Αφηρημένο

Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την επικράτηση, histoanatomical διανομής και του όγκου βιολογική σημασία της πρωτεΐνης-στόχου και δείκτη καρκίνου βλαστικών κυττάρων LGR5 Wnt στην όγκων του ανθρώπινου γαστρεντερικού σωλήνα. Διαφορική έκφραση του LGR5 μελετήθηκε επί μεταγραφική (σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) και στο επίπεδο της μεταφράσεως (ανοσοϊστοχημεία) σε κακοήθη και αντίστοιχα μη-κακοήθεις ιστούς του 127 ασθενών που περιλαμβάνει έξι διαφορετικές θέσεις πρωτογενούς όγκου, δηλαδή του οισοφάγου, του στομάχου, του ήπατος, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του ορθού. Η κλινικο-παθολογική σημασία της έκφρασης LGR5 μελετήθηκε σε 100 ασθενείς με γαστρικό καρκίνωμα (GC). Μη νεοπλασματικό ιστό συνήθως έτρεφε μόνο πολύ λίγα διάσπαρτα LGR5

+ κύτταρα. Τα αντίστοιχα καρκινώματα του οισοφάγου, του στομάχου, του ήπατος, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του ορθού παρουσίασαν σημαντικά περισσότερο LGR5

+ κύτταρα καθώς επίσης και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα LGR5-mRNA σε σύγκριση με το αντίστοιχο μη-νεοπλασματικό ιστό. Διπλά πειράματα χρώση αποκάλυψε ένα συν-έκφραση των LGR5 με τις υποθετικές δείκτες βλαστικών κυττάρων CD44, Μουσάσι-1 και ADAM17. Επόμενο ελέγξαμε την υπόθεση ότι οι διαδοχικές αλλαγές της γαστρικής καρκινογένεσης, δηλαδή η χρόνια ατροφική γαστρίτιδα, εντερική μεταπλασία και διηθητικό καρκίνωμα, σχετίζονται με ανακατανομή του LGR5

+ κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι η χωρική κατανομή των LGR5 αλλάξει: σε μη νεοπλασματικά βλεννογόνο του στομάχου, LGR5

+ κύτταρα βρέθηκαν κυρίως στην περιοχή του λαιμού βλεννογόνους? στην εντερική μεταπλασία LGR5

+ κύτταρα εντοπίστηκαν σε κρύπτη βάση, και GC LGR5

+ κυττάρων ήταν παρόντες στην επιφάνεια του αυλού, στο κέντρο του όγκου και το μέτωπο εισβολής. Η έκφραση της LGR5 στο κέντρο του όγκου και την εισβολή μπροστά GC συσχετίζεται σημαντικά με την τοπική ανάπτυξη του όγκου (Τ-κατηγορία) και το κομβικό εξάπλωση (Ν-κατηγορία). Επιπλέον, οι ασθενείς με LGR5

+ GCs είχαν μικρότερη μέση επιβίωση (28,0 ± 8,6 μήνες) από ό, τι οι ασθενείς με LGR5

– GCs (54,5 ± 6,3 μήνες). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι LGR5 εκφράζεται διαφορικά σε γαστρεντερικούς καρκίνους και ότι η χωρική κατανομή των histoanatomical LGR5

+ κύτταρα πρέπει να θεωρείται όταν ζητείται όγκου βιολογική σημασία τους

Παράθεση:. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) Η χωρική κατανομή των LGR5

+ κύτταρα συσχετίζεται με γαστρικός καρκίνος Εξέλιξη. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10.1371 /journal.pone.0035486

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Ιούλη 2011? Αποδεκτές: 16 Μάρτη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Απρίλη του 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρεντερικού καρκινώματα είναι από τις πιο κοινές κακοήθειες και η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Οι λόγοι για τις φτωχές προγνώσεις είναι σύνθετες: Πολλοί καρκίνοι του γαστρεντερικού σωλήνα διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια εκτός από θεραπευτική αγωγή, δεν υπάρχουν αξιόπιστες καρκινικών δεικτών που μπορούν να επιτρέψουν την έγκαιρη διάγνωση ή διαλογή των πληθυσμών υψηλού κινδύνου. Οι θεραπευτικές επιλογές περιορίζονται σε τοπικά προχωρημένη και μεταστατική νόσο, και ένας σημαντικός αριθμός των όγκων επαναληφθεί παρά την αρχική θεραπευτική ανταπόκριση [3]. Μια υποθετική εξήγηση ενός αναποτελεσματική θεραπεία είναι η παρουσία του καρκίνου του βλαστικά κύτταρα (CSC). Η υπόθεση CSC αξιώνει ότι ένας όγκος είναι ένας όμιλος ετερογενών δραστηριοτήτων των κυτταρικών πληθυσμών ετερογενείς. Μόνο ένας υποπληθυσμός αυτού του ομίλου διατηρεί την ικανότητα σχηματισμού αποικιών, και ως εκ τούτου υποτροπής και μεταστατική εξάπλωση. ΚΕΠ είναι πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία, οδηγώντας σε επανεμφάνιση του όγκου, της εξέλιξης και του θανάτου τελικά ασθενής [4], [5]. Ενώ η CSC-μοντέλο όλο και περισσότερο αποδεκτή, ταυτοποίηση και επιβεβαίωση των λεγόμενων δεικτών βλαστικών κυττάρων στη μητρική ανθρώπινο ιστό είναι δύσκολο και σε μεγάλο βαθμό λείπει. Πρόσφατα, η πλούσια σε λευκίνη, G-πρωτεΐνη υποδοχέα (GPCR) και γονιδίου στόχου Wnt

LGR5

ταυτοποιήθηκε ως νέο δείκτη βλαστικών κυττάρων του λεπτού εντέρου, του παχέως εντέρου και στα θυλάκια τρίχας ποντικών [6] . Έκφραση των LGR5 σε πολλαπλά άλλα όργανα δείχνουν ότι μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα παγκόσμιο δείκτη των ενήλικων βλαστικών κυττάρων. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την έκφραση της στην ηπατο-γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου.

Στη μελέτη αυτή στοχεύει να καλύψει αυτό το κενό της πληροφόρησης και έλεγξαν την υπόθεση ότι η LGR5 δείκτης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων έχει προγνωστική και όγκου βιολογικών σημασίας.

Υλικά και Μέθοδοι

Θέματα

φορμόλη-σταθερές και παραφίνη-ενσωματωμένες κακοήθη και τα αντίστοιχα μη κακοήθη ιστό από 127 ασθενείς που περιλαμβάνει έξι ανατομικές θέσεις του ήπατος και του γαστρεντερικού συστήματος (δηλαδή οισοφάγου, του στομάχου, του ήπατος, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του ορθού) ανακτήθηκαν από τα αρχεία των Ινστιτούτων της Παθολογίας του Christian-Albrechts Πανεπιστημίου του Κιέλου και του Πανεπιστημίου νοσοκομείο Charité του Βερολίνου (τόσο στη Γερμανία). Όλοι οι ασθενείς χειρουργήθηκαν είτε Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Schleswig-Holstein (1997-2009) ή πανεπιστημιακό νοσοκομείο Charité του Βερολίνου (1995-2008? Πίνακας 1). Αόριστης κατεψυγμένα ιστός ήταν διαθέσιμο από 105 από αυτούς τους ασθενείς με οκτώ διαφορετικούς τύπους όγκων, δηλαδή αδενοκαρκίνωμα του Barrett (9 ασθενείς) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (7) του οισοφάγου, εντερική (19) και διάχυτη (21) τύπου γαστρικό καρκίνο, αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (19) και του ορθού (20), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC? 4), και χολαγγειοκαρκίνωμα (CC? 6). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Μια ανεξάρτητη σειρά από 487 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο ανακτήθηκε από το αρχείο του Ινστιτούτου Παθολογίας των χριστιανικών-Albrechts-University (Πίνακας 2 και Πίνακας 3) . Αυτοί οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε ολική ή μερική γαστρεκτομή για αδενοκαρκινώματα του στομάχου ή oesophago-γαστρική διασταύρωση. Κάθε δείγμα εκτομή είχαν υποβληθεί σε ιστολογική εξέταση από εκπαιδευμένο χειρουργική παθολόγους. Ο χρόνος θανάτου των ασθενών λήφθηκε από το

Επιδημιολογικές Cancer Registry

του κράτους Schleswig-Holstein, Γερμανία. Παρακολούθηση δεδομένων των ασθενών ακόμα ζωντανοί ανασύρθηκαν από τα αρχεία του νοσοκομείου και με την επαφή τους γενικούς ιατρούς.

Η

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα δείγματα ιστού ελήφθησαν ως μέρος ενός διαγνωστικού ή θεραπευτική χειρουργική επέμβαση πραγματοποιείται αφού ο ασθενής έδωσε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Ασθενείς που προσφέρουν δείγματα για τη μελέτη pseudonymized και αναλύθηκαν ανώνυμα, έτσι δεν ατομικά σχετίζονται με τα στοιχεία που περιέχονται στη βάση δεδομένων. Η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου στο Κίελο, Γερμανία (ref. Αριθμός Δ 453/10).

Σε πραγματικό χρόνο ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης

Το συνολικό RNA ήταν απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς cryoconserved χρησιμοποιώντας κιτ Ambion του mirVana miRNA Απομόνωση (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία) που ακολουθείται από μια κατεργασία ϋΝάσης με Turbo DNA-free kit (Ambion). ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1,5%. Για τη σύνθεση cDNA, 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Gene-ειδικούς εκκινητές συντέθηκαν με Biomers.net (Ulm, Γερμανία) (Πίνακας S1). αλυσίδα της αντίστροφης μεταγραφάσης αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real-time RT-PCR) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του LightCyler® 480 Κεφαλές Μάστερ (Roche) και το σύστημα LightCycler® 480 (Roche). Οι συγκριτικές τιμές Ct κανονικοποιήθηκαν με εκείνη των τριών γονιδίων καθαριότητας:

Homo sapiens ηλεκτρική αφυδρογονάση συγκρότημα, υπομονάδα Α, φλαβοπρωτεϊνών (Fp) (SDHA), Homo sapiens καλπάίνης 2 (CAPN2)

και

Η κυκλοφιλίνη C ( CYCC)

. Δεν έλεγχοι εκμαγείο (χωρίς cDNA σε PCR) διεξήχθησαν για κάθε γονίδιο για την ανίχνευση μη-ειδική ή γονιδιωματική ενίσχυση και εκκινητή διμερισμού. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν.

Παραγωγή και καθαρισμός ενός αντι-LGR5-αντίσωμα

Πολυκλωνικοί αντιοροί παράχθηκαν εναντίον του καρβοξυ-τερματική ουρά του ανθρώπινου υποδοχέα LGR5. Κουνέλια ανοσοποιήθηκαν με τρεις διαφορετικές πεπτίδια της ταυτότητας του SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (που ονομάζεται Οτερματικό), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (που ονομάζεται 11β), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (που ονομάζεται 12) με Pineda-abservice (Βερολίνο, Γερμανία). Μονοδυναμικοί IgG καθαρίστηκε με υγρή χρωματογραφία ταχείας πρωτεΐνης με το σύστημα ÄKTAprime ™ (GE Healthcare, Ουψάλα, Σουηδία) χρησιμοποιώντας ένα Α-στήλη πρωτεΐνης (GE Healthcare). Για όλες τις επόμενες αναλύσεις, δηλαδή ανοσοφθορισμού, ανοσοκυτταροχημεία, κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία, η μονοειδικά IgG-κλάσμα καθαρίστηκε με συγγένεια εναντίον των ανοσοποιητικά πεπτίδια από το Pineda-abservice. Σε dot blot αναλύσεις και ανοσοϊστοχημικές έρευνες, ο μονοειδικό αντίσωμα IgG αντι-LGR5-11b εμφανίζεται υψηλή συγγένεια μαζί με ισχυρή και ειδική ανοσολογική χρώση. Ως εκ τούτου, το αντίσωμα αυτό χρησιμοποιείται σε όλη αυτή τη μελέτη. Η αντιδραστικότητα και ειδικότητα του μονοειδικού αντισώματος χαρακτηρίστηκε με western blot? ανοσοφθορισμό και ανοσοκυτταροχημική δοκιμασίες.

πλασμιδιακό κατασκεύασμα

κατασκεύασμα έκφρασης για LGR5 δημιουργήθηκε με ενίσχυση του ολόκληρο κωδικοποιητική αλληλουχία του ανθρώπινου

LGR5

(NM_003667.2) με PCR (Πίνακας S1 ). Για τη διευκόλυνση της υποκλωνοποίησης του ενισχυμένου θραύσματος εντός του φορέα έκφρασης pcDNA3.1 (-), ο πρόσθιος εκκινητής περιείχε μία θέση περιορισμού προσαρμογέα NheI και το αντίστροφο έναυσμα περιείχε μία θέση BamHI και μια ετικέτα c-Myc να επαληθεύσει επιτυχής διαμόλυνση. PCR θραύσματα και το pcDNA3.1 (-) φορέα έκφρασης υπέστησαν πέψη χωριστά με NheI και BamHI πριν από την απολίνωση με Τ4-λιγάσης (Roche). Το πλασμίδιο επιβεβαιώθηκε με πέψη με NheI και BamHI και αλληλουχίας DNA με χρήση κιτ Αντίδραση ΑΒΙ PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready, έκδοση 2.0 (ΡΕ Applied Biosystems, Langen, Γερμανία).

Κυτταρική καλλιέργεια και διαμόλυνση

Η ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΜΚΝ74 ελήφθη από την ιαπωνική Health Science Research Τράπεζα πόρων (Osaka, Japan), και ΜΚΝ45 από την Γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και κυτταρικών Καλλιεργειών (Braunschweig, Germany). κύτταρα ΗΕΚ293 ΕΒΝΑ αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (ΜΚΝ74, ΜΚΝ45) ή κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (ΗΕΚ293) συμπληρωμένο με 10% (ΜΚΝ74, ΗΕΚ293) ή 20% (ΜΚΝ45) ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (ΠΑΑ Laboratories GmbH, Pasching, Αυστρία). DNA επιμόλυνση ΗΕΚ293 ΕΒΝΑ, ΜΚΝ74 και ΜΚΝ45 κύτταρα έγινε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine LTX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία έξι φρεατίων. Σταθερή διαμόλυνση ΜΚΝ74 και ΜΚΝ45 με πλασμίδια έκφρασης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Για παροδική επιμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ293 1 μg πλασμιδιακού DNA και 5 μl αντιδραστηρίου Lipofectamine LTX αραιώθηκαν σε 500 μΙ του Dulbecco Modified Eagle Medium χωρίς ορό, αντίστοιχα. Μετά από επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, το μίγμα προστέθηκε σε ΗΕΚ293 κύτταρα. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και RNA ή πρωτεΐνες απομονώθηκαν. Κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα pcDNA3.1 (-) μόνο και μη επιμολυσμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι

ανοσοφθορισμού

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη σπορά επί CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium),. κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, που καθορίζεται στο 7:03 acetone:methanol (20 λεπτά, -20 ° C) και στη συνέχεια διαπερατά με 0,1% Triton-X (5 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου). Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με c-Myc μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Clontech, Mountain View, CA, USA) για όλη τη νύχτα στους 5 ° C σε ένα υγρό θάλαμο, που ακολουθείται από αντι-ποντικού Alexa Fluor 555 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (Invitrogen). Για την ανίχνευση της επιτυχούς επιμόλυνση LGR5, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-LGR5-αντίσωμα που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με Alexa Fluor 488 (Invitrogen) το καθένα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Παράλειψη των πρωτογενών αντισωμάτων επί LGR5 επιμολυσμένα ΗΕΚ293 ΕΒΝΑ χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Τοποθέτηση και αντιχρωματισμός έγινε με Vectashield Hard-Set συμπεριλαμβανομένων DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Ανοσοκυτοχημεία

Ανοσοκυτοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, παραφινώδη ενσωματωμένα ΜΚΝ45 γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα ΜΚΝ45 εγκλείστηκαν σε μικρά σφαιρίδια αγαρόζης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Περαιτέρω επεξεργασία και ανοσοχρώση με αντι-LGR5-αντίσωμα (αραίωση 1:1000) διεξήχθη σύμφωνα με την ανοσοϊστοχημική ανάλυση τομών ανθρώπινου ιστού (βλέπε παρακάτω). Η παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος επί LGR5 επιμολυσμένα κύτταρα ΜΚΝ45 χρησίμευσαν ως αρνητικός μάρτυρας, ενώ η εξειδίκευση της χρώσης αντι-LGR5-αντισώματος επιβεβαιώθηκε με επώαση του αντισώματος με το ανοσοποιητικό κλείδωμα πεπτίδιο.

κηλίδωση Western

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ελήφθησαν με επώαση ανθρώπινου γαστρικού ιστού και καλλιεργήθηκαν γαστρικών κυττάρων με Αντιδραστήριο ProteoJET ™ Mammalian ΟβΙΙ Λύσης (Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία) και το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Complete EDTA-free, Roche). Τα δείγματα πρωτεΐνης μετουσιώθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli (60 mM Tris-HCl ρΗ 6,8, 2% δωδεκυλο θειικό νάτριο, 10% γλυκερόλη, 5% β-μερκαπτοαιθανόλη και 0,01% κυανούν βρωμοφαινόλης) με θέρμανση στους 95 ° C για δέκα λεπτά και ήταν συνέχεια φορτώθηκε στις 4% έως πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS 16,5% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση με Coomassie blue. Μετά το διαχωρισμό, οι πρωτεΐνες σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου χωρίς χρώση μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham, Freiburg, Γερμανία), ανοσοστυπώθηκαν με το αντι-LGR5-αντίσωμα (αραίωση 1:20,000) και ένα αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (1:10,000? κλωνοποιήσουν AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) για να διασφαλιστεί η ίση ποσότητα τροφοδοσίας. Συνδεδεμένη με μεμβράνη HRP επισημασμένα δευτερογενή αντισώματα (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL (Amersham). Η παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, ενώ η εξειδίκευση της χρώσης αντι-LGR5-αντισώματος επιβεβαιώθηκε με επώαση του αντισώματος με το ανοσοποιητικό κλείδωμα πεπτίδιο.

Ιστολογίας

Για αναλύσεις ιστολογικές, ιστός δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη εξουδετερώθηκε και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Αποπαραφινωθείσες τομές χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Γαστρικό καρκίνωμα ταξινομήθηκε σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ [9]. Το στάδιο pTNM προσδιορίστηκε σύμφωνα με την 7

η έκδοση του Διεθνούς Καρκίνου Ένωση Ενάντια [10].

Ιστός μικρο σειρά κατασκευής

δειγμάτων ιστών σε παραφίνη ενσωματωμένο φορμόλη-σταθερές και ήταν χρησιμοποιείται για να παράγει συστοιχίες μικρο ιστού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Τέσσερα τμήματα μικρόμετρο του προκύπτοντος ιστού του όγκου μπλοκ micro array κόπηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Επιτυχής μεταφορά του ιστού του όγκου επιβεβαιώθηκε με μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας Η &?. Ε-χρωματισμένες τομές

Ανοσοϊστοχημεία

Για ανοσοϊστοχημεία, χρησιμοποιήθηκαν σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη τομών. Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε με το αντι-LGR5-αντίσωμα (αραίωση 1:1000), ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι CD44 (1:200? Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) και εμπορικά πολυκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται έναντι LGR5 (LGR5

com , 1:400? Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (αραίωση 1:50? Sigma-Aldrich) και Musashi-1 (1:500? Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Μετά 20 λεπτά με τα αποκλεισμό με μπλοκ υπεροξείδιο του υδρογόνου (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA), η θεραπεία 5 λεπτά Ultra V Μπλοκάρισμα (Thermo Scientific) και επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα έγινε σε ένα υγρό θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν μεταξύ των σταδίων με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS). Ανοσολογικές αντιδράσεις έγιναν ορατά με το n-Histofine Απλή Stain Σύστημα MAX PO (Nichirei Bioscience, Τόκιο, Ιαπωνία) και του υποστρώματος DAB (Linaris, Wertheim-Bettingen, Γερμανία). Για διπλή χρώση των LGR5 με CD44, ADAM17 και Musashi-1, ελεύθερες θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν με IgG ποντικού και ελέγχου κουνελιού-IgG (Abcam) αραιωμένο εντός αραιωτικού αντισώματος (ZYTOMED Systems, Βερολίνο, Γερμανία) μετά DAB-θεραπεία. Τα δείγματα με αιματοξυλίνη. Η παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Μη-νεοπλασματικές ανθρώπινο στομάχι (CD44) και εγκεφαλικού ιστού (LGR5

com, LGR5 και Μουσάσι-1) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι.

Αξιολόγηση των ανοσοχρώση

Ανοσοβαφή μη νεοπλασματικών επιθηλίου και καρκινικά κύτταρα βαθμολογήθηκε με την εφαρμογή ενός συστήματος ανοσολογική βαθμολόγησης (IRS). Εν συντομία, κατηγορία Α τεκμηριωμένη την ένταση της ανοσοχρώσης ως 0 (καμία ανοσοχρώση), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια) και 3 (ισχυρή). Κατηγορία Β τεκμηριώνεται το ποσοστό των ανοσοδραστικών κυττάρων ως 0 (αρνητική), 1 (διασκορπισμένα θετικά κύτταρα? ≤1%), 2 (2-10% θετικά κύτταρα), 3 (11-50%), 4 (51-80%) και 5 (& gt? 80%). Η προσθήκη της κατηγορίας Α και Β οδήγησε σε μια IRS που κυμαίνεται από 0 έως 8, για κάθε μεμονωμένη περίπτωση. Οι αναδιανεμητικές μεταβολές των LGR5

+ κύτταρα σε 100 ολόκληρα τμήματα βουνό του εντερικού τύπου καρκίνο του στομάχου βαθμολογήθηκε ως εξής: ο αριθμός των ανοσοδραστικών κυττάρων κατηγοριοποιούνται ως 0 (αρνητική), 1 (& lt? 10 θετικά κύτταρα), 2 (10 -50 θετικά κύτταρα) και 3 (& gt? 50 θετικά κύτταρα) ξεχωριστά για την επιφάνεια του αυλού, το κέντρο του όγκου και το μέτωπο εισβολή

Στατιστικές αναλύσεις

οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το PASW Statistics 18. στατιστικό πακέτο (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων ελέγχθηκαν με τη χρήση του exact test Fisher. Συσχέτιση της έκφρασης LGR5 μέσα σε μία ομάδα ιδρύθηκε από τον συσχετισμό tau rank-order Κένταλ. Οι καμπύλες επιβίωσης προσαρμόστηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και οι διαφορές στην επιβίωση αξιολογήθηκε από τη δοκιμασία log rank. Η σημασία των συσχετίσεων της έκφρασης LGR5 σε πρωτογενείς όγκους και αντίστοιχα μη κακοήθη ιστό αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία Wilcoxon. Σε πραγματικό χρόνο δεδομένα RT-PCR, τα οποία αξιολογήθηκαν με μια αντιστοιχισμένη δύο όψεων t-test, πήρε logarithmized να ληφθεί κανονικά περίπου κατανεμημένα δεδομένα. P-τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

LGR5-mRNA εκφράζεται διαφορικά σε ηπατο-γαστρεντερικά καρκινώματα

LGR5 φέρεται να εκφράζεται σε μυϊκά βλαστικά κύτταρα του η εντερική κρύπτες [12] και συχνά υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου [13]. Για να διερευνηθεί η έκφραση του σε μη νεοπλασματικών και νεοπλασματικών ανθρώπινο ιστό, αξιολογήσαμε την μεταγραφική έκφραση του LGR5 σε ανθρώπινα κλινικά δείγματα αποτελείται από ένα ευρύ φάσμα των ηπατο-γαστρεντερικών καρκινωμάτων. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε μια σειρά 105 ασθενών που περιλαμβάνει κακοήθη και αντίστοιχα μη κακοήθη ιστό, που λαμβάνεται από τους ίδιους ασθενείς, οκτώ διαφορετικών τύπων όγκου: οισοφάγος [αδενοκαρκινώματα Barrett (9 ασθενείς) και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων ( 7)], του στομάχου [εντερική (19) και διάχυτη τύπου (21) γαστρικά καρκινώματα], το ήπαρ [HCCs (4), ΥΧ (6)], του παχέος εντέρου (19) και του ορθού (20? Πίνακας 1)

LGR5-mRNA ήταν σημαντικά διαφορικά εκφράζεται σε αδενοκαρκινώματα του οισοφάγου (p = 0,007), του στομάχου [εντερικό τύπο (p = 0,006) και διάχυτη τύπου (p = 0,013)], το ήπαρ [ΥΧ (p = 0,022)], του παχέος εντέρου (ρ & lt? 0,001), καθώς και του ορθού (p = 0,002) σε σύγκριση με την αντιστοιχισμένη μη νεοπλαστικό ιστό. Ωστόσο, δεν διαφορική έκφραση βρέθηκε σε πλακώδη καρκινώματα του οισοφάγου (p = 0.503) και HCCs σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη νεοπλασματικά ιστούς (ρ = 0.545? Σχήμα 1).

Boxplots απεικονίζει τη συνολική κατανομή των LGR5 συγκρίνοντας κακοήθεις έναντι γειτονικών μη κακοήθη ιστό στο (Α) αδενοκαρκίνωμα του Barrett και (Β) καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων του οισοφάγου, (Γ) εντερική τύπος καρκίνου του στομάχου, (D) διάχυτη τύπος καρκίνου του στομάχου, (Ε) ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, (F) χολαγγειοκαρκίνωμα, (G) του παχέος εντέρου και (H) του ορθού καρκίνωμα.

η

Ένα πολυκλωνικό αντι-LGR5-αντίσωμα ανιχνεύει την ανθρώπινη LGR5 επιμολύνονται σε κύτταρα ΗΕΚ293 και ΜΚΝ45

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το histoanatomical διανομή του LGR5 σε ανθρώπινους ιστούς και να διερευνήσουν κλινικο-παθολογική σημασία του, ένα LGR5-ειδικό αντίσωμα ανυψώθηκε, αφού τα εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα δεν πληροί τις απαιτήσεις μας (Εικόνα 2Α). Για να αποκλειστεί διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του αντισώματος που δημιουργήθηκε πρόσφατα με τις πιο δομικώς παρόμοια LGRs, LGR4 και LGR6, πραγματοποιήσαμε μία ευθυγράμμιση αλληλουχίας με το

National Center for Biotechnology Information

εργαλείο ευθυγράμμισης των προτέρων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Δεν ομολογία αλληλουχίας ευρέθη με LGR4 ή LGR6 στην περιοχή του πεπτιδίου LGR5 χρησιμοποιήσαμε για την ανοσοποίηση. Για την επιλογή ενός εξαιρετικά ειδικό αντίσωμα έναντι LGR5, κλωνοποιημένο cDNA πλήρους μήκους διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293 ΕΒΝΑ και χρησιμοποιείται ως εκτελεί ανοσοφθορισμού θετικό στόχο. Το cDNA LGR5 ήταν άμεσα επισημαίνονται με myc-επίτοπο, που επέτρεψε την αξιολόγηση της διαμόλυνσης με ένα αντι-myc αντίσωμα. Χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού, η δέσμευση του αντι-myc αντίσωμα βρέθηκε μετά την επώαση με κύτταρα LGR5 /ΗΕΚ293, αλλά όχι σε κενά κελιά φορέα-επιμολυσμένα (φορέας /ΗΕΚ293), μη επιμολυσμένα ΗΕΚ293 κύτταρα, ή στον αρνητικό έλεγχο των κυττάρων LGR5 /ΗΕΚ293 επωάζονται με αραιωτικό αντισώματος αντί του πρωτογενούς αντισώματος. Το ίδιο αποτέλεσμα ελήφθη όταν χρησιμοποιήσαμε το αντι-LGR5-αντίσωμα (Σχήμα 3), καταδεικνύοντας ειδική σήμανση των LGR5.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες του ανοσοϊστοχημική χρώση για LGR5

COM (Α) και LGR5 (Β) σε ένα γαστρικό δείγμα καρκίνου. Μετά ξεχωριστή χρώση για ADAM17 (C) και LGR5 (D), καθώς και διπλή χρώση για ADAM17 (κόκκινο χρώμα) και LGR5 (καφέ χρώμα? Ε) σε μια σειριακή τομή του υγιούς γαστρικού βλεννογόνου. Συγκρίνοντας υγιή βλεννογόνο του στομάχου (F, G) και νεοπλασματικών γαστρικό ιστό (H), MSH-1

+ /LGR5

– (κόκκινο χρώμα), MSH-1

– /LGR5

+ (καφέ χρώμα? F), καθώς και MSH-1

+ /LGR5

+ κύτταρα (G) είναι παρόντα. Κυρίως CD44

+ /LGR5

+ κυττάρων σε πειράματα διπλής χρώσης για CD44 (κόκκινο χρώμα) και LGR5 (καφέ χρώμα) σε υγιείς (Ι) και νεοπλασματικών (J) γαστρικό βλεννογόνο. Τα διπλά θετικά κύτταρα που υποδεικνύεται από τα βέλη, βέλη σηματοδοτήσει διάσπαρτα μόνο προετοιμασμένα κύτταρα. Αρχικό μεγεθύνσεις × 400 (Α-J)? × 600 (Ε).

Η

χρώση ανοσοφθορισμού των κυττάρων ΗΕΚ293 ΕΒΝΑ με ειδικό αντίσωμα LGR5 (πράσινο) και αντι-myc αντίσωμα (κόκκινο). Τα κύτταρα αντίθετα με DAPI για να δείξει στον πυρήνα του κυττάρου (μπλε). Κύτταρα επιμολυσμένα με το myc-tagged LGR5 cDNA (πρώτος πίνακας) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα (έλεγχος με κενό φορέα)? αφήνοντας μη επιμολυσμένα (ελέγχει μη επιμολυσμένα)? ή επωάστηκαν χωρίς τα πρωτεύοντα αντισώματα, αντίστοιχα. Αρχικό μεγεθύνσεις × 400.

Η

Η ιδιαιτερότητα της LGR5-ανοσοσήμανση περαιτέρω επικυρωθεί χρησιμοποιώντας φορμόλη-σταθερής και παραφίνη-ενσωματωμένες ΜΚΝ45 γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με έναν τρόπο που είναι παράλληλη με την επεξεργασία των κλινικών δειγμάτων ανθρώπινου ιστού. Η ανοσοκυτταροχημική αναλύσεις για τομές παραφίνης αποκάλυψε θετική χρώση αντι-LGR5-αντισώματος επί ΜΚΝ45 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με LGR5 cDNA (LGR5 /ΜΚΝ45). Αντ ‘αυτού, κενό φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα ΜΚΝ45 (φορέας /ΜΚΝ45), όπως επίσης και ο αρνητικός έλεγχος (παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος) και ο έλεγχος πεπτίδιο (προ-επώαση του αντισώματος με ανοσοποιητικό πεπτίδιο μπλοκαρίσματος του) κυττάρων LGR5 /ΜΚΝ45 έδειξε αριθ δέσμευση του αντισώματος (Εικόνα S1).

πρωτεΐνη LGR5 ανιχνεύεται ειδικά από αντι-LGR5-αντισώματος σε ανθρώπινα επιμολυσμένα κύτταρα ΜΚΝ74

η ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ74, που είναι γνωστό ότι κατέχουν μια έκφραση μέτρια LGR5-mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και ανθρώπινη μη νεοπλαστικά στομάχι, που εμφανίζουν πολύ χαμηλή έκφραση LGR5 (Σχήμα 1) επιλέχθηκαν για να χαρακτηριστεί η αντιδραστικότητα και ειδικότητα του αντι-LGR5-αντισώματος στο επίπεδο της πρωτεΐνης.

σε ανάλυση στυπώματος Western, LGR5 πρωτεΐνη αναγνωρίζεται ειδικά από το μονοειδικό αντι-LGR5-αντίσωμα σε αραίωση 1:20,000. Προσδιόρισε μία ζώνη με ένα φαινομενικό μοριακό βάρος 100 kDa σε κυτταρολύματα ΜΚΝ74 (Σχήμα 4), η οποία ταιριάζει με την μοριακή μάζα υπολογισθείσα για LGR5 πρωτεΐνη. Αντιθέτως, δεν μπάντα ανιχνεύθηκε σε κυτταρολύματα ανθρώπινων μη-νεοπλασματικό ιστό του στομάχου, η οποία αποκλείει μια διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των αντι-LGR5-αντισώματος με κυτταρικές πρωτεΐνες. Σύμφωνα με τα δεδομένα της έκφρασης mRNA, ισχυρότερη έκφραση της πρωτεΐνης LGR5 παρατηρήθηκε σε ΜΚΝ74 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με cDNA LGR5, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου ΜΚΝ74 επιμολυσμένα με τον κενό φορέα. έκφραση της πρωτεΐνης LGR5 σε ανθρώπινα μη νεοπλασματικά βλεννογόνου του στομάχου ήταν πέρα ​​από το όριο ανίχνευσης της κηλίδωση Western, εμφανίζοντας καμία ζώνη. Παράλειψη του αντι-LGR5-αντίσωμα ή την προηγούμενη επώαση του αντισώματος με ανοσοποίησης του αποκλεισμού πεπτίδιο εμφανίζει κανένα ζώνες πρωτεϊνών, αντίστοιχα. Ανίχνευση β-ακτίνης πρωτεΐνης (περίπου 43 kDa? Σχήμα 4) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης και επιβεβαίωσε ομοιόμορφα φορτωμένο πρωτεΐνη ποσά σε όλες τις λωρίδες

κυανή χρώση

Coomassie (χρώση) απεικονίζει την ποιότητα του φορτωμένου συνολικής πρωτεΐνης λύματα.. Στην ανάλυση κηλίδας Western αντι-LGR5-αντίσωμα (1:20,000) ανιχνεύει μία μοναδική ζώνη πρωτεΐνης σε κυτταρολύματα από σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα ΜΚΝ74, υπερεκφράζουν LGR5 (ΜΚΝ74 + LGR5), μια ασθενέστερη ζώνη κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα ελέγχου (ΜΚΝ74 + κενό φορέα), και όχι σε προϊόντα λύσης μπάντα της ανθρώπινης μη νεοπλαστικών βλεννογόνο του στομάχου, αντίστοιχα. Σε ένα παράλληλο κηλίδα δεν διακρίνονται ζώνες στόχου είναι ορατά όταν το αντι-LGR5-αντισώματος προ-επωάστηκαν με το κλείδωμα πεπτίδιο (πεπτίδιο μπλοκαρίσματος) ανοσοποίηση της. Τα κορυφαία συγκροτήματα (100 kDa, βέλος) εμφανίζουν την πρωτεΐνη LGR5, ενώ οι κάτω ζώνες (~43 kDa, βέλος) απεικονίζουν β-ακτίνης, που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

LGR5 εκφράζεται σε μη -neoplastic και νεοπλαστικό ιστό του ήπατος και του γαστρεντερικού σωλήνα

η έκφραση και η κατανομή των histoanatomical LGR5 στη συνέχεια μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε μια σειρά από 127 διαφάνειες ιστού που ελήφθη από αντίστοιχα μη-νεοπλασματικών και νεοπλασματικών ιστών του ήπατος και των γαστρεντερικών οδού, η οποία περιλαμβάνει τον οισοφάγο (14 ασθενείς), στομάχι (32), το ήπαρ (24), του παγκρέατος (17), του παχέος εντέρου (20), και του ορθού (20? Πίνακας 1). Από αυτής της σειράς νεοπλασματικών και αντίστοιχες μη νεοπλασματικά δείγματα ιστών από 105 ασθενείς μελετήθηκαν επίσης στο μεταγραφικό επίπεδο (βλέπε παραπάνω).

LGR5 έκφραση της συνολικής ομάδα ήταν θετική σε 65 περιπτώσεις (51%) του συνόλου μη-κακοήθεις ιστούς και 103 περιπτώσεις (81%) όλων των ιστών του καρκίνου. Εντοπισμός της έκφρασης LGR5 παρατηρήθηκε κυρίως κυτταροπλασματική, ενώ επίσης παρουσιάστηκε σποραδικές μεμβράνη ή πυρήνα μεμβράνη τονίζεται έκφρασης. Ένα LGR5-ανοσοαντιδραστικότητα βρέθηκε σε όλα τα συστατικά ιστού, δηλ κύτταρα στρώματος, ενδοθηλιακά κύτταρα, κύτταρα του μη νεοπλασματικών επιθήλιο και στα καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 5). LGR5-ανοσοαντιδραστικότητας στα κύτταρα στρώμα παρατηρήθηκε σε 49 (39%) του συνόλου των μη-κακοήθεις ιστούς και σε 80 περιπτώσεις (63%) όλων των ιστών του καρκίνου. Μια ενδοθηλιακή ανοσοαντιδραστικότητα LGR5 παρατηρήθηκε σε 42 περιπτώσεις (33%) όλων των ιστών.

έκφραση LGR5 σε κανονικό κολονικό βλεννογόνο (Α), μεμβρανώδη (Β) και κυτταροπλασματική (C) χρώση σε καρκίνο του παχέος εντέρου που αντιστοιχεί κύτταρα. Βέλη σήμα διάσπαρτα ανοσοδραστικών κυττάρων μέσα στην κρύπτη βάσης. Αστερίσκο (*) σηματοδοτεί την περιοχή του αυλού. Μεταβλητή LGR5-ανοσοδραστικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων βρέθηκε σε καρκινικό ιστό: Η παρουσία των ενδοθηλιακών κυττάρων LGR5-ανοσοαρνητικούς (D) επιβεβαιώθηκε με CD34 (Ε) χρησιμοποιώντας σειριακές τομές. Σημείωση ισχυρή ενδοθηλιακά LGR5-ανοσοαντιδραστικότητας σε μια άλλη περίπτωση του καρκίνου του παχέος εντέρου (F). (G) Έκφραση LGR5 σε δεσμοπλαστικού στρωματικών κυττάρων. Αρχικό μεγεθύνσεις × 200 (Α)? × 400 (Β-G).

Η

Στο μη-κακοήθη επιθήλιο, LGR5 συνήθως βρίσκονται σε μερικά διάσπαρτα κύτταρα κοντά στη βασική μεμβράνη του γαστρικού βλεννογόνου μονάδα, παγκρεατικούς πόρους, και τα παχέος κρύπτες . LGR5 δεν βρέθηκε στο πλακώδες επιθήλιο του οισοφάγου, ενδοηπατικών χοληφόρων, και ηπατοκύτταρα (σχήμα 6). Για όλους τους τύπους ιστών εκτός από οισοφαγική ιστό η μέση τιμή του IRS ήταν σημαντικά υψηλότερο για ιστό όγκου σε σχέση με το συμφωνημένα μη κακοήθη ιστό, επιβεβαιώνοντας τα ευρήματά μας στο μεταγραφικό επίπεδο (Πίνακας 1).

Έκφραση LGR5 σε φυσιολογικό οισοφαγικό βλεννογόνο (Α), σε σύγκριση με αδενοκαρκίνωμα (Β) και ένα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (C). έκφραση LGR5 στο φυσιολογικό ήπαρ (D) σε σύγκριση με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (Ε), η κανονική (F) και κακοήθεις (G) επιθήλιο του χοληδόχου πόρου, καθώς και μη-νεοπλασματικών (H) και νεοπλασματικών (Ι) παγκρεατικό ιστό. Αρχικό μεγεθύνσεις × 400.

Η

LGR5 είναι παρούσα σε διάσπαρτα κύτταρα του φυσιολογικού γαστρικού βλεννογόνου

Η ύπαρξη πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων εντός του στομάχου ποντικού αποδεικνύεται από κλωνική μελέτες σήμανσης. Η οριστική ταυτοποίηση των κυττάρων αυτών απέτυχαν μέχρι σήμερα λόγω της μη διαθεσιμότητας των συγκεκριμένων ενδογενών δεικτών [14]. Χρησιμοποιώντας σειριακές τομές που λαμβάνονται από ένα μανίκι εκτομής δείγμα, το οποίο συνήθως λαμβάνεται για τη θεραπεία του υπερβολικού βάρους, και δεν έδειξε ιστολογική απόδειξη του γαστρικού καρκίνου ή χρόνια γαστρίτιδα, ψάξαμε για LGR5

+ επιθηλιακών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, διάσπαρτα + κύτταρα LGR5

βρέθηκαν στην περιοχή βλεννογόνους αυχένα μεταξύ του foveolae και αδένες (Σχήμα 7).

σχήματα κατανομής της LGR5

+ κυττάρων σε υγιή γαστρικό βλεννογόνο (Α, Ε) , μια εντερική μεταπλασία (Β, F), και ένα αδενοκαρκίνωμα στομάχου (C, G) με εν τω βάθει εμπρός του (D). Το άνω πάνελ δείχνει αντιπροσωπευτική ανοσοϊστοχημική χρώση με ένα αντι-LGR5-αντισωμάτων σε ολόκληρα τμήματα βουνό του εντερικού τύπου γαστρικών καρκίνων. Το κάτω πίνακας απεικονίζει το αντίστοιχο σχηματικό μοντέλο των διανεμητικών αλλαγές σε διάφορα στάδια της γαστρικής ογκογένεσης. Βέλη σήμα

+ κύτταρα LGR5. Αστερίσκο (*) σηματοδοτεί την περιοχή του αυλού. Η μαύρη γραμμή αναδεικνύει το περιβάλλον υποδοχής του όγκου (μπροστά εισβολή). Αρχικό μεγεθύνσεις × 200.

Η

LGR5 συνεκφράζεται με άλλους πιθανούς δείκτες κυττάρων γαστρικών βλαστικών κυττάρων ή προγονικών

Τα βλαστικά κύτταρα των μη νεοπλασματικών ιστών και ΚΕΠ συνήθως εντοπίζονται και επικυρωμένη από την έκφραση από περισσότερα από ένα δείκτη βλαστικών κυττάρων [15]. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, είμαστε δίπλα ανέλυσε την συν-έκφραση της LGR5 με άλλες υποθετικές δείκτες CSC, δηλαδή ADAM17, CD44, Μουσάσι-1 [16] – [21]. επιλέχθηκε ADAM17, αφού προηγούμενες μελέτες που προσδιορίζονται ADAM17 ως υποθετικό δείκτη βλαστικών κυττάρων του στομάχου [8]. Ανοσοχρώση (είτε διπλή χρώση ή χρώση διαδοχικών τομών) διεξήχθη σε ένα γαστρικό δείγμα καρκίνου και σε υγιή μη φλεγμαίνοντα γαστρικό βλεννογόνο λαμβάνεται με μανίκι γαστρεκτομή. Σε γενικές γραμμές μόνο λίγα διάσπαρτα κύτταρα εμφάνισαν θετική ανοσοχρώση για ένα ή /και το άλλο υποθετικό δείκτη βλαστικών κυττάρων. [26].