Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρή μη-κωδικοποίησης ρυθμιστικές RNA που ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση μέσω κυρίως μετα-μεταγραφική σίγηση. Έχουμε ήδη εντοπιστεί

miR-205

σε μια υπογραφή για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ανθρώπινο χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση βαθιά αλληλουχίας. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει ότι

miR-205

έκφραση ήταν συχνά υψηλότερα στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας από συμφωνημένα δείγματα φυσιολογικού ιστού τους. Λειτουργικά, έχουμε αποδείξει ότι

miR-205

προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Για την περαιτέρω κατανόηση των βιολογικών ρόλων των

miR-205

, πραγματοποιήσαμε

in vivo

διασταύρωσης και Argonaute 2 ανοσοκαθίζηση συγκροτήματα ριβονουκλεοπρωτεϊνικού miRNA που ακολουθείται από ανάλυση μικροσυστοιχιών (CLIP-Chip) για τον εντοπισμό πιθανών mRNA της στόχους. Εφαρμόζοντας CLIP-Chip για gain- και πειράματα απώλειας λειτουργίας, εντοπίσαμε μια σειρά από μεταγραφές ως πιθανοί στόχοι του

miR-205

. Αρκετοί στόχοι λειτουργικά εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Δύο από αυτούς, CYR61 και CTGF, περαιτέρω επικυρωθεί από την ανάλυση Western blot και ποσοτικοποίηση εμπλουτισμού mRNA στα ανοσοκαθιζήματα ago2 χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Επιπλέον, και τα δύο

CYR61

και

CTGF

ήταν προς τα κάτω σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς. Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν νέα λειτουργικά τους ρόλους και τους στόχους του

miR-205

στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, το οποίο μπορεί να παρέχει νέες ιδέες για το ρόλο της στην τραχηλική καρκινογένεση και η πιθανή αξία της για την κλινική διάγνωση.

Παράθεση: Xie Η, Zhao Υ, Caramuta S, Larsson C, Lui WO (2012)

miR-205

Έκφραση Προωθεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των Ανθρωπίνων Καρκίνου του Τραχήλου της Μήτρας κύτταρα. PLoS ONE 7 (10): e46990. doi: 10.1371 /journal.pone.0046990

Επιμέλεια: Siu Tim Cheung, του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 13η Απριλίου του 2012? Δεκτές: 7 Σεπτεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Xie et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας (523-2009-3517, 521-2010-3518)? Ίδρυμα του Åke Olsson για Αιματολογικές Έρευνας? το σουηδικό ίδρυμα Cancer? Ίδρυμα του Åke Wiberg του? Ο βασιλιάς Γουσταύος V Ταμείο Ιωβηλαίο? Αντικαρκινική Εταιρεία στη Στοκχόλμη? ο Axel και Ίδρυμα δωρεά Signe Lagerman του? Ινστιτούτου Καρολίνσκα και το Συμβούλιο της Κομητείας της Στοκχόλμης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του τραχήλου, η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των γυναικών σε όλο τον κόσμο [1], συνδέεται στενά με τη μόλυνση και την επακόλουθη μετατροπή των κυττάρων του τραχήλου από συγκεκριμένες ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) υποτύπων [2]. Το γεγονός ότι ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας αναπτύσσεται από καλά αναγνωρισμένο προ-κακοήθεις μορφές, προσφέρει μια σημαντική ευκαιρία για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόληψη. Σήμερα τέτοια πρωτογενή διαλογή περιλαμβάνει κυτταρολογικές αναλύσεις και ταυτοποίηση του ιού HPV. Ωστόσο, οι εξετάσεις αυτές δεν μπορεί αξιόπιστα να διακρίνουν τις βλάβες με επεμβατική δυναμικό από τις βλάβες που θα υποχωρούν αυθόρμητα. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη των πιο ισχυρή δείκτες για την εξέλιξη της νόσου θα ήταν πολύτιμη συμπληρώματα με τις τρέχουσες μεθόδους διαλογής.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρή μη-κωδικοποίησης RNAs (~ 22-νουκλεοτίδια) που ελέγχουν γενικά την έκφραση του γονιδίου στο ταχυδρομείο -transcriptional επίπεδο μέσω της υποβάθμισης του mRNA ή /και μεταφραστική καταστολή [3]. Αυτά τα μικροσκοπικά μόρια έχουν αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου. Εμείς, και άλλοι, έχουν καθοριστεί προηγουμένως αλλαγμένη υπογραφές έκφραση miRNA στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας του ανθρώπου [4] – [10]. Αρκετά από αυτά τα miRNAs έχουν επανειλημμένα αναφερθεί ως απορυθμίζεται σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (

π.χ.

.

miR-143

,

miR-145

,

miR-21

και

miR-205

). Λίγα έχουν επίσης χαρακτηρισθεί λειτουργικά σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Μεταξύ αυτών,

miR-143

,

miR-145

και

miR-34a

έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και

miR-146a

και

miR-21

για την αύξηση της ανάπτυξης των κυττάρων [8], [10], [11].

miR-23β

βρέθηκε πρόσφατα να καταστέλλει την έκφραση του ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) και επάγουν την κυτταρική μετανάστευση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας [12]. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η απορυθμισμένη miRNAs έχουν ένα λειτουργικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και μπορεί να εφαρμοστεί ως διαγνωστικά εργαλεία.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το λειτουργικό ρόλο του

miR-205

στον καρκίνο του ανθρώπου τραχήλου της μήτρας. Αυτό miRNA ήταν μια από τις πιο σημαντικές miRNAs χρησιμοποιηθούν για τραχηλική πρόβλεψη τάξη του καρκίνου και υπερεκφράζεται σημαντικά σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου σε σύγκριση με συμφωνημένα κανονική ομολόγους [9]. Αυξημένη έκφραση του

miR-205

έχει επίσης παρατηρηθεί σε αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου [13], κεφαλής και λαιμού πλακώδους κυτταρικές σειρές καρκινώματος [14], καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου του πνεύμονα [15] και τον καρκίνο των ωοθηκών [16]. Αντιθέτως, η μειωμένη έκφραση του

miR-205

έχει αναφερθεί σε μελάνωμα [17] και καρκίνους του οισοφάγου [18], των νεφρών [19], της ουροδόχου κύστης [20], [21], του μαστού [22] , και του προστάτη [23].

με βάση τις παραπάνω μελέτες,

miR-205

μπορεί να λειτουργεί ως ένα ογκογονίδιο ή ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ανάλογα με τα κυτταρικά περιβάλλοντα. Συνεπής με τη διπλή αποστολή της, αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει όγκου του προώθηση και κατασταλτική ρόλους σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές. Για παραδείγματα,

miR-205

έχει δειχθεί ότι καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή μέσω επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση τόσο ανθρώπινου προστάτη και κυττάρων καρκίνου του μαστού [23], [24], καθώς επίσης και για τη στόχευση

HER3

υποδοχέα κινάσης τυροσίνης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [22]. Προς στήριξη της ογκογόνο λειτουργία,

miR-205

βρέθηκε να στοχεύσετε

SHIP2

για Akt επιβίωσης σηματοδότησης στα κύτταρα καρκίνωμα κεφαλής και του λαιμού πλακώδους [14]. Δεδομένης της πολυπλοκότητας των λειτουργιών του, θα ήταν ενδιαφέρον να διερευνήσει τις λειτουργικές τους ρόλους του

miR-205

στην ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Εδώ περιγράφουμε τις λειτουργικές συνέπειες του

ΜΙΚ 205

ρύθμιση σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Σε gain- και πειράματα απώλειας λειτουργίας, έχουμε αποδείξει ότι

miR-205

ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Έχουμε ακόμη εντοπιστεί ένα σύνολο υποθετικών

miR-205

στόχους χρησιμοποιώντας μια βιοχημική προσέγγιση. Αρκετές από αυτές τις υποψήφιων στόχων λειτουργικώς συνδέονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Δύο από τις δυνατότητες

miR-205

στόχους mRNA περαιτέρω επικυρωθεί σε πειράματα καλλιέργειας κυττάρων. Τα ευρήματά μας παρέχουν ένα σημαντικό προβάδισμα για την περαιτέρω γνώσεις για τον λειτουργικό ρόλο του

miR-205

στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου.

Αποτελέσματα

miR-205

Η έκφραση σε ανθρώπινα δείγματα του τραχήλου της μήτρας Καρκίνος

Έχουμε ήδη εντοπιστεί ένα σύνολο miRNAs που θα μπορούσαν να διακρίνουν τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου από την κανονική τους ομολόγους τους, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση αλληλουχίας που βασίζεται miRNA προφίλ [9]. Σε αυτή την ταξινόμηση,

miR-205

είχε την υψηλότερη βαθμολογία, γεγονός που υποδηλώνει μια σημαντική λειτουργία στην ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Για να επιβεβαιωθεί η μεταβολή του επιπέδου εκφράσεως του

miR-205

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, μετρήσαμε

miR-205

έκφραση με πραγματικού χρόνου ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR) σε 27 ζεύγη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και του φυσιολογικού ιστού. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αλληλουχίας που βασίζεται,

miR-205

έγινε βρέθηκε σημαντικά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ανθρώπου σε σχέση με την κανονική τους ομολόγους τους

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1Α). Σε 19 περιπτώσεις (περίπου 70%) την έκφραση του

miR-205

έντονα αυξημένη στα δείγματα όγκων συγκριτικά με την κανονική τους ομολόγους τους? ενώ στις υπόλοιπες 8 περιπτώσεις, ο καρκίνος και φυσιολογικά δείγματα παρουσίασαν χαμηλά αλλά συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης του

miR-205

(Εικόνα 1Β).

(Α)

miR-205

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στους όγκους από τα κανονικά δείγματα (

P

& lt? 0,001? paired t-test). (Β) Σχετικά υψηλότερη έκφραση του

miR-205

βρέθηκε στην πλειονότητα των δειγμάτων όγκου σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς. (C) Υψηλή έκφραση του

miR-205

ανιχνεύθηκε σε ME-180, C4I και CaSki κύτταρα, και χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης βρέθηκε σε HeLa, SW756, SiHa και κύτταρα C33A. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με τριπλούν. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις από τη μέση τιμή.

Η

λειτουργικές συνέπειες του

miR-205

κανονισμού Ανθρώπινα κύτταρα του τραχήλου του καρκίνου

Οι λειτουργικές συνέπειες της διαταραγμένης

miR-205

έκφραση ερευνήθηκαν σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές με υψηλά ή χαμηλά επίπεδα ενδογενών

miR-205

. Για το σκοπό αυτό

miR-205

ποσοτικοποιήθηκε σε ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές με qRT-PCR. Μεταξύ των 7 κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν,

miR-205

αποδείχθηκε πάρα πολύ που εκφράζονται σε ME-180, C4I και CaSki, ενώ η χαμηλή έκφραση /επίπεδα μόλις ανιχνεύσιμη βρέθηκαν σε HeLa, SW756, SiHa και C33A (Σχήμα 1C) . Στη συνέχεια επιμολυσμένα κύτταρα CaSki με έναν αναστολέα miRNA κυττάρων (Anti-miR-205), και HeLa και SW756 με miRNA μιμούνται (Pre-miR-205), και προσδιορίζεται η επίδραση των

miR-205

σιγαστήρα ή υπερέκφραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και τη μετανάστευση. Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιήσαμε ένα πρόδρομο miRNA ή αναστολέα χωρίς ομολογία αλληλουχίας προς οποιαδήποτε ανθρώπινα μεταγραφές.

Παρατηρήσαμε ότι η αναστολή του

miR-205

έκφραση σε κύτταρα CaSki οδήγησε σε σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξης (-15%?

P

& lt? 0.001), ενώ η υπερέκφραση του

miR-205

σε κύτταρα HeLa και SW756 οδήγησε σε σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (-20% και -11% , αντίστοιχα?

P

& lt? 0,05), σε σύγκριση με τα αντίστοιχα αρνητικά δείγματα αναφοράς (Σχήμα 2Α). Στο σύνολό τους, τόσο gain- και απώλειας λειτουργίας πειράματα που υποστηρίζονται σταθερά αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Εφέ για τη μετανάστευση των κυττάρων αποδείχθηκε με τη χρήση του Transwell και επούλωσης πληγών δοκιμασίες μετανάστευσης. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Transwell, δείξαμε ότι η μετανάστευση των κυττάρων ενισχύθηκε σημαντικά με

miR-205

υπερέκφραση στις δύο κυτταρικές σειρές HeLa και SW756 (~ 20% και -30%, αντίστοιχα?

P

& lt ? 0,05). Ωστόσο,

miR-205

καταστολής σε κύτταρα CaSki δεν οδηγούν σε σημαντική μείωση της μετανάστευσης των κυττάρων (Εικόνα 2Β). Ο προσδιορισμός της μετανάστευσης επούλωση των πληγών αποκάλυψε ότι

miR-205

υπερέκφραση σε κύτταρα HeLa ενισχυμένη την ικανότητα να κλείσει το τραύμα σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα επεξεργασμένο και ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα Pre-miR. Ομοίως, το κλείσιμο του τραύματος ήταν καθυστερημένος κατά την αποσιώπηση του

miR-205

έκφρασης σε κύτταρα CaSki (Σχήμα 2C).

Η θεραπεία με

miR-205

μιμούνται σε HeLa ή αναστολέα σε CaSki κύτταρα δεν οδήγησε σε καμία σημαντική μεταβολή της απόπτωσης (Εικόνα S1). Σε πειράματα ελέγχου αποτελεσματική επιμόλυνση δείχθηκε από σημαντικά μεταβληθεί

miR-205

επίπεδο, και σημαντική επαγωγή της απόπτωσης παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνη (Σχήμα S1).

Αναγνώριση

miR-205 γονίδια

στόχος

Για την περαιτέρω κατανόηση της βιολογικής λειτουργίας του

miR-205

, εντοπίσαμε

miR-205

στόχους χρησιμοποιώντας το

in vivo

εγκάρσιας σύνδεσης και RNA ανοσοκατακρήμνιση σε συνδυασμό με μικροσυστοιχίες (CLIP-Chip). mRNAs δεσμεύεται με τη μηχανή miRNA καθαρίστηκαν με Argonaute 2 ανοσοκατακρήμνιση (ago2 IP). Οι στόχοι mRNA ανακτώνται από τα επεξεργασμένα και τα δείγματα ελέγχου διαφορικά σημασμένο με φθορίζουσες χρωστικές, και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε με μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων για τον προσδιορισμό των mRNAs που σχετίζεται με σύμπλεγμα ριβονουκλεοπρωτεΐνης microRNA (miRNP). Εδώ, πραγματοποιήσαμε πειράματα CLIP-Chip τόσο για

miR-205

υπερέκφραση σε κύτταρα HeLa και αναστολή σε κύτταρα CaSki.

Για να επαληθευτεί η αποτελεσματικότητα της ago2 IP, έχουμε ποσοτικά τα επίπεδα έκφρασης των

miR-21

και

miR-30a-5P

χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Αυτά τα miRNAs χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για την αξιολόγηση της εμπλουτισμό των miRNAs μετά CLIP εξαιτίας αναφερθεί προηγουμένως υψηλά επίπεδα έκφρασης τους και στα δύο κύτταρα HeLa και CaSki [5], [8]. Παρατηρήσαμε μια σημαντική εμπλουτισμό των δύο

miR-21

(& gt? 100 φορές,

P

& lt? 0,01) και

miR-30a-5P

(& gt? 10 φορές σε,

P

& lt?. 0.01) σε αντι-ago2 ΠΕ σε σύγκριση με αντι-IgG IP ή ελέγχου εισόδου (Εικόνα S2)

στην ανάλυση CLIP-Chip μας, αποκλείσαμε μια από τις οι μικροσυστοιχίες επανάληψη από τις

miR-205

πειράματα υπερέκφρασης που οφείλονται στην κακή σήματα υβριδοποίησης. Μετά το φιλτράρισμα των σημάτων φόντο, πραγματοποιήσαμε χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση των πέντε μικροσυστοιχιών βασισμένη σε πρότυπα έκφρασης mRNA τους. Έχουμε επικεντρωθεί στις έξι clusters (συμπεριλαμβανομένων 270 /μεταγραφές 252 σχολιασμένα γονίδια), στην οποία τα πρότυπα έκφρασης εμφανίζονται εμπλουτισμού στο

miR-205

υπερέκφραση και εξάντληση στο

miR-205

πειράματα καταστολής (Σχήμα S3 και τον πίνακα S1). Εμείς λειτουργικό σχολιασμό σχετικά με τους στόχους CLIP-Chip χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GENECODIS. Αρκετές λειτουργικές ομάδες ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη (

P

& lt? 0,05), συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού κύκλου, ιική αναπαραγωγή, την επιδιόρθωση του DNA, την απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση (Πίνακας 1). Μια λεπτομερής κατάλογος των λειτουργικών σχολιασμούς δίνεται στον Πίνακα S2. Μεταξύ των 75 υποψήφιων στόχων που παρατίθενται στον Πίνακα 1, 71 είχαν επίσης προβλεφθεί ως

miR-205

στόχων σε τουλάχιστον ένα πρόγραμμα πρόβλεψης (Πίνακας S3), και τέσσερις στόχους (

BOD1

,

SEPT2

,

AAGAB

και

DCAF13

) δεν είχαν προβλεφθεί από οποιοδήποτε από τα προγράμματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

η

Ανάμεσα στα υποψήφια γονίδια-στόχους, βρήκαμε

CYR61

και

CTGF

συσχετίστηκαν με τις δύο κυτταρικές πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση (Πίνακας 1), και είναι συνεπής με λειτουργικές συνέπειες μας παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Για την περαιτέρω κατανόηση της σχέσης μεταξύ της έκφρασης

miR-205

και

CYR61

ή

CTGF

, προσδιορίσαμε την έκφραση του

CYR61

και

CTGF

σε 28 ζεύγη του καρκίνου του τραχήλου και των φυσιολογικών ιστών χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση τόσο

CYR61

και

CTGF

σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του τραχήλου, σε σύγκριση με τα κανονικά αντίστοιχά τους (

P

= 0.002 και

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα? Σχήμα 3Α-Γ). Είναι ενδιαφέρον, τα πρότυπα έκφρασης αυτών των δύο επιλεγμένων γονιδίων ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το

miR-205

έκφρασης (

CYR61

,

Ανταποκρίτρια

= -0,241,

P

= 0.091?

CTGF

,

Ανταποκρίτρια

= -0,304,

P

= 0,032? Σχήμα 3D). Οι παρατηρούμενες αντίστροφη πρότυπα έκφρασης, σε συνδυασμό με την προβλεπόμενη

miR-205

θέσεις δέσμευσης (Πίνακας S3, S4 Εικόνα), παρέχει περαιτέρω στοιχεία για

CYR61

και

CTGF

ως

miR-205

στόχους.

πολλαπλασιασμού (α) κυττάρων εκτιμήθηκε σε ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικών σειρών επιμολυσμένων με ένα

miR-205

μιμούνται (Pre-miR-205), αναστολέα (Anti-miR-205) ή αντίστοιχο αρνητικό μάρτυρα (ελέγχου Anti-miR Αρν ή προ-miR έλεγχο Αρν) χρησιμοποιώντας δοκιμασία WST-1. Σχετική κυτταρική ανάπτυξη ομαλοποιήθηκε στα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου επεξεργασμένα του. (Β) γραφικές παραστάσεις που δείχνουν σχετική μετανάστευση των κυττάρων και στις δύο

miR-205

αναστολή και πειράματα υπερέκφρασης όπως αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της κυτταρικής μετανάστευσης αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωσης πληγών. τραύματα Scratch έγιναν σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας σε συρροή μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση. Εικόνες αποκατάστασης τραύματος πάρθηκαν στα 0, 18 και 24 ώρες μετά την πληγή (αριστερό πάνελ). Το ποσοστό κλεισίματος τραύματος κανονικοποιήθηκε ανά περιοχή τραύματος σε 0 h (δεξί πάνελ). Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι ράβδοι σφάλματος παριστάνουν τυπικές αποκλίσεις από την μέση τιμή. Όλες οι συγκρίσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001?

ns

= δεν είναι σημαντική.

Η

Σχετικά χαμηλότερη έκφραση του

CYR61

(Α) και

CTGF

(Β) βρέθηκε στην πλειοψηφία των δειγμάτων όγκου σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς (n = 28). (Γ) Η έκφραση του

CYR61

και

CTGF

ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους όγκους από τα φυσιολογικά δείγματα (

P

= 0,002 και

P

& lt ? 0.001, αντίστοιχα? paired t-test). (D) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του

miR-205

και

CYR61

(άνω) ή

CTGF

(κάτω). Η σχέση έκφραση αξιολογήθηκε από την ανάλυση συσχέτισης του Pearson.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Η

Επικύρωση

CYR61

και

CTGF

ως

miR-205

γονιδίων στόχων

Για να διαπιστώσετε εάν

CYR61

και

CTGF

θα μπορούσαν να είναι οι στόχοι του

miR-205

σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, εφαρμόσαμε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις. Πρώτον, αξιολόγησε τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του CYR61 και CTGF τόσο

miR-205

υπερεκφράζουν και -depleted καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 (Α και Β),

miR-205

υπερ-έκφραση σε κύτταρα HeLa είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης CYR61 (-30%,

P

= 0,045) . Η αναστολή της ενδογενούς

miR-205

έκφρασης σε κύτταρα CaSki αυξηθεί σημαντικά το επίπεδο CYR61 πρωτεΐνης (-15%,

P

= 0,016). Για CTGF, παρατηρήσαμε μια μικρή μείωση ή αύξηση (αλλά όχι στατιστικά σημαντική) έκφραση της πρωτεΐνης στο

miR-205

υπερεκφράζουν ή -depleted κύτταρα, αντίστοιχα. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι CTGF μπορεί να ρυθμίζεται από πολλούς miRNAs ή παράγοντες, και ρυθμίζοντας

miR-205

έκφραση από μόνη της δεν ήταν αρκετή για να δώσει σημαντικές αλλαγές σε επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης CTGF.

(Α) Εκπρόσωπος κηλίδα Western που δείχνει τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του CYR61 και CTGF σε κύτταρα επιμολυσμένα με ένα

miR-205

μιμούνται,

miR-205

αναστολέα, ή αντίστοιχο αγωνίζομαι και πλαστή ελέγχους επιμόλυνση. (Β) έκφραση της πρωτεΐνης CYR61 ήταν σημαντικά κατασταλεί το

miR-205

υπερεκφράζουν (επεξεργασία με προ-miR-205) κύτταρα και σημαντικά αυξημένη στο

miR-205

-depleting (θεραπεία με αντι -miR-205) κύτταρα σε σύγκριση με τις αντίστοιχες αρνητικούς ελέγχους τους. έκφραση πρωτεΐνης CTGF ήταν ελαφρώς καταστέλλεται σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με προ-miR-205, και ελαφρώς αυξημένη σε κύτταρα CaSki θεραπεία με αντι-miR-205, αλλά το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. ανάλυση qRT-PCR του

CYR61

(C) και

CTGF

(D) mRNA στα ago2-ανοσοκαταβυθίστηκε RNAs του

miR-205

υπερεκφράζουν ή -depleted κύτταρα ως σε σύγκριση με τον έλεγχο ψευδο-διαμόλυνση. Σχετικό επίπεδο έκφρασης της ατομικής mRNAs ομαλοποιήθηκε να

miR-21

έκφρασης (όπως ενδογενούς ελέγχου για ago2 IP RNA). Διπλώστε αλλαγή αυτή υπολογίζεται διαιρώντας τις κανονικοποιημένες τιμές έκφραση ago2-immunoprecipiated δείγματα από τις κανονικοποιημένες τιμές έκφραση των αντίστοιχων δειγμάτων εισόδου. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι ράβδοι σφάλματος παριστάνουν τυπικές αποκλίσεις από την μέση τιμή. Όλες οι συγκρίσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας

t-test

. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001?

ns

= δεν είναι σημαντική.

Η

Στη δεύτερη προσέγγιση, έχουμε ποσοτικά

CYR61

και

CTGF

mRNAs σε ago2-ανοσοκαταβυθίζονται mRNAs και στις δύο

miR-205

υπερεκφράζουν και εξαντλημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας qRT-PCR, και σε σύγκριση με τα επίπεδά τους με ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχους. Το πείραμα αυτό βασίζεται στην υπόθεση ότι miRNAs και οι στόχοι τους mRNA είναι φυσικά συνδέονται με το σύμπλοκο πρωτεΐνης ago2 περιέχουν. Ως εκ τούτου, περιμέναμε εμπλουτισμό mRNAs στόχου σε

miR-205

υπερ-εκφράζοντα κύτταρα, ή εξάντληση των στόχων σε κύτταρα με

miR-205

αναστολής. Πράγματι, παρατηρήσαμε σημαντική εμπλουτισμοί του

CYR61

(

P

= 0.050) και

CTGF

(

P

= 0,007) mRNAs σε κύτταρα HeLa με υπερέκφραση του

miR-205

και εξάντλησης των δύο μεταγραφές σε κύτταρα CaSki με

miR-205

αναστολής (

P

& lt? 0,001 για τους δύο στόχους? Σχήμα 4C και 4D) . Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τόσο το

CYR61

και

CTGF

είναι στόχοι του

miR-205

σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

Συζήτηση

Παρατηρήσεις αυξημένη ή μειωμένη έκφραση του

miR-205

σε διαφορετικούς τύπους όγκων υποδεικνύουν ότι

miR-205

μπορούν να έχουν διαφορετικές λειτουργίες στην ανάπτυξη του καρκίνου, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου που εμπλέκονται. Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει την καταστολή του όγκου λειτουργία του και στα δύο του μαστού και του προστάτη καρκινικά κύτταρα [22] – [24], και η λειτουργία προώθησης όγκων του στο κεφάλι και το λαιμό κύτταρα πλακώδους καρκινώματος [14]. Σε αυτό το έργο, ερευνήσαμε περαιτέρω λειτουργικές συνέπειες και τους στόχους της σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

miR-205

ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετανάστευση στην Ανθρώπινα κύτταρα του τραχήλου του καρκίνου

Εδώ , επιβεβαιώσαμε για πρώτη φορά από qRT-PCR που

miR-205

σημαντικά υπερεκφράζεται σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, σε σύγκριση με την κανονική τους ομολόγους τους. Το αποτέλεσμα είναι σε συμφωνία με τα ευρήματα προηγούμενων αλληλουχίας βάση μας [9], και με τα δεδομένα μικροσυστοιχιών που αναφέρονται από τους Wang et al. [8]. Με δεδομένη την παρατηρούμενη αυξημένη έκφραση του

miR-205

στην αυχενική καρκινικούς ιστούς, ερευνήσαμε περαιτέρω τις λειτουργικές συνέπειες του

miR-205

ρύθμιση σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Σε αμφότερες

miR-205

κύτταρα που υπερεκφράζουν (HeLa και SW756), παρατηρήσαμε σημαντικές επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Μετά

miR-205

αναστολή σε κύτταρα CaSki, πολλαπλασιασμός μειώθηκε σημαντικά, ωστόσο η επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση αποκαλύφθηκε μόνο στην πληγή δοκιμασία επούλωσης, αλλά όχι στη δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. Ένας πιθανός λόγος για αυτή την ασυμφωνία είναι ότι η μετανάστευση των κυττάρων εξαρτάται από διάφορους παράγοντες στις αντίστοιχες δοκιμασίες. Η μετανάστευση των κυττάρων που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραύματος εξαρτάται από την αλληλεπίδραση κυττάρου-μήτρας. Ωστόσο, στον προσδιορισμό Transwell, τα κύτταρα παρασκευάζονται για πρώτη φορά το εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων, η οποία θα διαταράξει κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας. Επιπλέον, η μετανάστευση των κυττάρων στην δοκιμασία Transwell μπορεί να εξαρτάται από την κλίση χημειοτακτικό, η οποία δεν είναι διαθέσιμη στο επούλωσης τραύματος δοκιμασία.

Επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν εδώ στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας του ανθρώπου έχουν επίσης αναφερθεί σε άλλους τύπους κυττάρων. Για παράδειγμα,

miR-205

υπερέκφραση οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του μαζικού προγόνων ποντικού επιθηλιακών κυττάρων [25] και η μετανάστευση των κυττάρων σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα [26]. Αντιθέτως, η αυξημένη έκφραση του

miR-205

βρέθηκε να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μελάνωμα [17] και κύτταρα καρκίνου του μαστού [27], καθώς και η μετανάστευση των κυττάρων σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου SK- LU-1 μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα [28], U87 γλοιοβλαστώματος [28] και Α498 νεφρικό καρκίνο [19]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν περαιτέρω τη διπλή λειτουργία του

miR-205

ως καταστολέας των όγκων ή ένα ογκογονίδιο.

CYR61

και

CTGF

ως μυθιστόρημα στόχοι του

miR-205

η

Λόγω της λειτουργικής πολυπλοκότητας της, εφαρμόσαμε μια βιοχημική προσέγγιση (CLIP-Chip) για τον εντοπισμό του

miR-205-

αλληλεπιδράσεις στόχου

in vivo

. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, εντοπίσαμε ένα σύνολο

miR-205

στόχους τόσο από gain- και την απώλεια-του-λειτουργία πειράματα. Μεταξύ αυτών, αρκετές συνδέεται λειτουργικά με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση? η οποία είναι σύμφωνη με τις λειτουργικές συνέπειες που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Δύο από τα γονίδια-στόχους,

CYR61

και

CTGF

, περαιτέρω επικυρωθεί σε πρωτεΐνη ή /και τα επίπεδα του RNA. Ωστόσο, η ακριβής θέση αλληλεπίδρασης τους (ες) πρέπει να προσδιοριστούν από λουσιφεράσης δημοσιογράφος. Σε αυτή τη μελέτη, δεν είχαμε εκτελέσει CYR61 και CTGF αναστολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, είναι πιθανό ότι άλλο άμεσο στόχο (α) συμβάλλει στην

miR-205

μεσολάβηση επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Ωστόσο, αυτά τα γονίδια είχαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου από το κανονικό τους ομολόγους τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αυχενική καρκινογένεση.

Πρωτεΐνες

CYR61 και CTGF είναι μέλη της πλούσιες σε κυστεΐνη 61 ανάπτυξη /συνδετικού ιστού παράγοντα /νεφροβλάστωμα (CCN) της οικογένειας των ρυθμιστών ανάπτυξης. Αυτές οι πρωτεΐνες παίζουν διαφορετικούς ρόλους σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, την προσκόλληση, η μετανάστευση, η αγγειογένεση και ογκογένεση [29]. CCNS Τα παρεκκλίνοντα εκφράζεται σε μια ευρεία ποικιλία τύπων όγκου [29]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο CYR61 και CTGF μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια, ανάλογα με την κυτταρική έννοια (βλέπε παραδείγματα παρακάτω)? η οποία είναι παρόμοια με τη διπλή λειτουργία του

miR-205

.

Σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις μας, η απορρύθμιση των CYR61 και CTGF έχει επίσης αποδειχθεί σε αρκετές άλλες μελέτες. Για παράδειγμα,

CYR61

έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του τραχήλου [30], ο καρκίνος του πνεύμονα [31] – [33], καρκίνος του ενδομητρίου [34] και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [35]? Ωστόσο, πάνω ρύθμιση της έχει αναφερθεί σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων οστεοσάρκωμα [36], γλοίωμα [37], [38], και του καρκίνου του μαστού [39], [40]. Παρόμοια με CYR61, προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει αντικρουόμενα πρότυπα έκφρασης του CTGF σε διαφορετικούς τύπους όγκων. Για παράδειγμα, μειωμένη έκφραση CTGF έχει αναφερθεί στον καρκίνο του πνεύμονα [31], του καρκίνου του μαστού [40], όγκο Wilm [41] και τον καρκίνο των ωοθηκών [42]? ενώ αυξημένη έκφραση βρέθηκε στην θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς [43], ορθοκολικό καρκίνο [44], κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο [45], [46] και το γλοιοβλάστωμα [47].

Είναι ενδιαφέρον ότι,

miR -205

, CYR61 και CTGF εμπλέκονται σε κοινές λειτουργικές διαδικασίες και μονοπάτια. Παρόμοια με τις λειτουργικές συνέπειες των

miR-205

παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, CYR61 έχει δειχθεί ότι καταστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα [32] και ηπατοκυτταρικό καρκίνο [35]. Από την άλλη πλευρά, αποσιώπηση του CYR61 καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε γλοιώματος [37] και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [48]. Απώλεια

miR-205

έκφραση οδηγεί στην επαγωγή της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [23], [24], ενώ αποσιώπηση της έκφρασης CYR61 αναστέλλει ΕΜΤ [48]. Εξάντληση των

miR-205

και έκφραση CYR61 αναστέλλει τη σηματοδότηση Akt στα κερατινοκύτταρα, τα κύτταρα του στόματος πλακώδες καρκίνωμα [14] και τα κύτταρα γλοιώματος [37]. Όπως CYR61 και

miR-205

, CTGF έχει επίσης καταδειχθεί για να παίξει και τις δύο ογκογόνους και καταστολέα ρόλους σε ένα ευρύ φάσμα καρκινικών κυτταρικών τύπων [45], [47], [49] – [51], και είναι επίσης εμπλέκεται και στην ΕΜΤ [52], [53] και της οδού Akt [54] – [56]. Παρά τις πολυάριθμες μελέτες που αναφέρθηκαν παραπάνω, οι ρόλοι των CYR61 και CTGF στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας του ανθρώπου παραμένουν ασαφείς. Θα είναι ενδιαφέρον να καθορίσει τους λειτουργικούς ρόλους αυτών των παραγόντων στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και να αξιολογήσει τις αλληλεπιδράσεις τους με το

miR-205

σε διάφορους τύπους καρκίνου.

Εν κατακλείδι, αναφέρουμε λειτουργικές επιδράσεις στην φαινότυποι των όγκων και τα νέα τους στόχους του

miR-205

σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Θα δείξουμε ότι

miR-205

παίζει ογκογόνο ρόλο στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας με την προώθηση κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Επιπλέον, εντοπίσαμε ένα σύνολο νέων

miR-205

στόχους χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των βιοχημικών και μικροσυστοιχιών προσέγγιση. Μεταξύ αυτών,

CYR61

και

CTGF

περαιτέρω επαλήθευση σε πρωτεΐνη ή /και τα επίπεδα του RNA. Σημαντικά, αυτά τα δύο γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι

miR-205

και τους στόχους της (

π.χ.

CYR61 και CTGF) μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, και ότι

miR-205

(και τους στόχους του) μπορεί να παρέχει στους δυνητικούς τιμές διάγνωσης για παθολογία τραχήλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ιστών και δήλωση Δεοντολογίας

Τριάντα ζεύγη snap-κατεψυγμένα τραχήλου της μήτρας όγκου και συμφωνημένα φυσιολογικών ιστών από γειτονικές περιοχές των 30 ασθενών που δόθηκαν από τον Γυναικολογικής Ογκολογίας του Ομίλου Tissue Bank (Columbus, Οχάιο). Όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων ιστού δεν έχει ελεγχθεί ως όγκος ή μη-όγκου με ιστοπαθολογική εξέταση του αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές παραφίνης χρώση. Είκοσι-εννέα ζεύγη των δειγμάτων που περιλαμβάνονται σε προηγούμενες μικρά RNA προφίλ μας από την τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας [9]. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Ινστιτούτου Καρολίνσκα Επιτροπή Δεοντολογίας. Δεν γραπτή συγκατάθεση ήταν απαραίτητη, επειδή όλα τα κλινικά υλικά deidentified. Η ηθική του σκάφους επιτροπή του Ινστιτούτου Καρολίνσκα παραιτηθεί ρητά την ανάγκη για συναίνεση

Καρκίνος του τραχήλου της μήτρας τηλέφωνα Γραμμές

Επτά ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν:. CaSki, HeLa, SW756, ΜΕ-180, SiHa, C4I και C33A. CaSki και ΜΕ-180 κύτταρα είχαν αρχικά καθοριστεί από μεταστατικές θέσεις του καρκίνου του τραχήλου, και οι άλλες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πρωτογενείς όγκους του τραχήλου της μήτρας [57] – [61]. Αυτές οι γραμμές ευγενώς από το Δρ Keng-Ling Wallin (Karolinska University Hospital, Σουηδία), και είχε αγοραστεί από την αμερικανική Πολιτισμού Τύπος Tissue (ATCC). CaSki και τα κύτταρα ΜΕ-180 αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640, ενώ HeLa, SW756, SiHa, C4I και C33A κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM. Όλα τα κύτταρα συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA) και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή.

TaqMan Ποσοτική Αντίστροφη Μεταγραφή -PCR (qRT-PCR)

η έκφραση των ώριμων miRNAs και mRNAs ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας ένα σύστημα PCR Fast πραγματικό χρόνο Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems). RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Applied Biosystems /Ambion, Austin, ΤΧ), με την εφαρμογή μικρών εμπλουτισμού RNA από δείγματα ιστών και συνολική απομόνωση RNA από κυτταρικές σειρές. Οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

Για ώριμο miRNA, cDNA συντέθηκε από 25 ng μικρό RNA εμπλουτισμένου RNA για δείγματα ιστών, 120 ng ολικού RNA για κυτταρικές σειρές ή 15 ng RNAs ago2-ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας Taqman microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Προσχεδιασμένα TaqMan microRNA Δοκιμασίες για

miR-205

(ID 000509),

miR-21

(ID 000397) και

miR-30a-5P

(ID 000417) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε τρεις ανεξάρτητες περιπτώσεις, και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν με τη μέση γεωμετρική του

RNU6B

(ID 001093) και

RNU43

(ID 001095), και αναφέρονται ως 2

-ΔCT.

για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA, cDNA συντέθηκε από 200 ng μεγάλο κλάσμα RNA (

δηλαδή

RNA κλάσμα παρέμεινε μετά μικρό εμπλουτισμού RNA) για δείγματα ιστού ή 50 ng ago2 ανοσολογικά RNAs χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems).