Αφηρημένο

TAE226, μια ένωση πυριμιδίνης δις-ανιλινο, έχει αναπτυχθεί ως αναστολέας της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) και μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα αυξητικού παράγοντα-Ι (IGF-IR). Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση της TAE226 για τον καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC), με ιδιαίτερη έμφαση στο

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων. TAE226 ήταν πιο αποτελεσματικό έναντι των κυττάρων με μεταλλαγμένο EGFR, συμπεριλαμβανομένου του μεταλλαγμένου Τ790Μ, από ό, τι κατά των κυττάρων με άγριου τύπου ένα. TAE226 ανέστειλε κατά προτίμηση φωσφο-EGFR και κατάντη μεσολαβητών σηματοδότηση του στα κύτταρα με μεταλλαγμένη EGFR σε σχέση με εκείνους με άγριου τύπου ένα. Η φωσφορυλίωση της FAK και IGF-IR δεν ανεστάλη κατά τη συγκέντρωση στην οποία ο πολλαπλασιασμός των

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα ανεστάλη. Αποτελέσματα του

in vitro δοκιμασία σύνδεσης

υποδεικνύεται σημαντικές διαφορές στη συγγένεια για TAE226 μεταξύ του άγριου τύπου και L858R (ή delE746_A750) μετάλλαξη, και η μειωμένη συγγένεια του ΑΤΡ στο L858R (ή delE746_A750) μετάλλαξη είχε ως αποτέλεσμα καλή ανταπόκριση του L858R (ή delE746_A750) μεταλλαγμένα κύτταρα να TAE226. Ενδιαφέρον, ο L858R /Τ790Μ ή delE746_A750 /Τ790Μ μεταλλαγμένο ενίσχυσε τη συγγένεια σύνδεσης για TAE226 σε σύγκριση με την L858R ή delE746_A750 μεταλλαγμένη, με αποτέλεσμα την αποτελεσματικότητα της TAE226 έναντι μεταλλαγμένων κυττάρων Τ790Μ παρά την μετάλλαξη Τ790Μ αποκατάσταση του συγγένεια ATP για το μεταλλαγμένο EGFR κοντά ότι για την άγριου τύπου. TAE226 έδειξε επίσης υψηλότερη συγγένεια από περίπου 15-φορές για το μεταλλαγμένο L858R /Τ790Μ ό, τι για άγριου-τύπου ένα προς ανάλυση κινητικής αλληλεπίδρασης. Η αντικαρκινική δράση έναντι

EGFR

μεταλλαγμένου όγκων συμπεριλαμβανομένων μετάλλαξη Τ790Μ επιβεβαιώθηκε σε μοντέλα ποντικών χωρίς σημαντική τοξικότητα. Συνοπτικά, δείξαμε ότι TAE226 ανέστειλε την ενεργοποίηση των μεταλλαγμένων EGFR και παρουσίασαν αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα κατά NSCLCs μεταφέρουν

EGFR

μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων μετάλλαξη Τ790Μ

Παράθεση:. Otani Η, Yamamoto Η, Takaoka Μ, Sakaguchi Μ, Soh J, Jida Μ, et al. (2015) TAE226, μια ένωση δις-ανιλινο πυριμιδίνης, αναστέλλει την EGFR-κινάση μεταλλάκτη Συμπεριλαμβανομένων Τ790Μ Mutant να εμφανίζουν αντι-όγκου Επίδραση στο

EGFR

μεταλλαγμένου μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 10 (6): e0129838. doi: 10.1371 /journal.pone.0129838

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Pier Giorgio Petronini, Πανεπιστήμιο της Πάρμα, Ιταλία

Ελήφθη: 19 του Αυγ, 2014? Αποδεκτές: 13 του Μάη 2015? Δημοσιεύθηκε: 19 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Otani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (αριθμός επιχορήγηση : 18790993 στο ST), https://www.mext.go.jp/english/. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Novartis Pharma AG παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους δημιουργούς SH και EK, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Παρά το γεγονός ότι οι συγγραφείς αυτού του χειρογράφου (SH και EK) είναι εργαζόμενοι της Novartis Pharma AG, αυτό δεν μεταβάλλει οι συγγραφείς » τήρηση PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Novartis Pharma AG παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους δημιουργούς SH και EK, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές».

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Ο καρκίνος του πνεύμονα χωρίζεται σε δύο μεγάλες κατηγορίες ιστολογική, καρκίνο πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC) και καρκίνο των πνευμόνων μικρών-κυττάρων. Παρά τις μεγάλες προσπάθειες για τη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, ένα ικανοποιητικό ποσοστό επιβίωσης δεν έχει ακόμη επιτευχθεί, διότι η πλειοψηφία των ασθενών με προχωρημένο στάδιο της νόσου και οι όγκοι τους επιδεικνύουν μία εγγενή αντοχή σε συμβατική χημειοθεραπεία [2]. Για να βελτιωθεί η πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, πολλές κλινικές και βασικές έρευνες, συμπεριλαμβανομένης της έρευνας μεταγραφική, έχουν αναληφθεί [3, 4].

Molecular στόχευση θεραπεία βασίζεται σε μοριακές αλλαγές στον καρκίνο είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για η θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, καθώς και άλλα κακοήθεις όγκους. Για παράδειγμα αναστολείς, 4-ανιλινοκιναζολίνης, όπως gefitinib και erlotinib, έχουν σχεδιαστεί για να αναστέλλει την περιοχή κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ο οποίος υπερεκφράζεται σε NSCLC? τέτοιοι αναστολείς χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία του NSCLC [5-8]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, αυτοί οι αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (EGFR-TKIs) παράγουν δραστικά αποτελέσματα κατά των όγκων κατά NSCLCs διεξαγωγή κοινών

EGFR

μεταλλάξεις, μικρές διαγραφές στο εξόνιο 19 και μετάλλαξης L858R στο εξόνιο 21. Εκτός από αυτά τα EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητου μεταλλάξεις, Τ790Μ μετάλλαξη στο εξόνιο 20 είναι γνωστό ως EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική μετάλλαξη [9, 10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η κοινή

EGFR

μεταλλάξεις στην περιοχή της κινάσης της τυροσίνης είναι πιο συχνές σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας, μια ιστορία ποτέ δεν το κάπνισμα, και μια ασιατική εθνικότητα Ανατολή [11-13]. Η συχνότητα των κοινών

EGFR

μετάλλαξη στο αδενοκαρκίνωμα, το οποίο εξαρτάται από φόντο των ασθενών, κυμαίνεται από 15 έως 45%, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κοινή

EGFR

μετάλλαξη είναι μια συχνή και σημαντική εκδήλωση του πνεύμονα αδενοκαρκινώματα [11, 13, 14]. Σε αντίθεση, εγγενής μεταλλάξεις T790M είναι πολύ σπάνιες [15]. Ωστόσο, οι μεταλλάξεις Τ790Μ βρεθεί σε περίπου 50% των περιπτώσεων μεταξύ NSCLCs που επίκτητη αντοχή σε EGFR-ΤΚΙ [16].

Εκτός EGFR-TKIs στόχευση πρωτεΐνης EGFR, διάφορα είδη μικρομοριακών ενώσεων έχουν αναπτυχθεί για τη στόχευση του καρκίνου -εξειδικευμένης μοριακές αλλαγές. TAE226, μία ένωση πυριμιδίνης δις-ανιλινο, ανταγωνίζεται με ΑΤΡ για κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) και μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα αυξητικού παράγοντα-Ι (IGF-IR). Αυτή η ένωση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φέρεται, τη μετανάστευση, και την εισβολή πολλών καρκίνων όπως γλοίωμα, αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου Barrett, των ωοθηκών, του παχέος εντέρου και μαστού [17-22].

ΡΑΚ είναι ένας μη-υποδοχέα κινάσης τυροσίνης ότι μετάγει σήματα από υποδοχέα ιντεγκρίνης και συμμετέχει σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες που απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επιβίωση, την κινητικότητα, και εισβολή [23]. IGF-IR είναι μία κινάση τυροσίνης υποδοχέα διαμεμβράνης, που συμμετέχει στην καταρράκτες που οδηγούν στην ενεργοποίηση των δύο ΑΚΤ και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [24] σηματοδότησης. Αυτές οι κινάσες τυροσίνης είναι γνωστό ότι υπερεκφράζεται σε πολλούς κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων NSCLCs και να παίξουν ένα ογκογόνο ρόλο σε καρκινικά κύτταρα [25-27]. Αυτά τα γεγονότα και το ιστορικό μας ενθάρρυνε να εξετάσει την επίδραση κατά των όγκων των TAE226 στο NSCLC, και απροσδόκητα διαπίστωσε ότι TAE226 προτίμηση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές NSCLC συμπεριλαμβανομένου του μεταλλαγμένου Τ790Μ, σε σύγκριση με το

EGFR

-wild τύπου κυτταρικές σειρές NSCLC.

σε αυτή τη μελέτη, θα περιγράψουμε την επίδραση κατά των όγκων των TAE226 στο

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα em

in vitro

και

in vivo

και διερευνήθηκε ο μηχανισμός αντι-όγκου των TAE226 στο

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου Okayama (Αριθμός Άδειας: OKU-2007232). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη υπό κεταμίνη και ξυλαζίνη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Αντιδραστήρια

NVP-TAE226 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Novartis Pharma AG (Βασιλεία, Ελβετία). ZD1839 (gefitinib) παρασχέθηκε ευγενώς από την AstraZeneca (Wilmington, DE). Το διάλυμα αποθέματος των ενώσεων αυτών αντίστοιχα ανασυστάθηκε σε συγκέντρωση 20 mM και 10 mM με διμεθυλο σουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για

in vitro

πειράματα

αντισώματα

τα πρωτογενή αντισώματα με τις ακόλουθες πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν για western αποτύπωση:. πολυκλωνικό αντι-EGFR, φωσφο-EGFR (Tyr1068), IGF-IRβ, φωσφο-IGF -IRβ (Tyr1131), ΑΚΤ, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ρ44 /ρ42 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και φωσφο-ρ44 /ρ42 αντισώματα ΜΑΡΚ αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Τα μονοκλωνικά αντι-κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), FAK φωσφο-(pY397) αντισωμάτων αγοράστηκαν από Biosource (Berkeley, CA), και αντι-ακτίνης αντίσωμα, που χρησιμοποιείται ως ίσες έλεγχοι φόρτωση, αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich.

οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Για να εκτιμηθεί η επίδραση της TAE226, τις ακόλουθες 17 κυτταρικές σειρές NSCLC, το ένα στήθος κυτταρική σειρά καρκίνου (SK-BR-3), ένα γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρά (ΜΚΝ45) και ΗΕΚ -293T κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκαν για

in vitro

και

in vivo πειράματα

. HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820, NCI-H1819, NCI-H1666, NCI-H1395, NCI-H2228, NCI-H1648, NCI-H1993, NCI-H838 και NCI-Η1299 κυτταρικές σειρές ευγενώς από το Δρ Adi F. Gazdar (University of Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ντάλας, Τέξας, ΗΠΑ), ο οποίος ιδρύθηκε εκείνα NSCLC κυτταρικές σειρές με τον Δρ John D. Minna [28-30] εκτός από την NCI-H3255, η οποία ιδρύθηκε από τον Δρ Bruce E. Johnson [11, 31]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές αποδεδειγμένα να έχουν ατομική γενετική προέλευση από το σύστημα Powerplex 1.2 (Promega, Madison, WI) στο Πανεπιστήμιο του Τέξας Southwestern Medical Center στο Ντάλας, πριν λάβαμε αυτές τις κυτταρικές σειρές [29]. (Αριθμός καταλόγου: 37012) PC-9 αγοράστηκε από την Immuno-Biological Laboratories (Takasaki, Ιαπωνία). ΜΚΝ45 (αριθμός καταλόγου: JCRB0254) αγοράστηκε από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Τράπεζας Κυττάρων, Εθνικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Καινοτομίας (Ibaraki, Japan). SK-BR-3 (αριθμός καταλόγου: ΗΤΒ-30), Α549 (αριθμός καταλόγου: CCL-185), Calu-3 (αριθμός καταλόγου: ΗΤΒ-55) και ΗΕΚ-293Τ (αριθμός καταλόγου: CRL-3216) αγοράστηκαν από την την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Η κυτταρική σειρά gefitinib ανθεκτικό PC-9 (RPC-9) ιδρύθηκε από έναν από τους συγγραφείς (Κ.Κ.) [32]. PC-9, HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820 και RPC-9 έχουν EGFR-TKIs ευαίσθητες μεταλλάξεις. Εκτός αυτού, NCI-H1975, NCI-H820 και RPC-9 κυτταρικές σειρές έχουν επίσης Τ790Μ EGFR-TKIs-ανθεκτική μετάλλαξη. Οι λεπτομέρειες των γενετικών αλλοιώσεων σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές εκτός από την HCC4006 (delL747_A750, Ρ ins) είναι και NCI-H820 (delE746_E749 /Τ790Μ) φαίνονται στον Πίνακα 1.

Η

NCI-H3255 αναπτύχθηκε σε ACL- 4 μέσο [33, 34] συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και τα άλλα καρκινικές κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich). ΗΕΚ-293Τ κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα πλήρως υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Όλα

in vitro

πειράματα διεξήχθησαν με περίπου 80% συρροή καλλιέργειες.

Η επίδραση της TAE226 σε IGF-IR μετά από ορό πείνα

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της TAE226 για IGF-IR υπό συνδέτη κατάσταση ελεύθερης, αναλύσαμε την επαγόμενη φωσφορυλίωση του IGF-IR μετά από ορό ασιτία ακολουθούμενη από TAE226 θεραπεία. Μετά κυτταρικές γραμμές ήταν ορό επί τρεις ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξημένη συγκέντρωση TAE226 για δύο ώρες, είχαν διεγερθεί με 100 ng /ml ΙΟΡ-Ι ανασυνδυασμένο (Sigma-Aldrich) για 15 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

ο προσδιορισμός της ευαισθησίας φαρμάκου προς TAE226 και gefitinib σε διάφορες κυτταρικές σειρές

ευαισθησία φαρμάκου προσδιορίστηκε με μία τροποποιημένη δοκιμασία MTS με CellTiter Αντιδραστήριο Solution 96 υδατική (Promega, Madison, WI). Τα κύτταρα γενικά σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα που θα απέδιδε το 80% συρροή με την ολοκλήρωση του πειράματος, που ποικίλλει από κάθε κυτταρική γραμμή από 3000 να 4000 ανά φρεάτιο. Μετά από αυτό, το μέσο στα φρεάτια αντικαταστάθηκε με το μέσο που περιέχει φάρμακο αραιωμένα διαλύματα του TAE226 ή gefitinib σε μια σειρά 4-log ή πλήρες μέσο, ​​οι οποίες κατανεμήθηκαν σε 8-αναπαράγουν φρεάτια. Τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία του κάθε συγκέντρωση του TAE226 για 48 ώρες και του gefitinib για 72 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Μετά από αυτό, MTS βαφή προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για άλλη 1 ώρα στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Οι οπτικές πυκνότητες των δειγμάτων μετρήθηκαν στα 490 nm χρησιμοποιώντας Immuno Mini NJ-2300 (Nalge Nunc Διεθνής ΚΚ, Rochester, ΝΥ). Μέση οπτική πυκνότητα σε κάθε συγκέντρωση του φαρμάκου υπολογίστηκε μετά την απόρριψη τις υψηλότερες και χαμηλότερες τιμές. Τα αποτελέσματα κατά του όγκου των TAE226 και gefitinib για κάθε κυτταρική σειρά δείχθηκε σε όρους ανασταλτικής συγκέντρωσης 50% (IC

50), η οποία προσδιορίσθηκε με γραφική απεικόνιση του γραφήματος του ποσοστού αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης (Υ-άξονας) έναντι συγκέντρωση φαρμάκου (Χ-άξονας). IC

50 τιμές εκφράστηκαν ως μέση τιμή και την τυπική απόκλιση. Οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν μέχρις ότου η τυπική απόκλιση έγινε μικρότερο από το μέσο.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 60 mm επί μία νύκτα, και στη συνέχεια, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή κάθε συγκέντρωση TAE226 και gefitinib. Στη συνέχεια, αυτά πλύθηκαν με κρύο PBS και λύθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης [20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Να

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM να

3νο

4, 1 μg /ml λευπεπτίνη] (Cell Technology σηματοδότηση) συμπληρωμένο με Complete, Mini (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) για την εκχύλιση της πρωτεΐνης. Μετά μετρήθηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης, ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης (30 μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι πρωτεΐνες στις μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα. Τα ακόλουθα δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: κατσίκα αντι-κουνελιού ή ποντικού IgG συζευγμένο με υπεροξειδάση (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Για την ανίχνευση ειδικά σήματα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ECL συν Western Blotting Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK).

In vitro

δοκιμασία δέσμευσης της παραλλαγής πεδίων EGFR-TK

Η ικανότητα δέσμευσης του ΤΑΕ 226 για την παραλλαγή τομείς EGFR-TK εξετάστηκε με

in vitro

δοκιμασία σύνδεσης. Παραλλαγή τομείς EGFR-TK αποτελούνταν από άγριου τύπου, delE746_A750, L858R, delE746_A750 /Τ790Μ, και L858R /Τ790Μ. Η λεπτομερής μέθοδος περιγράφεται στη Μέθοδο S1.

Κινητική ανάλυση της αλληλεπίδρασης των TAE226 και gefitinib έναντι του άγριου-τύπου EGFR και L858R /Τ790Μ EGFR μεταλλαγμένο

Για να χαρακτηρίζουν το μηχανισμό της δράσης της TAE226 για EGFR , εκτελέσαμε κινητική ανάλυση της αλληλεπίδρασης των TAE226 και gefitinib (ως μάρτυρας) έναντι του άγριου-τύπου EGFR και L858R /Τ790Μ EGFR μεταλλαγμένο με Proteros Δοκιμασία Reporter Μετατόπιση (Proteros βιολογικών δομών GmbH, Μόναχο, Γερμανία), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ακόλουθων παραμέτρων: Κ

d,

k

στο

k

off και ο χρόνος παραμονής. Η Δοκιμασία Proteros Reporter εκτοπισμός διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35, 36]. Λεπτομερής μέθοδος περιγράφεται στην Μέθοδο S1.

Animal ξενομοσχεύματος μοντέλο ποντικού

Σε αυτό το πείραμα, χρησιμοποιήσαμε BALB /c-nu /nu θηλυκά γυμνά ποντίκια 4-6 εβδομάδων που αγοράστηκαν από Charles River Laboratories Ιαπωνία, Inc (Yokohama, Ιαπωνία). Αυτοί διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων οργανισμών, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Φροντίδα και Χρήση των ζώων στο Πανεπιστήμιο Okayama. γραμμές PC-9 και RPC-9 κυττάρων (4.0 χ 10

6/100 μΐ) αναμιγνύονται με 100 μΙ Matrigel (Corning Life Sciences, Tewksbury ΜΑ) εμβολιάστηκαν υποδόρια σε γυμνά ποντίκια 24 [4 διαφορετικές ομάδες (n = 6 σε κάθε ομάδα) με τη συγκέντρωση του TAE226], η οποία είχε περίπου 20 g βάρους σώματος. TAE226 αραιώθηκε με μεθυλοκυτταρίνη σε συγκέντρωση των 0 mg /kg (όχημα), 30 mg /kg, 60 mg /kg και 90 mg /kg. Μετά ο όγκος του όγκου έφθασε 200-400 mm

3, TAE226 χορηγήθηκε από του στόματος σε κάθε γυμνό ποντίκι μία φορά την ημέρα για τον αύξοντα 14 ημέρες. Κάθε τρεις ημέρες, το σωματικό βάρος των ποντικών και τον κύριο άξονα και μικρό άξονα του κάθε όγκου μετρήθηκαν και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο? (Κύριος άξονας) × (μικρός άξονας)

2 × 1/2 [37, 38]. Για τις 14 ημέρες, ο όγκος του όγκου, το ρυθμό ανάπτυξης του όγκου και του σωματικού βάρους αναλύθηκαν ως μέσος όρος της κάθε ομάδας.

Η στατιστική ανάλυση

Φοιτητών

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε να συγκρίνουν τα δεδομένα μεταξύ των δύο ομάδων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD).

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του TAE226 σε κυτταρικές σειρές NSCLC

Αξιολογήσαμε τη δράση κατά του όγκου του TAE226 χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS σε 15 κυτταρικές γραμμές NSCLC, το ένα στήθος κυτταρική σειρά καρκίνου και ένας γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (Πίνακας 1). Αριθμός δοκιμασιών MTS εκτελούνται και κάθε IC

50 αξίας λαμβάνονται από ανεξάρτητες αναλύσεις παρουσιάζονται στον Πίνακα S2. Τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC (PC-9, HCC827, και NCI-H3255) μόνο με EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα

EGFR

μεταλλάξεις και δύο NSCLC κυτταρικές σειρές (RPC-9 και NCI-H1975) τόσο με ΤΚΙ ευαίσθητα και ΤΚΙ-ανθεκτική

EGFR

μεταλλάξεις έδειξαν παρόμοια IC

50 τιμές, που κυμαίνονται 0,086 έως 0,31 μΜ. Σε αντίθεση, το IC

50 τιμές για

EGFR

NSCLC κυτταρικές σειρές άγριου τύπου (n = 10: κυμαίνονταν από 0,28 να 6,2 μΜ) ήταν υψηλότερες από εκείνες των

EGFR-

μεταλλαγμένο NSCLC κυτταρικές σειρές, αν και τα δύο

BRAF

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές και ένα

EML4

–

ALK

μετατοπισμένη γραμμή κυττάρων έδειξε ενδιάμεσο επίπεδο του IC

50 τιμές (εύρος 0,28 έως 0,48 μΜ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι TAE226 ήταν πιο αποτελεσματική σε

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές γραμμές, ανεξάρτητα από την παρουσία του ΤΚΙ-ανθεκτική

EGFR

Τ790Μ μετάλλαξη, από ό, τι σε

EGFR

άγριου -τύπος κυτταρικές σειρές, ιδιαίτερα οι οποίες δεν έχουν

BRAF

ή

EML4

-.

ALK

αλλαγές

επίσης εξετάσαμε την επίδραση κατά των όγκων των gefitinib κατά 14 NSCLC κυτταρικών γραμμών (Πίνακας 1). Τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC φιλοξενούν μόνο EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα

EGFR

μετάλλαξη ήταν ευαίσθητα στο gefitinib (το IC

50 τιμές κυμαίνονταν 0,0014 έως 0,0028 μΜ), ενώ άλλες κυτταρικές σειρές NSCLC φιλοξενούν άγριου τύπου

EGFR

(n = 9) ή ΤΚΙ-ανθεκτική

EGFR

μετάλλαξη (n = 2) ήταν ανθεκτικά (το IC

50 ήταν κυμαινόταν 5,3 έως 32,6 μΜ). Τα δεδομένα αυτά ήταν συνεπή με εκείνα των προηγούμενων εκθέσεων [10, 28].

Απελευθέρωση της FAK, IGF-IR, και οι πρωτεΐνες EGFR που σχετίζονται μετά τη θεραπεία TAE226 σε κυτταρικές σειρές NSCLC

Εμείς διερευνηθεί η επίδραση της TAE226 για ΡΑΚ, IGF-IR, και οι πρωτεΐνες EGFR που σχετίζονται με τη χρήση 6 κυτταρικές σειρές (PC-9, HCC827, NCI-H1975, RPC-9, NCI-Η1299, και NCI-H1819). Η φωσφορυλίωση του ΡΑΚ (Thy397) και του IGF-IR (Tyr1131), που είναι στόχοι των TAE226, δεν ανεστάλη σημαντικά μέχρι συγκέντρωση 5 μΜ σε όλες τις 6 κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 1). Για FAK, φωσφορυλίωση ανεστάλη σε συγκέντρωση 20 μΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για IGF-IR, φωσφορυλίωση ανεστάλη πλήρως από TAE226 μετά από ορό ασιτία σε όλες τις 4 κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (PC-9, RPC-9, ΝΟΙ-Η1299, και NCI-H1819), ανεξάρτητα από διέγερση με συνδέτη (S1 Εικ). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι TAE226 ανέστειλε φωσφορυλίωση του IGF-IR, όπως αναμενόταν.

Οι κυτταρικές γραμμές NSCLC με EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα (εξόνιο 19 διαγραφές) μετάλλαξη (PC-9 και HCC827), κυτταρικές σειρές και με τα δύο EGFR- ΤΚΙ-ευαίσθητα και ανθεκτικά (Τ790Μ) μεταλλάξεις (NCI-H1975 και RPC-9), και κυτταρικές γραμμές με EGFR φυσικού τύπου (NCI-Η1299 και ΝΟΙ-H1819) υποβλήθηκαν σε αγωγή με TAE226 σε διάφορες συγκεντρώσεις και κηλίδωση Western ανάλυση διεξήχθη . Οι φωσφορυλιώσεις των FAK και IGF-IR δεν κατεστάλησαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές NSCLC δοκιμάστηκαν. Σε αντίθεση, οι φωσφορυλιώσεις των EGFR και κατάντη πρωτεΐνες του, ΑΚΤ και ΜΑΡΚ, κατεστάλησαν σε χαμηλότερη συγκέντρωση του TAE226 σε ποσοστό

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές γραμμές ανεξάρτητα από την παρουσία της μετάλλαξης Τ790Μ σε σύγκριση με το

EGFR

κυτταρικές σειρές -wild τύπου. Επωάσαμε την μεμβράνη για ακτίνη (42 kDa) αφού επωάστηκε ΜΑΡΚ (42 και 44 kDa) και το ρυθμιστικό διάλυμα απογύμνωσης χρησιμοποιήθηκαν για την εν λόγω μεμβράνη.

Η

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, η φωσφορυλίωση του EGFR ήταν κυρίως αναστέλλεται με TAE226 στα τέσσερα

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές (PC-9, HCC827, ΝΟΙ-H1975, και RPC-9), ανεξάρτητα από την παρουσία του ΤΚΙ ανθεκτικών μεταλλάξεων. Επιπλέον, οι φωσφορυλιώσεις των ΑΚΤ και ΜΑΡΚ, τα οποία είναι μεταγενέστερα μόρια του EGFR, επίσης ανέστειλε σε αυτές

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές γραμμές. Σε αντίθεση, οι φωσφορυλιώσεις του EGFR, ΑΚΤ, και ΜΑΡΚ δεν ανεστάλησαν σε κυτταρικές σειρές με άγριου τύπου

EGFR

(NCI-Η1299 και ΝΟΙ-H1819) (Σχήμα 1). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι TAE226 μπορεί να έχει ισχυρότερη επίδραση επί μεταλλαγμένου EGFR από EGFR φυσικού τύπου.

Επιβεβαιώσαμε το επίπεδο έκφρασης της ΡΑΚ, ρ-ΡΑΚ, IGF-IR, και ρ-IGF-IR σε κυτταρικές γραμμές χωρίς έκθεση στο φάρμακο που χρησιμοποιούν δέκα κυτταρικές σειρές ΜΜΚΠ (

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές, PC-9, HCC827, NCI-H3255, HCC4006, NCI-H1975, NCI-H820 και RPC-9?

EGFR

κυτταρικές σειρές άγριου τύπου, NCI-H1819, NCI-Η1299 και Α549). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο έκφρασης καθενός των πρωτεϊνών παρατηρήθηκε μεταξύ των κυτταρικών σειρών (S2 Εικ).

Επίδραση της TAE226 επί μεταλλαγμένου EGFR-επιμολυσμένη κυτταρική σειρά ΗΕΚ-293Τ

Εξετάσαμε η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των TAE226 σε δύο κυτταρικές σειρές ΗΕΚ-293Τ σταθερά επιμολυσμένα με EGFR φυσικού τύπου ή μεταλλαγμένων EGFR (L858R) που είχαμε προηγουμένως καθοριστεί [39]. Η ΗΕΚ-293Τ με μεταλλαγμένο EGFR ήταν περισσότερο ευαίσθητη σε gefitinib από το ΗΕΚ-293Τ με EGFR φυσικού τύπου (το IC

50 τιμές ήταν 0,38 ± 0,087 και 18,2 ± 3,9 μΜ, αντίστοιχα) (Πίνακας 1). TAE226 άσκησαν μεγαλύτερη επίδραση κατά του όγκου για την ΗΕΚ-293Τ με το μετάλλαγμα EGFR παρά στο ΗΕΚ-293Τ με τον EGFR φυσικού τύπου (το IC

50 τιμές ήταν 0,41 ± 0,06 και 3,0 ± 0,11 μΜ, αντίστοιχα) ( Τραπέζι 1). TAE226 ανέστειλε τις φωσφορυλιώσεις των EGFR και ΑΚΤ στο κύτταρο ΗΕΚ-293Τ με το μετάλλαγμα EGFR αλλά όχι στο κύτταρο ΗΕΚ-293Τ με τον άγριου-τύπου EGFR (S3 Εικ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι TAE226 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων ή την επιβίωση του

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα καταστέλλοντας μεταλλαγμένη πρωτεΐνη EGFR.

Η σύνδεση συγγένειας των TAE226 με μεταλλαγμένες EGFR

Για την εκτίμηση η συγγένεια πρόσδεσης του TAE226 να κινασών EGFR, πραγματοποιήσαμε μια

in vitro δοκιμασία

των κινασών παραλλαγής EGFR (Εικόνα 2) σύνδεση. Το υπερκείμενο κλάσμα περιείχε κινάσης EGFR που δεν δεσμεύονται με σφαιρίδιο-τροποποιημένη ΑΤΡ εξαιτίας παρεμβολών από TAE226 (ή εξωγενούς ΑΤΡ). Το καταβυθισθέν κλάσμα περιείχε EGFR κινάσης που είχαν συνδεδεμένο με σφαιρίδια τροποποιημένα ΑΤΡ, δείχνοντας ότι TAE226 (ή εξωγενούς ΑΤΡ) δεν παρεμβαίνει σύνδεσης ΑΤΡ. Έτσι, η ένταση λωρίδα σε κάθε TAE226 (ή εξωγενούς ΑΤΡ) συγκέντρωση αντανακλά την ικανότητα του TAE226 (ή εξωγενούς ΑΤΡ) για να ανταγωνιστεί με χάντρα-τροποποιημένο ATP για τις κινάσες EGFR.

Α) κινάσες μεταλλαγμένο κοινή EGFR και Β ) T790M περιέχει EGFR μεταλλαγμένων κινασών. Οι πέντε τύποι κινασών EGFR, άγριου τύπου, εξόνιο 21 L858R μετάλλαξη (L858R) ή εξόνιο 19 διαγραφή (delE746_A750), Τ790Μ σε συνδυασμό με την μετάλλαξη L858R (L858R /Τ790Μ), και Τ790Μ σε συνδυασμό με delE746_A750 (delE746_A750 /Τ790Μ) , το οποίο ανταγωνιστικά δεσμεύεται με ΑΤΡ ή TAE226, εκχυλίστηκαν και επωάστηκαν με σφαιρίδια τροποποιημένα με ΑΤΡ. TAE226 ή το ανασυνδυασμένο ΑΤΡ προστέθηκε για να ανταγωνιστεί με σφαιρίδια τροποποιημένα με ΑΤΡ για την σύνδεση με κινάσες EGFR. Η κινάση EGFR πολυφαγία με τα σφαιρίδια τροποποιημένα με ΑΤΡ ήταν παρόν σε καθίζηση, και η σύνδεση με TAE226 (ή ανασυνδυασμένο ΑΤΡ) κινάσης EGFR ήταν παρούσα σε υπερκείμενο. Κηλίδωση Western Διεξήχθη να ανιχνεύσει κινάσες EGFR σε κάθε συστατικό χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ΗΑ. *, Σε συγκέντρωση 10 μΜ για την ΑΤΡ? **, Σε συγκέντρωση 0.005 μΜ για TAE226.

Η

Μεταξύ των κινασών παραλλαγή EGFR που ελέγχθηκαν (άγριου τύπου, L858R, delE746_A750, L858R /Τ790Μ και delE746_A750 /Τ790Μ), καμία διαφορά στην τα ποσά των κινασών EGFR που δεσμεύεται με το σφαιρίδιο τροποποιημένου ΑΤΡ παρατηρήθηκε υπό την προϋπόθεση ελέγχου (Σχήμα 2Α και 2Β). Εξωγενείς ΑΤΡ ασθενώς συνδεδεμένο με κινάσες EGFR σε συγκέντρωση 1.000 μΜ σε όλες τις παραλλαγές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 2Α). Σε αντίθεση, TAE226 άρχισαν να δεσμεύονται με EGFR κινάσης άγριου-τύπου σε συγκέντρωση 0,1 μΜ και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις για μεταλλαγμένο EGFRs, υποδεικνύοντας ότι TAE226 έχουν υψηλότερη συγγένεια για κινάσες EGFR από ΑΤΡ. Εκτιμήσαμε την συγγένεια δέσμευσης του TAE226 σε παραλλαγές EGFR με σύγκριση της αναλογίας της ημι-ποσοτικοποιείται ένταση ζώνης μεταξύ του υπερκείμενου κλάσματος και του καταβυθισμένου κλάσματος σε 0,1 μΜ TAE226 μεταξύ άγριου τύπου, L858R, ή delE746_A750 (S4A Εικ). Ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) έδειξε ότι η συγγένεια δέσμευσης του TAE226 ήταν περίπου 7,5 φορές υψηλότερη για τις δύο μεταλλαγμένο EGFRs από προς άγριου-τύπου EGFR (S4A Εικ). Η επίδραση της επίκτητης μετάλλαξης Τ790Μ στο συγγένεια δέσμευσης για TAE226 στην κοινή μεταλλαγμένο κινάσες EGFR (L858R ή delE746_A750) αξιολογήθηκε επίσης σε συγκέντρωση 0.005 μΜ για TAE226 και 10 μΜ για την ΑΤΡ (Σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η συγγένεια σύνδεσης για TAE226 ήταν υψηλότερη σε Τ790Μ περιέχουν EGFR μεταλλαγμένο κινασών (L858R /Τ790Μ ή delE746_A750 /Τ790Μ) από ότι στην κοινή EGFR κινασών μεταλλάκτη (L858R ή delE746_A750) (Εικ S4B).

κινητική Αλληλεπίδραση TAE226 και gefitinib με άγριου τύπου EGFR και L858R /Τ790Μ EGFR μεταλλαγμένο

IC

50 και Κ

δ τιμές για TAE226 και gefitinib έναντι του άγριου-τύπου EGFR και L858R /Τ790Μ EGFR μεταλλαγμένο φαίνονται στον πίνακα 2. IC

50 και Κ

δ τιμές για TAE226 ήταν 0.326 μΜ και 0.163 μΜ σε άγριου-τύπου EGFR, και 0.0193 μΜ και 0.00966 μΜ σε L858R /Τ790Μ EGFR μετάλλαξη, αντίστοιχα. Όσον αφορά gefitinib, αυτά ήταν 0.0244 μΜ και 0,0122 μΜ σε άγριου-τύπου EGFR, και 0,927 μΜ και 0,463 μΜ σε L858R /Τ790Μ EGFR μετάλλαξη, αντίστοιχα. Gefitinib έδειξε μια υψηλότερη συγγένεια από περίπου 40 φορές για άγριου-τύπου EGFR απ ‘ότι για L858R /Τ790Μ EGFR μεταλλαγμένο. Αντιθέτως, TAE226 έδειξε υψηλότερη συγγένεια από περίπου 15-φορές για L858R /Τ790Μ EGFR μεταλλαγμένο ό, τι για άγριου-τύπου EGFR. Οι τιμές του

k

και να

k

off δεν θα μπορούσε να υπολογίζεται TAE226 για τους δυο τύπο του EGFR και gefitinib για L858R /Τ790Μ EGFR μετάλλαξη λόγω της σύντομο χρονικό διάστημα παραμονής (& lt? 1,4 λεπτά). επίδραση

Η

Anti-όγκου των TAE226 σε μοντέλα ξενομοσχεύματος NSCLC ποντίκι

με βάση την

in vitro

δεδομένων μας, Εξετάσαμε την επίδραση κατά των όγκων των TAE226 σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. Μετά την υποδόρια όγκο του όγκου των εμβολιασθέντων γραμμές PC-9 και RPC-9 κυττάρων σε γυμνά ποντίκια είχαν φθάσει σε όγκο 200-400 mm

3, υποβάλλαμε σε αγωγή γυμνά ποντίκια την με την από του στόματος χορήγηση του TAE226 (30 mg /kg , 60 mg /kg ή 90 mg /kg) ή μεθυλοκυτταρίνη ως όχημα για 14 ημέρες. Το μέγεθος του όγκου και το σωματικό βάρος των δύο ξενομοσχεύματα μετρήθηκαν την ημέρα πριν από την από του στόματος χορήγηση TAE226 και στη συνέχεια κάθε τρεις ημέρες. Εμφανή παρενέργειες, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας σωματικού βάρους, δεν έλαβε χώρα στην ομάδα υπό αγωγή με όχημα ή στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με 30mg /kg ή 60 mg /kg TAE226, ενώ η απώλεια του σωματικού βάρους παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 90 mg /kg TAE226. Ο όγκος του όγκου σε δύο ξενομοσχεύματα μειώθηκε σημαντικά την πάροδο του χρόνου και με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σε σύγκριση με την αγωγή με όχημα ποντικούς (Σχήμα 3). Επιπλέον, και οι δύο ξενομοσχεύματα του EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα (PC-9) και EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική (RPC-9) κυτταρικές σειρές έδειξε παρόμοια αποτελέσματα κατά του όγκου σε απόκριση προς TAE226

in vivo

.

Η από του στόματος χορήγηση του TAE226 για 14 ημέρες ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου των υποδορίως εμβολιάσθηκαν ξενομοσχεύματα ποντικών με PC-9 (διαγραφή exon19) ή RPC-9 (διαγραφή exon19 και μετάλλαξης Τ790Μ) σε κάθε δόση (30, 60 και 90 mg /kg). Επιπλέον, TAE226 έδειξε το ανάλογο αποτέλεσμα αντι-όγκου για τα δύο μοντέλα ξενομοσχεύματος ανεξάρτητα από την παρουσία της μετάλλαξης του EGFR Τ790Μ.

Η

Συζήτηση

Όπως φαίνεται στη σχέση μεταξύ μικρών EGFR-ΤΚΙ και

EGFR

μετάλλαξη [40], η ικανότητα των TAE226 να ανταγωνίζονται με ΑΤΡ, με αποτέλεσμα στο δυναμικό κατά του όγκου του, καθορίζεται από δύο παράγοντες: 1) η ικανότητα σύνδεσης για TAE226 να μεταλλαγμένες EGFR και 2), το συγγένεια για ΑΤΡ σε μεταλλαγμένες EGFR. Είναι γνωστό ότι η συγγένεια για ΑΤΡ είναι μικρότερη από την κοινή μεταλλάξεις του EGFR από τον άγριου-τύπου EGFR [40].

φαίνεται να είναι ένα άλλο σημαντικό παράγοντας που επηρεάζει σημαντικά τις επιδράσεις της μοριακής φάρμακα που στοχεύουν σε καρκινικά κύτταρα υπάρχουν . Σύμφωνα με την έννοια της «ογκογονιδίου εθισμός»,

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές εξαρτώνται από μεταλλαγμένο EGFR για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [41] πολύ. Ότι ο λόγος για την κακή παρεμπόδιση να ΡΑΚ ή δραστηριότητα του IGF-IR σε NSCLC δεν είναι σαφής, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι TAE226 παρεμποδίζει ισχυρά την μεταλλαγμένη EGFR, σε σύγκριση με FAK και IGF-IR, σε κύτταρα που είναι «εθισμένοι» στο μεταλλαγμένο EGFR, με αποτέλεσμα την αντικαρκινική δραστικότητα του TAE226. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρχαν ορισμένες διαφορές μεταξύ IC

50

in vitro

δοκιμασία μη κυτταρική κινάση και δοκιμασία κυτταρικής αναστολής για ορισμένα ογκογονίδια. Αυτό το φαινόμενο φαίνεται να εξηγείται από την έννοια της «ογκογονιδίου προσθήκη» που ο βαθμός εξάρτησης σε συγκεκριμένα ογκογονίδια μπορεί να είναι διαφορετική μεταξύ των όγκων και ογκογονίδια. IC

50 τιμές για c-Src (0.91), HER2 (0.95), FGFR-1 (0,75), c-Met (0.16) και ALK (0,15), οι οποίες συχνά ενεργοποιούνται σε NSCLC, είναι μικρότερη από εκείνη για EGFR (1,7) (S1 πίνακα, ενημερωμένα δεδομένα από ref. 20), υποδεικνύοντας ότι TAE226 μπορεί επίσης να αναστέλλουν αυτές τις κινάσες εκτός από EGFR σε NSCLCs, ειδικά εάν οι όγκοι «εθισμένοι» σε αυτές τις κινάσες.

Αναφορικά ο μηχανισμός με τον οποίο η μετάλλαξη Τ790Μ πιστεύεται ότι επηρεάζουν τις μικρές TKIs μόριο όπως gefitinib και erlotinib, η μετάλλαξη Τ790Μ έχει πιστεύεται ότι προκαλούν αντίσταση από στερεοχημικά μπλοκάροντας την πρόσδεση του TKIs [9, 10, 42]. Επιπλέον, Yun και συνεργάτες ανέφεραν ότι η αύξηση της συγγένειας ΑΤΡ είναι ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο η μετάλλαξη Τ790Μ προκαλεί αντίσταση στην TKIs? ενώ η απλή μετάλλαξη L858R μειώνει την συγγένεια δέσμευσης του ΑΤΡ κατά περίπου 30 φορές σε σύγκριση με το EGFR φυσικού τύπου, η εισαγωγή του επιπλέον μετάλλαξη Τ790Μ αποκαθιστά τη συγγένεια δέσμευσης του ΑΤΡ συγκρίσιμη με εκείνη του EGFR φυσικού τύπου [43]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι IC

50 τιμές TAE226 για EGFR Τ790Μ σε συνδυασμό με την L858R (ή delE746_A750) μεταλλαγμένα κύτταρα είναι παρόμοιες με εκείνες για EGFR L858R (ή delE746_A750) μεταλλαγμένα κύτταρα, παρέχοντας τα αντιφατικά αποτελέσματα σε σύγκριση με το IC

50 τιμές του gefitinib για αυτούς.

in vitro δοκιμασία πρόσδεσης

μας δείχνει επίσης ότι το διπλό μετάλλαγμα αποκαλύπτει υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης με TAE226 από εκείνη του μεταλλαγμένου L858R (ή delE746_A750).