Αφηρημένο

Σύμφωνα με τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) θεωρία, κακοήθεις όγκοι μπορεί να είναι ετερογενείς στην οποία ένας μικρός πληθυσμός των ΚΕΠ οδηγεί την εξέλιξη του καρκίνου. Λόγω των εγγενών ικανοτήτων τους, ΚΕΠ μπορεί να επιβιώσει μια ποικιλία από θεραπείες και στη συνέχεια να οδηγήσει σε θεραπευτικές αντίσταση και υποτροπή του καρκίνου. Οι παγκρέατος ΚΕΠ έχει αναφερθεί ότι είναι υπεύθυνος για τα κακοήθη συμπεριφορές του καρκίνου του παγκρέατος, συμπεριλαμβανομένης της καταστολής του ανοσοποιητικού προστασίας. Έτσι, η ανάπτυξη του ανοσοποιητικού στρατηγικών για την εξάλειψη του παγκρέατος ΚΕΠ μπορεί να έχει μεγάλη αξία για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Σε αυτή τη μελέτη, εμπλουτισμένο παγκρεατική ΚΕΠ καλλιεργώντας κύτταρα Panc-1 κάτω από συνθήκες σχηματισμού σφαίρας. Panc-1 ΚΕΠ εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα του HLA-ABC και CD86, όπως μετράται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Βρήκαμε επίσης ότι τα ΚΕΠ Panc-1 ρυθμίζει την ασυλία από την αναστολή του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων που προωθείται από φυτοαιμοσυγκολλητίνη (PHA) και-CD3 αντι μονοκλωνικά αντισώματα. Τα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μονοκύτταρα (DCS) έχουν επιβαρυνθεί με συνολική λύματα που παράγονται από Panc-1 ΚΕΠ που λαμβάνεται από τη σφαίρα του όγκου καλλιέργειας. Μετά από συν-καλλιέργεια με λεμφοκύτταρα, σε διαφορετικές αναλογίες, οι Panc-1 ΚΕΠ λύματα τροποποιημένο DC προωθηθούν αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων. Η αποτελεσματικότητα ενεργοποίησης έφθασε 72,4% και 74,7% στις αναλογίες 1:10 και 1:20 με τα λεμφοκύτταρα. Τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα εκκρίνονται υψηλά επίπεδα ΙΝΡ-γ και IL-2, τα οποία είναι ισχυρή αντικαρκινική κυτοκίνες. Επιπλέον, Panc-1 ΚΕΠ κυτταρολύματα τροποποιημένο DC επάγονται σημαντικά κυτταροτοξικά αποτελέσματα των λεμφοκυττάρων επί Panc-1 ΚΕΠ και γονικά κύτταρα Panc-1, αντίστοιχα, όπως φαίνεται από γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) δοκιμασίας. Η μελέτη μας δείχνει ότι η ανάπτυξη του εμβολίου ΚΕΠ με βάση αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την αντιμετώπιση του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Yin Τ, Shi P, Gou S, Shen Q, Γουάνγκ C (2014) δενδριτικά κύτταρα φορτωμένα με παγκρέατος καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) Κυτταρολύματα Προκαλέστε κατά του όγκου του ανοσοποιητικού Killing δράση in vitro. PLoS ONE 9 (12): e114581. doi: 10.1371 /journal.pone.0114581

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 11, Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Yin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30801100)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες κακοήθειες του πεπτικού συστήματος, η οποία κατατάσσεται ως η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στις ανεπτυγμένες χώρες. Τα τελευταία χρόνια, η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παγκρέατος και του σχετικού θανάτου αυξάνεται σταθερά στις αναπτυσσόμενες χώρες, ενώ η πρόγνωση των περισσότερων ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος δεν βελτίωσε τα τελευταία τριάντα χρόνια. Η πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος χάσει ευκαιρία για χειρουργική εκτομή, λόγω του γεγονότος της προχωρημένο στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση, και εγγενή ή επίκτητη ανθεκτικότητα σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, η οποία είναι ένα τυπικό χαρακτηριστικό των παγκρεατικού καρκίνου [1]. Έτσι, είναι επείγον να διερευνήσει νέες στρατηγικές στοχευμένες παρεμβάσεις για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι ένα υποπληθυσμό των νεοπλασματικών κυττάρων που έχουν ισχυρές ικανότητες αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης στην οδήγηση καρκινογένεση και την εξέλιξη της Καρκίνος. Πρόσφατα, η CD44 + CD24 + ESA + παγκρεατικών ΚΕΠ έχουν επιβεβαιωθεί ότι έχουν αυξημένη ογκογόνο δυναμικό, και είναι υπεύθυνα για την κακοήθη συμπεριφορά του καρκίνου του παγκρέατος. [2] Πλήρης εκριζωτικά αυτών ΚΕΠ μπορούν να παρέχουν ελπίδα ως μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Ωστόσο, αντι-αποπτωτική ικανότητα είναι ένα από τα εξέχοντα χαρακτηριστικά για ΚΕΠ σε πολλούς τύπους όγκων, με αποτέλεσμα την αναποτελεσματική θανάτωση σε πρότυπο χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [3] – [4]. Οι απομεινάρι ΚΕΠ μπορεί να αποτελέσει την προέλευση της υποτροπής και η πηγή της αποτυχίας της θεραπείας.

ανοσοθεραπεία του καρκίνου ενεργοποιεί αντικαρκινική ανοσολογικές αποκρίσεις του ασθενούς να απορρίψει κακοήθη καρκινικά κύτταρα. ΚΕΠ εκφράζουν ορισμένες βιοδείκτες που έχουν διακριτά αντιγονικότητα, οι οποίες μπορεί να προκαλέσουν ειδικές ανοσοαποκρίσεις [5] – [6]. έχουν ΚΕΠ δειχθεί να αναγνωριστούν και να εξαλειφθούν από τα κύτταρα CD8 + κυτταρολυτικών Τ [7]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η εγγενής ανοσία κατά ΚΕΠ μπορεί να υπαγορεύσει πορεία εξέλιξης του καρκίνου [6]. Έτσι, είναι μια ελκυστική στρατηγική για την επαγωγή ανοσοαποκρίσεων έναντι του παγκρέατος ΚΕΠ για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. DCs είναι ισχυροί αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και παίζουν κεντρικό ρόλο στην επαγωγή πρωτογενών ανοσοαποκρίσεων έναντι αντιγόνων που σχετίζονται με όγκους. Ένας αριθμός στρατηγικών έχουν αναπτυχθεί για να τροποποιήσει DCs με ειδικά αντιγόνα του όγκου για να δημιουργήσει αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις. Ασθενής με όγκο αντιγόνο-τροποποιημένο εμβόλιο DC μπορεί να προκαλέσει ισχυρές αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις in vitro και in vivo [8]. Σε αυτή τη μελέτη, τροποποιήσαμε ΑΧ με παγκρεατικά αντιγόνο ΚΕΠ, και διερευνήθηκε η επίδραση δολοφονία ανοσολογική απόκριση στο CSC-DC για παγκρέατος ΚΕΠ in vitro.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η χρήση των ανθρώπινων υποκειμένων είχε εγκριθεί ειδικά από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του νοσοκομείου Ένωσης, Tongji Medical College, HUST. Τα δείγματα αίματος ελήφθησαν από υγιείς δότες. Όλοι οι εθελοντές γνώριζαν και συμφώνησαν ότι το αίμα επρόκειτο να χρησιμοποιηθεί για την επιστημονική έρευνα. Όλοι οι συμμετέχοντες υπέγραψαν μια γραπτή έντυπο συγκατάθεσης πριν από την αιμοδοσία του αίματος.

καλλιέργειας κυττάρων

Το παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά Panc-1 καλλιεργήθηκε σε Dulbecco Modified Eagle Medium εμπλουτισμένο με 10% ορό εμβρύου βοός ( Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 U /ml) στους 37 ° C με επωαστήρα 5% CO

2. Η προϋπόθεση για καλλιέργεια παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να σχηματίσουν σφαίρες όγκου σε εναιώρημα περιγράφεται προηγουμένως [9]. Εν συντομία, τα ενζυματικά διασπασμένα μονά κύτταρα αραιώθηκαν σε πυκνότητα 10

3 κύτταρα /ml σε μέσο σχηματισμού σφαίρας (SFM). Τα κύτταρα περάστηκαν κάθε 10 έως 14 ημέρες και απλώνονται εκ νέου σε SFM. Τα σφαιρικά συστάδες κυττάρων που αναπτύσσονται σε αυτή την κατάσταση ονομάστηκαν Panc-1 ΚΕΠ. SFM που χρησιμοποιήθηκε ήταν DMEM-F12 συμπληρωμένου με 10 ng /mL αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-βασικά (Peprotech), 20 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Peprotech), 5 μg /ml ινσουλίνη, 2.75 μg /ml τρανσφερίνη, 2,5 ng /mL σεληνικό νάτριο (Sigma) και 0,4% αλβουμίνη βόειου ορού (Amresco).

Παρασκευή λύματος κυττάρου όγκου

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Panc-1 σφαίρα, Panc-1) επωάστηκαν με 0,01% EDTA -διάλυμα για 5 λεπτά. Μετά από πλύσιμο δύο φορές σε PBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού. Τα εναιωρήματα κυττάρων καταψύχθηκαν στους -80 ° C και αποψύχθηκε από τέσσερις κύκλους ψύξης-απόψυξης. Μετά την απομάκρυνση του ακάθαρτου συντρίμμια, τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 300 g βαρύτητα. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των προϊόντων λύσης προσδιορίστηκε με δοκιμασία Bio-Rad (Bio-Rad, Munich, Germany).

Παρασκευή παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα λύματα τροποποιημένα DC

Περιφερειακά μονοπύρηνα αίματος κύτταρα (PBMCs) από δύο υγιείς δότες απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση πυκνότητας Ficoll-κλίση. Τα PBMCs καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που παρέχεται με 10% ορό στις πλάκες καλλιέργειας για προσκόλληση σε 37 ° C με 5% CO

2 για δύο ώρες. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 10 U /ml IL-2 για την περαιτέρω παραγωγή του πληθυσμού λεμφοκυττάρων. Τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν παρουσία GM-CSF (Genzyme, 100 ng /ml) και IL-4 (Genzyme, 100 ng /ml) για 6 ημέρες στους 37 ° C, 5% CO2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με προϊόντα λύσης των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων (σφαίρα PANC1 και Panc-1) σε μία συγκέντρωση των 100 μg για κάθε 2 × 10

5 DCs για 24 ώρες. Στη συνέχεια, DC ενεργοποιήθηκαν με ΤΝΡ-α (20 ng /ml) για 24 ώρες.

Immunologic φαινοτυπική ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση των ανοσολογικών φαινοτύπους όγκου και δενδριτικά κύτταρα. Τα αντισώματα περιλαμβάνουν αντι-HLA-DR-FITC, αντι-HLA-ABC-FITC, αντι-HLA-DQ-ΡΕ, αντι-CD80-FITC, αντι-CD54-FITC, αντι-CD1a-FITC και αντι-CD86-ΡΕ , (eBioscience). FITC-IgG και ΡΕ-IgG χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. Για τη χρώση, 5 × 10

5 κύτταρα απλώθηκαν στο 96 φρεατίων U πλάκα (Corning, USA) και επωάζονται με 5 μΙ από κάθε αντίσωμα σε 4 ° C για 30 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 1000 g βαρύτητα για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με 300 μΐ PBS και υποβάλλονται σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Αναστολή της παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε πολλαπλασιασμό λεμφοκυττάρων

Panc-1 ΚΕΠ συλλέχθηκαν ως διεγερτικά κύτταρα. Αφού προεπεξεργασία με μιτομυκίνη C (25 μg /ml), τα διεγερτικά κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με το 1 × 10

6 /ml μη προσκολλημένα λεμφοκυττάρων (αντιδραστήρες) σε αναλογία 1:10 σε παρουσία ΡΗΑ (Sigma) ή αντι-CD3 μονοκλωνικά αντισώματα (ΟΚΤ3, eBioscience). Στη συνέχεια, 20 μΙ 5 μg /μl του 3- (4, 5-dim ethylthiazol-2-υλ) -2, 5- διφαινυλο- 2Η – τετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση για 4 ώρες, το υπερκείμενο αντικαταστάθηκε με 150 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (Sigma). Η απορρόφηση (Α) μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Ο σχετικός ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων υπολογίστηκε ως εξής: (Α-Β) /(C + D) × 100%. (Α) ομάδα πείραμα: Panc-1 ΚΕΠ + λεμφοκυττάρων + PHA /ΟΚΤ3? (Β) θετικός μάρτυρας: λεμφοκυττάρων + PHA /ΟΚΤ3? (C) μάρτυρα: Panc-1 ΚΕΠ + PHA /ΟΚΤ3. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Ενεργοποίηση επίδραση του Panc-1 ΚΕΠ τροποποιημένο DC επί του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων

Για να διερευνηθεί η ικανότητα του Panc-1 ΚΕΠ τροποποιημένο DC για την ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων, διαφορετικών ομάδες της DC (Panc-1 CSC-DC, DC) συλλέχθηκαν ως διεγερτικά κύτταρα. Μετά από προ-θεραπεία με μιτομυκίνη C (25 μg /mL, Roche), τα διεγερτικά κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με 1 χ 10

6 /ml αλλογενή μη προσκολλημένα λεμφοκυττάρων (αντιδραστήρες) σε πλάκες 96 φρεατίων σε αναλογίες που κυμαίνονται από 1: 10 έως 1:20 και ήταν καλλιέργειας στους 37 ° C, 5% CO

2 για 96 ώρες. Τα λεμφοκύτταρα που καλλιεργήθηκε μόνος του χωρίς να διεγείρει ορίστηκαν ως μάρτυρες. Στη συνέχεια, 20 μΐ 5 μg /μl του 3- (4, 5-dim ethylthiazol-2-υλ) -2, 5- διφαινυλο- 2Η – τετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση για 4 ώρες, τα υπερκείμενα αντικαθίστανται με 150 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (Sigma). Η απορρόφηση (Α) μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Ο σχετικός αριθμός των λεμφοκυττάρων μετά από ενεργοποίηση υπολογίστηκε ως: ένα πείραμα /A έλεγχος χ 100%. Ο ρυθμός του πολλαπλασιασμού των κυττάρων υπολογίστηκε ως: (Α πείραμα-μάρτυρας) /Ενας έλεγχος χ 100%. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ανίχνευσης κυτοκίνης με Elisa δοκιμασία

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα διέγερσης των δενδριτικών κυττάρων για την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων, τα υπερκείμενα της λεμφοκυττάρων συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την διεγερμένα με DC , και οι συγκεντρώσεις των IFN-γ, IL-2, IL-10 μετρήθηκαν με κιτ ELISA από την R & amp? D σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τη χρήση ενός φασματοφωτομέτρου μικροπλάκας. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Οι Panc-1 ΚΕΠ λύματα τροποποιημένα DC και οι πρωτόγονες δενδριτικά κύτταρα (1 χ 10

5 /ml) καλλιεργήθηκαν σε αναλογία 1:10 με λεμφοκυττάρων για 5 ημέρες. Τα μη-προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν ως τελεστές κύτταρα. Τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 12 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 /ml η κάθε μία. Οι τελεστές κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε διαφορετική αναλογία επί 20 ώρες σε 37 ° C, 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Το υπερκείμενο ελεύθερο κυττάρων συλλέχθηκε και αναλύθηκε με ένα κιτ μη ραδιενεργό απελευθέρωσης LDH σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστηριότητα LDH των τελεστών κυττάρων μόνο ανιχνεύθηκε ως μάρτυρες, και οι δραστηριότητες LDH σε διαφορετικές ομάδες αντίδρασης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου υπολογίστηκαν ως η κυτταροτοξικότητα των διαφόρων DCs. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο ± SD. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 18.0 λογισμικού. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

παγκρέατος ΚΕΠ του πολιτισμού και της σφαίρας που σχηματίζει

Οι ικανότητες σχηματισμού σφαίρας των καρκινικών κυττάρων σε μέσο ελεύθερο ορού έχουν χρησιμοποιηθεί από καιρό για να. εμπλουτισμό των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Η σχέση μεταξύ του σχηματισμού των ικανοτήτων σε μέσο ελεύθερο ορού σφαίρα και την ιδιότητα των βλαστικών κυττάρων του Panc-1 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα έχουν δοκιμαστεί σε προηγουμένως μελέτες μας [9], [10]. προκαταρκτικές μελέτες μας διαπίστωσαν ότι τα κύτταρα Panc-1 μπορεί να διαδοθεί για να σχηματίσουν σφαίρες με τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων. Επιπλέον, αυτά τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν έδειξε αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία και την αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης. Σε αυτή τη μελέτη, συλλέξαμε τα ΚΕΠ Panc-1 καλλιεργήθηκαν κάτω από μέσο χωρίς ορό για περαιτέρω μελέτη της ανοσολογικής στρατηγικής θανάτωσης (Εικ. 1).

Η

Η ανοσολογική φαινοτύπου των κυττάρων Panc-1 σφαίρα

Διαπιστώσαμε την έκφραση της ανοσολογικής μορίων για Panc-1 σφαίρα με μεθόδους FACS. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, Panc-1 σφαίρα εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα του HLA-ABC και CD80 σε σύγκριση με κύτταρα Panc-1. Εμείς δεν βρήκε καμία διαφορά μεταξύ Panc-1 και Panc-1 σφαίρες σχετικά με άλλες ανοσοποιητικό μοριακών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων HLA-DR, HLA-DQ, CD86, και CD1a. Η χαμηλή έκφραση του ανοσοποιητικού μοριακών δεικτών επί Panc-1 σφαίρα υποδεικνύει ότι η χαμηλή ικανότητα διέγερσης του ΚΕΠ στο ανοσοποιητικό σύστημα.

Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα ανάλυση FCM έδειξε ότι MHC Ι και CD80 ήταν ταπεινός εκφράζονται σε Panc-1 ΚΕΠ σύγκριση με κύτταρα Panc-1. Δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές για άλλες ανοσοποιητικό μόρια συμπεριλαμβανομένων των CD86, HLA-DR, HLA-DQ, CD86, και CD1a. Η έκφραση των CD80 και HLA-ABC επί Panc-1 ΚΕΠ φαίνονται με συνεχή γραμμή. Η έκφραση των CD80 και HLA-ABC σε κύτταρα Panc-1 δείχνονται με διακεκομμένη γραμμή

Η

Επίδραση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων επί του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων

ΚΕΠ έχουν αναφερθεί ότι διαμορφώνουν ανοσοποιητικό και να προκαλεί ανοσοκαταστολή μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Για να προσδιοριστεί εάν παγκρεατικών ΚΕΠ ρυθμίζουν την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων, τα αποτελέσματα των Panc-1 ΚΕΠ επί του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων προωθείται από ΡΗΑ ή αντι-CD3 μονοκλωνικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Panc-1 σφαίρες συν-καλλιεργήθηκαν με λεμφοκυττάρων. ΡΗΑ ή αντι-CD3 μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων που ενεργοποιούνται από ΡΗΑ ή αντι-CD3 μονοκλωνικά αντισώματα ανεστάλη με την παρουσία της παγκρεατικής ΚΕΠ σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 3).

Τα λεμφοκύτταρα διεγέρθηκαν να πολλαπλασιάζονται με ΡΗΑ ή αντι CD3 μονοκλωνικά αντισώματα. Panc-1 ΚΕΠ συν-καλλιεργήθηκαν με λεμφοκυττάρων σε αναλογία 1:10 σε παρουσία ΡΗΑ ή CD3-αντι μονοκλωνικά αντισώματα. Τα λεμφοκύτταρα διεγερμένα με ΡΗΑ ή CD3-αντι μονοκλωνικά αντισώματα αποκλειστικά ορίστηκαν ως έλεγχος. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων που προωθούνται από ΡΗΑ ή αντι-CD3 μονοκλωνικά αντισώματα ανεστάλη παρουσία Panc-1 ΚΕΠ.

Η

Η τόνωση ικανότητα των κυτταρολυμάτων ΚΕΠ τροποποιημένων DC επί του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων

για να προσδιοριστεί η επίδραση των προϊόντων λύσης ΚΕΠ τροποποιημένων-DC επί του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων, διαφορετικό ποσοστό των DC (Panc-1 CSC DC και πρωτόγονα DC) συν-καλλιεργήθηκαν με λεμφοκύτταρα. Οι ενεργοποιώντας αποτελέσματα διαφορετικών DC επί του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων αποδεικνύεται από τη μέθοδο ΜΤΤ. Ο πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων αποδείχθηκε με την τήρηση σε OD570 nm. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, DC φορτωμένο με λύματα Παγκρέατος ΚΕΠ προκάλεσε ισχυρό πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων, (Εικ. 4Α). Η ενεργοποίηση επίδραση διαφορετικών DC σε λεμφοκύτταρα μπορεί να αντικατοπτρίζεται με ρυθμό πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων, και η επίδραση ενεργοποίησης των Panc-1 κυτταρολύματα σφαίρα φορτωμένο DC σε λεμφοκύτταρα έφθασε 72,4% και 74,7% σε αναλογία 1:10 και 1:20, ενώ το πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων που ενεργοποιούνται από DC έφθασε μόνο το 17,5% και 14,6% (Σχ. 4Β).

διαφορετικές DCs (Panc-1 CSC DC, DC) συνκαλλιεργήθηκαν με λεμφοκυττάρων (αντιδραστήρες) σε πλάκες 96 φρεατίων σε διαφορετικές αναλογίες (1:10, 1:20). Τα λεμφοκύτταρα που καλλιεργήθηκε μόνος ορίστηκαν ως έλεγχοι. Μετά από 96 ώρες, ο σχετικός αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε ως απορρόφηση με μεθόδους ΜΤΤ. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. A. Ο σχετικός αριθμός των λεμφοκυττάρων μετά από διέγερση μπορεί να αντικατοπτρίζεται με απορρόφηση. Panc-1 ΚΕΠ τροποποιημένο DC διεγείρεται ισχυρότερη πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων σε σύγκριση με τις ομάδες DC. B. Η ενεργοποίηση επιπτώσεις της ΑΧ για λεμφοκυττάρων μπορεί να αντανακλάται με ρυθμό πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων. Οι Panc-1 ΚΕΠ κυτταρολύματα τροποποιημένο DC πέτυχε σημαντική ρυθμό πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων υψηλή σε σύγκριση με τις ομάδες DC.

Η

λύματα Παγκρέατος ΚΕΠ τροποποιημένο DC προκάλεσε έκκριση ΙΡΝ-γ με IL-2 και IL-10 επί των λεμφοκυττάρων

για να προσδιοριστεί η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων με παγκρεατική ΚΕΠ τροποποιημένα DC, ανιχνεύσαμε τα κυτταροκίνες που εκκρίνονται από Τ-κύτταρα σύμφωνα με τα υλικά και τις μεθόδους. DC παλμικά με καρκίνο του παγκρέατος κυτταρολύματα επαγόμενη έκκριση της Th1 κυτοκίνης IFN-γ, IL-2 και η Th2 κυτοκίνη IL-10. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η επάνω ρύθμιση της ΙΡΝ-γ ήταν ιδιαίτερα σημαντική για την σφαίρα Panc-1 τροποποιημένα DC, και η έκκριση της ΙΡΝ-γ αυξήθηκαν σε 5,03 φορές σε σύγκριση με πρωτόγονες ομάδα DC. Η έκκριση της IL-2 αυξήθηκε σε 2,28 φορές σε σύγκριση με πρωτόγονες ομάδα DC (Εικ. 5). Εν τω μεταξύ, η Th2 σχετιζόμενη κυτοκίνη IL-10 επίσης αυξήθηκαν σε Panc-1 αντιγόνο ΚΕΠ φορτωμένα DC. Η ποσότητα της IL-10 στο υπερκείμενο αυξήθηκε έως 7,3 φορές σε λύματα Panc-1 σφαίρα τροποποιημένο DC σε σχέση με το πρωτόγονο DC, αλλά σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του Th1 σχετίζεται κυτοκίνης (Εικ. 5).

Διαφορετικές DCs συν-καλλιεργήθηκαν με 1 χ 10

6 /ml λεμφοκυττάρων σε τρυβλία 96 φρεατίων. Τα υπερκείμενα του λεμφοκυττάρου συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την διεγείρονται με DC, και οι συγκεντρώσεις των IFN-γ, IL-2, IL-10 μετρήθηκαν με δοκιμασία ELISA. Παγκρέατος ΚΕΠ λύματα τροποποιημένο DC προκάλεσε σημαντική έκκριση IFN-γ, IL-2 και IL-10 σε λεμφοκυττάρων.

Η

παγκρέατος ΚΕΠ τροποποιημένο DC που προκαλείται ισχυρή επίδραση θανάτωσης στα παγκρεατικά ΚΕΠ

περαιτέρω σε σύγκριση με το συγκεκριμένο αποτέλεσμα τη θανάτωση των λεμφοκυττάρων που ενεργοποιούνται από παγκρέατος ΚΕΠ τροποποιημένα DC. Αυτόλογη λεμφοκυττάρων διεγέρθηκαν με CSC-DC συλλέχθηκαν και συν-καλλιεργήθηκαν με Panc-1 ΚΕΠ σε διαφορετική αναλογία. Η ειδική δράση θανάτωσης ανιχνεύθηκε με μεθόδους LDH. Τα λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται με DC φορτωμένο με Panc-1 ΚΕΠ συντρίμμια έδειξε σημαντική επίδραση θανάτωσης επί Panc-1 ΚΕΠ σε σύγκριση με DC ελέγχει σε διαφορετική αναλογία (Εικ. 6). Επιπλέον, βρήκαμε ότι πρωτόγονες κυτταρολύματα Panc-1 φορτωμένα DC προκάλεσε μια ασθενέστερη επίδραση θανάτωσης επί Panc-1 σε σύγκριση με το ΚΕΠ Panc-1 ΚΕΠ κυτταρολύματα τροποποιημένο DC (Σχ. 7Α). Ωστόσο, Panc-1 ΚΕΠ τροποποιημένο DC προκάλεσε συγκρίσιμα αποτελέσματα δολοφονία δύο για Panc-1 ΚΕΠ και τα κύτταρα Panc-1. Αν και τα αποτελέσματα ήταν θανάτωσης ασθενέστερες επί Panc-1 κυττάρων σε σύγκριση με Panc-1 DC, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της Panc-1 και DC Panc-1 CSC- DC (Σχ. 7Β). Αυτό το αποτέλεσμα θανάτωσης ήταν ιδιαίτερα σημαντικό σε μια χαμηλότερη αναλογία 1:10 και 1:20 με τα λεμφοκύτταρα.

Διαφορετικές DCs συνκαλλιεργήθηκαν σε αναλογία 1:10 με λεμφοκυττάρων για 5 ημέρες. Τα μη-προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν ως τελεστές κύτταρα. Οι τελεστές (1 × 10

6 κύτταρα) συνκαλλιεργήθηκαν με τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε διαφορετική αναλογία επί 20 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Το υπερκείμενο ελεύθερο κυττάρων συλλέχθηκε και αναλύθηκε με δοκιμασία LDH. Οι Panc-1 ΚΕΠ λύματα τροποποιημένο DC έδειξε ισχυρότερη επίδραση δολοφονία στο Panc-1 ΚΕΠ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

Η

Διαφορετικές ΑΧ (Panc-1DC, Panc-1CSC DC) συν-καλλιεργήθηκαν σε αναλογία 1:10 με λεμφοκύτταρο για 5 ημέρες. Τα μη-προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν ως τελεστές κύτταρα. Οι τελεστές (1 × 10

6 κύτταρα) συνκαλλιεργήθηκαν με τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Panc-1, Panc-1 ΚΕΠ) σε διαφορετική αναλογία επί 20 ώρες στους 37 ° C σε επωαστή 5% CO2. Το υπερκείμενο ελεύθερο κυττάρων συλλέχθηκε και αναλύθηκε με δοκιμασία LDH. A. Η Panc-1 ΚΕΠ λύματα τροποποιημένο DC έδειξαν ισχυρότερη σκοτώνοντας επιπτώσεις στο Panc-1 ΚΕΠ σε σύγκριση με Panc-1 λύματα τροποποιημένο DC. Β Panc-1 ΚΕΠ λύματα τροποποιημένο DC είχαν συγκρίσιμα αποτελέσματα δολοφονία στο Panc-1 κύτταρα σε σύγκριση με Panc-1 εμβόλιο DC.

Η

Συζήτηση

ΚΕΠ ήταν διαβόητη για την αντοχή του σε θεραπεία και μπορεί να είναι η αιτία για υποτροπή των κακοήθων όγκων, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10] – [11]. Ανάπτυξη αντικαρκινική ανοσία μπορεί έτσι να είναι μια αποτελεσματική εναλλακτική προσέγγιση για την εξάλειψη του παγκρέατος ΚΕΠ. Δυστυχώς, ΚΕΠ μπορεί να παραβιάζει το ανοσοποιητικό επιτήρησης του σώματος μέσω πολλαπλών μηχανισμών. έχουν ΚΕΠ αναφερθεί ότι είναι αδύναμος ανοσογόνα. Ohlfest et al ανέφεραν ότι η ανθρώπινη CD133 + γλοιώματα κύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα MHC Ι ή φυσικών φονικών (ΝΚ) κυττάρων ενεργοποίηση συνδετήρες. Χαμηλή έκφραση αυτών των ανοσοποιητικό διέγερσης των μορίων μπορεί να βοηθήσει τα γλοιώματα ΚΕΠ, προκειμένου να αποφύγει την προσαρμοστική και έμφυτο ανοσοποιητικό επιθέσεις [12]. Με συνέπεια στη μελέτη μας, κυτταρομετρία ροής ανάλυση αποκάλυψε ότι η παγκρεατική ΚΕΠ εκφράζουν χαμηλά επίπεδα των HLA-ABC και CD80. Χαμηλή έκφραση των μορίων MHC μπορεί να αποδυναμώσει την αναγνώριση του αντιγόνου ΚΕΠ από το ανοσοποιητικό σύστημα ανθρώπινου σώματος. Χαμηλή έκφραση του CD80 μπορεί να οδηγήσει σε ανοσολογική ανέργειας [13]. Οι παρατηρούμενες ανοσοποιητικό χαρακτηριστικά πρότεινε χαμηλή τόνωση των ικανοτήτων του παγκρέατος ΚΕΠ στο ανοσοποιητικό σύστημα του ανοσοποιητικού. ΚΕΠ αναφέρθηκαν επίσης να ρυθμίζουν ανοσοαποκρίσεις. Heimberger et al ανέφεραν ότι ΚΕΠ συμβάλλει ανοσοποιητικό διαφυγή μέσω επαγωγής ρυθμιστικά Τ κύτταρα και εκκρίνουν ειδικές ανοσοκατασταλτική μόρια [14], [15]. Αναφέρθηκε επίσης ότι η κακοήθους μελανώματος κύτταρα έναρξης μπορούν να διαμορφώσουν την αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση αναστέλλοντας την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και κυττάρων που επάγουν Treg [14]. Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων που διεγείρονται από ΡΗΑ ή αντι-CD3 μονοκλωνικά αντισώματα ανεστάλη παρουσία Panc-1 σφαίρα. Αυτό έδειξε ότι η παγκρεατική ΚΕΠ μπορεί να έχει ανοσοκατασταλτικά χαρακτηριστικά. Σπάζοντας το ανοσοποιητικό ανοχή των παγκρεατικών ΚΕΠ και επαγωγή ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι ΚΕΠ μπορεί να είναι αποτελεσματικό και ελπιδοφόρο στρατηγικές για την εξάλειψη των ΚΕΠ.

ΑΧ είναι επαγγελματίες αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα που παίζουν καθοριστικό ρόλο στην πρόκληση και την οδήγηση των πρωτογενών ανοσολογικές αποκρίσεις , καθιστώντας τα ως ουσιαστικό στόχο τη δημιουργία θεραπευτικής ανοσίας έναντι καρκίνων [16]. Τροποποίηση των DCs με αντιγόνο όγκου μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και κατά του όγκου ανοσοαπόκριση. DC-βασίζεται ο εμβολιασμός αποτελεί μια τέτοια πολλά υποσχόμενη και ισχυρή στρατηγική για την πρόκληση ανοσίας κατά του όγκου για τη θεραπεία του καρκίνου. Παραγωγή DC φορτωμένα με αντιγόνα που σχετίζονται ΚΕΠ μπορεί να παρουσιάσει μία νέα και πολύτιμη μέθοδος για την πρόκληση της ανοσολογικής απόκρισης για την εξάλειψη της ΚΕΠ. Είχε αναφερθεί ότι κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων Τ κατά των ΚΕΠ μπορεί να επαχθεί με σύντηξη του ΚΕΠ με DC ή επιμόλυνση ΚΕΠ mRNA σε δενδριτικά κύτταρα [17] – [18]. Σε αυτή τη μελέτη, θα χρεωθείτε DC με παγκρεατικά συντρίμμια ΚΕΠ. Μετά συν-καλλιέργεια με λεμφοκύτταρα, αυτή η τροποποιημένη DC ενεργοποιεί και διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων και την έκκριση του ΙΝΡ-γand IL-2. Η αυξητική ρύθμιση της IFN-γ, η οποία είναι ένα ισχυρό κατά του όγκου κυτοκίνης, ήταν ιδιαίτερα σημαντική. Εν τω μεταξύ, βρέθηκε ότι η Th2 συνδέονται κυτοκίνη IL-10 επίσης αυξήθηκαν μετά DC διέγερση. IL-10 είναι μια ισχυρή ανοσοκατασταλτική κυτοκίνη η οποία αναστέλλει την ενεργοποίηση των κυττάρων Τ. Αν και τα πάνω ρύθμιση της IL-10 ήταν πολύ χαμηλότερο σε σύγκριση με την Th1 κυτοκίνη που σχετίζεται, η αναστολή της IL-10 μπορεί να ενισχύσει την ανοσοαπόκριση έναντι ΚΕΠ.

περαιτέρω μελέτη μας έδειξε ότι λεμφοκυττάρων που ενεργοποιούνται από Panc-1 ΚΕΠ λύματα τροποποιημένο DC έδειξαν σημαντικές επιδράσεις θανάτωσης τόσο σε Panc-1 και Panc-1 ΚΕΠ. Επιπλέον, το αποτέλεσμα θανάτωσης επί Panc-1 ΚΕΠ προκαλείται από Panc-1 CSC-DC ήταν ισχυρότερη σε σύγκριση με Panc-1 DC. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ανθεκτικό σε όλα σχεδόν τα επί του παρόντος διαθέσιμες θεραπείες, και η θεραπευτική αντίσταση μπορεί να αποδοθεί σε ΚΕΠ. Ανάπτυξη της ανοσοθεραπείας με παγκρέατος ΚΕΠ γίνεται μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος στο εγγύς μέλλον.

Μέχρι σήμερα, η απομόνωση των παγκρεατικών ΚΕΠ έχει επιτευχθεί κυρίως μέσω ειδικών κυτταρική επιλογή δείκτη που εξαρτάται από την επιφάνεια. Αναφέρθηκαν δείκτες κυτταρικής επιφάνειας περιλαμβάνουν CD44, CD24, CD133, ESA, και άλλοι για παγκρέατος ΚΕΠ [2], [19]. Ωστόσο, παγκρεατικό ΚΕΠ επιλέγονται μέσω αυτών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας μπορεί να είναι ετερογενής, καθώς κανένας από αυτούς τους δείκτες εμφανίζονται να χαρακτηρίσει επιλεκτικά ένα καθαρό πληθυσμό ΚΕΠ [20] – [21]. Από την άλλη πλευρά, η καλλιέργεια των ΚΕΠ σφαίρες σε ρυθμισμένο σύστημα καλλιέργειας βλαστικών κυττάρων μπορεί να είναι μια άλλη προσέγγιση για τον εμπλουτισμό του παγκρέατος ΚΕΠ. Στην παρούσα μελέτη, εμπλουτίζεται παγκρέατος ΚΕΠ με τη χρήση μη προσκολλημένα σύστημα σφαίρα του πολιτισμού. Τα συντρίμμια της σφαίρας των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να χρεώσει DC και να συλλέγουν τα ΚΕΠ τροποποιημένα DC. Η ανοσολογική αντίδραση που προκαλείται από μια τέτοια προσέγγιση μπορεί να στοχεύουν άμεσα την πλειοψηφία των παγκρεατικών ΚΕΠ πληθυσμού.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το DC-based ανοσοποιητικό θεραπεία μπορεί να είναι μια ιδανική στρατηγική για την εξάλειψη του παγκρέατος ΚΕΠ. Αυτή η πολλά υποσχόμενη ανοσοποιητικό θεραπεία αξίζει περαιτέρω ανάπτυξη λαμβάνοντας υπόψη την εγγενή αντίσταση του παγκρέατος ΚΕΠ στις υπάρχουσες θεραπείες.

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει καμία σύγκρουση συμφερόντων όσον αφορά τη δημοσίευση του παρόντος εγγράφου.