Αφηρημένο

Ιστορικό

Εξωσώματα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο κελί-να-κυττάρων επικοινωνίας, με στόχο τα κύτταρα να μεταφέρουν μόρια exosomal συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, mRNA, και microRNAs (miRNAs) από endocytosis- όπως μονοπάτι. miRNAs είναι μικρά μόρια RNA μη κωδικοποιητική κατά μέσο όρο 22 νουκλεοτίδια σε μήκος που ρυθμίζουν πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της παθογένεση του καρκίνου και μεσολαβούν γονίδιο ρύθμιση προς τα κάτω με τη στόχευση mRNAs να διεγείρει αποικοδόμηση RNA ή /και παρεμβαίνει με τη μετάφραση. Πρόσφατες αναφορές υποδηλώνουν ότι miRNAs μπορεί να ανιχνευθεί σταθερά στα κυκλοφορούντα στο πλάσμα και ορό επειδή τα miRNAs συσκευάζονται από εξωσώματα να προστατεύονται από την αποδόμηση του RNA. Έτσι, προφίλ miRNAs exosomal έχουν ανάγκη να αποσαφηνιστεί η ενδοκυττάρια σήμανση και ανακαλύψτε ένα νέο δείκτη της νόσου, καθώς και.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εξωσώματα απομονώθηκαν από καλλιεργημένα καρκινικές κυτταρικές σειρές και ελέγχθηκε η ποιότητά τους από τις αναλύσεις των ηλεκτρονίων μετάδοσης μικροσκόπιο και western αποτύπωση. Μία από τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ένα μεταστατικού καρκίνου του στομάχου κυτταρική γραμμή, AZ-P7a, έδειξε την υψηλότερη απόδοση RNA στα απελευθερώνονται εξωσώματα και διακριτικό σχήμα στη μορφολογία. Επιπλέον, τα RNA απομονώνεται από κύτταρα και μέσα καλλιέργειας, και τα προφίλ των τριών αυτών κλασμάτων miRNA ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών. Με τη σύγκριση εντάσεις σήματος των δεδομένων μικροσυστοιχίας και την ακόλουθη επικύρωσης χρησιμοποιώντας ανάλυση RT-PCR, βρήκαμε ότι ας-7 οικογένεια miRNA ήταν άφθονο τόσο στο ενδοκυτταρικό και εξωκυτταρικό κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a, ενώ χαμηλού μεταστατικού AZ-521, το γονικό κύτταρο γραμμή της AZ-P7a, καθώς και άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές έδειξαν καμία τέτοια τάση.

Συμπεράσματα /Σημασία

ο εμπλουτισμός του ας-7 οικογένεια miRNA στα εξωκυττάρια κλάσματα, κυρίως, στην εξωσώματα από κύτταρα AZ-P7a μπορεί να αντανακλά ογκογόνο χαρακτηριστικά τους, συμπεριλαμβανομένων των ογκογένεση και τη μετάσταση. Από ας-7 miRNAs γενικά παίζουν ρόλο όγκου-κατασταλτικό ως στοχεύουν ογκογονίδια όπως

RAS

και

HMGA2

, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα κύτταρα AZ-P7a απελευθερώσει ας-7 miRNAs μέσω εξωσώματα σε η εξωκυτταρικό περιβάλλον για τη διατήρηση ογκογένεση τους

Παράθεση:. Ohshima K, Inoue Κ, Fujiwara Α, Hatakeyama Κ, Kanto Κ, Watanabe Υ, et al. (2010) Ας-7 microRNA Family επιλεκτικά εκκρίνονται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον μέσω Εξωσώματα σε μια γραμμή κυττάρων μεταστατικού καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Συντάκτης: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Γερμανία

Ελήφθη: 14 του Απριλίου του 2010? Αποδεκτές: 10η Σεπτεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση σε συνεργασία με την πρωτοποριακή τεχνολογία και Advanced Research in Εξελικτικά Χώρου (ΠΟΛΗ) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα κύτταρα εκκρίνουν διάφορους τύπους μικρών κυστιδίων μεμβράνης. Τα εξωσώματα είναι ένα από τα κυστίδια με διάμετρο 30-100 nm και φυσικοχημικά διακριτή από άλλες εκκρινόμενες φλύκταινες [1]. Μέσα εξωσώματα, κυτταρικό γονίδιο προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, mRNA, και microRNAs (miRNAs) είναι συσκευασμένα και αυτά τα μόρια μπορούν να μεταφερθούν σε κύτταρα δέκτες για να παραδώσει μοριακή σήμανση τους, όπως η ογκογένεση [2] – [4] και ανοσολογική απόκριση [1], [ ,,,0],5]. Τα εξωσώματα απελευθερώνονται από πολλούς τύπους κυττάρων [6] οι οποίες περιλαμβάνουν κύτταρα όγκου, επιθηλιακά κύτταρα, και τα αιμοποιητικά κύτταρα όπως δικτυοκύτταρα, κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, ιός μετασχηματισμένα Β κύτταρα Epstein-Barr, σιτευτικά κύτταρα, δενδριτικά κύτταρα, και αιμοπετάλια. Οι εκκρινόμενες εξωσώματα απομονωθεί και χαρακτηρισθεί

in vitro

από καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές [7] μαζί με

in vivo

στα σωματικά υγρά [7] συμπεριλαμβανομένου του αίματος [8], τα ούρα [9], το σάλιο [10], το αμνιακό υγρό [11], και κακοήθη πλευριτική συλλογή [12]. Επειδή παρατηρείται σε πολλούς τύπους κυττάρων πολλαπλασιαζόμενα, είναι νοητό να επιδεινώσει τα καρκινικά κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη παρουσία τους στο πλάσμα και υπεζωκοτικές συλλογές των ασθενών με καρκίνο [8], [12]. Αυτή η αυξημένη παρουσία σε μη επεμβατικές σωματικά υγρά των ασθενών με καρκίνο έχει επιταχυνθεί στο προφίλ μοριακών συστατικών στα εξωσώματα για την ανακάλυψη κλινικώς χρήσιμοι δείκτες όγκου και βιολογικοί δείκτες [3], [7], [13].

miRNAs αποτελούν κατηγορία μη κωδικεύουσας μικρών RNAs που εμπλέκονται στην μετα-μεταφραστική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω αναστολής τόσο σταθερότητα και τη μετάφραση των mRNAs [14]. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι miRNA μεταλλάξεις ή misexpression συσχετίζονται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και υποδεικνύουν ότι ορισμένα miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων [15], [16]. Για την ανάλυση RNAs, είναι πάντα να εξετάσει τους σταθερότητα από την υποβάθμιση από την RNase. Πρόσφατα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ενδογενής miRNAs πλάσμα σε δείγματα αίματος είναι σταθερά ανιχνεύσιμα σε μια μορφή που είναι ανθεκτική σε δραστικότητα ριβονουκλεάσης [17], η οποία αποδεικνύεται με τον προσδιορισμό της miRNAs στα σωματικά υγρά όπως το αίμα [17] – [24], τα ούρα [25], και το σάλιο [10], [26].

έχουν καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα έχουν χρησιμοποιηθεί για να αναζητήσετε δείκτες όγκου. Ειδικότερα, ο προσδιορισμός πρωτεΐνες και πεπτίδια που εκκρίνονται στο μέσο καλλιέργειας έχει αναπτυχθεί από την προσέγγιση που βασίζεται πρωτεωμική [27], [28]. Όσο για μοριακή υπογραφή στα εξωσώματα, έχουν πρωτεομική καθώς και αναλύσεις transcriptomics έχουν διεξαχθεί για να αποκαλύψει την ογκογένεση και τον προσδιορισμό των υποψηφίων δείκτη όγκου [2] – [4], [7], [29]. Εδώ, για τον εντοπισμό miRNA που σχετίζονται με ογκογένεση και μετάσταση, πραγματοποιήσαμε εκτεταμένη ανάλυση miRNA σε τρία κυτταρικά κλάσματα συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων, εξωσώματα και μέσο από καλλιεργημένα κύτταρα. Κατάταξη δεδομένα αυτών των ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών miRNAs που λαμβάνονται με ανάλυση μικροσυστοιχιών, βρήκαμε ότι οικογένεια ας-7 miRNA είναι πλούσιο σε όλα τα κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a, ένα μεταστατικού καρκίνου του στομάχου κυτταρική γραμμή, η οποία παράγει ομοιογενές και συμπυκνωμένο μορφολογία, και υψηλή ανάκτηση ποσοστό των miRNAs exosomal. Αυτά τα ευρήματα ήταν διαφορετικές από τις άλλες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (SBC-3, ΝΟΙ-Η69, και DMS53), ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (SW480 και SW620), και ΑΖ-521, της μητρικής κυτταρικής σειράς του AZ-P7a. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ας-7 λειτουργίες της οικογένειας miRNA κυρίως ως ογκοκατασταλτικά γονίδια [30] με στόχο ογκογονίδια όπως

RAS

και υψηλής ομάδα για την κινητικότητα Α2 (

HMGA2

) [31], προτείνουμε ότι η AZ -P7a κύτταρα επιλεκτικά εκκρίνουν ας-7 miRNAs στο εξωκυτταρικό περιβάλλον μέσω εξωσώματα να διατηρήσει ογκογόνο και μεταστατικό τάσεις τους.

Αποτελέσματα

Απομόνωση εξωσωμάτων από τις κυτταρικές σειρές διαφόρων καρκίνο

τα εξωσώματα παράγονται από κύτταρα έσω προς το εξωκυτταρικό περιβάλλον μέσω ενός εξωκύττωση-σαν μονοπάτι [1]. Εκτός από τα υγρά του σώματος όπως ο ορός και το πλάσμα από περιφερικό αίμα [7], [8], εξωσώματα βρίσκονται στο μέσο των καλλιεργημένων κυττάρων [7], διευκολύνοντας την αναγνώριση των μορίων exosomal συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, mRNA, και miRNAs για το σκοπό για τον κλινική χρήση τους. Προφίλ τέτοια μόρια exosomal παράγονται σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα έχουν οδηγήσει να ανακαλύψουν ένα νέο υποψήφιο δείκτη και αντιγόνο για τη διάγνωση του καρκίνου και ανοσοθεραπεία [7]. Σε αυτή τη μελέτη, για τους σκοπούς του προφίλ miRNAs exosomal, απομονώσαμε πρώτα εξωσώματα από μέσα καλλιέργειας κυτταρικών γραμμών 46 με καρκίνο με διάφορους τύπους ιστών, τα οποία περιλαμβάνουν 8 για το στομάχι, 16 για πνεύμονα, 5 για κόλον, 9 για το πάγκρεας, 3 για προστάτη , και 5 του μαστού. Μετά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 48 ώρες, εξωσώματα συλλέχθηκαν με συνδυασμό διαδοχικών φυγοκέντρηση και το μοριακό βάρος μεμβράνες αποκοπής όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. καθαρότητα τους exosomal κλασμάτων εκτιμήθηκε με αναλύσεις ηλεκτρονίων μετάδοσης μικροσκοπία και κηλίδωση Western. Μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου κατέδειξε στρογγυλού σχήματος δομές φυσαλιδώδους μεμβράνη περίπου εντός του μεγέθους των 100 nm σε διάμετρο. Μεταξύ τρεις κυτταρικές γραμμές, SBC-3, AZ-521, και AZ-P7a, είναι ενδιαφέρον ότι η μορφολογία από τα κύτταρα AZ-P7a ήταν πιο ομοιογενής και συμπυκνώνεται σε σχέση με άλλα κύτταρα (Σχήμα 1Α). Ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε ότι το εξωκυτταρικό σωματίδια απομονώνονται από το μέσο καλλιέργειας των κυττάρων AZ-P7a είχε ανοσοαντιδραστικότητα με ένα αντίσωμα έναντι CD63, μία από τις πρωτεΐνες μεμβράνης exosomal, στις μεμβράνες καψικό (Σχήμα 1Β). Η παρουσία των γνωστών πρωτεϊνών exosomal συμπεριλαμβανομένων CD29 /β1-ιντεγκρίνης, Aip1 /Alix και γονίδιο ευαισθησίας όγκου 101 (Tsg101) επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western, ενώ μία πρωτεΐνη που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο, Bip /Grp78, ήταν μη ανιχνεύσιμη (Εικόνα 1 C). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η μόλυνση του υλικού που προέρχεται από άλλα κυτταρικά διαμερίσματα στα κλάσματα exosomal ήταν ελάχιστη. Η απόδοση των πρωτεϊνών από κύτταρα exosomal AZ-P7a ήταν 10 φορές υψηλότερη από εκείνη από AZ-521 κύτταρα? -2.5 Mg πρωτεΐνες λήφθηκαν από 1 × 10

8 κύτταρα AZ-P7a.

Α. Μορφολογικά χαρακτηρισμός εξωσωμάτων προέρχονται από AZ-P7a, AZ-521, και SBC-3 κυττάρων με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου. Β Immunoelectron μικρογραφίες της AZ-P7a Εξωσώματα επισημαίνονται με immunogold αντι-CD63. Εξωσώματα με μαύρο κολλοειδή σωματίδια χρυσού στις μεμβράνες κάψας παρατηρήθηκαν ως θετική CD 63 χρώση κάτω από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (αιχμές βελών). C. Μοριακός χαρακτηρισμός εξωσωμάτων προέρχονται από AZ-P7a, AZ-521, και SBC-3 κύτταρα με ανάλυση αποτύπωσης Western. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (10 μg) που παρασκευάστηκε από κύτταρα (C) ή εξωσώματα (Ex) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι πρωτεϊνικών δεικτών exosomal (CD29 /β1-ιντεγκρίνης, Aip1 /Alix, και Tsg101) και ένα ενδοπλασμικό δείκτη δίκτυο (Bip /Grp78).

Η

Εμπλουτισμός RNAs exosomal προέρχονται από κύτταρα AZ-P7a

Μετά την απομόνωση, exosomal σύνολο RNAs απομονώθηκαν από 46 καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές. Είναι ενδιαφέρον ότι, το RNA αποδόσεις από κύτταρα AZ-P7a ήταν πολύ μεγαλύτερες από εκείνες από τα άλλα κύτταρα (Σχήμα 2Α). Η κατανομή σε μήκος έδειξε την παρουσία μεγάλων ποσοτήτων μικρών RNAs σε εξωσώματα (κέντρο πάνελ, Σχήμα 2Β). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχει σημαντική διαφορά στη συνολική εξωσώματα και τα επίπεδα exosomal miRNA μεταξύ των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και τους ελέγχους [8]. AZ-P7a κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε με επανειλημμένη εμβολιασμό των γονικών κυττάρων AZ-521 σε ποντικούς, έδειξαν υψηλή περιτοναϊκή-μεταστατικού δυναμικού [32], [33]. Έτσι, οι υψηλές αποδόσεις και των δύο RNA και πρωτεΐνης μαζί με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά σε κύτταρα AZ-P7a μπορεί να αποδοθεί στην υψηλή ογκογόνο και μεταστατικό τάσεις τους. Δεδομένου ότι miRNAs έχουν ανιχνευθεί στα σωματικά υγρά άνευ κυττάρων [17] – [20], εκτελέσαμε επίσης άμεση απομόνωση των συνολικών RNAs από μέσο καλλιέργειας χωρίς διαδικασία απομόνωσης εξωσώματα. Τα ποσά των συνολικών RNAs από μέσα καλλιέργειας ήταν γενικά μεγαλύτερες από εκείνες από εξωσώματα (Σχήμα 2Α). διανομή RNA μήκους έδειξε ότι τα κλάσματα miRNA ανιχνεύθηκαν στην περιοχή από 10 έως 40 μήκος νουκλεοτιδίου σε RNAs που παρασκευάζεται από μέσο καλλιέργειας (δεξί πάνελ), καθώς και εξωσώματα (κεντρικό φύλλο) από κύτταρα AZ-P7a (Σχήμα 2Β). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για Bioanalyzer, κορυφές με περισσότερο από 40 νουκλεοτιδικές μήκος περιέχουν και άλλα μικρά RNAs συμπεριλαμβανομένων tRNAs στο 70-90, 5S ριβοσωμικό RNA στα 100, και 5.8S ριβοσωμικό RNA στα 150, όπως παρατηρείται στην ενδοκυτταρική κλάσμα (αριστερό πάνελ) . Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να υπάρχουν miRNAs στο μέσο καλλιέργειας εκτός της exosomal κλάσμα αν και οι RNAs πιστεύεται να προστατεύονται από ριβονουκλεάσες ως συσκευασμένα σε εξωσώματα. Ιδιαιτέρως, σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα, η αύξηση του RNA αποδόσεις ήταν αξιοσημείωτα μεγαλύτερη σε επιπλέοντα κύτταρα (NCI-Η69 και Lu-135) ή κύτταρα με πληθυσμούς μείγμα επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα (ΟοΙο205), που μπορεί να αντικατοπτρίζεται από τη μόλυνση του RNAs υπόστεγο από λυμένα κύτταρα που έχουν συνεχώς αριστερά στο μέσο καλλιέργειας.

Α. Τα ποσά των συνολικών RNAs που ανακτώνται από εξωσώματα (κάτω τμήμα) και μέσα καλλιέργειας (άνω πάνελ). Η ποσότητα του συνολικού RNA που ανά κύτταρο δείχθηκε. Β Κατανομή σε μήκος RNA. Απομονωμένο συνολικό RNA που από την εξωσώματα και μέσο καλλιέργειας των κυττάρων AZ-P7a ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Bioanalyzer. Το αποτέλεσμα της κυτταρικής συνολικής RNAs δείχθηκε για σύγκριση.

Η

miRNA προφίλ με microarray ανάλυση

προφίλ miRNA στα ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά κλάσματα προσδιορίστηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών για επτά καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων AZ-521, Α-Ω-P7a, SBC-3, NCI-Η69, DMS53, SW480 και SW620. Δείγματα από μέσο καλλιέργειας, καθώς και εξωσώματα προβλέπεται σήματα υβριδισμού (Σχήμα 3), υποδεικνύοντας την ύπαρξη miRNAs σε αυτά τα δείγματα. Μέχρι σήμερα, αναλύοντας τα δεδομένα μικροσυστοιχιών για miRNA μεταξύ των δειγμάτων, δεν υπάρχουν σαφείς μέθοδοι έχουν γίνει για την εξομάλυνση της έντασης του σήματος, δεδομένου ότι είναι δύσκολο να βρεθεί ένα κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο υλικό [34]. Έτσι, miRNA δεδομένων μικροσυστοιχιών έχουν σε γενικές γραμμές να αναλυθούν χωρίς κανονικοποίηση, υποθέτοντας ότι τα συνολικά ποσά των RNAs εισόδου είναι σταθερή μεταξύ των δειγμάτων [34], [35]. Σε αυτή τη μελέτη, μετά από κατά μέσο όρο δεδομένων μικροσυστοιχιών miRNA μεταξύ δύο επαναλήψεων, θα κατατάσσονται miRNAs σύμφωνα με εντάσεις σήματος τους. Βρήκαμε ότι ας-7 οικογένεια miRNA όπως ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, αφήστε-7δ, αφήστε-7ε, αφήστε-7F, αφήστε-7g, και αφήστε-7i ανιχνεύθηκαν με σχετικά υψηλά σήματα κατά το μεγαλύτερο μέρος των ενδοκυτταρικών κλάσματα από τις επτά κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1, Σχήμα 3). Ωστόσο, μικρή ή καθόλου εντάσεις σήματος για τα miRNAs ας-7 ανιχνεύθηκαν στα εξωκυτταρικά κλάσματα εκτός τόσο εξωκυτταρικά κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a και μέσο καλλιέργειας κλάσμα από κύτταρα ΝΟΙ-Η69 (Πίνακας 1, Σχήμα 3). Ιδιαίτερα, τόσο εξωκυτταρικά κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a, το σύνολο των οκτώ ας-7 miRNAs ανιχνεύθηκαν αν και η κατάταξη των αφήνω-7g ήταν χαμηλότερη από ό, τι άλλες επτά ας-7 miRNAs. Με βάση τα διαφορετικά πρότυπα ας-7 επίπεδα miRNA μεταξύ των τριών κυτταρικών κλασμάτων, διαιρέσαμε τα επτά κυτταρικές γραμμές σε τρεις ομάδες (Σχήμα 3) ως ακολούθως? (1) AZ-P7a, κύτταρα που ας-7 miRNAs βρέθηκαν σε όλα τα τρία κλάσματα, (2) AZ-521 μαζί με το SBC-3, DMS53, SW480 και SW620, κύτταρα που ας-7 miRNAs ήταν γενικά βρίσκεται σε μόνο ενδοκυτταρική κλάσματα, (3) ΝΟΙ-Η69, κύτταρα που ας-7 miRNAs βρέθηκαν στα ενδοκυττάρια κλάσματα καθώς και στο μέσο καλλιέργειας σε κάποιο βαθμό.

προφίλ miRNA σε κύτταρα (C), εξωσώματα ( ex), και μέσα καλλιέργειας (CM) ελήφθησαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA. άξονας Υ αντιπροσωπεύει ημερολόγιο

2 σημάτων υβριδισμού, φαίνεται από τα μπαρ και τα γεμάτα κουτιά. Τα βέλη στην αριστερή πλευρά από την δέσμη των σημάτων αντιπροσωπεύουν σήματα που αντιστοιχούν σε αφήνω-7 οικογένεια miRNA συμπεριλαμβανομένων ας-7α (κόκκινο), αφήστε-7b (κίτρινο), αφήστε-7c (ανοιχτό πράσινο), αφήστε-7d (σκούρο πράσινο) ας-7ε (γαλάζιο του ουρανού), αφήστε-7f (μπλε), αφήστε-7g (μπλε), και αφήστε-7θ (μοβ).

Η

RT-PCR αναλύσεις της ενδοκυτταρικής και εξωκυττάριο ας-7 οικογένεια miRNA

Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ποσοτική RT-PCR για την οικογένεια οκτώ ας-7 miRNA για την επικύρωση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών. ας-7 miRNAs ανιχνεύθηκαν εύκολα στα ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a (Σχήμα 4Α) και ΑΖ-521 κύτταρα (Σχήμα 4Β). Τα επίπεδα ας-7 miRNAs ανά RNAs εισόδου ήταν γενικά υψηλότερες στα εξωκυττάρια κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a από ό, τι από την AZ-521 κύτταρα. Για την ομαλοποίηση των επιπέδων της miRNAs στόχου που λαμβάνεται με RT-PCR, U6 snRNA έχει γενικά χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Παρατηρήσαμε την παρουσία U6 snRNA σε όλα τα τρία κλάσματα από κύτταρα AZ-P7a και ΑΖ-521 κύτταρα (Σχήμα 4C) και στη συνέχεια συνέκριναν τα επίπεδα ας-7 miRNAs μεταξύ των αντίστοιχων κλασμάτων από αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Μετά την κανονικοποίηση, τα επίπεδα ας-7 miRNAs συμπεριλαμβανομένων ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, αφήστε-7δ, αφήστε-7ε, και αφήστε-7i τόσο στα κλάσματα εξωσωμάτων και μέσα καλλιέργειας από την AZ-521 κύτταρα χαμηλώνει σε σχέση με εκείνα από κύτταρα AZ-P7a. Αντιθέτως, δεν υπήρχε μεγάλη διαφορά στα επίπεδα της ενδοκυτταρικής ας-7 miRNAs. Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με το επίπεδο της exosomal ας-7a από κύτταρα AZ-P7a με εκείνα από άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων SBC-3, NCI-Η69, DMS53, SW480 και SW620, και διαπίστωσε ότι το επίπεδο αφήνω-7α μόνο από τα κύτταρα SW620 ήταν σχετικά κοντά (0,7 φορές) στο επίπεδο από τα κύτταρα AZ-P7a (Σχήμα 4Ε). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ενδοκυτταρική επίπεδο ας-7a από κύτταρα SW620 ήταν περίπου 3,5 φορές περισσότερο άφθονο από ότι από κύτταρα AZ-P7a. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, υποθέτουμε εντοπισμός του ας-7α στα κλάσματα των κυττάρων και εξωσωμάτων (Σχήμα 5), και διεξήχθη περαιτέρω ανάλυση. Ομαλοποιηθεί από τα επίπεδα U6, υπολογίσαμε σε σχέση με τα επίπεδα του ας-7α συσκευασμένα σε εξωσώματα σύμφωνα με τα επίπεδα του κυτταρικού ας-7α (Σχήμα 4F). Ως αποτέλεσμα, το ποσό των exosomal ας-7α ήταν πολύ μεγαλύτερη στα κύτταρα AZ-P7a από ό, τι άλλες έξι κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα AZ-P7a ήταν επιλεκτικά και ενεργά εκκρίνεται ας-7 οικογένεια miRNA στον εξωκυττάριο περιβάλλον μέσω εξωσώματα.

Α, Β Επίπεδα της ώριμης ας-7 οικογένεια miRNA συμπεριλαμβανομένων ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, αφήστε-7δ, αφήστε-7ε, αφήστε-7F, αφήστε-7g, και αφήστε-7i στα κύτταρα (σκιασμένες ράβδοι), εξωσώματα (γεμάτες ράβδοι), και το μέσο καλλιέργειας (ανοικτές ράβδοι) από κύτταρα AZ-P7a (Α) και ΑΖ-521 κύτταρα (Β). Κάθε επίπεδο miRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Η τιμή κατωφλίου κύκλου (Ct) παρουσιάζεται ως η μέση ± SD (η = 4). C. Επίπεδα U6 snRNA σε κύτταρα (σκιασμένες ράβδοι), εξωσώματα (γεμάτες ράβδοι), και το μέσο καλλιέργειας (ανοικτές ράβδοι) από AZ-P7a και AZ-521 κύτταρα ανιχνεύονται με ποσοτική ανάλυση RT-PCR. Η τιμή κατωφλίου κύκλου (Ct) παρουσιάζεται ως η μέση ± SD (η = 4). Δ Σχετικές ποσότητες ας-7 οικογένεια miRNA σε κύτταρα (σκιασμένες ράβδοι), εξωσώματα (γεμάτες ράβδοι), και το μέσο καλλιέργειας (ανοικτές ράβδοι) από AZ-521 κυττάρων έναντι κυττάρων AZ-P7a. Η διακεκομμένη γραμμή και το βέλος αντιπροσωπεύει τα επίπεδα ας-7 οικογένεια miRNA σε κύτταρα AZ-P7a, εμφανίζεται ως 100%. Τα επίπεδα του U6 snRNA σε κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικό πρότυπο για την ομαλοποίηση ποσότητες ας-7 miRNAs. Εκτός ας-7f και αφήστε-7g, τα επίπεδα ας-7 miRNAs μειώθηκαν στα εξωκυττάρια κλάσματα. Ε Σχετική ποσότητες ας-7α στα κύτταρα (σκιασμένες στήλες) και εξωσώματα (γεμάτο μπαρ) από τις 7 καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων AZ-P7a, AZ-521, NCI-Η69, SBC-3, DMS53, SW480 και SW620 κυττάρων. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τα επίπεδα σε κύτταρα AZ-P7a, δείχνεται ως 1. Τα επίπεδα U6 snRNA σε κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για κανονικοποιημένες ποσότητες ας-7α. Η αξία των φορές αλλαγή παρουσιάζεται ως η μέση τιμή ± SD (η = 3) από τα δείγματα ανεξάρτητα παρασκευάστηκε από καλλιέργεια κυττάρων. F. Σχετικές ποσότητες exosomal ας-7a σε 7 καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει το επίπεδο στα κύτταρα AZ-P7a, εμφανίζεται ως 100%.

Η

Με βάση τα αποτελέσματα που προέκυψαν από μικροσυστοιχιών και RT-PCR αναλύσεις, συντάχθηκαν αυτά τα μοντέλα. Σε σύγκριση μεταξύ των κυττάρων AZ-P7a (αριστερά) και AZ-521cells (κέντρο), κανονικοποιημένη από το ποσό των U6 snRNA (ανοιχτά τρίγωνα), το ποσό της exosomal ας-7α miRNA (γεμάτα τρίγωνα) στην AZ-521 κύτταρα ήταν περίπου 3 % του ότι σε κύτταρα AZ-P7a ενώ η ενδοκυτταρική ποσό AZ-521 κύτταρα ήταν μάλλον 1,4 φορές μεγαλύτερη από ότι στα κύτταρα AZ-P7a (Σχήμα 4Ε). Τα μοντέλα αυτά εφαρμόζονται σε έξι από τις οκτώ ας-7 οικογένεια miRNA δοκιμαστεί, συμπεριλαμβανομένων ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, αφήστε-7δ, αφήστε-7ε, και αφήστε-7i. Σε SW620 κύτταρα (δεξιά), το ποσό της ας-7α ήταν 3,5 φορές μεγαλύτερη από ότι στα κύτταρα AZ-P7a ενώ το ποσό της exosomal ας-7α ήταν 0,7 φορές λιγότερο από ό, τι στα κύτταρα AZ-P7a (Σχήμα 4Ε).

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, αποκάλυψε ότι ας-7 οικογένεια miRNA εκκρίνεται στον εξωκυττάριο περιβάλλον μέσω μεταφοράς exosomal, η οποία ήταν ειδική για ένα μεταστατικό γαστρικό καρκίνο κυτταρική σειρά, AZ-P7a . ας-7 miRNA οικογένεια στην ανθρώπινη αποτελείται από 10 σειρές από 13 πρόδρομες ουσίες [30]. Σε γενικές γραμμές, ας-7 miRNAs δρα ως καταστολέας των όγκων από ογκογονίδια στόχευσης, όπως

RAS

και

HMGA2

και αφήστε-7 miRNAs προς τα κάτω σε πολλούς καρκίνους από συμπαγή όργανα [31]. κύτταρα AZ-P7a διαθέτουν ένα μεταστατική ικανότητα με περιτοναϊκή διάχυση σε γυμνά ποντίκια [32], [33]. Έτσι, προτείνουμε ότι η απελευθέρωση exosomal της ας-7 miRNAs στον εξωκυττάριο περιβάλλον οδηγεί σε μείωση των αντι-ογκογόνο δράση μέσα στα κύτταρα, τα οποία οδηγούν στη διατήρηση ογκογένεση και εισβολής τους. Από την άλλη πλευρά, ας-7 miRNAs λιγότερο συχνά παίζουν ογκογόνο λειτουργία, λόγω της αύξησης της έκφρασης από υπομεθυλίωσης στον τόπο ας-7 [36] ή στόχευση κασπάσης-3 mRNA [37]. Σε αυτήν την περίπτωση, η απελευθέρωση exosomal της ας-7 miRNAs μπορεί να προκαλέσει μετασχηματισμό στα κύτταρα-στόχους, μεταφέροντας ογκογόνο τους ιδιότητες.

Σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, τα συνολικά επίπεδα εξωσωμάτων και miRNAs τους να αυξάνονται σε σύγκριση με ελέγχους [8 ]. Έχει αποδειχθεί ότι εξωσώματα όγκου επάγει ανοσολογική μηχανισμός διαφυγής σε καρκίνους με αυτόματη απόπτωση των κυττάρων Τ [38] – [40]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ομογενή μορφολογία και τον εμπλουτισμό των RNAs σε εξωσωμάτων από μεταστατικά κύτταρα AZ-P7a. Αυτό μπορεί να αντανακλάται από την γένεσιν όγκων τους.

miRNAs είναι πολύ σταθερά στο πλάσμα αίματος και ορό επειδή προστατεύεται από ριβονουκλεάσες [17]. Έτσι, κάνει τα επίπεδα miRNA δοκιμάστηκαν για την κλινική διάγνωση ως δείκτες όγκου και βιοδείκτες. Πώς γίνεται αυτό; Chin et al. έχουν προταθεί δύο υποθέσεις για την πηγή των miRNAs στην κυκλοφορεί δείγματα αίματος? αυτό μπορεί να οφείλεται σε ένα αποτέλεσμα το θάνατο και λύει κυττάρου όγκου ή απελευθέρωση από τα καρκινικά κύτταρα στο εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον των αιμοφόρων αγγείων [19]. Σε αντίθεση με προσκολλημένα κύτταρα, παρατηρήσαμε ότι τα ποσά των συνολικών RNAs σε μέσα καλλιέργειας ήταν σχετικά υψηλότερη από ό, τι σε εξωσώματα για κύτταρα με κυμαινόμενο ακινήτων, όπως ΝΟΙ-Η69, Lu-135, και ΟοΙο205. Αυτή η αύξηση κατά πάσα πιθανότητα ως αποτέλεσμα τη μόλυνση των RNAs από τα νεκρά κύτταρα στα μέσα καλλιέργειας.

Για την ανακάλυψη νέων καρκινικών δεικτών στο αίμα και βιοδείκτες, omics προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένων είναι πρωτεομική και transcriptomics διεξάγεται είτε με απ ‘ευθείας ανάλυση των δειγμάτων αίματος ή την εφαρμογή των προφίλ σε δείγματα ιστών. Υπάρχουν αντικρουόμενες αναφορές στην περίπτωση κατά πόσον τα προφίλ των miRNA και mRNAs στην κυκλοφορία του αίματος είναι παράλληλα με το προφίλ του όγκου. Η υπογραφή των miRNAs exosomal βαθμό με εκείνη των καταγόμενων καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [8] και του καρκίνου του μαστού [41]. Από την άλλη πλευρά, Skog et al. έχουν δείξει ότι η ανάλυση μικροσυστοιχιών για mRNA που προέρχεται από κύτταρα γλοιοβλαστώματος και των αντίστοιχων εξωσώματα αποκάλυψε mRNAs ανιχνεύονται αποκλειστικά σε μικροκυστίδια, εικάζουν ότι τα mRNA εντοπίζεται σε μία συγκεκριμένη περιοχή του κυτταροπλάσματος [3]. Επιπλέον, Tanaka et al. έχουν αποδείξει ότι το επίπεδο του miR-92a μειώθηκε στο πλάσμα του αίματος των ασθενών με οξεία λευχαιμία, ενώ ισχυρή έκφραση του βρέθηκε στα δείγματα των ιστών [24]. Τα αποτελέσματά μας για επιλεκτικό εμπλουτισμό ας-7 οικογένεια miRNA στην AZ-P7a κύτταρα που προέρχονται από εξωσώματα ταιριάζει με την τελευταία περίπτωση. Εκτός εάν τα μόρια στόχοι είναι miRNAs προέρχονται από κυκλοφορούντα κύτταρα όγκου, προτείνει προσεκτική έρευνα είναι αναγκαία για τη χρήση προφίλ miRNA σε δείγματα ιστού για την ανίχνευση σε δείγματα ορού ή πλάσματος.

Επειδή τα εξωσώματα παράγονται σε αιμοποιητικά κύτταρα καθώς και τα επιθηλιακά κύτταρα , κυκλοφορούν αίμα περιέχει εξωσώματα προέρχονται τόσο από τον τύπο των κυττάρων. Σε γενικές γραμμές, για να διερευνήσει τα προφίλ exosomal πρωτεϊνών, mRNA, και miRNAs στον ορό και το πλάσμα, τα εξωσώματα προέρχονται από όγκους με επιθηλιακά χαρακτηριστικά διαχωρίζονται από εκείνα από αιμοποιητικά κύτταρα [8], [13]. Αυτό γίνεται χρησιμοποιώντας καθαρισμό συγγενείας με αντισώματα κατά των μορίων όπως EpCAM που εκφράζουν στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων. Τα ευρήματά μας ότι υπήρχαν παρόμοια επίπεδα ας-7 οικογένεια miRNA μεταξύ εξωσώματα και μέσα καλλιέργειας από τα κύτταρα-Ω-P7a δείχνουν ότι τα επίπεδα αυτά miRNA μπορεί να μετρηθεί χωρίς απομόνωση εξωσωμάτων από κλινικά δείγματα όπως ο ορός και το πλάσμα.

Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη απέδειξε ότι ας-7 οικογένεια miRNA είναι πλούσια σε εξωσώματα από ένα μεταστατικό γαστρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, κύτταρα AZ-P7a. Δεδομένου ότι οι ας-7 miRNAs που εμπλέκονται στη διαδικασία της διάδοσης [31], η έκκριση exosomal τους μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του στομάχου (ΑΖ-521, ΜΚΝ45, KATOIII, και NUGC-3) ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα (SBC-3, Lu-65, Lu-135, και KNS-62), και ( κοστούμι-2) αγοράστηκαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας βιολογικών πόρων. Ανθρώπινο στομάχι καρκινικά κύτταρα (SNU-1), κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα (DMS-53, DMS114, ΝΟΙ-Η69, Α549, ΝΟΙ-Η1299, ΝΟΙ-H1155, NCI-H520, ΝΟΙ-H1560, SK-MES-1, και HCC827), ανθρώπινο μεσοθηλιώματος κύτταρα (MSTO-H211), ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (SW480, SW620, ΟοΙο205, LoVo, και HCT116, τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (BxPC-3, AsPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, ΗΡΑΡ-ΙΙ, PL45, και Capan-2), κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου προστάτη (PC-3, SU145, και LNCaP) και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (Τ-47ϋ, MCF7, SK-BR-3, ΒΤ -474, και ΜϋΑ-ΜΒ-231) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. ΜΚΝ28 (ανθρώπινο στομάχι καρκινικών κυττάρων) και PSN-1 (ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος) αγοράστηκαν από την Immuno-Biological Laboratories και Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων, αντίστοιχα . Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του στομάχου, AZ-P7a [32], [33] και MKN45P [42] ήταν δώρο από τον Δρ. Yutaka Yonemura και Yoshio Endo. Σε κύτταρα AZ-521 και AZ-P7a, δεν παρατηρήθηκαν RT-PCR προϊόντα για 14 ρετροϊούς συμπεριλαμβανομένου HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2 και ADV τύπου 1 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), με εξαίρεση τη μόλυνση από αυτούς τους ρετροϊούς και στις δύο κυτταρικές σειρές . Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen), 100 U /ml πενικιλλίνη, και 0,1 mg /ml στρεπτομυκίνης.

Παραγωγή και απομόνωση εξωσωμάτων

τα προσκολλημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 150 mm-πιάτα στο κατάλληλο αριθμό κυττάρων που κυμαίνεται από 3 × 10

6 έως 1 × 10

7 κύτταρα ανά δίσκο, ενώ επιπλέει κύτταρα εμβολιάστηκαν σε 75 cm

2-φιάλη στους 2~2.5 × 10

7 κύτταρα ανά φιάλη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες RPMI-1640 από 25 ml και 50 ml για τα πιάτα και φιάλες, αντίστοιχα, για 24 ώρες στους 37 ° C και 5% του CO

2, πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και επωάστηκαν 48 ώρες σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) που περιέχει 10% θερμο-αδρανοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό που είχε προηγουμένως εξαντληθεί μολυσματικά μικροκυστίδια με ολονύκτια φυγοκέντρηση στα 100.000 χ g. Τα εξωσώματα απομονώθηκαν από τα ολικά κύτταρα που κυμαίνονται από 6 × 10

7 σε 3 × 10

8 κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Εν συντομία, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 800 χ g για 5 λεπτά και επιπλέον 2.000 χ g για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν αρθεί κύτταρα. Το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε διήθηση σε φίλτρο μεμβράνης πολυαιθεροσουλφόνης 0,1 μm πόρου (Corning) για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και μεγάλα κυστίδια, που ακολουθείται από συμπύκνωση με 100.000 Mw μεμβράνη αποκοπής (Centriplus-70, Millipore). Ο όγκος του υπερκειμένου μειώθηκε από περίπου 250-500 ml έως περίπου 30 ml. Το υπερκείμενο στη συνέχεια υπερφυγοκεντρήθηκε στα 100.000 χ g για 1 ώρα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας 70Ti δρομέα (Beckman Coulter). Τα προκύπτοντα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 6 ml PBS και υπερφυγοκεντρήθηκε στα 100.000 χ g για 1 ώρα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας 100Ti ρότορα (Beckman Coulter).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα σφαιροποιήθηκαν εξωσώματα αναμίχθηκαν με ίσες ποσότητες από πρόσφατα παρασκευασμένο 2% γλουταραλδεΰδη σε PBS, επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C, μετασταθεροποιήθηκε με 1% τετροξείδιο του οσμίου σε PBS στους 4 ° C για 2 ώρες, και αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης. Μετά την αφυδάτωση, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε οξείδιο του προπυλενίου και τα ενσωματωμένα σε εποξική ρητίνη Quetol 812 (Nisshin ΕΜ). Εξαιρετικά λεπτές τομές κόπηκαν με Ultracut UCT (LEICA), χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο, και παρατηρείται με το μικροσκόπιο JEM-1230 Electron (JEOL). Ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Xiao et al. [43] με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, εξωσώματα αναμίχθηκαν και επωάστηκαν με CD63 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου (αρ. Καταλόγου sc-51662, Santa Cruz) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το δείγμα είχε πέσει πάνω στην επιφάνεια της μεμβράνης ενός πλέγματος χαλκού (κολλόδιο /άνθρακα επικαλυμμένο 400 mesh, Nisshin ΕΜ) και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, immunogold συζευγμένου αντισώματος κατσίκας αντι-ποντικού IgG (αρ. Καταλόγου EM.GMHL15, BBInternational) αραιωμένο 1:20 προστέθηκε στάγδην επί της μεμβράνης. Το πλέγμα χαλκού εισήχθη στα σταγονίδια με επιφάνεια της μεμβράνης του στραμμένο προς τα κάτω σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS, ουρανύλιο σταγόνες οξικού τέθηκε επάνω στην επιφάνεια πλέγματος χαλκού και χρωματίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 s. Τα εξωσώματα με μαύρο σωματίδια κολλοειδούς χρυσού επί των μεμβρανών καψικό χαρακτηρίστηκαν ως θετικά κάτω από το μικροσκόπιο μετάδοσης ηλεκτρονίων.

Western ανάλυση κηλίδος

Cells και τα κλάσματα exosomal πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [7,5 M ουρία (Sigma-Aldrich), 2.5 Μ θειουρία (Sigma-Aldrich), 12,5% γλυκερίνη (Wako), 50 mM Tris, 2,5% η-οκτυλ-βήτα-ϋ-γλυκοζίτη (Sigma-Aldrich), 6.25 mM Tris (2- καρβοξυαιθυλο) υδροχλωρική φωσφίνη (Sigma-Aldrich), 1,25 αναστολέα πρωτεάσης mM (αρ. καταλόγου P2714, Sigma-Aldrich)], και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας το Rotator RT-50 (TAITEC). Μετά από φυγοκέντρηση στα 14.000 χ g για 60 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε από τον Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). Ένα τμήμα των πρωτεϊνών (10 μα) μετουσιώθηκαν με βρασμό σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli, τρέχει σε 10% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου, και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF Immobilon-Ρ (μέγεθος πόρων 0,45 μm, Millipore). Οι κηλίδες μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιείχε Tween 20 (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl και 0.01% Tween 20). Μετά τον αποκλεισμό των μεμβρανών επωάστηκαν με κάθε πρωτογενές αντίσωμα ή αντιορός συμπεριλαμβανομένων κουνελιού αντι-Tsg101 ορού (αρ. Καταλόγου T5951, Sigma-Aldrich), κατσίκα αντι-Aip1 ορού /Alix (αρ. Καταλόγου sc-49268, Santa Cruz), μονοκλωνικό ποντικού αντι-CD29 /β1-ιντεγκρίνης (αρ. καταλόγου sc-610 468, BD Biosciences), και μονοκλωνικό ποντικού αντι-Bip /Grp78 (αρ. καταλόγου 610979, BD Biosciences) σε αραίωση 1:200 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με το αντίστοιχο αντι-IgG δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Jackson Laboratories) σε αραίωση 1:2,000 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Συγκεκριμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL (GE Healthcare) και το FUJIFILM φθορισμού Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης συνάχθηκε χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη Precision Plus Προτύπων (Bio-Rad Laboratories).

Απομόνωση RNA

Για την απομόνωση του RNA από το μέσο καλλιέργειας, τα κύτταρα σπάρθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω.