Αφηρημένο

Ιστορικό

Ταχεία αξιόπιστη διάγνωση των μεταλλάξεων του DNA είναι ιδιαίτερα επιθυμητή στην έρευνα και κλινικές δοκιμασίες. Τρέχουσες εξελίξεις στον τομέα αυτό πηγαίνει ταυτόχρονα σε δύο κατευθύνσεις: 1) μεθόδους υψηλής απόδοσης, και 2) φορητές δοκιμασίες. Μη ενζυματική προσεγγίσεις είναι ελκυστικές για τους δύο τύπους μεθόδων, δεδομένου ότι θα επιτρέπει την ταχεία και σχετικά φθηνό ανίχνευση των νουκλεϊκών οξέων. Σύγχρονη μικροσκοπία φθορισμού έχει τεράστιο αντίκτυπο στην ανίχνευση των βιομορίων στο παρελθόν ακατόρθωτο ανάλυση. Ωστόσο, δεν απλές μέθοδοι για την ανίχνευση του DNA σε μια μη-ενζυματική τρόπο χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού και ανάλογα νουκλεϊκών οξέων έχουν προταθεί μέχρι τώρα.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Εδώ αναφέρουμε μία νέα ελεύθερη από ένζυμο προσέγγιση για τον εντοπισμό μεταλλάξεων αποτελεσματικά τον καρκίνο. Αυτή η δοκιμασία περιλαμβάνει ειδική γονιδιακή εμπλουτισμού στόχο που ακολουθείται από ανόπτηση σε ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν κλειδωμένα νουκλεϊκά οξέα (LNAs) και τέλος, η ανίχνευση με μικροσκοπία φθορισμού. Το LNA που περιέχει ανιχνευτές εμφανίζουν υψηλή συγγένεια σύνδεσης και ειδικότητα σε μεταλλάξεις του DNA που περιέχουν, το οποίο επιτρέπει την ανίχνευση της αφθονίας μετάλλαξης με EvaGreen παρεμβαλλόμενη χρωστική. Χρησιμοποιήσαμε ένα δεύτερο ανιχνευτή, η οποία αυξάνει τον συνολικό αριθμό των ζευγών βάσεων, ώστε να παραχθεί ένα υψηλότερο σήμα φθορισμού ενσωματώνοντας περισσότερα μόρια χρωστικής. Πράγματι δείχνουμε εδώ ότι η χρήση EvaGreen χρωστικής και LNA ανιχνευτές, γονιδιωματικό DNA που περιέχει

BRAF

μετάλλαξη V600E μπορούσε να ανιχνευθεί με μικροσκοπία φθορισμού σε χαμηλές συγκεντρώσεις femtomolar. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτό ήταν τουλάχιστον 1000 φορές πάνω από το δυναμικό όριο ανίχνευσης.

Συμπέρασμα

Σε γενικές γραμμές, η νέα δοκιμασία θα περιγράψουμε θα μπορούσε να γίνει μια νέα προσέγγιση για την γρήγορη, αξιόπιστη και ελεύθερη από ένζυμο διάγνωση της καρκίνο ή άλλες συναφείς στόχους DNA. Σημαντικά, στοιχειομετρία αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στόχους διατηρείται στον προσδιορισμό μας, η οποία επιτρέπει την ακριβή εκτίμηση του μεταλλαγμένου αφθονίας, όταν η απαίτηση όριο ανίχνευσης ικανοποιείται. Χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού, η προσέγγιση αυτή δίνει την ευκαιρία να ανιχνεύσουν DNA σε ανάλυση ένα μόνο μόριο και άμεσα στο βιολογικό δείγμα επιλογής

Παράθεση:. Miotke L, Maity Α, Ji Η, Μπρούερ J, K Astakhova (2015 ) Enzyme-Free ανίχνευση μεταλλάξεων στο DNA καρκίνου χρησιμοποιώντας συνθετικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές και φθορισμού μικροσκοπία. PLoS ONE 10 (8): e0136720. doi: 10.1371 /journal.pone.0136720

Επιμέλεια: Θωμάς Αβραάμ, Pennsylvania State Hershey College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες