Αφηρημένο

fulgens Potentilla

ρίζα χρησιμοποιείται παραδοσιακά ως λαϊκή θεραπεία στη Meghalaya, Ινδία. Ωστόσο, η συστηματική αξιολόγηση των αντικαρκινικών αποτελεσματικότητά του ήταν περιορισμένη. Ερευνήσαμε τις αντικαρκινικές δυνατότητες των διαφόρων εκχυλισμάτων που παρασκευάζονται με κλασμάτωση του εκχυλίσματος μεθανόλης της ρίζας, με σκοπό να ανακαλύψουν κύριοι συνεισφέροντες παράγοντες από τις πιο αποτελεσματικές κλάσματα. εκχύλισμα μεθανόλης του

P

.

fulgens

ρίζες (PRE) παρασκευάστηκε με διαβροχή το οποίο στη συνέχεια κλασματοποιείται σε εξάνιο, οξικό αιθύλιο (ΕΑ) και

n-βουτανόλη

διαλυτά κλάσματα. Διάφορες δοκιμασίες (κλωνογονική δοκιμασία, κυτταρομετρία ροής, western blot, ημιποσοτική RT-PCR και το επίπεδο της ενδογενούς γλουταθειόνης) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση διαφόρων παραμέτρων, όπως επιβίωσης Cell, PARP-1 πρωτεόλυση, πρότυπο έκφρασης των αντι-αποπτωτικών και γ- γλουταμυλ-κυστεΐνη βαριά υπομονάδα συνθετάσης (GCSC) γονίδια σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές MCF-7 και του καρκίνου U87. Δεδομένου ότι η ΕΑ-κλάσμα έδειξε πιο αποτελεσματική δράση αναστολής αύξησης, ήταν περαιτέρω καθαρισμένα και συνολικά εννέα ενώσεις και ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν μερικά μονομερή και διμερή φλαβαν-3-όλες. Τρεις ενώσεις δηλ., Επικατεχίνη (EC), γαλλικό οξύ (GA) και ουρσολικό οξύ (UA) ελήφθησαν επί τη βάσει των υψηλότερη απόδοση τους και 10 μg /ml από κάθε αναμίχθηκε μαζί. Η συγκέντρωση που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη για PRE, EA- και Hex-κλάσμα ήταν 100 μg /ml, η οποία ήταν υψηλότερη από την IC

50 τιμή. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος στο PRE, ΕΑ-κλάσμα και ΕΚ + GA + UA επεξεργασμένες καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι στα φυσιολογικά κύτταρα λόγω της καταστολής των αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl2 μετά τη θεραπεία. Παρατηρήθηκε επίσης η εξάντληση της γλουταθειόνης με ρύθμιση προς τα κάτω GCSC. Επαγωγή της απόπτωσης και μείωση του επιπέδου γλουταθειόνης θεωρούνται θετικές δραστηριότητα για ένα αντικαρκινικό παράγοντα. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση της συγκέντρωσης GSH σε κύτταρα όγκου με προ και EA-κλάσμα του άνοιξε τη δυνατότητα μιας νέας θεραπευτικής προσέγγισης επειδή αυτά τα φυτικά προϊόντα που δεν είναι επιβλαβή για τα κανονικά κύτταρα και μπορεί να ρυθμίζει την κυτταρική απόκριση όγκου σε διαφορετικές αντικαρκινικές θεραπείες. Έτσι, θα ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα αυτών των φυτικών προϊόντων ή EA-κλάσμα στη θεραπεία του καρκίνου του ανθρώπου

Παράθεση:. Tripathy D, Choudhary Α, Banerjee UC, Singh IP, Chatterjee Α (2015) επαγωγή της απόπτωσης και μείωση των ενδογενών επιπέδου γλουταθειόνης από το κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα Διαλυτές της μεθανόλης Απόσπασμα από τις ρίζες του

fulgens Potentilla

σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (8): e0135890. doi: 10.1371 /journal.pone.0135890

Επιμέλεια: Ying-Jan Wang, Εθνική Cheng Kung University, Ταϊβάν

Ελήφθη: 22, Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 27 Ιουλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 Αυγούστου, 2015

Copyright: © 2015 Tripathy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από DBT, Govt. της Ινδίας (BT /59 /NE /ΤΒΡ /2010) για AC, UCB, και IPS? DBT υποτροφία και DST-Inspire υποτροφία (ΑΝ 120044) για να Alka Choudhary? DBT-υποτροφία στην DT

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παραδοσιακά φαρμακευτικών φυτών ως πιθανοί καρκίνο προληπτικά και θεραπευτικά μέσα έχουν λάβει ολοένα και μεγαλύτερη προσοχή κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών [1,2]. Το γένος

Potentilla

ανήκει στην οικογένεια

Rosaceae

η οποία περιλαμβάνει περίπου 500 είδη, και κυρίως στις εύκρατες, αρκτικές και αλπικές ζώνες του βόρειου ημισφαιρίου [3].

Οι Potentilla

εκχυλίσματα θεωρείται ότι είναι ασφαλές και μη τοξικό όταν εφαρμόζεται σε ανθρώπους [4,5]. Αποσπάσματα από τη ρίζα του

Potentilla anserina

έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ορισμένων ιογενών λοιμώξεων όπως λαϊκή φαρμακευτικά φυτά στο Θιβέτ [6]. Προτάθηκε ότι η παρουσία υψηλότερο ποσό των υδρολυτής και συμπυκνωμένες τανίνες, φλαβονοειδή και τριτερπένια στα περισσότερα μέρη του φυτού του

Potentilla

ειδών θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τις παρατηρούμενες βιολογικές επιδράσεις [7].

fulgens Potentilla

Wall. Ex Hook, κοινώς γνωστή ως Ιμαλαΐων Πεντάφυλλο στην αγγλική γλώσσα, είναι ένα σημαντικό φαρμακευτικό φυτό της τριτοβάθμιας ρου των Ιμαλαΐων. Διαφορετικές εθνοτικές ομάδες της βορειοανατολικής Ινδίας χρησιμοποιούν διαφορετικά μέρη του φυτού ως πηγή της ιατρικής, αν και ο τρόπος δράσης τους είναι ακόμα να καθοριστεί. Οι κάτοικοι της περιοχής αυτής παραδοσιακά μασάτε betel-παξιμάδι (

Areca κατεχού

), φύλλα betel (

Piper ινδοκάρυδο

) και η ρίζα βρύση του

P

.

fulgens

για διάφορες παθήσεις [8], αλλά παρά την εκτεταμένη χρήση του λίγα είναι γνωστά για phytochemistry και ο μηχανισμός δράσης της. Προηγούμενες μελέτες σχετικά με εκχύλισμα μεθανόλης της ρίζας του

P

.

fulgens

έδειξαν καλύτερη επιβίωση των ποντικών που έφεραν κύτταρα ασκίτη Ehrlich, και επίσης μία δοσο-εξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων MCF-7 [9]. Μια πρόσφατη απόπειρα απομονώσουν και να χαρακτηρίσουν καθαρές ενώσεις από το αιθυλ-οξεικό διαλυτό κλάσμα του εκχυλίσματος μεθανόλης των ριζών του

P

.

fulgens

έχουν αποδώσει εννέα ενώσεις συμπεριλαμβανομένων δύο νέων τριτερπενοειδή τύπου ursane Fulgic οξύ και Fulgic οξύ B. Και οι δύο αυτές νέες ενώσεις εμφανίζουν καλή αντιοξειδωτική δράση [10]. Πιο εκτεταμένες μελέτες χρησιμοποιώντας διάφορες αναλυτικές τεχνικές έχουν αποδειχθεί ότι flavans συμπεριλαμβανομένων φλαβανόλες ολιγομερών που ακολουθείται από triterpene οξέα είναι τα κύρια συστατικά της ρίζας του

P

.

fulgens

[11].

Η παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει τις συνέπειες των διαφόρων κλασμάτων του

P

.

fulgens

εκχύλισμα ρίζας στην κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και ενδογενούς GSH επιπέδου σε καρκινικά κύτταρα θηλαστικών και να καθορίσει τους κυριότερους παράγοντες για τέτοια ισχύ από τον πιο αποτελεσματικό κλάσμα αυτής εκχύλισμα ρίζας. Έχουμε αποδείξει ότι

P

.

fulgens

εκχύλισμα ρίζας και οξικό αιθυλεστέρα διαλυτό κλάσμα του αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με διέγερση απόπτωσης. Αναλύσαμε επίσης την κατάσταση της ενδογενούς γλουταθειόνης (GSH) στα κατεργασμένα καρκινικά κύτταρα και δείξει εξάντληση της, θεωρείται ότι είναι ένα θετικό αποτέλεσμα οποιασδήποτε χημειοθεραπευτικού φαρμάκου επειδή η μείωση του επιπέδου της ενδογενούς GSH καθιστά το κύτταρο πιο ευαίσθητο στο φάρμακο [12]. Από GSH βρέθηκε να παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και εξάντληση του απαιτεί για την εκτέλεση της απόπτωσης [13], επομένως προσπάθεια για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν τους οξειδοαναγωγής συστήματα, για παράδειγμα, γλουταθειόνη και θειορεδοξίνη, έχουν προσελκύσει την προσοχή.

Υλικά και Μέθοδοι

Φυτικό υλικό

Ρίζες του

P

.

fulgens

, μια μη-απειλούμενων φυτών, συλλέχθηκαν από 20 διαφορετικά φυτά σε Shillong εμβαδόν της κορυφής δάσος (υψόμετρο 1700 m πάνω από τη στάθμη της θάλασσας? 25 ° 34 βόρειο γεωγραφικό πλάτος και 91 ° 54 Ανατολικά γεωγραφικό μήκος) της Meghalaya κατάσταση της Ινδίας μετά από μια κατάλληλη έγκριση του υπευθύνου δάσος. Ένα δείγμα κουπόνι κατατέθηκε στη ερμπαρίου του Τμήματος Βοτανικής, North-Eastern Λόφος Πανεπιστημίου, Shillong (αριθμός πρόσβασης 11906). Το υλικό της ρίζας (1 kg) ξηραίνεται με αέρα υπό σκιά για μια εβδομάδα και το έδαφος σε ένα μύλο μίξερ σε ένα χοντρό σκόνη.

Εξόρυξη και απομόνωση

ουρσολικό οξύ, euscaphic οξύ, corosolic οξύ, fulgic οξύ Α και Β, επικατεχίνη, κατεχίνη, γαλλικό οξύ, ρ-υδροξυβενζαλδεΰδη μαζί με διάφορα διμερή φλαβαν-3-όλες απομονώθηκαν όπως περιγράφεται σε προηγούμενες ανακοινώσεις μας [10]. Εν συντομία, το εκχύλισμα μεθανόλη (MeOH) (80:20) του

P

.

fulgens

ρίζες (PRE) παρασκευάστηκε με διαβροχή το οποίο στη συνέχεια κλασματοποιείται σε εξάνιο (Hex), αιθυλο-οξική (ΕΑ) και

n-βουτανόλη

διαλυτά κλάσματα. Το εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα υποβλήθηκε σε κενό υγρή χρωματογραφία χρησιμοποιώντας κλίσεις οξικού και χλωροφόρμιο-μεθανόλη-εξάνιο για να δώσει αιθυλεστέρα πέντε συγκεντρωμένα κλάσματα, Ε1 έως Ε5. χρωματογραφία στήλης του κλάσματος Ε1 απέδωσε ουρσολικό οξύ, euscaphic οξύ και corosolic οξύ. Δύο στερεοϊσομερικές οξέα τριτερπενίου, fulgic οξύ Α και Β fulgic οξύ διαχωρίστηκαν από το κλάσμα της Ε2 με HPLC. Κλάσματα Ε3 να Ε5 μετά από χρωματογραφία στήλης και HPLC αντίστροφης φάσης απέδωσε φαινολικά κατεχίνη, επικατεχίνη, γαλλικό οξύ, το ρ-υδροξυβενζοϊκό οξύ, διάφορα μονομερή και διμερή φλαβαν-3-όλες [10,11]. σχήμα Απομόνωση φαίνεται στο Σχ 1.

Η

γραμμή κυττάρων και προσδιορισμό κυτταρικής επιβίωσης κλωνογονικού.

MCF-7 (ανθρώπινου μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή) και U87 (ανθρώπινο κακόηθες γλοίωμα κυτταρική γραμμή) αγοράστηκαν από το Εθνικό Κέντρο Cell Science (Pune, Ινδία). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ Dulbecco (DMEM, Invitrogen-Gibco) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen-Gibco), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen-Gibco) και 2 mM L-γλουταμίνη ( Invitrogen-Gibco).

Η survivality κύτταρο αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία και στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και κατάλληλοι αριθμοί κυττάρων (κύτταρα 2000 και 3000) σπάρθηκαν σε τρεις 25 cm

2 φιάλες κάθε ένα και για δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής, τέσσερα φιαλίδια απλώθηκαν σε μία κυτταρική πυκνότητα (1000 κύτταρα). Πέντε ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες με 5 έως 150 μg /ml του εκχυλίσματος ρίζας (PRE) του

P

.

fulgens

ή 10 έως 120 μg /ml του EA- ή εξ- ή

ν

βουτανόλη-κλάσμα. Αφού τα κύτταρα θεραπεία πλύθηκαν δύο φορές με το μέσο και τέλος φιάλες επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C με μέσο ΜΕΜ φρέσκο ​​του Dulbecco με 10% ορό εμβρύου μόσχου επί 10 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες σε 70% αιθανόλη. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και οι αποικίες που περιέχουν τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Ο αριθμός των αποικιών που επιβιώνουν (επεξεργασμένα δείγματα) κανονικοποιήθηκε έναντι του αριθμού των αποικιών σε μη επεξεργασμένα δείγματα.

Θεραπεία Λεπτομέρειες

Σε όλα τα πειράματα που διεξήχθησαν μετά colonogenic δοκιμασίας, τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml του PRE, ΕΑ-κλάσμα και Hex-κλάσμα του εκχυλίσματος μεθανόλης από τις ρίζες του

P

.

fulgens

. Σε περίπτωση μίγμα τριών ενώσεων, οι οποίες απομονώθηκαν από την ΕΑ-κλάσμα δηλ επικατεχίνη (EC), ουρσολικό οξύ (UA) και γαλλικό οξύ (GA), το καθένα ελήφθη 10 μg /ml. Αυτές οι τρεις ενώσεις ελήφθησαν από τρία διαφορετικά ΕΑ-υποκλάσματα (κλάσμα 1, 3 και 4) και η επιλογή τους βασίστηκε στην υψηλότερη απόδοση τους. Σε όλα αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες.

ικανότητα θανατώσεως κυττάρων με προ και EA-κλάσμα σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα

Αυτό προσδιορίστηκε με δοκιμασία αποκλεισμού Trypan μπλε. Προσφάτως συλλέγονται ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος χρησιμοποιήθηκε ως φυσιολογικά κύτταρα και MCF-7 και κύτταρα U87 χρησιμοποιήθηκαν ως καρκινικά κύτταρα.

Ηπαρινισμένο περιφερικού αίματος από δύο υγιείς άρρενες δότες (HPBL) ελήφθη αφού έγγραφη συγκατάθεσή τους για τη συμμετοχή και χρησιμοποιήθηκαν αμέσως μετά τη συλλογή του. Μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics, St. Louis, ΜΟ) φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας (ειδικό βάρος 1,077 g /ml) για 30 λεπτά στους 400

g

από αυτές νεοεξαχθέν ηπαρινισμένου πλήρους αίματος . Τα λεμφοκύτταρα καλλιέργειες στήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο FCS. Πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /ml) και 2 mM L-Γλουταμίνη προστέθηκαν στο μέσο. Τα λεμφοκύτταρα διεγέρθηκαν με ΡΗΑ και μετά από 24 ώρες λεμφοκύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με PRE και EA-κλάσμα (100 και 150 μg /ml) για 24 ώρες. Αυτές οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C και συλλέχθηκαν αμέσως μετά τη θεραπεία. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από τη θεσμική και την Επιτροπή Ανθρωπίνων Δεοντολογίας. Σε περίπτωση των καρκινικών κυττάρων, MCF-7 και κύτταρα U87 χρησιμοποιήθηκαν και κατεργάστηκαν με PRE και EA-κλάσμα (100 και 150 μg /ml) για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με φρέσκο ​​μέσο και στη συνέχεια επωάζονται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 0.4% τελική μπλε τρυπανίου. Τα νεκρά κύτταρα βάφτηκαν μπλε και ζώντων όνες χωρίς χρώση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

ικανότητα θανατώσεως κυττάρων με προ και EA-κλάσμα αξιολογήθηκε επίσης με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (S1 File).

Επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε MCF-7 και U87 κύτταρα

Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού διεξήχθη σε MCF-7 και κύτταρα U87 μετά την κατεργασία των κυττάρων με PRE, ΕΑ και Hex-κλάσματα. Τα κύτταρα σε πυκνότητα 5 χ 10

5 αναπτύχθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες σε μέσο ϋΜΕΜ στους 37 ° C και 5% CO

2. Μετά από 24 ώρες σποράς, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε PRE, EA ή Hex-κλάσμα σε τελική συγκέντρωση 100 μg /ml για 24 ώρες και τελικά σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη.

Όλα τα παραπάνω στερεωμένα κύτταρα ήσαν πλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου (ιωδιούχο 20 μg /ml προπίδιο, 0,2 mg /ml ΚΝάσης) για 1 ώρα επώαση σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. 10.000 κύτταρα αποκτήθηκαν για κάθε δείγμα και τους αναλύονται σε FACS Calibur (Becton-Dickinson) με χρήση λογισμικού CellQuest προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί διαμερίσματα του κυτταρικού κύκλου για την εκτίμηση του ποσοστού των κυττάρων που κατανέμεται στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου.

Ροή κυτταρομετρική ανάλυση του μιτοχονδριακού δυναμικού μεμβράνης

Η απαγωγή του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης θεωρείται ένας μιτοχονδριακή εκδήλωση διαταραχής πριν την απόπτωση. Προκαλείται από μια ξαφνική αύξηση στην εσωτερική διαπερατότητα μιτοχονδριακής μεμβράνης, γνωστό ως μιτοχονδριακό μετάβαση διαπερατότητα [14]. Μιτοχονδριακή βλάβη αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη λιπόφιλη φθορίζουσα 5,5 ανιχνευτής ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-τετρα-αιθυλο-βενζιμιδαζολ-καρβοκυανίνη ιωδιούχο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (JC-1? BD Mitoscreen JC-1 κιτ? Cat 51302). Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε σε MCF-7 και κύτταρα U87 υποβάλλεται σε επεξεργασία με και χωρίς προ, ΕΑ-κλάσμα, Hex-κλάσμα και μείγμα του ΕΚ, UA και GA χρησιμοποιώντας JC-1 λεκέ. Εν συντομία, JC-1 διάλυμα εργασίας παρασκευάζεται σε ρυθμιστικό 1xAssay και προστέθηκαν 0,5 ml JC-1 χρώσης να 1×10

6 MCF-7 ή U87 κυττάρων για 10 λεπτά στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό δοκιμασίας 1χ σε θερμοκρασία δωματίου και τελικά JC-1 φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αναλυτικό ροής Becton Dickinson FACScalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA). Το ποσοστό των κυττάρων του πράσινου (530 nm) και κόκκινο (590 nm) φθορισμό JC-1 αναλύθηκε.

ανοσοαποτύπωσης

αναλύσεις ανοσοστυπώματος διεξήχθησαν για την ανίχνευση της έκφρασης της PARP και β- πρωτεΐνες ακτίνης στα κύτταρα μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων MCF-7 και U87. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες σε μια συγκέντρωση 4 χ 10

5 και 20 ώρες μετά εκτέθηκαν σε PRE, ΕΑ, Hex και μίγμα του ΕΚ + GA + UA για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν αμέσως μετά τη θεραπεία.

Όλα τα συλλεγέντα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν σε ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης (50 mM Tris (ρΗ 8,0), 150mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 1% ΝΡ-40 , 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS και 0,42% NaF) που περιέχει αναστολέα πρωτεάσης (1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο και 100 U /ml απροτινίνης). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία δικιγχονικό πρωτεΐνη οξέος και 40 μg πρωτεΐνης λύματα από κάθε δείγμα φορτώθηκε σε Novex πηκτές Τπδ-Γλυκίνης gradiaent 4-20% και η ηλεκτροφόρηση έγινε σε σύστημα ηλεκτροφόρησης NuPAGE από (Invitrogen, USA). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Sigma) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αραίωση 1: 1000 ενός κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι PARP Ab-3 (Neo-Markers, USA) και το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι β-ακτίνης (AC-15? Ab6276? Abcam, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη, φρέσκα σε TBST (10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) ρυθμιστικό. Αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη αντι-ποντικού IgG (Abcam, USA) που χρησιμοποιήθηκε ως δευτερογενές αντίσωμα, και ανοσοανίχνευση λήφθηκε με κατεργασία της κηλίδος με το διάλυμα υποστρώματος ΒΟΙΡ /ΝΒΤ (Bangalore Genei, Ινδία). Το όλο πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

κατακερματισμού του DNA δοκιμασία

Ο κατακερματισμός του DNA ως μια ένδειξη της απόπτωσης είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη δοκιμασία σε μελέτες αλληλεπίδρασης φαρμάκου-κυττάρων. Τα κύτταρα MCF7 και U87 (5 × 10

5 κύτταρα /φιάλη) καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε PRE, EA ή Hex-κλάσμα σε τελική συγκέντρωση 100 μg /ml για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν άπαξ με παγωμένο PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 250 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6, 20 mM EDTA, ρΗ 8.0 και 0.5% (w /v) Triton Χ-100). Μετά από φυγοκέντρηση στις 12.000 rpm για 5 λεπτά, το υπερκείμενο εκχυλίστηκε μία φορά με φαινόλη /χλωροφόρμιο (1: 1) και μία φορά με χλωροφόρμιο /ισοαμυλική αλκοόλη (24: 1). DNA καταβυθίστηκε με οξικό νάτριο (ρΗ 5.2) στους -20 ° C επί μία νύκτα. Το DNA μετά σφαιροποιήθηκε και ακολούθως σε πέψη με DNase-free ΚΝΑάσης (Amersham Biosciences UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) στους 37 ° C για 20 λεπτά. Η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη σε 2.0% (β /ο) πηκτή αγαρόζης και εξετάστηκε κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία εξής αιθίδιο χρώση βρωμιούχου να προσδιοριστεί η έκταση των αποπτωτικών κατακερματισμού του DNA.

ποσοτικαί RT-PCR (αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης )

Η έκφραση του Bcl2, Survivin, CIAP, ΧΙΑΡ, GCLC (γλουταμινικό-κυστεΐνη λιγάση καταλυτική υπομονάδα) και GAPDH αναλύθηκε σε MCF-7 και κύτταρα U87 μετά τη θεραπεία με PRE, ΕΑ, Hex και μείγμα του ΕΚ + GA + UA. Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας RNAeasy κιτ (Qiagen GmbH, Hilden Γερμανία). cDNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα από 1 μg του ολικού RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας Quantiscript ανάστροφης μεταγραφάσης, Quantiscript-RT-ρυθμιστικό διάλυμα και RT-εκκινητή μείγμα QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ενίσχυση του cDNA διεξήχθη σε διάλυμα 20 μΐ που περιέχει 2 μΐ cDNA, ζεύγη εκκινητών 10 pmol για Bcl2, Survivin, ΧΙΑΡ, CIAP και GAPDH (για αστάρι sequences- πίνακα Α σε S1 File) και 10 μΙ RT qPCR Μάστερ ανακατεύουμε (Qiagen GmbH, Hilden, Γερμανία). Το PCR αποτελούνταν από την αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 25 κύκλους αντίδρασης (30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, 30 δευτερόλεπτα στους 60 ° C, και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C) και ένα τελικό κύκλο στους 72 ° C για 10 λεπτά. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα ενισχυμένα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και οπτικοποιούνται με ethydium βρωμίδιο. Η αφθονία του κάθε mRNA στόχου ανιχνεύτηκε και ομαλοποιήθηκε ως προς εκείνη του GAPDH mRNA.

Προσδιορισμός του επιπέδου GSH

Συνολική περιεκτικότητα κυτταρικό GSH εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του Akerboom και Sies [15] σε MCF -7 και U87 κυττάρων μετά από θεραπεία με PRE, ΕΑ, Hex και ΕΚ + GA + UA. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες σε μια συγκέντρωση 5 χ 10

4 και όταν τα κύτταρα έφθασαν σε συρροή μεταξύ 75-80%, το PRE ή ΕΑ-κλάσμα ή Hex-κλάσμα ή ΕΚ + GA + UA προστέθηκε επί 24 ώρες. Τόσο θεραπεία και χωρίς θεραπεία κύτταρα έλαμψε σε παγωμένο 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (ρΗ 7.4), και ο όγκος συμπληρώθηκε σε 1 ml. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε ένα αιμοκυτταρόμετρο και υποβάλλονται σε επεξεργασία για τον προσδιορισμό του συνολικού επιπέδου GSH όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, μετά από αποπρωτεΐνωση με εναιώρημα μl δείγματος 10% παγωμένο 5-σουλφοσαλικυλικό οξύ 190 ελήφθη και προστέθηκε σε 700 μλ NADPH (0.3 mM), 100 μΐ DTNB (6 mM) και 10 μλ GSH αναγωγάσης (6 μονάδες /ml) και η οπτική πυκνότητα των δειγμάτων μετρήθηκε στα 412 nm χρησιμοποιώντας τον υν-ορατού (σειρά Cecil 1000, Camlab, UK). Οι συγκεντρώσεις GSH προσδιορίστηκαν με σύγκριση με πρότυπα.

Στατιστικά

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος συν ή πλην τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με paired t-test και ρ αξιών & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Τα στοιχεία που λαμβάνονται από δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση παριστάνεται ως μία σιγμοειδή καμπύλη ταιριάζει με μια κλίμακα γραμμική Χ, η συνάρτηση χρησιμοποιήθηκε ήταν Boltzmann. Η τιμή του Υ στο Χ

0 θεωρείται ότι είναι στη μέση μεταξύ των δύο οριακών τιμών για Y-άξονα και αυτό θεωρείται ότι είναι η συγκέντρωση του αναστολέα 50 (IC

50) αξία.

Αποτελέσματα

Επίδραση στην κλωνογονικού

απόδοση

MCF-7 και U87 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PRE, και EA-, εξ- και τα κλάσματα βουτανίου-εξάγεται. Εκτιμώντας PRE, ΕΑ-κλάσμα και Hex-κλάσμα προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη μείωση της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α-2D) η βουτανόλη-κλάσμα δεν το έπραξε (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, ο βαθμός της μείωσης της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης και στις δύο κυτταρικές γραμμές ήταν μέγιστη με PRE. Η τιμή της συγκέντρωσης αναστολής (IC

50) συνάγεται από τη σιγμοειδή ταιριάζει γράφημα ήταν 39,34 μg /ml με PRE ενώ για ΕΑ ήταν 48,4 μg /ml σε κύτταρα MCF-7. Για U87, αυτές οι τιμές ήταν 64,2 και 134,3 μg /ml (Σχήμα 2Α) με προ και ΕΑ-κλάσμα, αντιστοίχως.

Μετά τον προκαθορισμένο χρόνο της θεραπείας, τα κύτταρα διατηρήθηκαν χωρίς υλικά δοκιμής για 10 ημέρες. Την ημέρα 10, οι αναπτυχθείσες αποικίες μετρήθηκαν και το ποσοστό του κλάσματος επιβίωσης υπολογίστηκε στη συνέχεια και δεικνύεται στο (Α και Β) σε κύτταρα MCF-7 και (Γ και Δ) σε κύτταρα U87. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± SD για τρεις ανεξάρτητους προσδιορισμούς.

Η

PRE και EA-κλάσμα σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα περισσότερο από τα φυσιολογικά κύτταρα

Οι συχνότητες των νεκρών κυττάρων είναι περισσότερο στα καρκινικά κύτταρα από το κανονικό λεμφοκύτταρα μετά την αγωγή με προ ή ΕΑ-κλάσμα (Πίνακας 1). Σημαντική αύξηση σε κύτταρα υπο-G1 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές (μετρήθηκε με FACS) σε σχέση με τα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα μετά την αγωγή με προ ή ΕΑ-κλάσμα δείχνουν επίσης την αυξημένη απόπτωση σε MCF-7 και U87 (Εικ Α στο S1 File) .

Η

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων μετά την επεξεργασία με το εκχύλισμα

Η κατανομή των κυττάρων σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου DNA σε MCF-7 ( Σχήμα 3Α) και κύτταρα υ87 (Σχήμα 3Β). Όπως φαίνεται στο σχήμα, δεν υπάρχει σημαντική συσσώρευση των κυττάρων σε κάθε φάση παρατηρήθηκε σε οποιαδήποτε από τις αγωγή κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, η αυξημένη κλάσμα των κυττάρων σε υπο-G1 φάση παρατηρήθηκε σε δείγματα που κατεργάζονται με PRE (49% σε MCF-7 και 45% σε κύτταρα U87) και ΕΑ-κλάσμα (MCF-7: 31%, U87: 21%). Το δεξί πάνελ του Σχ 3Α και 3Β έδειξε σημαντική αύξηση στη συχνότητα των κυττάρων υπο-G1 μετά την κατεργασία με PRE και EA-κλάσμα. Εξάνιο-κλάσμα δεν μετέβαλε τη συχνότητα σε κύτταρα υπο-G1 φάση.

δεξί πάνελ Το ποσοστό των κυττάρων σε διάφορα στάδια τόσο MCF7 και κύτταρα U87 με και χωρίς θεραπεία. Οι τιμές είναι η μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, Students’t-τεστ σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα

Η

Η ανάλυση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης με την επισήμανση JC1 αποκάλυψε ότι ποσοστό πολωμένα κύτταρα μειώθηκε σημαντικά τόσο στην MCF-7 και U87. κυττάρων μετά από θεραπεία με είτε πριν, ΕΑ ή μίγμα ΕΚ + GA + UA (Σχήμα 4Α και 4Β? Σχήμα Β S1 αρχείου). Η μείωση του πολωμένου κυττάρων ήταν μικρότερο με Hex-κλάσμα σε αμφότερα τα κύτταρα. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν ως επί το πλείστον κόκκινο φθορισμό, υποδεικνύοντας ένα άθικτο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Κατά τη θεραπεία με PRE ή EA ή ΕΚ + GA + UA ο αριθμός των κυττάρων ενισχύεται, όπως φαίνεται από το πράσινο φθορισμό. Το δεξί πάνελ του σχήματος (Σχήμα 4Α και 4Β) έδειξαν σημαντική αύξηση στα κύτταρα με μιτοχονδριακή αποπόλωση της μεμβράνης μετά την κατεργασία με PRE, ΕΑ-κλάσματος και του μίγματος ΕΚ + GA + UA.

Το άνω τμήμα υποδεικνύει το ποσοστό των κυττάρων δείχνουν πόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και το κάτω τμήμα δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που έχουν μιτοχονδριακής εκπόλωση της μεμβράνης. Όλα αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Δεξιός πίνακας δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που αποπολωμένο μετά από κάθε θεραπεία. * P & lt? 0,05, Φοιτητές ‘t-test σε σύγκριση με το μάρτυρα. (C) Επίδραση της PRE, εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα θεραπεία διαλυτό κλάσμα για την αποδόμηση του DNA και τον κατακερματισμό σε MCF7 και κύτταρα U87. Τα δείγματα DNA επισημαίνονται ως: (Μ) δείκτης μοριακού βάρους, (1) μη επεξεργασμένα κύτταρα, (2) κύτταρα επεξεργασμένα με εξάνιο-κλάσμα, (3) κύτταρα επεξεργασμένα με PRE και (4), κύτταρα κατεργασμένα με κλάσμα οξικό αιθυλεστέρα. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Η συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε 100 μg /ml και η θεραπεία δόθηκε για 24 ώρες.

Η

DNA κατακερματισμό ανάλυση

Για να επικυρώσετε την επαγωγή της απόπτωσης από PRE, ΕΑ ή μίγμα ΕΚ + GA + UA στα δύο κύτταρα MCF-7 και U87, η ανάλυση του κατακερματισμού του DNA πραγματοποιήθηκε (Σχήμα 4C). Παρατηρήθηκε ότι η θεραπεία με PRE και EA-κλάσμα (100 μg /ml) για 24 ώρες έδειξε αποικοδόμηση του DNA σε συνδυασμό με DNA τμήση σε κύτταρα U87 (πίνακας 3 και 4), ωστόσο σε κύτταρα MCF-7 μερική και πλήρη αποικοδόμηση του DNA ήταν παρατηρείται στην λωρίδα 3 και 4, αντίστοιχα, χωρίς DNA laddering. αποικοδόμηση DNA δεν μπορούσε να παρατηρηθεί σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές μετά από επεξεργασία με εξάνιο-κλάσμα για 24 ώρες. Στο σύνολό τους, το PRE και EA-διαλυτό κλάσμα που προκαλείται αποικοδόμηση του DNA τόσο U87 και MCF-7cells το οποίο είναι το σήμα κατατεθέν της βιοχημική αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Ανίχνευση της πρωτεόλυση και έκφραση επίπεδο ΡΑΚΡ-1 αναστολέων απόπτωσης

προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι το κυτταρικό θάνατο που επάγεται από PRE, EA ή μίγμα ΕΚ + GA + UA στις δύο MCF-7 και κύτταρα U87 οφειλόταν σε απόπτωση, η διάσπαση της PARP μετρήθηκε σε δύο κυτταρικές γραμμές μετά 24 ώρες θεραπείας (Σχήμα 5Α). PARP-1 πρωτεόλυση ανιχνεύθηκε μετά τη θεραπεία με PRE, ΕΑ και μίγμα του ΕΚ + GA + UA τόσο στα κύτταρα (Σχήμα 5Α). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, σημαντική μείωση στην έκφραση των Bcl2 στα δύο κύτταρα MCF-7 και U87 παρατηρήθηκε επίσης ακόλουθες επεξεργασίες με PRE, κλάσμα ΕΑ και τα μίγμα-ενώσεις (Σχήμα 5Β και 5Γ). Η θεραπεία με Hex-κλάσμα απέτυχε να μειώσει το επίπεδο της Bcl2 και στα δύο κυτταρικούς τύπους. Εκτός Bcl2, η έκφραση των αναστολέων πρωτεϊνών απόπτωσης μειώθηκε επίσης μετά από αυτές τις αγωγές σε κύτταρα MCF-7, ενώ στα κύτταρα U87 δεν παρατηρήθηκε τέτοια μείωση.

(Α) Προσδιορισμός της διάσπασης της ΡΑΚΡ. Κάτω πάνελ δείχνει ποσοτική πυκνομετρική ανάλυση του επιπέδου της ΡΑΚΡ με και χωρίς διάσπαση των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων MCF-7 και κύτταρα U87. Οι τιμές είναι η μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητα μη επεξεργασμένα δείγματα. Οι τιμές κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες β-ακτίνης αξίες. πρότυπο έκφρασης του Bcl2, survivin, ΧΙΑΡ και CIAP χρησιμοποιώντας ημιποσοτική RT- PCR στο (Β) MCF-7 και (C) κύτταρα υ87 σε επεξεργασία με ή χωρίς PRE, ΕΑ, τα κλάσματα Hex και ΕΚ + GA + UA (δύο ανεξάρτητα δείγματα). Δεξιό πλευρικό πάνελ δείχνει ποσοτική πυκνομετρική ανάλυση του προφίλ έκφρασης γονιδίων επίπεδο mRNA. Οι τιμές είναι η μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα και κανονικοποιούνται με τις αντίστοιχες τιμές GAPDH.

Η

Επίπεδο ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH) και έκφραση επίπεδο GCLC

επίπεδο των μειωμένων GSH στο MCF-7 και κύτταρα U87 εμφανίζεται μετά από τη θεραπεία με PRE, ΕΑ, Hex και ΕΚ + GA + UA (Σχήμα 6Β και 6D). Η συγκέντρωση της GSH μειώθηκε σημαντικά τόσο στα κύτταρα μετά την επεξεργασία με PRE, ΕΑ και ΕΚ + GA + UA.

Δύο ανεξάρτητοι μη επεξεργασμένα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Κάτω πάνελ δείχνει ποσοτική πυκνομετρική ανάλυση του προφίλ έκφρασης του επιπέδου GCLC mRNA. Οι τιμές είναι η μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα και κανονικοποιούνται με τις αντίστοιχες τιμές GAPDH. Επίπεδα γλουταθειόνης στο (Β) κύτταρα MCF-7 και (D) U87 κύτταρα επεξεργασμένα με ή χωρίς PRE, ΕΑ, τα κλάσματα Hex και ΕΚ + GA + UA. Δύο ανεξάρτητα μη επεξεργασμένα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών διαφορετικών πειραμάτων. * P & lt?. 0.05, Φοιτητές ‘t-test σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα

Η

Αυτή η μείωση GSH επιπέδου συνοδεύεται από τη μικρότερη έκφραση των GCLC στα επεξεργασμένα MCF-7 και U87 κύτταρα (Εικ 6Α και 6C).

Συζήτηση

P

.

fulgens

υποκειμένων και ολόκληρο το βότανο χρησιμοποιείται συνήθως ως λαϊκή ιατρική από τους ντόπιους της βορειοανατολική Ινδία, το Νεπάλ και το Μπουτάν για ποικιλία παθήσεων [8]. Με τη χρήση διαφόρων τεχνικών ανάλυσης με το ακατέργαστο εκχύλισμα δείχθηκε η παρουσία του τριτερπενίου οξέων και Β-τύπου φλαβαν-3-όλες στο εκχύλισμα τα οποία είναι γενικά γνωστή για διάφορες βιολογικές δραστηριότητες [11]. στεγανοποίηση διαλύτη-διαλύτη του εκχυλίσματος μεθανόλης απέδωσε εξανίου, οξικού αιθυλεστέρα,

ν

βουτανόλη και υδατικό εκχύλισμα. Η παρούσα μελέτη έδειξε πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική δράση του ακάθαρτου μεθανολικού εκχυλίσματος

P

.

fulgens

ρίζα και EA-κλάσμα του έναντι MCF-7 και κύτταρα U87. Η συγκέντρωση που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη για PRE, EA- και Hex-κλάσμα ήταν 100 μg /ml, η οποία ήταν μεγαλύτερη από την ατομική IC

50 τιμή. Όλα αυτά τα εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν νωρίτερα για τις αντιοξειδωτικές και κυτταροτοξικές δραστηριότητες και ο ΕΑ-κλάσμα βρέθηκε να είναι η πιο δραστήρια [10]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήθηκε ότι η θεραπεία με προ ή ΕΑ-κλάσμα σκότωσε σημαντικά περισσότερο καρκινικά κύτταρα από τα φυσιολογικά κύτταρα. Τόσο PRE και EA-κλάσμα που προκαλούνται δοσοεξαρτώμενη μείωση της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης στις δύο κυτταρικές σειρές, ωστόσο τέτοια μείωση στην κλωνοποίηση απόδοσης δεν παρατηρήθηκε με εξανίου και

ν

βουτανόλη-κλάσματα. Από ΕΑ-κλάσμα έδειξε πιο αποτελεσματική δράση αναστολής αύξησης, ήταν περαιτέρω καθαρισμένα και δοκιμάστηκαν για αντικαρκινική δράση τους.

Νωρίτερα εννέα ενώσεις και μερικά μονομερή και διμερή φλαβαν-3-όλες ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν από την ΕΑ-κλάσμα του μεθανολικού εκχυλίσματος της ρίζας του

P

.

fulgens

[10]. Από αυτά τα εννέα ενώσεις, τρεις ενώσεις δηλ., Επιλέχθηκαν επικατεχίνη (EC), γαλλικό οξύ (GA) και ουρσολικό οξύ (UA) και αναμιγνύονται μαζί. Η επιλογή αυτών των ενώσεων έγινε από τρεις διαφορετικές επιμέρους κλάσματα και ήταν με βάση την υψηλότερη απόδοση τους σε σχέση με το ποσό? GA (3,6%), UA (3,3%) και της ΕΚ (2,7%) στο ακατέργαστο εκχύλισμα μεθανόλης [10,11]. UA βρέθηκε να είναι η πιο δραστική ένωση μεταξύ των απομονωθεί triterpene οξέα με IC

50 5,3 και 7,8 μΜ σε DPPH

• και ABTS

+ • αντιοξειδωτική δοκιμασία [10,11].

σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα MCF-7 ήταν πιο ευαίσθητη από κύτταρα U87 αφού σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων ελήφθη με χαμηλότερη συγκέντρωση PRE και EA-κλάσμα. Τέτοια αναστολή της αύξησης αυτών των κυτταρικών γραμμών θα μπορούσαν να αποδοθούν οφείλεται είτε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή θανάτωσης των κυττάρων. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής απέδειξε αυξημένο κλάσμα των κυττάρων σε υπο-G1 υποδεικνύοντας κυτταρικό θάνατο που μπορεί να οφείλεται σε απόπτωση. Για να αποκτήσετε πρόσθετα αποδεικτικά στοιχεία για την απόπτωση, ελέγξαμε κατά πόσο οι θνήσκοντα κύτταρα εμφάνισαν άλλα χαρακτηριστικά του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής απέδειξε σημαντική μείωση των πολωμένων κυττάρων σε μιτοχονδριακή μεμβράνη ενώ ανοσοκηλίδος αποτελέσματα έδειξαν διασπάται πρωτεΐνη ΡΑΚΡ-1 στα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με PRE, ΕΑ-κλάσματος και του μίγματος ΕΚ + GA + UA. PARP ενεργοποιείται σε ένα ενδιάμεσο στάδιο της απόπτωσης και απενεργοποιείται από πρωτεολυτική διάσπαση σε μεταγενέστερο στάδιο από caspase3 και caspase7. Τέτοια πρωτεολυτική διάσπαση της PARP θεωρείται ως χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης [17]. Έτσι παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ακατέργαστο εκχύλισμα του

P

.