Αφηρημένο

καρκίνο του στομάχου αναπτύσσεται κάτω από ένα περιβάλλον υποξίας. HIF-1α είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) στα μιτοχόνδρια υπό συνθήκες υποξίας. Έχουμε ήδη συσταθεί κύτταρα HIF-1α νοκ ντάουν (KD) και τα κύτταρα ελέγχου (SC) του γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρά 58As9. Σε αυτή τη μελέτη, αποκάλυψε ότι τα κύτταρα KD, αλλά όχι τα κύτταρα SC, η απόπτωση που επάγεται υπό συνθήκες υποξίας (1% O

2) που οφείλεται στην υπερβολική παραγωγή των ROS. Μια ποσοτική ανάλυση RT-PCR έδειξε ότι οι εκφράσεις των δέκα γονίδια, τα οποία εμπλέκονται στους μηχανισμούς ελέγχου των ROS (συμπεριλαμβανομένου του Warburg αποτέλεσμα, mitophagy, μεταφορά ηλεκτρονίων αλυσίδα [ΕΕΣ] τροποποίηση και ROS σάρωσης), ρυθμίζονταν από τον HIF-1α. Επιπλέον, η προαγωγή της πρόσληψης γλυκόζης από γλυκόζη συν ινσουλίνη (GI) θεραπεία ενίσχυσε την αποπτωτική δράση, η οποία συνοδεύεται από περαιτέρω παραγωγή ROS σε υποξικά κύτταρα KD. Μια ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι η μεμβρανική έκφραση του GLUT1 σε κύτταρα KD ανυψώθηκε από τη γλυκόζη ή /και θεραπείες ινσουλίνη, υποδεικνύοντας ότι η πρόσληψη γλυκόζης GI επαγόμενη προκαλείται από την αυξημένη μετατόπιση GLUT1 στην κυτταρική μεμβράνη. Τέλος, η αντικαρκινική δράση του HIF-1α knockdown (KD) συν GI αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου, όπου υπάρχει φυσικά ένα υποξικό περιβάλλον. Ως αποτέλεσμα, η θεραπεία GI παρεμποδίζει ισχυρά την ανάπτυξη των όγκων KD οπότε κυτταρικής απόπτωσης ήταν ιδιαίτερα επάγεται σε σύγκριση με την αγωγή ελέγχου. Σε αντίθεση, η ανάπτυξη των όγκων που εκφράζουν SC HIF-1α δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία GI. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή HIF-1α συν GI μπορεί να είναι μια ιδανική θεραπεία, επειδή η απόπτωση λόγω της καταστροφής της ομοιόστασης ROS επάγεται ειδικά σε γαστρικό καρκίνο που αναπτύσσεται κάτω από ένα υποξικό περιβάλλον, αλλά όχι στο φυσιολογικό ιστό κάτω από το αερόβιες συνθήκες

Παράθεση:. Tanaka Τ, Kitajima Υ, Miyake S, Yanagihara Κ, Χαρά Η Νισιτζίμα-Matsunobu A, et al. (2015) Η αποπτωτική δράση του HIF-1α Αναστολή συνδυασμό με γλυκόζη συν ινσουλίνη Θεραπεία για γαστρικός καρκίνος υπό συνθήκες υποξίας. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257

Επιμέλεια: Ester Hammond, Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 30 του Απρίλη του 2015? Αποδεκτές: 13 Αυγούστου 2015? Δημοσιεύθηκε: 4 Σεπ 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Το περιβάλλον υποξίας είναι σημαντική σε συμπαγείς όγκους όπου επιταχύνει κακοήθη συμπεριφορά τους [1-4]. Όπως και άλλοι στερεοί όγκοι, γαστρικό καρκίνωμα είναι γνωστό ότι περιλαμβάνει εκτεταμένες περιοχές της υποξίας εντός του όγκου [5-7]. Υποξικές συνθήκες επάγουν διάφορες βιολογικές εκδηλώσεις, όπως η αγγειογένεση, η τοπική εισβολή, μεταστατικής εξάπλωσης, ράδιο- ή χημειοαντίσταση και μετέβαλε το μεταβολισμό της ενέργειας σε πολλά καρκινώματα, οδηγώντας σε κακή πρόγνωση σε ασθενείς [2-4].

Ο παράγοντας μεταγραφής υποξία παράγοντα 1 (HIF-1) είναι ο κύριος μεσολαβητής της κυτταρικής προσαρμογής σε υποξία [8-10]. HIF-1 είναι μία ετεροδιμερής πρωτεΐνη που αποτελείται από ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο β-υπομονάδα (HIF-1β) και ένα υποξία α (HIF-1α) υπομονάδα [8-10]. Η υπομονάδα HIF-1α αποικοδομείται μέσω του μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος υπό φυσιολογική οξυγόνωση. Αντίθετα, κάτω από υποξία, HIF-1α σταθεροποιείται και διμερίζεται με HIF-1β αλληλεπιδρά με CBP /p300, το οποίο στη συνέχεια δεσμεύεται με το στοιχείο απόκρισης υποξίας (HRE) σχετικά με την περιοχή υποκινητή των εκατοντάδων γονιδίων στόχων [11-16]. Οι προηγούμενες εκθέσεις έχουν οδηγήσει στην αναγνώριση του HIF-1α ως κεντρικό ρυθμιστή στην παθογένεση του καρκίνου του στερεού

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), όπως το ανιόν υπεροξειδίου (O

2

. – ), υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2), και ρίζα υδροξυλίου (ΗΟ •), αποτελείται από ρίζα και μη ρίζα είδη οξυγόνου που σχηματίζονται από την μερική αναγωγή του οξυγόνου. Η ενδοκυτταρική ROS παράγονται κυρίως στα μιτοχόνδρια από οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS), μια διαδικασία εκτελείται από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (ETC) [17]. Όταν ROS συντρίψει το κυψελοειδές σύστημα αντιοξειδωτικής άμυνας, εμφανίζεται το οξειδωτικό στρες. Η υπερβολική οξειδωτικό στρες προκαλεί το ROS μεσολάβηση βλάβη των νουκλεϊκών οξέων, των πρωτεϊνών και των λιπιδίων και οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο [17, 18].

HIF-1α έχει αναφερθεί για τον έλεγχο της παραγωγής ROS υπό συνθήκες υποξίας μέσω πολλαπλών μηχανισμών συμπεριλαμβανομένης της μετατροπής του μεταβολισμού της ενέργειας από OXPHOS προς γλυκόλυση, το οποίο αναφέρεται ως το φαινόμενο Warburg [19-23], την επαγωγή της μιτοχονδριακής επιλεκτικής αυτοφαγία (ορίζεται ως mitophagy) [24, 25], ETC τροποποίηση από έναν διακόπτη υπομονάδα σε κυτοχρώματος c οξειδάση (COX) [26] και καθαριστές ROS [27]. Στο μεταβολικό μονοπάτι της επίδρασης Warburg, HIF-1α ενεργοποιεί πρώτα τη μεταγραφή του

GLUT1

να αυξήσει την πρόσληψη γλυκόζης στα κύτταρα. Η γλυκόζη στη συνέχεια μεταβολίζεται σε πυροσταφυλικό από τις ενέργειες των μελών γλυκολυτικών ενζύμων, τα οποία είναι γνωστά στόχοι για HIF-1α [28, 29]. Κάτω από αερόβιες συνθήκες, πυροσταφυλικό μετατρέπεται σε ακετυλο-CoA (AcCoA) με πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης (PDH) για την έναρξη του κύκλου τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Αντιστρόφως, σε καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε υποξία, πυροσταφυλικό είναι παραπέμπονται μακριά από τα μιτοχόνδρια, οπότε HIF-1α ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση της ΡϋΚ1 να αναστέλλουν τη δράση της PDH. Στη συνέχεια, LDHA μετατρέπει εναλλακτικά πυροσταφυλικού σε γαλακτικό και MCT4 μεταφέρει το γαλακτικό έξω από το κύτταρο. Αυτά τα γονίδια ρυθμίζονται επίσης από HIF-1α [16, 30, 31]. Υποξία επάγει mitophagy να αποφευχθεί η υπερβολική παραγωγή ROS, με την οποία οι ζημιές μιτοχόνδρια αποβάλλεται μέσω πέψης λυσοσωμικής [24, 25]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι HIF-1α ενεργοποιεί τις μεταγραφές των γονιδίων που κωδικοποιούν BNIP3 και BNIP3L, ουσιαστικοί παράγοντες στη διαδικασία mitophagy [32]. Μια άλλη μελέτη ανέφερε ότι HIF-1α ρυθμίζει τη μεταγωγή υπομονάδα COX4 ενεργοποιώντας τη μεταγραφή των γονιδίων ETC σχετίζονται COX4-2 και LON, ένα μιτοχονδριακό πρωτεάση που απαιτείται για την αποικοδόμηση COX4-1 υπό υποξία [26]. Ο διακόπτης υπομονάδα COX4 αναφέρθηκε ως ένα σημαντικό βήμα στην ομοιόσταση ROS, λόγω του ρόλου της στη βελτιστοποίηση της αποδοτικότητας της αναπνοής κάτω από υποξία [26]. Ο εκκαθαριστής MnSOD ROS είναι γνωστό ότι μετατρέπει ριζών υπεροξειδίου σε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι MnSOD υπερεκφράζεται κάτω από υποξία, αν και κατά πόσο αυτή η προς τα πάνω ρύθμιση διαμεσολαβείται από HIF-1α δεν έχει ακόμη αποδειχθεί [27]. Πρόσφατα, μια άλλη έκθεση κατέδειξε την ενδιαφέρον εύρημα ότι οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες (ΠΜΑ) των υποξικών HIF-1α-null ποντίκια πέθαναν λόγω της υπερβολικής παραγωγής ROS, ενώ οι ΠΜΑ διασώθηκαν με κατεργασία με το αντιοξειδωτικό Ν ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC) [ ,,,0],33]. Στο σύνολό τους, οι εκθέσεις αυτές υποδεικνύουν ότι HIF-1α παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην οργάνωση του μιτοχονδριακή παραγωγή ROS σε ζωντανά κύτταρα κάτω από υποξία.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να δημιουργήσει ένα θεραπευτικό μοντέλο αποδεικνύοντας ότι η υποξία προκαλούμενη απόπτωση μέσω η υπερπαραγωγή ROS μπορεί να εισαχθεί σε ανεπάρκεια του γαστρικού καρκινικά κύτταρα HIF-1α. Εμείς αρχικά καθοριστεί αν η υποξία επάγει τον κυτταρικό θάνατο από την υπερβολική παραγωγή ROS στον HIF-1α νοκ ντάουν (KD) κύτταρα. Στη συνέχεια, ασχοληθήκαμε την υπόθεση ότι η εισαγωγή των υψηλών επιπέδων γλυκόζης κατά την κατεργασία των κυττάρων KD με ινσουλίνη μπορεί να ενισχύσουν την αποπτωτική δράση. Τέλος, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου, προτείναμε ότι HIF-1α αναστολή σε συνδυασμό με (GI) επεξεργασία της γλυκόζης συν ινσουλίνη μπορεί να είναι μια πιθανή θεραπεία για καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων συνθήκες και τα αντιδραστήρια

Η γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή 58As9 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Κ Yanagihara (National Cancer Center Νοσοκομείο Ανατολή, Chiba, Ιαπωνία) το Δεκέμβριο του 2009. Η κυτταρική σειρά 58As9 ιδρύθηκε αρχικά από το σκιρώδης γαστρικό καρκίνωμα κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται HSC-58 [34]. Αυτή η κυτταρική γραμμή στη συνέχεια επικυρώνεται περαιτέρω στις 24 Φεβρουαρίου

ου, το 2015 από την JCRB Τράπεζας Κυττάρων (Osaka, Japan). Ένα άλλο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, ΜΚΝ74 αγοράστηκε από την Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japan). Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε σταθερή HIF-1α νοκ ντάουν κύτταρα KD και 74-KD, που συστάθηκε με την επιμόλυνση του πλασμιδίου siRNA που φιλοξενούν τις σειρές RNAi στα κύτταρα 58As9 και ΜΚΝ74 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7, 35]. Οι αλληλουχίες siRNA που στοχεύει HIF-1α και ελέγχου κωδικοποιημένο siRNA σχεδιάστηκαν ως ακολούθως: HIF-1α siRNA για KD ή 74-KD (5′-CCA CAT TCA CGT ATA TGA Τ-3 ‘) και σκαρφάλωμα siRNA για SC ή 74- SC (5’-TCT ΤΑΑ ΤΕΕ CGT ΑΤΑ ΑΓΓ C-3 ‘). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο (FBS) και 100 μg /mL καναμυκίνη (Meiji, Τόκιο, Ιαπωνία ) και επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό είτε ορθοξικές συνθήκες (20% O

2 και 5% CO

2 στον αέρα) ή υποξικές συνθήκες (1% O

2, 5% CO

2 και 94% Ν

2) σε μία υποξική θάλαμο (ASTEC, Fukuoka, Japan) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NAC (Sigma-Aldrich) και ινσουλίνη (Wako, Osaka, Japan) σε μια τελική συγκέντρωση 5 mM και 500 ng /ml, αντίστοιχα. Η συγκέντρωση του μέσου υψηλής γλυκόζης παρασκευάστηκε με την προσθήκη 45% D – (+) – Γλυκόζη διάλυμα (Sigma-Aldrich) και η τελική συγκέντρωση προσδιορίστηκε να είναι 10 g /L, η οποία είναι 5 φορές υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς RPMI-1640.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία εκτιμήθηκε με trypan προσδιορισμούς αποκλεισμού μπλε χρωστική ουσία. Για την αξιολόγηση των επιδράσεων της θεραπείας φαρμάκου, συμπεριλαμβανομένης της NAC, υψηλής γλυκόζης ή /και ινσουλίνης επί της κυτταρικής βιωσιμότητας, 1 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε τρυβλία καλλιέργειας 6 cm. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορα φάρμακα στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και καλλιεργούνται υπό φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 24 ώρες έως 96 ώρες. Στο τέλος της επώασης, τα επιπλέοντα και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση (3000 rpm, 5 λεπτά). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 90 μι του πλήρους μέσου, αναμιγνύεται με 10 μL διαλύματος κυανού τρυπάνης 0,4% και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο κάτω από ένα μικροσκόπιο. Ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου προσδιορίστηκε ως η αναλογία του αριθμού των νεκρών κυττάρων /συνολικό αριθμό των κυττάρων. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές.

Western ανάλυση κηλίδος

κυτταρολύματα Σύνολο από καλλιεργημένα κύτταρα και οι όγκοι ξενομοσχεύματος σε ποντικούς παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που αποτελείται από 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 7.6), 0.5% Triton Χ-100, και ένα μίγμα αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche, Mannheim, Germany). Κυτταρολύματα από το κυτοσολικό κλάσμα και κλάσμα κυτταρικής μεμβράνης παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Κυτόχρωμα c Releasing Δοκιμασία Απόπτωσης Kit και μεμβράνης πλάσματος Kit Protein Extraction (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Δείγματα που περιέχουν 30 μg πρωτείνης διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά σε 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Amersham Hybond-ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς. Μετά τον αποκλεισμό με 5% γάλα δέρματος για 30 λεπτά, η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-HIF-1α (αραίωση 1: 1000, Abcam, Cambridge, UK), αντι-διασπασμένη κασπάση 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), αντι-κυτοχρώματος ο (1 : 500 αραίωση, BioVision), αντι-GLUT1 (1: 100.000 αραίωση, Abcam), και αντι-β-ακτίνης (αραίωση 1: 10.000? Sigma-Aldrich, Inc.). Μετά την επώαση με τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα, τα σήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας Amersham ECL Plus Δυτική Σύστημα Ανίχνευσης Blotting (GE Healthcare).

Ανίχνευση των ενδοκυτταρικών ROS με κυτταρομετρία ροής

αξίες Η ενδοκυτταρική ROS αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας συνολικά ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, ΝΥ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, KD, SC, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες είτε νορμοξία ή υποξία με ή χωρίς φαρμακευτικές αγωγές (δηλαδή, NAC, υψηλής γλυκόζης και /ή ινσουλίνης) για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. 74-KD και 74-SC ήταν επίσης καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες είτε νορμοξία ή υποξία για 24, 48, και 72 ώρες χωρίς οποιαδήποτε φαρμακευτική αγωγή. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επανα-εναιωρούνται στο διάλυμα ανίχνευση ROS. ROS φθορισμός ανιχνεύθηκε με τη ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο (Becton-Dickinson, San Jose, CA) και αναλύθηκαν με το πρόγραμμα Cell Quest λογισμικό. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Ο μέσος φθορισμός της παραγωγής ROS προσδιορίστηκε αυτόματα και παρουσιάζεται ως GEO σημαίνει.

Σύνολο εκχύλισης RNA και ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης RNA Isogen ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Ένα μg RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα ReverTra Ace (Toyobo) ανάστροφη μεταγραφή του κιτ αντίδρασης. Το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την PCR. Ένα πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (RT-qPCR) εκτελέστηκε με τη βοήθεια του συστήματος μέσου Light Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) χρησιμοποιώντας ένα κιτ Light-Cycler-FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche). Οι δέκα γονίδια που αναλύθηκαν από το RT-qPCR ήταν ως εξής: 1 μεταφορέα γλυκόζης (

GLUT1

), αλδολάση C (

ALDOC

), πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης κινάσης 1 (

ΡϋΚ1

), γαλακτική αφυδρογονάση Α (

LDHA

) και μονοκαρβοξυλικό μεταφορέα 4 (

MCT4

), Bcl-2 /αδενοϊό ΕΤΕ 19-kDa πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης 3 (

BNIP3

), BINP3 όπως (

BNIP3L

), μιτοχονδριακή μαγγανίου δισμουτάση του υπεροξειδίου (

MnSOD

), μια μιτοχονδριακή πρωτεάσης

LON

και οξειδάση κυτοχρώματος υπομονάδα 4-2 (

Cox4 – 2

). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις αναφερθείσες αλληλουχίες cDNA (GenBank, Bethesda, MD) (Πίνακας 1). Μετά την εκτέλεση ένα βήμα μετουσίωσης στους 95 ° C για 3 λεπτά, PCR ενίσχυση διεξήχθη με 50 κύκλους 15 s μετουσίωσης στους 95 ° C, 5 s από ανόπτηση στους 60 ° C και 10 s επέκταση στους 72 ° C. Οι ποσοτικές τιμές κανονικοποιήθηκαν προς την β-ακτίνης (

ACTB

) έκφραση (Πίνακας 1). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

Η πρόσληψη γλυκόζης δοκιμασία

Η πρόσληψη γλυκόζης σε καλλιεργημένα κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα 2-δεοξυγλυκόζη (2DG) πρόσληψη Μέτρηση Kit (COSMO ΒΙΟ Co. Ltd., Tokyo, Japan). Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκη άνευ ορού για 6 ώρες, που ακολουθείται από την περαιτέρω καλλιέργεια για 18 ώρες σε κανονικό μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες κάτω από νορμοξία ή υποξία. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 500 ng /ml ινσουλίνη για 18 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2DG για 20 λεπτά και υποβλήθηκε σε μέτρηση της πρόσληψης 2DG σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές.

Μελέτες σε ζώα

Τα πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από τις επιτροπές φροντίδας ζώων και Χρήση του Πανεπιστημίου Saga (πρωτόκολλο 24-008-0 ) και συμφωνήθηκε με τις ΦΘΑΣΕΙ κατευθυντήριες γραμμές για τη χρήση των ζώων στην έρευνα. Θηλυκό 4 εβδομάδων αθυμικά ποντίκια BALB /CA Jcl (ηυ /ηυ) ελήφθησαν από την Nihon Crea Co. (Osaka, Japan). Τα ζώα διατηρούνται κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων οργανισμών. Τους δόθηκαν στείρα τροφή και σε αυτόκαυστο νερό με ένα κύκλο φωτός-σκότους 12-h. Οι ποντικοί εγκλιματίστηκαν για το περιβάλλον για 7 ημέρες πριν από τα πειράματα. KD ή SC κύτταρα (3 χ 10

6) ενέθηκαν υποδορίως στη ράχη των ποντικών (n = 9 για κάθε κυτταρική σειρά). Δέκα ημέρες μετά την υποδόρια εμβολιασμό, τα ξενομοσχεύματα και των δύο κυττάρων έγινε προφανής. Εννέα ποντικοί που φέρουν KD ή SC ξενομοσχεύματα χωρίστηκαν στη συνέχεια σε τρεις ομάδες για θεραπεία με γλυκόζη (8 g /kg /ημέρα, Sigma), γλυκόζη συν ινσουλίνη (GI) (1 μονάδα ανά 3 g γλυκόζης /ημέρα, Wako) ή ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) ως θεραπεία ελέγχου. Κάθε ένα από αυτά τα φάρμακα χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε τρία ποντίκια (έξι όγκους συνολικά) κάθε 24 ώρες από την ημέρα 1 έως την ημέρα 11. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, οι όγκοι μετρήθηκαν σε 2 διαστάσεις κάθετα με ένα παχύμετρο κάθε τέσσερις ημέρες. Το μέγεθος του όγκου (

T

) αξιολογήθηκε ως η μέγιστη επιφάνεια κοπής και καθορίζεται από τον ακόλουθο τύπο:

T

= π /4 ×

μια

×

β

, όπου

μια

είναι η μικρότερη άξονα (mm) και

β

είναι το μεγαλύτερο άξονα (mm). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 12 ημέρες μετά τις φαρμακευτικές αγωγές και οι όγκοι συλλέχθηκαν για το επόμενο πείραμα.

Διασπασμένη κασπάση 3 ανοσοϊστοχημεία και η αξιολόγηση της απόπτωσης

in vivo

Η

Η κατεψυγμένα όγκοι με ενσωματωμένο Tissue-Tek Οκτώβριο Χημική ένωση. Αυτά τα μπλοκ κόπηκαν σε 4-μm πάχους τομές. Για ανάκτηση αντιγόνου, τα πλακίδια θερμάνθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (ρΗ 9.0) σε φούρνο μικροκυμάτων (500 watt) επί 5 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-διασπασμένη κασπάση 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και το ϋΑΚΟ Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκε ως το δεύτερο αντίσωμα. Τα σήματα κατέστησαν ορατά με διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (0,02%). Για την αξιολόγηση της απόπτωσης, διασπασμένη κασπάση 3-θετικών κυττάρων με καφέ χρώμα πυρήνες μετρήθηκαν σε πέντε πεδία σε μεγέθυνση 400χ και ο μέσος υπολογίστηκε. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της διασπαστεί κασπάσης 3 τυφλά εξεταστεί και αξιολογηθεί από πιστοποιημένο παθολόγο (Δρ AN).

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με ANOVA χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού Prism 5 ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Για τη σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων, οι διαφορές στις μέσες τιμές αξιολογήθηκαν από

t-

δοκιμασία του Student και το Mann-Whitney

U

δοκιμή. Για τη σύγκριση μεταξύ τριών ή περισσοτέρων ομάδων, έγιναν Bonferroni post hoc δοκιμασίες για μια μονόδρομη ANOVA. Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± SEM.

Αποτελέσματα

HIF-1α knockdown επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο κάτω από υποξία σε 58As9 γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Η έκφραση HIF-1α ήταν αξιολογήθηκαν σε κύτταρα σταθερά HIF-1α knockdown (KD) και SC (ως η κυτταρική γραμμή ελέγχου) κύτταρα. Μια ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι η έκφραση του HIF-1α ήταν πλήρως χτυπηθεί κάτω στα κύτταρα KD μετά από 8 ώρες κάτω από υποξία σε σύγκριση με τα κύτταρα SC (Σχήμα 1Α). Ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου εκτιμήθηκε μετά από 24 ώρες έως 96 ώρες υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία. Το ποσοστό θανάτου ήταν υψηλότερη στα κύτταρα KD ό, τι στα κύτταρα SC υπό φυσιολογική οξυγόνωση για 24 έως 96 ώρες, ωστόσο οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Σχήμα 1Β). Αντίθετα, το ποσοστό θανάτου κυττάρου σε κύτταρα KD ήταν έντονα αυξημένη υπό υποξία και σημαντικά υψηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε στα κύτταρα SC στις 72 και 96 ώρες (Σχ 1C). Η ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι διασπασμένης κασπάσης 3 καθώς και κυτοσολικό κυτόχρωμα c ήταν αυξημένα στα κύτταρα KD, αλλά όχι στα κύτταρα SC υπό υποξία για 8 ώρες (Σχ 1D και 1Ε). Η υποξία θάνατος επαγόμενο κυτταρικό επιβεβαιώθηκε επίσης και σε άλλες knockdown γαστρικά καρκινικά κύτταρα HIF-1α 74-KD (S1 Εικ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υποξία επάγεται ισχυρά απόπτωση στην HIF-1α knockdown κυτταρική γραμμή KD.

(Α) Η ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης HIF-1α πραγματοποιήθηκε με τον SC ή KD κύτταρα κάτω από νορμοξία (20% O

2) και υποξία (1% O

2). Η εσωτερική δείκτη β-ακτίνης (β-act) ήταν εξίσου εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα. (Β), (Γ) Ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα SC ή κύτταρα KD υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Β) και υποξία (C) για 0 ​​h έως 96 h. Τα ποσοστά θανάτου συγκρίθηκαν μεταξύ των κυττάρων SC και τα κύτταρα KD. N.s .: δεν είναι σημαντική, *: p & lt? 0,05, **: p & lt? 0,01, ***: p & lt? 0.001. (D), (Ε) Μια ανάλυση κηλίδας Western των (D) διασπασμένη κασπάση 3 και (Ε) κυτοσολικό κυτόχρωμα c στο SC ή KD κύτταρα υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία για 8 ώρες.

Η

Εκκαθάριση ROS αντιστραφεί το αποπτωτικό φαινότυπο που παρατηρείται σε νοκ ντάουν κύτταρα HIF-1α

το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS εκτιμήθηκε και συγκρίθηκε μεταξύ των κυττάρων KD και SC. Το επίπεδο ROS αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο στα κύτταρα KD υπό υποξία, ενώ το επίπεδο ήταν αχνά αυξημένα στα κύτταρα SC (Σχήμα 2Α). Το επίπεδο ROS στα κύτταρα KD ήταν σημαντικά υψηλότερη υπό υποξία για 24 έως 72 ώρες από ότι στα κύτταρα SC (Σχήμα 2Α). Τα επίπεδα ROS αξιολογήθηκαν επίσης στα κύτταρα 74-SC και τα κύτταρα 74-KD (S2 σχήμα). Τα επίπεδα ROS δεν διέφεραν μεταξύ των 74-SC και 74-KD κυττάρων υπό φυσιολογική οξυγόνωση (S2A σχήμα). Ωστόσο, σύμφωνα με υποξία, τα επίπεδα ROS ήταν σημαντικά υψηλότερα στα κύτταρα 74-KD από ότι στα κύτταρα 74-SC στις 48 έως 72 ώρες (Εικ S2B). NAC, ένα αντιοξειδωτικό, μείωσε σημαντικά το επίπεδο ROS στα κύτταρα KD υπό υποξία για 48 έως 72 ώρες (Σχήμα 2Β). Για να εκτιμηθεί αν η παραγωγή ROS επάγει υποξία κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κύτταρα KD, το ποσοστό θανάτου των κυττάρων με ή χωρίς NAC αξιολογήθηκε σε κύτταρα KD κάτω από νορμοξία και υποξία. θεραπεία NAC δεν επηρέασε το ρυθμό του κυτταρικού θανάτου στα κύτταρα KD υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 2C). Αντίθετα, η θεραπεία NAC μείωσε σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα KD υπό υποξία για 48 έως 96 ώρες (Σχ 2D).

(Α) Τα επίπεδα ROS εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τα κύτταρα KD και SC κάτω από υποξία για 0 h έως 72 h. (Β) Το επίπεδο ROS αναλύθηκε σε υποξικά KD κύτταρα με ή χωρίς 5 mM θεραπεία NAC για 0 ​​έως 72 ώρες. (Γ) Το ποσοστό κυτταρικού θανάτου εκτιμήθηκε σε κύτταρα KD με ή χωρίς NAC υπό φυσιολογική οξυγόνωση (C) και υποξία (D) για 0 ​​h έως 96 h. KD-NAC (-): NAC-ακατέργαστα κύτταρα KD, KD-NAC (+): NAC-επεξεργασμένα κύτταρα KD. *: P & lt? 0,05, ***: ρ. & Lt? 0.001

Η

HIF-1α νοκ ντάουν μείωσε την υποξική διέγερση των διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται στον έλεγχο των ROS παραγωγής

Για να διερευνηθεί η υποξία προκαλούμενη συσσώρευση ROS στα κύτταρα knockdown HIF-1α, η έκφραση του mRNA του δέκα γονίδια που εμπλέκονται στο μηχανισμό ελέγχου ROS (

GLUT1

,

ALDOC

,

ΡϋΚ1

,

LDHA

,

MCT4

,

BNIP3

,

BNIP3L

,

LON

,

COX4-2

και

MnSOD

) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα RT-qPCR. Η υποξική επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης εκτιμήθηκε από την επαγωγή αναδίπλωσης (FI). Το ΧΟ στις δέκα γονίδια ήταν σημαντικά χαμηλότερα στα κύτταρα KD από ότι στα κύτταρα SC (Σχήμα 3). Επιπλέον, όταν περιορίζονται σε υποξικές συνθήκες, τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων δέκα ήταν σημαντικά χαμηλότερα στα κύτταρα KD από τα κύτταρα SC. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HIF-1α knockdown μειώθηκε αισθητά το υποξία προκαλούμενη έκφραση των δέκα γονιδίων. Από την άλλη πλευρά, κάτω από νορμοξία, η έκφραση της ΡϋΚ1 και BNIP3L ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα KD ό, τι στα κύτταρα SC. Αντιστρόφως, τα επίπεδα έκφρασης του LON και COX4-2 ήταν σημαντικά υψηλότερα στα κύτταρα KD σε σύγκριση με τα κύτταρα SC.

Η έκφραση του mRNA του GLUT1, ALDOC, ΡϋΚ1, LDHA, MCT4, BNIP3, BNIP3L, LON , COX4-2 και MnSOD ποσοτικά αξιολογούνται βάσει νορμοξίας (μαύρες μπάρες) και υποξία (λευκές ράβδοι) για 24 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης που παρουσιάζονται στο γράφημα. Η πλάσια επαγωγή (FI) υπολογίστηκε ως ο λόγος έκφραση της υποξίας /νορμοξία και παρουσιάζεται στο κάτω μέρος των γραφικών παραστάσεων. Τα επίπεδα έκφρασης του δέκα γονιδίων στα κύτταρα KD συγκρίθηκαν με τα επίπεδα έκφρασης στα κύτταρα SC υπό τόσο νορμοξία και υποξία. ns: δεν είναι σημαντική, *: p & lt? 0,05, **: p & lt? 0,01, ***: ρ. & lt? 0.001

Η

γλυκόζης και της ινσουλίνης θεραπείες ενισχυθεί το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα KD κάτω από υποξία

επόμενο διερευνηθεί κατά πόσον η προαγωγή της πρόσληψης γλυκόζης επηρεάζει την υποξία απόπτωση σε κύτταρα KD. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε στα κύτταρα KD και SC ακόλουθες επεξεργασίες με μάρτυρα (PBS), υψηλή γλυκόζη, ινσουλίνη ή υψηλή γλυκόζη συν ινσουλίνη (GI). Η υποξία-επαγόμενη κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε από την FI. Ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου κάτω από υποξία συγκρίθηκε μεταξύ της θεραπείας ελέγχου και των άλλων θεραπειών σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4). Στα κύτταρα SC, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στο ποσοστό θανάτου FI και κυττάρου υπό υποξία παρατηρήθηκαν μεταξύ οποιαδήποτε από τις θεραπείες (Σχήμα 4Α). Στα κύτταρα KD, ο FI αυξήθηκε σημαντικά από την υποξία σε όλες τις θεραπείες. Ειδικότερα, η θεραπεία GI απέδωσε την υψηλότερη FI μεταξύ όλων των θεραπειών (Εικόνα 4Β). Ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου υπό υποξίας ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα ΓΕ-θεραπεία σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου επεξεργασμένα (Σχήμα 4Β). Για να διερευνήσουν κατά πόσον οι θεραπείες επηρέασε την παραγωγή ROS, το επίπεδο ROS αναλύθηκε στα κύτταρα KD. Σε σύγκριση με νορμοξικές συνθήκες, το επίπεδο ROS ήταν σημαντικά αυξημένα στα κύτταρα KD υπό συνθήκες υποξίας (Σχήμα 4C). Κάτω από υποξία, το επίπεδο ROS στα κύτταρα KD αυξήθηκε σημαντικά από την υψηλή γλυκόζη, ινσουλίνη και θεραπεία GI σε σύγκριση με τη θεραπεία ελέγχου. Το υψηλότερο επίπεδο των ROS θετικά παρατηρήθηκε στις GI-κατεργασμένων κυττάρων KD (Σχήμα 4C).

Η FI του ρυθμού κυτταρικού θανάτου προσδιορίστηκε ως ο λόγος του θανάτου της υποξίας /φυσιολογική οξυγόνωση. Το ποσοστό κυτταρικού θανάτου σε αγωγή με PBS (έλεγχος), υψηλή γλυκόζη και /ή SC κύτταρα που έλαβαν ινσουλίνη (Α) και τα κύτταρα KD (Β) παριστάνεται γραφικά. Η τιμή FI παρουσιάζεται στο κάτω μέρος. Ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου κάτω από υποξικές συνθήκες για τη θεραπεία ελέγχου συγκρίθηκε με εκείνη σε υψηλής γλυκόζης, της ινσουλίνης και θεραπεία GI. (Γ) Η ενδοκυτταρική επίπεδο ROS στον μάρτυρα, υψηλής ινσουλίνη επεξεργασμένα κύτταρα KD γλυκόζη και /ή απεικονίζονται στο γράφημα. Τα επίπεδα ROS στα κύτταρα KD αγωγή με τη θεραπεία ελέγχου συγκρίθηκαν μεταξύ νορμοξία (μαύρες ράβδοι) και υποξία (λευκές ράβδοι). Το επίπεδο ROS στα υποξικά KD κυττάρων με αγωγή ελέγχου περαιτέρω συγκρίθηκε με εκείνη με την υψηλή γλυκόζη, ινσουλίνη και θεραπεία GI. ns: δεν είναι σημαντική, *: p & lt? 0,05, **: p & lt? 0,01, ***: ρ. & lt? 0.001

Η

Η αξιολόγηση της πρόσληψης της γλυκόζης μετά τη θεραπεία με ινσουλίνη

Η γλυκόζη ικανότητα πρόσληψης αναλύθηκε σε μια μελέτη ενσωμάτωση 2DG. Στα κύτταρα SC και KD κάτω από νορμοξία, η ενσωμάτωση 2DG ήταν σημαντικά αυξημένα από την κατεργασία 2DG σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η ενσωμάτωση 2DG αυξήθηκε περαιτέρω με την πρόσθετη θεραπεία με ινσουλίνη και στα δύο κύτταρα (Σχήμα 5Α). Σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση, υποξία διεγείρονται πιο έντονα την πρόσληψη 2DG στα κύτταρα SC, με ή χωρίς ινσουλίνη (Σχήμα 5Β). Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν στα κύτταρα KD υπό υποξία (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, σύμφωνα με υποξία, λιγότερο 2DG ενσωματώθηκε στα κύτταρα KD ό, τι στα κύτταρα SC, με ή χωρίς την πρόσθετη θεραπεία με ινσουλίνη (Σχήμα 5Β). Για να αξιολογηθεί ο μηχανισμός της πρόσληψης γλυκόζης εξαρτάται από την ινσουλίνη, η μεμβρανώδης έκφραση του GLUT1 αναλύθηκε στα κύτταρα KD υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία. Κάτω από νορμοξία, ο μεμβρανώδης έκφραση GLUT1 ανυψώθηκε με υψηλή γλυκόζη και /ή θεραπεία με ινσουλίνη σε σύγκριση με εκείνη χωρίς θεραπεία (Εικ 5C). Σε σύγκριση με αυτό που παρατηρήθηκε κάτω από νορμοξία, υπό υποξία, η μεμβρανώδης έκφραση GLUT1 ανυψώθηκε σε όλες τις θεραπείες. Επιπλέον, η έκφραση αυξήθηκε από υψηλά επίπεδα γλυκόζης και /ή θεραπεία με ινσουλίνη, σε σύγκριση με εκείνη με την απουσία θεραπείας (Σχήμα 5C). Ειδικότερα, η μεμβρανώδης έκφραση GLUT1 ήταν πιο έντονα αυξημένη από την υψηλή γλυκόζη και ινσουλίνη (GI) θεραπεία στα υποξικά κύτταρα KD (Σχ 5C). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση μιας άλλης οικογένειας GLUT, GLUT3, ήταν αχνά παρατηρήθηκε στα κύτταρα KD, και το εύρημα αυτό δεν μεταβλήθηκε μεταξύ αυτών διάφορες θεραπείες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αυτή τη μελέτη, GLUT2 και GLUT4 δεν εκφράζεται στα κύτταρα KD.

(Α), (Β) Το επίπεδο πρόσληψης 2DG στα κύτταρα SC ή κύτταρα KD με ή χωρίς θεραπεία με ινσουλίνη αξιολογήθηκε υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Α) και υποξία (Β). (Γ) Η ανάλυση στυπώματος Western των μεμβρανώδη GLUT1 (54 kDa) έκφραση στα κύτταρα KD με έλεγχο, υψηλής γλυκόζης και /ή θεραπείες ινσουλίνη κάτω τόσο νορμοξία και υποξία όπως υποδεικνύεται. ***: Σελ. & Lt? 0.001

Η

HIF-1α νοκ ντάουν συν θεραπεία GI κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών ξενομοσχευμάτων σε γυμνά ποντίκια

Τέλος, προσδιορίσαμε το

in vivo

επίδραση της θεραπείας GI σε ξενομοσχεύματα όγκου KD και SC. Σχήμα 6Α δείχνει τον πειραματικό σχεδιασμό του μοντέλου ποντικού ξενομοσχεύματος. Δέκα ημέρες μετά την υποδόριο εμβολιασμό του SC ή κυττάρων KD, ξενομοσχεύματα αναπτύχθηκαν στις πλάτες των γυμνών ποντικών. Σε αυτό το σημείο, μια ανάλυση κηλίδος Western επιβεβαίωσε την HIF-1α έκφραση στους όγκους SC, αλλά όχι στους όγκους KD (Σχήμα 6Β). Στη συνέχεια, τρία φάρμακα, που αποτελείται από PBS, γλυκόζη ή GI, εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν ένα SC ή KD του όγκου (ημέρα από την ημέρα 1 έως την ημέρα 11). Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των ποντικών που φέρουν όγκο, που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS (SC-PBS και KD-PBS), γλυκόζη (SC-γλυκόζη και KD-γλυκόζη) ή GI (SC-GI και KD-GI) φαίνονται στο Σχ 6C . Οι όγκοι KD-γλυκόζη και KD-GI φάνηκε να είναι μικρότερο από τα άλλα όγκους. Σχήμα 6D έδειξε την καμπύλη ανάπτυξης των 6 όγκων. Τα μεγέθη της KD-γλυκόζη και όγκους KD-GI ήταν σημαντικά μικρότερες από τον όγκο KD-PBS κατά την ημέρα 12. Το KD-GI όγκου ήταν η μικρότερη. Από την άλλη πλευρά, στα ποντίκια SC, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέγεθος του SC-PBS, SC-γλυκόζη και όγκων SC-GI (Σχήμα 6D). Μία ανοσοϊστοχημική ανάλυση διασπασμένη κασπάση 3 διεξήχθη για να αξιολογηθεί η απόπτωση που επάγεται από τη γλυκόζη ή τη θεραπεία GI. Η θετική έκφραση της διασπαστεί caspase3 ήταν συχνά παρατηρείται στην KD-γλυκόζης και οι όγκοι KD-GI (Σχήμα 6Ε). Ωστόσο, όλοι οι όγκοι KD εμφάνισε κάποιο βαθμό διασπασμένης κασπάσης 3 (Εικόνα 6F). Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση του διασπασμένη κασπάση 3 μεταξύ των SC-PBS, SC-γλυκόζη και όγκων SC-GI. Στα όγκους KD, η θετική έκφραση του διασπασμένου caspase3 ήταν σημαντικά υψηλότερη στον όγκο KD-PBS σε σχέση με τον όγκο SC-PBS. Επιπλέον, η έκφραση του διασπασμένου caspase3 ήταν σημαντικά υψηλότερη στους όγκους KD-γλυκόζη ή KD-GI σε σχέση με τον όγκο KD-PBS. Η υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε στον όγκο KD-GI.

(Α) Το πειραματικό πρόγραμμα της γλυκόζης (G) ή γλυκόζη συν ινσουλίνη (GI) θεραπεία για τα ξενομοσχεύματα όγκου. Η ένεση αρχική ενδοπεριτοναϊκή (ί.ρ.) με έλεγχο PBS ή γλυκόζη, GI υποδεικνύεται από τον άδειο τρίγωνο. Οι ενέσεις ί.ρ υποδεικνύονται με βέλη. Οι όγκοι συλλέχθηκαν την ημέρα 12 που υποδεικνύεται από τον δικτυωμένο τρίγωνο. (Β) Η ανάλυση Western blot του HIF-1α στα ξενομοσχεύματα των κυττάρων SC (SC όγκου) και τα κύτταρα KD (KD όγκου). (C) Εκπρόσωπος εικόνες της SC ή όγκων KD αγωγή με PBS, γλυκόζη ή GI. Τα επεξεργασμένα όγκοι χαρακτηρίζονται ως SC-PBS, SC-Γλυκόζη, SC-GI, KD-PBS, KD-γλυκόζη και KD-GI. (Δ) Το μέγεθος των 6 όγκων κατά την ημέρα 1 έως την ημέρα 12 με γράφημα στο όπως υποδεικνύεται.