές μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη συντριπτική πλειοψηφία των ESCCs. Τέλος, σε Et3N δείγμα, ένα δείγμα μη καρκινικό κύτταρο LCM-καθαρίζεται, οι τρεις περιοχές ήταν ελαφρώς μεθυλιωμένα. Αυτό θεωρήθηκε ότι οφείλεται στην ελλιπή καθαρισμό με LCM επειδή τα όρια μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και συστάδων μη-καρκινικές συστάδες κυττάρων ήταν εξαιρετικά ασαφείς σε αυτό το δείγμα.

Εν κατακλείδι, μεθυλίωση του DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση του κλάσματος των καρκινικών κυττάρων σε ένα δείγμα DNA όγκου. Η εκτίμηση αυτή θεωρείται ότι είναι μια πρακτική και ακριβή μέθοδο για μοριακή ανάλυση των ιστών του καρκίνου στην οποία τα φυσιολογικά κύτταρα είναι σχεδόν πάντα μολυσμένα. Ο δείκτης κλάσμα μεθυλίωση του DNA αναμένεται να είναι ιδιαίτερα επωφελής σε πολλές πτυχές της έρευνας για τον καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Μετρημένες επίπεδο μεθυλίωσης και αληθινή κλάσμα των καρκινικών κυττάρων. Υποθέτοντας μια 2-πλάσια αύξηση αριθμού αντιγράφων ήταν παρούσα σε καρκινικά κύτταρα, η πραγματική κλάσμα των καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε ως το [Μετρηθείσα επίπεδο μεθυλίωσης (%) /(200-Μετρηθείσα επίπεδο μεθυλίωσης (%))] χ100. Υποθέτοντας μια 0,5-φορές απώλεια αριθμού αντιγράφων ήταν παρούσα σε καρκινικά κύτταρα, η πραγματική κλάσμα των καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε ως το [επίπεδο 2xMeasured μεθυλίωσης (%) /(100 + Μετρηθείσα επίπεδο μεθυλίωσης (%))] χ100. Η απόκλιση της μετρούμενης επίπεδο μεθυλίωσης από την πραγματική κλάσμα των καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε ότι είναι μικρότερη από 17,2% τόσο στις 2 φορές κέρδος και στην απώλεια 0,5 φορές.

doi: 10.1371 /journal.pone.0082302.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Σύγκριση β τιμών πριν και μετά τη διόρθωση. τιμές των πρώτων β των δύο χώρων CpG [cg22879515 (

MIR34B

), cg23180938 (

CDO1

)] διορθώθηκαν από το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων στις 28 ESCCs. Ο άξονας Χ δείχνει τις πρώτες τιμές β, και ο άξονας-γ δείχνει τις τιμές β μετά την διόρθωση.

doi: 10.1371 /journal.pone.0082302.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Αστάρια και τις προϋποθέσεις για το MS-HRMA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082302.s003

(DOCX)

Πίνακας S2.

Αστάρια και τις προϋποθέσεις για την ποσοτική PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082302.s004

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε κ Mark Glaire για απόδειξη ανάγνωση του χειρογράφου μας και το Εθνικό Αντικαρκινικό Κέντρο Ερευνών Πυρήνας διευκόλυνση για την προετοιμασία των τμημάτων αυτών από παραφίνη-ενσωματωμένες χειρουργικά δείγματα σε αυτή τη μελέτη.