Αφηρημένο

ανάπτυξη του όγκου απαιτεί αγγειογένεση και αντι-αγγειογενετική θεραπεία έχουν εισαχθεί στη θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτό το πλαίσιο, πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs) αναδύονται ως ενδιαφέρουσα στόχους, λόγω της λειτουργίας τους ως συν-υποδοχείς των μεγάλων, προ-αγγειογονικούς παράγοντες. Συνεπώς, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επιδράσεις κατά του όγκου της ηπαρίνης,

δηλ

υπερ-θειωμένη HS, και διάφορα ηπαρίνη μιμητικά.? Ωστόσο, ένα σημαντικό μειονέκτημα είναι μη ειδική μηχανισμού δράσης τους και δυνητικά σοβαρές παρενέργειες που σχετίζονται με αντιπηκτικές ιδιότητες τους. Εδώ, έχουμε διερευνήσει τη χρήση ανθρώπινων αντισωμάτων αντι-HS ScFv (αHS) ως μια πιο ορθολογική προσέγγιση για τη στόχευση λειτουργία HSPG σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECS). αHS επελέγησαν αρχικά για την αναγνώριση τους επιτόπων HS εντοπίζεται κατά προτίμηση στο αγγειακό σύστημα των όγκων γλοιοβλαστώματος ασθενούς,

δηλ.

ιδιαίτερα αγγειογενετική όγκους του εγκεφάλου. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι αυτά τα αHS εμφάνισαν ισχυρή προ-αγγειογενετική δράση σε πρωτογενή ανθρώπινα ECs. αHS είχαν αποδειχθεί ότι διεγείρει τη διαφοροποίηση ΕΚ, η οποία συνδέθηκε με αυξημένο σχηματισμό σωλήνα ΕΚ και τον πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, αHS υποστήριξε την επιβίωση της ΕΚ στο πλαίσιο υποξία και την πείνα,

δηλ.

Συνθήκες που χαρακτηρίζουν το μικροπεριβάλλον του όγκου. Σημαντικά, αHS μεσολάβηση πολλαπλασιασμός αποτελεσματικά αντι-ενήργησε από την ηπαρίνη και απουσίαζε σε HSPG ανεπάρκεια μεταλλαγμένα κύτταρα, επιβεβαιώνοντας επιδράσεις HS-ειδική. Σε ένα μηχανιστικό επίπεδο, η σύνδεση του αHS να HSPGs του ECs καθώς και κύτταρα γλοιοβλαστώματος βρέθηκε να προκαλέσει ρ38 ΜΑΡΚ εξαρτώμενη σηματοδότηση με αποτέλεσμα την αύξηση του πολλαπλασιασμού. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι αρκετές αHS που αναγνωρίζουν επιτόπια ΕΣ άφθονα στην αγγείωση του όγκου μπορεί να προκαλέσει μια προ-αγγειογενετική απόκριση, η οποία έχει συνέπειες για την ανάπτυξη της στόχευσης που βασίζονται σε αντίσωμα της HSPGs στον καρκίνο

Παράθεση:. Christianson HC, van Kuppevelt Θ, μετάδοσης κίνησης M (2012) ScFv αντι-ηπαράνη Sulfate Αντισώματα Απροσδόκητα ενεργοποιούν ενδοθηλιακά κύτταρα και τον καρκίνο μέσω της p38 ΜΑΡΚ: Συνέπειες για βασίζονται σε αντίσωμα στοχοθέτηση των ηπαράνη Sulfate πρωτεογλυκάνες στον Καρκίνο. PLoS ONE 7 (11): e49092. doi: 10.1371 /journal.pone.0049092

Επιμέλεια: Ramani Ramchandran, Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 8 του Οκτώβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Νοεμ 2012

Copyright: © 2012 Christianson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το σουηδικό ταμείο του καρκίνου? το Σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας? η Σουηδική Εταιρεία Ιατρικής? η φυσιογραφικούς Κοινωνία, Lund? οι Gunnar Nilsson, Lundgren και Kamprad Ιδρύματα? τα κεφάλαια δωρεά Skåne Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο? και η χρηματοδότηση Κυβερνητικών της κλινικής έρευνας στο πλαίσιο των εθνικών υπηρεσιών υγείας (ALF). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η εξέλιξη από κακοήθη εξαλλαγή σε εξέλιξη πρόδηλη όγκου απαιτεί την πρόσληψη των αιμοφόρων αγγείων,

δηλαδή

η αγγειογενετική διακόπτη [1], [2]. Η αγγειογένεση είναι μια διαδικασία πολλαπλών βημάτων που εξαρτώνται από την ενδοθηλιακή (ΕΚ) πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση στον περιβάλλοντα ιστό και, τέλος, τη διαφοροποίηση σε ένα νέο δοχείο. Δεσμευτική διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων,

π.χ.

VEGF-A, FGF, και HB-EGF με θειική ηπαρίνη (HS) αλυσίδες πολυσακχαρίτη υπογραμμίζει τη σημασία των πρωτεογλυκανών ΕΣ (PG) στο ΕΚ βιολογία [3] – [5] . HSPGs δρουν ως συν-υποδοχείς που παρούσης αυξητικούς παράγοντες για υψηλής συγγένειας τυροσινικής κινάσης τους υποδοχείς σηματοδότησης στην κυτταρική επιφάνεια [6], [7]. Εκτεταμένες postsynthetic τροποποιήσεις των γραμμικών αλυσίδων HS, που αποτελείται από επαναλαμβανόμενες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη και μονάδες γλυκουρονικού δισακχαρίτη οξύ, περιλαμβάνουν θείωση σε διάφορες θέσεις κατά μήκος της αλυσίδας, η οποία οδηγεί σε αρνητικά φορτισμένα πεδία που παρέχουν θέσεις δέσμευσης για διάφορους παράγοντες ανάπτυξης, πρωτεάσες και κυτοκίνες που εμπλέκονται στην ανάπτυξη όγκων [3] – [7]. Κατά συνέπεια, τα έμβρυα ποντικού γενετική μηχανική για να εκφράζουν ένα VEGF-A λείπει η αλληλουχία HS-πρόσδεσης επέδειξαν μια μείωση σε σχηματισμό τριχοειδών υποκατάστημα [8], και διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών με είτε ένα ομόζυγη διαγραφή του μοτίβου HS-δεσμευτικός PDGF-ΒΒ ή μειωμένη HS θείωση, εμφανίζεται ελαττωματικό πρόσληψη περικύτταρο και επισκιάζεται μικροαγγειακή ανατομία [9], [10]. Η αλλαγμένη έκφραση των ρυθμιστικών ενζύμων που εμπλέκονται στη διαμόρφωση της λεπτή δομή των αλυσίδων HS έχουν ενοχοποιηθεί στον καρκίνο,

π.χ.

γονίδιο υπερμεθυλίωσης μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση του 3-Ο σουλφοτρανσφερασών και HSulf-1 βρέθηκε σε μερικούς καρκίνους [11], και HSulf-2 υπερέκφραση συσχετίζεται με αυξημένη αγγειογένεση και αυξητικού παράγοντα ικανότητα σύνδεσης στον καρκίνο του μαστού [12]. Περαιτέρω, HS-ταπεινωτική ηπαρινάσης έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου και την κακή έκβαση των ασθενών μέσω της αναμόρφωσης της μικροπεριβάλλον του όγκου [13]. HSPGs Έτσι έχουν εμπλακεί σε αρκετές πτυχές της ανάπτυξης του όγκου και της αγγειογένεσης? Ωστόσο, ο ρόλος της HSPG ως στόχος αντι-αγγειογένεσης θεραπεία παραμένει να καθοριστεί. Στην πραγματικότητα, αρκετές στρατηγικές έχουν διερευνηθεί με σκοπό την επίτευξη αυτού του σκοπού, το πιο σημαντικό οι HS μιμούνται την ηπαρίνη και τα παράγωγά της [14] – [18]. Σημαντικά μειονεκτήματα με αυτές τις ενώσεις είναι σχετική απροσδιόριστα τρόπους τους στόχευση, καθώς και σημαντικούς κινδύνους αιμορραγικές επιπλοκές που σχετίζονται με αντιπηκτικό δραστηριότητές τους. Άλλες πιθανές θεραπείες HS-στόχο για την θεραπεία του καρκίνου περιλαμβάνουν πρωτεΐνες ή πεπτίδια με θετικά φορτισμένα υπολείμματα αμινοξέων που δρουν ως ανταγωνιστικοί αναστολείς του αυξητικού παράγοντα πρόσδεσης σε αλυσίδες HS [19].

θεραπεία

Antibody-based είναι ένας από τους ταχύτερα περιοχές καλλιέργειας θεραπεία στην ιατρική ογκολογία και αντισώματα που στοχεύουν τον VEGF, τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα 2 (HER-2), υποδοχέα EGF ή CD20 έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία του

π.χ.

μεταστατικό καρκίνο του μαστού και καρκίνο του παχέος εντέρου και επιθετική Β- λεμφώματα κυττάρων [20]. Μικρότερες ανασυνδυασμένα αντισώματα, όπως μεταβλητό θραύσμα (scFv) αντισώματα μονής αλυσίδας είναι ενδιαφέρουσες επιλογές των βελτιωμένων στόχευσης λόγω των ευνοϊκών φαρμακοκινητική τους [21] – [23]. Είναι ενδιαφέρον, van Kuppevelt και οι συνάδελφοι του περιέγραψαν προηγουμένως την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισμό πολλών επιτόπων ειδικών, εμφάνιση φάγου που προέρχεται, ScFv αHS για να εξετάσουν τη δομική ποικιλομορφία των αλυσίδων HS σε διάφορους ιστούς [24], [25]. Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να εντοπίσει ScFv αHS που αναγνωρίζουν επίτοπα HS εκφράζονται στο αγγειακό σύστημα των όγκων γλοιοβλαστώματος ασθενούς, και περαιτέρω διερεύνησε τη χρήση αυτών των αHS ως υποθετικό στρατηγική για την αναστολή διαφόρων πτυχών της λειτουργίας ΕΚ.

αποτελέσματα

Αναγνώριση αHS κλώνοι που αναγνωρίζουν ΕΣ επίτοποι του αγγειακό σύστημα του όγκου

Εμείς αρχικά προσπάθησε να εντοπίσει αHS κλώνων με ιδιαιτερότητες γνωστό επίτοπο (Πίνακας 1) [26] που μπορεί να αναγνωρίσει το αγγειακό θέση της ασθενής όγκους γλοιοβλαστώματος. Αυτός ο τύπος του όγκου επιλέχθηκε με βάση γνωστά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του που προκαλείται από υποξία αγγειογένεσης που εκδηλώθηκε με βαθιές υπερπλασία ΕΚ [27]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1A-D, τρεις ξεχωριστές αHS κλώνοι (AO4B08, EV3C3, και HS4E4) κατά προτίμηση χρωματίζονται για HS επιτόπων που εντοπίζεται στο αγγειακό σύστημα του όγκου,

δηλαδή

αHS έδειξε ισχυρή συν-εντοπισμό με τους δείκτες ΕΚ παράγοντα νοη Willebrand (vWF) και ιντεγκρίνη ανβ3, όπου το τελευταίο είναι ένας γνωστός δείκτης ενεργοποιημένου ενδοθηλίου [28]. επιτόπια HS αναγνωρίζεται από το ίδιο σύνολο αHS αντισώματα βρέθηκαν να εκφράζονται επίσης σε πρωτογενή ανθρώπινα ECs (HUVECs) (Εικ. S1 Α-C). Η εξειδίκευση των αHS ΕΣ

in vitro

φάνηκε από σημαντικά μειωμένη δέσμευση στην ECS μετά από θεραπεία με ηπαρινάσης λυάση που υποβαθμίζει ενζυμικά ΕΣ (Εικ. S1D). Η εξειδίκευση της αHS ΕΣ ήταν επίσης αλήθεια

in vivo

σε τομές όγκων ξενομοσχεύματος γλοιοβλάστωμα, ως θεραπεία ηπαρινάσης οδήγησε σε πλήρη απώλεια της χρώσης αHS (Εικ. 1 Ε, δεξιά άνω πάνελ). Εμείς επόμενη εκτελείται χρώσεις με αντίσωμα (3G10) που είναι γνωστό ότι αναγνωρίζουν ειδικά πρωτεΐνη πυρήνα HSPG με εναπομένουσα στέλεχος HS μετά τη θεραπεία με ηπαρινάσης, αλλά αυτό δεν αναγνωρίζει ούτε ελεύθερες αλυσίδες HS ή ανέπαφο HSPG [29]. Ανεπεξέργαστα τομές όγκων δεν έδειξαν χρώση με 3G10 (Εικ. 1 Ε, κάτω αριστερά πλαίσιο), ενώ τα τμήματα του όγκου που έλαβαν θεραπεία με ηπαρινάσης εμφανίζονται σημαντικές θετικότητα για τον επίτοπο 3G10 κυρίως εντοπισμένη σε σκάφος-όπως δομές που έμοιαζαν πολύ με τα αHS χρώση πρότυπο (συγκρ. 1Ε, κάτω δεξιά πάνελ και άνω αριστερό πάνελ). Μαζί, αυτές οι μελέτες εντοπίσει αρκετές αHS κλώνους που αναγνωρίζουν επιτόπια ΕΣ που σχετίζονται με άθικτο HSPGs άφθονα στο αγγειακό θέση των όγκων γλοιοβλαστώματος.

, τμήματα γλοιοβλάστωμα όγκου του ασθενούς βάφτηκαν ΕΣ χρησιμοποιώντας τα αντισώματα αHS AO4B08 (Α και D) , EV3C3 (Β) ή HS4E4 (C) (πράσινο) και για vWF (Α-Γ, ενδοθηλιακά δείκτη? κόκκινο) ή ιντεγκρίνη ανβ3 (D, δείκτης ενεργοποιημένο ενδοθήλιο? κόκκινο), και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. Ισχυρή συν-συσχέτιση μεταξύ επιτόπων του ΕΣ και αγγείωση του όγκου υποδεικνύεται από συγχωνευθείσας εικόνες (Α-Δ, δεξί πάνελ? Κίτρινο). Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών όγκων και τουλάχιστον πέντε τμήματα ανά όγκο, και ελήφθησαν σε 20 × μεγέθυνση. μπαρ κλίμακα, 50 μΜ. Ε, Άνω πάνελ: Ιδιαιτερότητα αHS εκτιμήθηκε με AO4B08 χρώση τομών ξενομοσχευμάτων όγκου U-87 MG γλοιοβλάστωμα ακόλουθα είτε χωρίς αγωγή (Ctrl) ή προ-θεραπεία με ηπαρινάση III λυάσης (λυάσης HS) για να χωνέψει HS. Κάτω πάνελ: 3G10 αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει στελεχών HS του HSPGs που παραμένουν μετά την πέψη λυάσης HS. Expecedly, χρώση 3G10 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε μη επεξεργασμένα τμήματα όγκου με άθικτο HS (Ctrl, αριστερό πάνελ)? Ωστόσο, 3G10 χρώση του ΕΣ δείγματα αντιμετωπίζονται λυάση (δεξί πάνελ) δείχνει ένα σκάφος όπως το μοτίβο που μοιάζει σε μεγάλο βαθμό τη χρώση AO4B08 (άνω αριστερό πάνελ). Κλίμακα bar, 20 μΜ

Η

λειτουργικά αποτελέσματα αHS στην Πρωτοβάθμια Ανθρωπίνων ECs

Με βάση την υπόθεση ότι HSPGs είναι κατάλληλοι στόχοι για αντι-αγγειογενετική θεραπεία [3]. – [10], [13] – [18] από την επόμενη εκτέλεσε μια σειρά από λειτουργικές μελέτες με πρωτογενή ανθρώπινα ECs. Συνεπής με τον ρόλο της HSPGs σε λειτουργία ΕΚ, το μιμητικό ηπαρίνη HS μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό ΕΚ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α). Το ίδιο ίσχυε για το βάρος ένωση ηπαρίνης χαμηλού μοριακού tinzaparin (Εικ. 2Β), το οποίο είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιπηκτικό και ότι είναι προς το παρόν υπό έρευνα για ανασταλτικά αποτελέσματα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα όγκου του (https://clinicaltrials.gov/ct2/? εμφάνιση /NCT00475098 όρος = tinzaparincancer & amp?. rank = 7)

, HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο χωρίς ορό με την παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων είτε ηπαρίνης (Α) ή του χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη, Tinzaparin (Β ). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της ενσωματωμένης [

3Η] θυμιδίνης επί περίοδο 48 h. C, HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία (Ctrl) ή παρουσία του AO4B08 (αHS, 3 μg /ml) για 72 ώρες. κυτταρική μορφολογία οπτικοποιήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους, και συλλαμβάνονται χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Αριστερά και μέσα πάνελ παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες από ένα επίμηκες φαινότυπο ΕΚ αHS αγωγή σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Δεξιός πίνακας δείχνει ποσοτική ανάλυση του μήκους των μεμονωμένων κυττάρων σε τρία ξεχωριστά μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο (n = 4), χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J. D, HUVECs καλλιεργήθηκαν επί Matrigel,

δηλαδή

μια εξωκυτταρική μήτρα που προέρχονται από όγκους, σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία (Ctrl) ή παρουσία του AO4B08 (αHS? 3 μg /ml) και αφέθηκαν να σχηματίσουν σωλήνες για περίπου 20 ώρες. Αριστερά και μέσα πάνελ παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά εικόνες του αυξημένου σχηματισμού σωλήνα σε αHS αγωγή σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Δεξιός πίνακας δείχνει ποσοτική ανάλυση του αριθμού των απροσβλήτων σωλήνων από τρία μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο (n = 4) με τη χρήση του λογισμικού Image J. Ε και F, αHS διεγείρει τον πολλαπλασιασμό ΕΚ: HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία ή παρουσία AO4B08 (αHS) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και αξιολογούνται για πολλαπλασιασμό κατά [

3Η] θυμιδίνης επί περίοδο 3 h. F, HUVECs υποβλήθηκαν σε ανάλυση φάση του κυτταρικού κύκλου μετά από 6 ώρες χωρίς (Ctrl) ή με AO4B08 θεραπεία (αHS). Κλάσμα των κυττάρων στο αντίστοιχο φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής μετά την πυρηνική χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± το S.D. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο Ctrl, P & lt?. 0.05

Η

Ένα σημαντικό μειονέκτημα με ηπαρίνες είναι μη ειδική τους μηχανισμό δράσης και δυνητικά σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. έτσι αποφασίσαμε να διερευνήσει τη δυνατότητα στόχευσης αντισώματος-based του ΕΣ ως μια πιο συγκεκριμένη και λογική αντι-αγγειογενετική στρατηγική, αρχικά μελετώντας ένα από τα παλαιότερα επιλεγεί αHS,

δηλ.

AO4B08, στη λειτουργία ΕΚ. AO4B08 αντιμετωπίζονται ECs εμφανίζεται ένα επίμηκες μορφολογία με αύξηση περίπου 75% της μέσης κυττάρου μήκους σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2C). ΕΚ επιμήκυνση είναι γνωστό ότι συνδέεται με ένα σωλήνα που σχηματίζει και βλάστησης ΕΚ φαινότυπο [30]. Κατά συνέπεια, AO4B08 βρέθηκε να προαχθεί ο σχηματισμός σωλήνα & gt? 2-φορές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2D).. Επιπλέον, αHS βρέθηκε να αυξάνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό ΕΚ σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με μέγιστη διέγερση του περίπου 3,5 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 2Ε). Αξίζει να σημειωθεί ότι, με τη μεσολάβηση AO4B08 διέγερση του πολλαπλασιασμού ΕΚ δείχθηκε ήδη στις 3 ώρες της θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει μια σχετικά γρήγορη απόκριση. Η επίδραση της AO4B08 στον πολλαπλασιασμό ΕΚ επήλθε μετά από 24 ώρες θεραπείας AO4B08 (Εικ. S2). Διέγερση του πολλαπλασιασμού των ΕΚ με AO4B08 υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την αυξημένη κλάσμα των κυττάρων στην S-φάση, και αντίστοιχη μείωση της G1 φάσης στο AO4B08 θεραπεία σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2F).

αHS Προστατεύει πρωτογενή ανθρώπινα ECS από υποξία και λιμοκτονίας Associated κυτταρικού θανάτου

ως υποξία και ανεπάρκεια θρεπτικών συστατικών είναι χαρακτηριστικά γνωρίσματα της μικροπεριβάλλον του όγκου [31], και ως υποξία έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τη σύνθεση κυτταρικής επιφάνειας HS του ECs σε μια ικανότητα σύνδεσης αυξήθηκε αυξητικού παράγοντα [32], μπορούμε αιτιολογημένη ότι διαμεσολαβούμενη από αντίσωμα απόφραξη του ΕΣ μπορεί να ευαισθητοποιήσει ECs στο πλαίσιο της υποξίας και της λιμοκτονίας. Για το σκοπό αυτό, ECs καλλιεργήθηκαν σε υποξία (1% O

2) στην παρουσία ή την απουσία AO4B08, και αξιολογήθηκαν για την απόπτωση με ανάλυση της διασπασμένης κασπασών. λιμοκτονία ορού των υποξικών ECs που προκαλείται κασπάσης 3 και 7 ενεργοποίηση σε ECs και, κατά τρόπο ενδιαφέροντα, η διάσπαση της κασπάσης ήταν αποτελεσματικά αντι-ενήργησε με επεξεργασία AO4B08 (Σχ. 3Α). Σε περαιτέρω στήριξη των εν λόγω στοιχείων, AO4B08 δείχθηκε να αυξηθεί σημαντικά ο αριθμός των βιώσιμων ECs σε υποξικές και συνθήκες ορού με ανεπάρκεια (Σχ. 3Β). Συνολικά, τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι ένα αHS φαίνεται να αναγνωρίζουν όγκου των δομών του ΕΣ αγγείωση κάτοικος μπορεί να ασκήσει προ-αγγειογενετική επιπτώσεις σε EC.

, HUVECs αναπτύχθηκαν για 72 ώρες σε πλήρες μέσο (10% FBS), ορό μέσο ελεύθερο, ή σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με AO4B08 (αHS? 3 μg /ml), όπως υποδεικνύεται, υπό συνθήκες υποξίας (1% O

2). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για ολική και διασπασμένη κασπάση-3 και 7, καθώς και α-τουμπουλίνης με ανοσοκηλίδωση. Άνω πάνελ δείχνει αντιπροσωπευτική ανοσοστυπώματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Κάτω πάνελ δείχνουν ποσοτικοποίηση των διασπαστεί κασπάσης συνόλου των αναλογιών /κασπάσης από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Β, HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία (Ctrl) ή παρουσία του AO4B08 (αHS? 3 μg /ml) υπό συνθήκες υποξίας για 72 ώρες, και στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Αριστερό πάνελ δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες των χρωματισμένων κυττάρων. Δεξιά πάνελ δείχνει ποσοτική ανάλυση των βιώσιμων κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± το Τ.Α. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο Ctrl, P & lt?. 0.05

Η

αHS μεσολαβητική κυτταρική διέγερση είναι Ειδικοί του ΕΣ, αλλά δεν είναι του ΕΣ επιτόπου ή κυττάρων Ειδικές

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ιδιαιτερότητα της λειτουργικής επιδράσεις της αHS. AO4B08 διέγερση του πολλαπλασιασμού ΕΚ εμφανίστηκε αυστηρά εξαρτάται HS δέσμευσης όπως υποδεικνύεται από αποτελεσματική αντιστροφή από την ηπαρίνη σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 4Α). Ήδη στη χαμηλότερη συγκέντρωση ηπαρίνης που χρησιμοποιήθηκε (10 μg /ml), περίπου το 75% των AO4B08-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό ανεστάλη και στα 100 μg /ml Το αποτέλεσμα ήταν πλήρως καταργηθεί (Σχ. 4Α). Είναι σημαντικό, βρήκαμε ακόμη ότι επιπλέον αHS κλώνοι φαίνεται να αναγνωρίζουν γλοιοβλάστωμα αγγειακό σύστημα του όγκου, HS4E4 και EV3C3 (Εικ. 1), που διεγείρεται επίσης πολλαπλασιασμό ΕΚ, και ότι αυτή η επίδραση αποτελεσματικά αντι-ενήργησε με ηπαρίνη (Εικ. 4C). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι στα πειράματα πολλαπλασιασμού φαίνεται στο Σχ. 2Α, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ηπαρίνη για 48 ώρες, ενώ στις αHS πειράματα αντιστροφής κύτταρα επωάστηκαν με ηπαρίνη μόνο για 3 ώρες (Εικ. 4Α και C). Είναι σημαντικό, διάφορες παραλλαγές της CS,

δηλ.

Μια γλυκοζαμινογλυκάνη στενά συνδεδεμένη με την ηπαρίνη, δεν ήταν σε θέση να αντιστρέψει τη διεγερτική επίδραση της αHS (Εικ. 4Β). Επιπλέον, υπό αυτές τις συνθήκες, η δέσμευση ηπαρίνης (10 μg /ml) αναστέλλεται αποτελεσματικά αHS κυτταρικής επιφάνειας (Σχ. S3b). Παρά το γεγονός ότι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι αHS-προκαλούμενα αποτελέσματα στον πολλαπλασιασμό ΕΚ HS συγκεκριμένες αλλά όχι περιορίζεται σε συγκεκριμένο επίτοπο HS, το διεγερτικό αποτέλεσμα ήταν ιδιαίτερα έντονη για EV3C3 ακολουθούμενη από AO4B08 και HS4E4 (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα φάνηκε να συσχετίζεται με την κυτταρική επιφάνεια αφθονία του επιτόπου αντίστοιχων αHS,

δηλ

ECs κατά προτίμηση δεσμεύονται αHS με τη σειρά EV3C3 & gt?. AO4B08 & gt? HS4E4 (Εικ S3A.). Περαιτέρω, η επίδραση των διαφόρων αHS κλώνοι εμφανίστηκαν να μην συνδέονται άμεσα με την κυτταρική κατανομή των αντίστοιχων επιτόπου τους, όπως AO4B08 και HS4E4 χρώσεις εμφανίζεται ένα παρόμοιο μοτίβο κατά μήκος περιφέρεια του κυττάρου, ενώ EV3C3 έδειξε μια πιο διάχυτη χρώση με αυξημένη πυκνότητα προς το περιπυρηνική περιοχή (Σχ S1 Α-C.)

Α, HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία (λευκές ράβδοι) ή παρουσία AO4B08 (μαύρες μπάρες? 1,25 μg /ml). και με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση ηπαρίνης για 3 ώρες και αξιολογούνται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από το [

3Η] δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, P & lt? 0,05? # Στατιστικά διαφορετικό από AO4B08 επεξεργασμένο, P & lt? 0,05. Κύτταρα ελέγχου επωάζονται χωρίς αντίσωμα. Β, HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία (λευκές ράβδοι) ή παρουσία AO4B08 (μαύρες μπάρες? 1,25 μg /ml) χωρίς (Ctrl) ή με CS-6, CS4, ή CS-0 (10 μg /ml), όπως υποδεικνύεται. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την [

3Η] δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, P & lt? 0,05. C, HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία (λευκές ράβδοι) ή παρουσία ηπαρίνης (μαύρες μπάρες? 10 μg /ml) χωρίς ή με τους κλώνους αντισώματος διαφορετικές αHS (1,25 μg /ml), όπως υποδεικνύεται. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την [

3Η] δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, P & lt? 0,05? # Στατιστικά διαφορετικό από αHS επεξεργασμένο, P & lt? 0,05. , Άγριου τύπου κύτταρα D (ΟΗΟ-Κ1) και PG- ανεπάρκεια (PgsA-745) κύτταρα CHO αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού απουσία ή παρουσία διαφορετικών κλώνων αHS αντίσωμα (1.25 μg /ml), όπως υποδεικνύεται. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την [

3Η] δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, P & lt? 0,05? # Στατιστικά διαφορετική από αHS-επεξεργασμένα κύτταρα ΟΗΟ-Κ1, Ρ & lt? 0.05. Ε και F, Human ομφαλική αρτηρία ECs (HUAECs? Ε) και τα κύτταρα U-87 MG γλοιοβλάστωμα (F) αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με την παρουσία AO4B08 (αHS) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με την [

δοκιμασία 3Η] θυμιδίνης. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, P & lt?. 0.05

Η

Η ιδιαιτερότητα της αHS και η εξάρτηση από HSPG για τις διεγερτικές επιδράσεις τους ήταν δίπλα διερευνηθεί χρησιμοποιώντας άγριου τύπου (CHO-K1) και μεταλλαγμένων (pgsA- 745) κύτταρα CHO, γενετικά ελλειμματικά σε ξυλοζυλ τρανσφεράσης (XT). XT καταλύει το πρώτο βήμα στη συναρμολόγηση HSPG,

δηλαδή

. η σύνδεση ξυλόζης σε συγκεκριμένα υπολείμματα σερίνης στην πρωτεΐνη πυρήνα PG. κύτταρα PgsA εκφράζουν περίπου 5% HSPG σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου [33]. Η κατεργασία των κυττάρων CHO-K1 με AO4B08, EV3C3 καθώς HS4E4 οδήγησε σε σχεδόν 2-πλάσια αύξηση στον πολλαπλασιασμό, δείχνοντας ότι οι διεγερτικές επιδράσεις του αHS δεν περιορίζονται σε HUVECs (Σχ. 4D). Η έννοια αυτή ενισχύθηκε από το εύρημα ότι αHS επαγόμενη τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων ομφάλιων αρτηρίας ECs (HUAEC),

δηλαδή

άλλη πηγή πρωτογενών ανθρώπινων ECs, καθώς και του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος κυτταρική γραμμή U-87 MG σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στην ίδια έκταση όπως στην HUVECs (Σχ. 4Ε και F). Είναι σημαντικό, HSPG ανεπάρκεια μεταλλαγμένα κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε όλα τα μελετήθηκαν αHS (Εικ. 4D), παρέχοντας γενετική απόδειξη ότι αHS μεσολάβηση ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων απαιτεί τη λειτουργία ατάραχος ΕΣ.

αHS εξαρτώμενη διέγερση του πολλαπλασιασμού Περιλαμβάνει p38 ΜΑΡΚ σηματοδότηση Ενεργοποίηση

Είμαστε δίπλα ήθελε να διευκρινίσει κατά πόσον αHS που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που εμπλέκονται ένα συγκεκριμένο μονοπάτι σηματοδότησης. Χρησιμοποιώντας μια φωσφορυλίωση ειδικών υποδοχέα τυροσίνης κινάσης συστοιχία, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία αHS δεν ενεργοποιούν τους υποδοχείς των γνωστών HS-πρόσδεσης παραγόντων ανάπτυξης,

δηλαδή

FGFs, PDGFs, και VEGFs, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ECs (Σχ. 5Α ). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ο μηχανισμός του αHS μεσολάβηση διέγερση του ECs δεν οφείλεται άμεση μιμητικό αποτέλεσμα των προσδεμάτων HS-δεσμευτική. Είναι ενδιαφέρον ότι, χρησιμοποιώντας ένα φωσφορυλίωση ειδικών συστοιχία κινάση, κατεργασία αHS βρέθηκε να επάγει σημαντικά τη φωσφορυλίωση της ρ38 ΜΑΡΚ (περίπου 2,5 φορές) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ECs (Εικ. 5Β). Τα δεδομένα συστοιχία επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western, εξαρτώμενη από τον χρόνο και παροδικές επαγωγή ρ-p38 ΜΑΡΚ με αHS (Εικ. 5C) που δείχνει. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του CREB, ενός γνωστού κατάντη στόχος της ρ38 ΜΑΡΚ [34], φάνηκε να αυξηθεί κατά την κατεργασία αHS (περίπου κατά 35% σε σύγκριση με τον έλεγχο) (Εικ. 5Β). Ωστόσο, φωσφορυλίωση ενός άλλου ΜΑΡΚ εμπλέκεται ευρέως στην σηματοδότηση του πολλαπλασιασμού, εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη 1/2 (ERK1 /2), δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία αHS (Εικ. 5Β). Η επίδραση της αHS στην ενεργοποίηση σηματοδότησης ρ38 ΜΑΡΚ φαινόταν να είναι ένα πιο γενικό φαινόμενο, όπως μια παρόμοια απόκριση βρέθηκε σε μικροαγγειακά ECs που απομονώνεται από πνεύμονα ποντικού (Σχ. 5D) [35], καθώς και σε κύτταρα U-87 MG γλοιοβλάστωμα (Σχ . S4A)

HUVECs επωάζονται σε μέσο χωρίς ορό με ή χωρίς αHS (AO4B08?. 1.5 μg /ml) για 5, 15, 45, και 60 λεπτά, και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες κινάσης τυροσίνης υποδοχέα προσδιορίστηκαν σε συγκεντρωτικά κυτταρολύματα από τα ανθρώπινα αντι-φωσφο ανάλυση συστοιχία αντισωμάτων υποδοχέα κινάσης τυροσίνης, όπως περιγράφεται στο

Μέθοδοι

. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά ανοσοστυπώματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Ενδείκνυται περιοχές δείχνουν FGFR, στήλη 1: FGFR1? 2: FGFR2? 3: FGFR3? 4: FGFR4. PDGFR, στήλη 1: PDGFRα? 2: PDGFRβ? 3: SCFR? 4: Flt3. VEGFR, στήλη 1: VEGFR1? 2: VEGFR2? 3: VEGFR3. Β, HUVECs επωάζονται σε μέσο χωρίς ορό με ή χωρίς αHS (EV3C3? 1,5 μg /ml) για 5, 15, 45, και 60 λεπτά, και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες κινάσης καθορίστηκαν με ομαδοποιήθηκαν κυτταρολύματα από ανθρώπινες συστοιχία αντισωμάτων κινάσης αντι-φωσφο ανάλυση όπως περιγράφεται στο

Μέθοδοι

. Αριστερό πάνελ παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά ανοσοστυπώματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Δεξιός πίνακας δείχνει ποσοτικοποίηση του ρ-p38 ΜΑΡΚ, ρ-CREB, και ρ-ERK1 επίπεδα /2 στις διάφορες συνθήκες, που παρουσιάζονται ως σχετικές εντάσεις

vs.

Συστοιχία αναφοράς (κόκκινο κουτί). C, HUVECs ήταν είτε χωρίς θεραπεία (Ctrl) ή επωάστηκαν με αHS (AO4B08? 1,25 μg /ml) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα που ακολουθείται με ανοσοστύπωμα για φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ, σύνολο p38 ΜΑΡΚ και α-τουμπουλίνης. Αριστερό πλαίσιο δείχνει αντιπροσωπευτικά ανοσοστυπώματα των τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Δεξιός πίνακας δείχνει ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων φωσφο-ΜΑΡΚ p38 (Ρ-p38 /α-τουμπουλίνης) από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. D, ίδιο πείραμα όπως στο (C) πραγματοποιήθηκε με πνεύμονα ποντικού μικροαγγειακή ECs, που δείχνουν συγκρίσιμη επαγωγή της φωσφορυλίωσης ΜΑΡΚ p38 με αHS όπως στο HUVECs. E-F, πολλαπλασιασμό αHS που προκαλείται εξαρτάται από την p38 ΜΑΡΚ. Ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με [

3Η] θυμιδίνης σε ECs ποντικού (Ε) και τα κύτταρα U-87 MG γλοιοβλάστωμα (F) μετά από αγωγή με το SB203580 αναστολέα ρ38 ΜΑΡΚ (1 μΜ) και /ή αHS (AO4B08? 1,25 μg /ml) για 3 ώρες, όπως υποδεικνύεται. πολλαπλασιασμό των βασικών κυττάρων δεν επηρεάστηκε σημαντικά από την p38 ΜΑΡΚ αναστολή ενώ αHS επαγόμενο πολλαπλασιασμό ήταν σχεδόν πλήρως αντιστραφεί. * Στατιστικά σημαντική διαφορά από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, P & lt? 0,05? # Στατιστικά διαφορετική από αHS επεξεργασμένο, Ρ & lt?. 0.05

Η

Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης, ίσως το πιο σημαντικό προ-αγγειογόνο FGF, VEGF, PDGF και έχουν βρεθεί να πυροδοτούν την ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ σε ορισμένους τύπους κυττάρων [ ,,,0],36]. έτσι Πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων συστοιχία αντισωμάτων φωσφορυλίωση του υποδοχέα της αγγειογένεσης και της κινάσης της τυροσίνης για να αποσαφηνιστεί εάν διεγερτικές επιδράσεις των κυττάρων και την ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ από αHS μπορεί να είναι δευτερογενής στην επαγωγή ειδικών αυξητικών παραγόντων και των αντίστοιχων υποδοχέων σηματοδότησης τους. Ωστόσο, δεν μπορέσαμε να βρούμε σημαντική επαγωγή με αHS είτε αυτών των αυξητικών παραγόντων ή των υποδοχέων τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Να μελετήσουν άμεσα την λειτουργική σημασία της σηματοδότησης p38 ΜΑΡΚ στην αHS μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού, χρησιμοποιήσαμε το καθιερωμένο αναστολέα της p38 MAPK SB203580 [34], [37]. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο αναστολέας αποτελεσματικά αντι-ενήργησε ενεργοποίησης p38 ΜΑΡΚ σε HUVECs (Σχ. S4B), και μειωμένο ορό, καθώς και αHS μεσολάβηση ενεργοποίηση του p38 ΜΑΡΚ κατάντη CREB στόχου (Σχ. S4C). SB203580 αποδείχθηκε ότι αναστέλλει τη βασική ρ-CREB (Εικ. S4C) και τον πολλαπλασιασμό σε μη διεγερμένα HUVECs (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά όχι σε ECs ποντικού και τα κύτταρα U-87 MG γλοιοβλάστωμα (Σχ. 5Ε και F),

δηλαδή

περαιτέρω μελέτες διεξήχθησαν στους τελευταίους τύπους κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, αHS-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των ECs ποντικού (Σχ. 5Ε) καθώς και γλοιοβλαστώματος κύτταρα (Σχ. 5F) ήταν αποτελεσματικά εξασθενημένη από την αναστολή ρ38 ΜΑΡΚ. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η πρόσδεση του αHS να κυτταρικής επιφάνειας HSPGs των ECs καθώς και κύτταρα γλοιοβλαστώματος ενεργοποιεί ένα ρ38 ΜΑΡΚ εξαρτώμενη οδό σηματοδότησης έχοντας σαν αποτέλεσμα αυξημένη πολλαπλασιασμό.

Συζήτηση

αντισωμάτων με βάση όγκου αγγειακής στόχευσης για τη θεραπεία του καρκίνου βασίζεται στο γεγονός ότι οι όγκοι απαιτούν αγγειογένεση, προκειμένου να επεκτείνει και μετάσταση, και ότι η ECS αντιμετωπίζουν τον αυλό των αιμοφόρων αγγείων και ως εκ τούτου είναι σχετικά προσβάσιμα για συστηματική θεραπεία. Η λογική του HSPG-κατευθυνόμενη αντικαρκινική θεραπεία είναι η δυνατότητα ταυτόχρονης πολλαπλής στόχευσης ορισμένων βασικών προ-αγγειογενετική πρωτεΐνες, το σημαντικότερο VEGF-A, FGFs, ΗΒ-EGF, PDGF, και IL-8, το οποίο μπορεί να προάγουν την αγγειογένεση των όγκων σε μια εν μέρει περιττό τρόπο, με επιπτώσεις για την αντίσταση της θεραπείας. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε εντοπίσει αρκετές αHS κλώνους που αναγνωρίζουν επίτοπα HS εκφράζεται σε αφθονία στο αγγειακό σύστημα των κακοήθων όγκων γλοιώματος. Απροσδόκητα, διαπιστώνουμε ότι αυτές οι αHS διεγείρουν διάφορες πτυχές της λειτουργίας του ΕΚ,

δηλ.

Διαφοροποίησης, το σχηματισμό σωλήνα, τον πολλαπλασιασμό και την αντίσταση στην υποξία και την πείνα εξαρτάται κυτταρικό θάνατο. Παρέχουμε αποδείξεις ότι οι επιπτώσεις αυτές εξαρτώνται από συγκεκριμένα στην αHS δεσμευτική και δεν σχετίζονται με μη ειδική αλληλεπιδράσεις. Είναι σημαντικό, οι διεγερτικές επιδράσεις φαίνεται να περιλαμβάνει αρκετές επιτόπων του ΕΣ, όπως AO4B08, EV3C3 καθώς HS4E4 εμφανίζονται όλα διεγερτική δράση, η οποία φαίνεται να συσχετίζονται άμεσα με τις αντίστοιχες κυτταρική επιφάνεια αφθονία τους σε EC. Επιπλέον, αHS επαγόμενη διέγερση βρέθηκε σε τρεις διαφορετικούς τύπους πρωτογενών ECs,

δηλαδή

HUVECs, HUAECs, και πνεύμονα ποντικού μικροαγγειακή ECs, καθώς και σε μετασχηματισμένα κύτταρα CHO και ανθρώπινα κύτταρα U-87 MG γλοιοβλάστωμα, υποδηλώνοντας . ότι τα ευρήματά μας έχουν γενικότερο ενδιαφέρον

Προηγούμενες μελέτες στηρίξει την έννοια της HSPG ως σχετικός στόχος της θεραπείας του καρκίνου [7] – [18]. Αυτές οι στρατηγικές έχουν κυρίως επικεντρώνεται στην ηπαρίνη, τα παράγωγά της, και άλλα πολυανιονικά ενώσεις, όπως σουραμίνη [18]. Άλλες στρατηγικές να παρεμβαίνει με τη λειτουργία HSPG περιλαμβάνουν ψευδή υποστρώματα για την βιοσύνθεση του ΕΣ,

δηλ.

Ξυλοσίδια [38], η αναστολή της HS-ενζύμων αποικοδόμησης [39], και γενετικός χειρισμός της βιοσυνθετικής μηχανήματα HS [40]. Οι απέδειξαν ανασταλτικά αποτελέσματα αυτών των ενώσεων μπορεί κυρίως να εξηγηθεί από την άμεση ανταγωνιστική παρεμπόδιση των αλληλεπιδράσεων συνδετήρα-HSPG εξασθένηση έτσι κατάντη του υποδοχέα ενεργοποίησης (πολυανιοντικών ενώσεων) σηματοδότησης, ή διαμορφώνοντας την βιολογική διαθεσιμότητα του HSPGs για δέσμευση συνδέτη (ξυλοσίδια, ένζυμα, γενετική στρατηγικές). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η κυρίαρχη επίδραση του αντισώματος δέσμευση από τα κυτταρικά HSPGs είναι να προωθούν άμεσα την ενεργοποίηση των κυττάρων, αντί να εμποδίσει την ενεργοποίηση HS εξαρτώμενη από τον υποκαταστάτη κύτταρο. Σε ένα μηχανιστικό επίπεδο, η σύνδεση του αHS να HSPGs του ECs καθώς και κύτταρα γλοιοβλαστώματος βρέθηκε να προκαλέσει ρ38 ΜΑΡΚ που εξαρτώνται από τη σηματοδότηση, και ατάραχος λειτουργία ρ38 ΜΑΡΚ ήταν απαραίτητη για τη διέγερση των κυττάρων αHS μεσολάβηση. Στο πλαίσιο αυτό, είναι αξιοσημείωτο ότι οι άλλοι συνδετήρες HS-δέσμευσης έχουν δειχθεί ότι διεγείρουν ECs μέσω της οδού της ρ38 ΜΑΡΚ [41]. Αυτό ενδοκυτταρική κινάση ταυτοποιήθηκε αρχικά ως ένα μεγάλο προ-φλεγμονώδης μεσολαβητής και βρέθηκε αργότερα να συμμετέχουν σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες και σε ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [36]. Στην πραγματικότητα, η ρ38 ΜΑΡΚ έχει ενοχοποιηθεί ως καταστολέας των κακοηθών διαδικασιών,

π.χ.

Ογκογονίδιο μεσολάβηση κυτταρικής γήρανσης και αναστολή επαφής. Άλλες μελέτες, ωστόσο, έχουν δείξει προμεταναστευτικές και επεμβατική αποτελέσματα της ενεργοποίησης p38 ΜΑΡΚ σε καρκινικά κύτταρα και στρωματικά κύτταρα [36]. Όπως και άλλες MAPKs, οι λειτουργίες της ρ38 εξαρτώνται από κινάσες κατάντη της, συμπεριλαμβανομένων των κινασών σερίνης /θρεονίνης, όπως ρ38-ρυθμιζόμενη /ενεργοποιημένη κινάση (Prak) και ΜΑΡΚ-ενεργοποιημένη κινάση-2, και πολλές διαφορετικές κινάσες ανάντη, όπως ως ΜΚΚ3 /6, ΜΚΚ4, καθώς και ΜΑΡΚΚ ανεξάρτητα σήματα. Κυττάρου ειδικά καθώς υποκυτταρικό εντοπισμό ειδικών εφέ προσθέτουν στην πολυπλοκότητα της λειτουργίας ρ38. Στο πλαίσιο των όγκων αγγειογένεση έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον ότι η ρ38 δείχθηκε πρόσφατα να ενεργοποιήσει ECs όγκο μέσω Prak [42]. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να διευκρινιστεί κατά πόσον Prak και ποιες εναλλακτικές p38 κατάντη οι μηχανισμοί σηματοδότησης που εμπλέκονται σε pro-αγγειογενετική αποτελέσματα αHS μεσολάβηση.