Αφηρημένο

Έχουμε περιγράψει τη χρήση εκκινητών «υπερεκλεκτική» που επιτρέπουν την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των σωματικών μεταλλάξεων του οποίου η παρουσία σχετίζεται με τη διάγνωση του καρκίνου, την πρόγνωση και τη θεραπεία, σε προσδιορισμούς PCR σε πραγματικό χρόνο που μπορούν δυνητικά να αναλύσει σπάνια θραύσματα DNA που υπάρχει σε δείγματα αίματος (υγρό βιοψίες). Ο σχεδιασμός αυτών των εκκινητών δεοξυριβονουκλεοτιδίου ενσωματώνει τόσο μία σχετικά μακρά » ‘αλληλουχία άγκυρα που υβριδοποιεί έντονα για στόχευση θραυσμάτων DNA, και μια πολύ σύντομη, φυσικά και λειτουργικά χωριστή,» 3 5 «‘ αλληλουχία πόδι» που είναι απόλυτα συμπληρωματική με την μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο αλλά αναντιστοιχίες η αλληλουχία άγριου τύπου. Όπως λίγα όσο δέκα μεταλλαγμένο θραύσματα μπορεί αξιόπιστα να ανιχνευθεί με την παρουσία 1.000.000 θραυσμάτων άγριου τύπου, ακόμα και όταν η διαφορά μεταξύ της μεταλλαγμένης και άγριου τύπου είναι μόνο ένα πολυμορφισμό μονού νουκλεοτιδίου. Multiplex PCR δοκιμασίες που χρησιμοποιούν ένα σύνολο υπερεκλεκτική εκκινητές, και ένα αντίστοιχο σύνολο διαφορετικού χρώματος ανιχνευτών μοριακών φάρων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε καταστάσεις όπου οι διαφορετικές μεταλλάξεις, αν και εμφανίζονται σε διαφορετικά κύτταρα, βρίσκονται στην ίδια κωδικόνιο. Αυτά τα μη-συμμετρική πραγματικού χρόνου δοκιμασίες πολλαπλή PCR περιέχουν περιορισμένες συγκεντρώσεις κάθε υπερεκλεκτική εκκινητή, επιτρέποντας έτσι την ταυτόχρονη προσδιορισμό της αφθονίας κάθε μετάλλαξης, συγκρίνοντας τιμή κατωφλίου της προς την οριακή τιμή ενός γονιδίου αναφοράς που υπάρχει στο δείγμα.

Παράθεση: Βάργκας DY, Kramer FR, Tyagi S, Μάρρα ΣΑΕ (2016) Multiplex Real-Time PCR δοκιμασίες που μετρούν την πληθώρα των εξαιρετικά σπάνιες μεταλλάξεις συνδέονται με τον καρκίνο. PLoS ONE 11 (5): e0156546. doi: 10.1371 /journal.pone.0156546

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 23 του Μάρ, 2016? Αποδεκτές: 16 Μαΐου του 2016? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2016

Copyright: © 2016 Vargas et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η έρευνα αυτή, η επιβάρυνση της ανοικτής πρόσβασης για τη δημοσίευση του παρόντος εγγράφου, καθώς και τους μισθούς όλων των συντακτών αυτού του χειρογράφου υποστηρίχθηκαν από το Ινστιτούτο του εργαστηρίου (Public Health Research, Πανεπιστήμιο Rutgers) το μερίδιο των εσόδων που έλαβε από το μη αποκλειστικές άδειες εκμετάλλευσης της τεχνολογίας μοριακών φάρων από PHRI Properties, Inc, η οποία είναι μια μη κερδοσκοπική εταιρεία που ανήκει εξ ολοκλήρου από το Πανεπιστήμιο Rutgers. Ούτε PHRI Properties, Inc., ούτε των φάρων τους δικαιοδόχους του περίπου 75 μοριακών, είχε οποιοδήποτε ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. FRK , ST, και SAEM λαμβάνουν δικαιώματα από τη μη αποκλειστικές άδειες εκμετάλλευσης της τεχνολογίας μοριακών φάρων από PHRI Properties, Inc. Οι σχετικές με άδεια διπλώματα ευρεσιτεχνίας Ηνωμένων Πολιτειών είναι: «ανιχνεύσιμα σημασμένο Διπλή Διάπλαση ολιγονουκλεοτιδίων Probes, Αναλύσεις και κιτ» 5.925.517? και «νουκλεϊκών οξέων Ανίχνευση ανιχνευτές που έχουν μη-FRET η απόσβεση φθορισμού και Κιτ και Δοκιμασίες συμπεριλαμβανομένων των Πιστόνια» 6150097. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Έχει περάσει πολύς-αναζήτησαν ιατρική στόχο να είναι σε θέση να ανιχνεύσει σε πολύ πρώιμο στάδιο εξαιρετικά σπάνιες μεταλλάξεις των οποίων η παρουσία σε ένα κλινικό δείγμα είναι χρήσιμη για τη διάγνωση του καρκίνου, τον καθορισμό της πρόγνωσης, και που αφορά την επιλογή της αποτελεσματικής θεραπείας [1]. Η αξιολόγηση ανίχνευση και ποσοτική των σχετικών σωματικών μεταλλάξεων έχει πολλαπλές χρήσεις, που περιλαμβάνουν: (i) την ανίχνευση του καρκίνου σε θεραπεύσιμη στάδιο σε ασθενείς που κληρονομούν τα γονίδια που καθιστούν πιο πιθανό καρκίνο? (Ii) την ανίχνευση μεταλλάξεων σε καλοήθη καρκινικά κύτταρα που δείχνουν ότι μπορούν τώρα μετάσταση? (Iii) μέτρηση της αφθονίας των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας? και (iv) τον καθορισμό για το κατά πόσον ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικών κυττάρων έχουν προκύψει κατά τη διάρκεια της θεραπείας, έτσι ώστε η θεραπεία μπορεί να ρυθμιστεί. Μια περαιτέρω στόχος είναι η ανάπτυξη μεθόδων που επιτρέπουν την πολλαπλή δοκιμασίες που μπορεί να μετρήσει ταυτόχρονα την αφθονία των διαφορετικών σπάνιες μεταλλάξεις. Εάν αυτές οι δοκιμασίες ήταν να γίνει διαθέσιμη, ο καρκίνος θα μπορούσε δυνητικά να μετατραπεί από μια συχνά θανατηφόρα ασθένεια σε χρόνια πάθηση που μπορεί να αντιμετωπιστεί με συχνές δοκιμές σε συνδυασμό με την εξατομικευμένη θεραπευτική προσαρμογές.

Παρακίνηση αυτές τις προσπάθειες για είναι η συνειδητοποίηση ότι καρκινικά κύτταρα, δεν έχει σημασία πού μέσα στο σώμα βρίσκονται, διαιρούν συχνά, υφίστανται απόπτωση και νέκρωση, και κατά συνέπεια, θραύσματα γενωμικού DNA από αυτά τα καρκινικά κύτταρα είναι παρόντα στο πλάσμα του αίματος του κάθε ασθενούς [2]. Η συνειδητοποίηση αυτή έχει ανοίξει το ενδεχόμενο ότι η παρουσία σπάνιες μεταλλάξεις ενδεικτική της διάγνωσης του καρκίνου, την πρόγνωση και θεραπεία μπορεί να ανιχνευθεί και να ποσοτικοποιηθεί σε ένα πολύ πρώιμο στάδιο, εκτελώντας «υγρό βιοψίες,» χρησιμοποιώντας DNA απομονωμένο από το πλάσμα [3-5] . Η πρόκληση που αντιμετωπίζει σχεδιαστές δοκιμασίας είναι να βρει ένα μέσο για την επιλεκτική ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό αυτά τα σπάνια μεταλλαγμένη θραύσματα αλληλουχίας του DNA στο πλάσμα, παρά την παρουσία θραυσμάτων αλληλουχίας άφθονα άγριου τύπου που προέρχονται από τα φυσιολογικά κύτταρα σε όλο το σώμα, και παρά το γεγονός ότι οι διαφορετικές σχετικές μεταλλάξεις , αν και προέρχονται από διαφορετικά κύτταρα, συμβαίνουν συχνά στο ίδιο ή σε γειτονικά κωδικόνια. Η επιτυχία της αλληλούχισης «επόμενης γενιάς» για την ανίχνευση σπάνιων μεταλλαγμένη αλληλουχία θραυσμάτων του DNA στο πλάσμα [6-8], αν και περίπλοκη και δαπανηρή, έχει απεικονισθεί η αξία αυτής της προσέγγισης.

Molecular διαγνωστικές δοκιμασίες με βάση την η εκθετική ενίσχυση των αλληλουχιών νουκλεϊνικού οξέος στόχου, όπως αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης, είναι φθηνές και αρκετά ευαίσθητη για την παραγωγή σημάτων από τόσο λίγο όσο ένα μόνο μόριο εκμαγείου. Η πρόκληση είναι να σχεδιάσει αυτές τις δοκιμασίες για να είναι εξαιρετικά επιλεκτικές, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η εκθετική ενίσχυση του μεταλλαγμένου DNA θραυσμάτων, ενώ ταυτόχρονα καταστέλλει την παραγωγή αμπλικονίων από πολύ πιο άφθονη θραύσματα DNA άγριου τύπου, ακόμα και όταν η μόνη διαφορά μεταξύ της μεταλλαγμένης αλληλουχίας και η αλληλουχία άγριου τύπου είναι ένα ενιαίο-νουκλεοτιδίου πολυμορφισμού.

ελπιδοφόρες προσεγγίσεις χρησιμοποιούν εναρκτήρες ενίσχυσης που έχουν σχεδιαστεί για να είναι εξαιρετικά επιλεκτική. Για παράδειγμα, οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του συστήματος ενίσχυσης πυρίμαχων μετάλλαξη (ARMS) εκκινητές [9] είναι απολύτως συμπληρωματικά με μεταλλαγμένο αλληλουχίες στόχους, αλλά περιέχουν «ανακρίνει νουκλεοτίδιο» στο 3 ‘άκρο τους, που δεν είναι συμπληρωματικό προς το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο στο άγριου τύπου αλληλουχίες στόχου. Τα προκύπτοντα κακοταιριασμένα υβρίδια άγριου τύπου είναι πολύ λιγότερο πιθανό να μπορέσει η σύνθεση του αμπλικονίων, επειδή DNA πολυμεράσες απαιτούν ένα 3’-τερματικό ζεύγος βάσεων για την έναρξη της σύνθεσης. Εδώ, ο επιλεκτικός μηχανισμός είναι ενζυματική. Από την άλλη πλευρά, η διπλή ολιγονουκλεοτίδιο αστάρωμα (DPO) εκκινητές [10], MYT εκκινητές [11], αστάρια φουρκέτα [12, 13], και εκκινητές PASS [14], χρησιμοποιούν ένα διαφορετικό μηχανισμό. Μπορούν επίσης να έχουν μία αλληλουχία πλήρωσης που είναι απολύτως συμπληρωματικό σε ένα μεταλλαγμένο στόχο, αλλά περιέχουν ένα εσωτερικό νουκλεοτίδιο ερωτήσεως που δεν ταιριάζει με την αντίστοιχη αλληλουχία άγριου τύπου. Το μήκος της αλληλουχίας πλήρωσης τους επιλέγεται έτσι ώστε, υπό συνθήκες ανόπτησης, τέλεια συμπληρωματικός μεταλλαγμένο υβρίδια είναι πιθανό να σχηματίσουν, και συνεπώς είναι πιθανό να οδηγήσει στη δημιουργία αμπλικονίων, ενώ ακατάλληλα υβρίδια άγριου τύπου είναι πολύ λιγότερο πιθανό να σχηματίσουν, και Ως εκ τούτου, είναι πολύ λιγότερο πιθανό να οδηγήσει στη δημιουργία του αμπλικονίων. Εναλλακτικές προσεγγίσεις, με τη συμμετοχή PCR-σύσφιξης [15] ή της χρήσης φουρκέτα ολιγονουκλεοτιδικών αναστολέων [16], χρησιμοποιούν ένα μίγμα που περιέχει και τα δύο συμβατικά εκκινητές DNA που προσδένονται σε μεταλλαγμένες αλληλουχίες, και «αντι-εκκινητές» που είναι σχεδιασμένες να δεσμεύονται επιλεκτικά με τα άγρια -τύπου αλληλουχίες, εμποδίζοντας έτσι την έναρξη της συνθέσεως αμπλικονίου άγριου τύπου. Ωστόσο, όλες αυτές οι προσεγγίσεις, αν και γενικά εφαρμόσιμη για την ανίχνευση μεταλλαγμένων αλληλουχιών, είτε δεν είναι επαρκώς ευαίσθητες για την ανίχνευση εξαιρετικά σπάνιες μεταλλάξεις [12-15], δεν είναι συμβατή με πραγματικού χρόνου PCR λόγω της παρουσίας των μη φυσικών νουκλεοτιδίων στην αλληλουχία τους [10], ή δεν έχουν δείξει να ενεργοποιήσετε ποσοτικών προσδιορισμών multiplex PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο όταν συμβαίνουν διαφορετικές μεταλλάξεις στόχο στο ίδιο κωδικόνιο [9, 11, 16].

Αυτή η έκθεση περιγράφει πειράματα που διερευνούν το σχεδιασμό και τη λειτουργία του «υπερεκλεκτική» PCR εκκινητές που επιτρέπουν την ποσοτικοποίηση των σπάνιων μεταλλαγμένου στόχων. Σημαντικά, μια φορά αυτοί οι εκκινητές να ξεκινήσει σύνθεση στο μεταλλαγμένο DNA θραύσματα, τα προκύπτοντα αμπλικόνια είναι εκθετικά ενισχύονται με υψηλή αποτελεσματικότητα σε μεταγενέστερες θερμικών κύκλων, και τα δεδομένα σε πραγματικό χρόνο παρέχει ένα συμβατικό μέσο εκτίμησης της αφθονίας των μεταλλαγμένων πρότυπα στο αρχικό δείγμα. Επιπλέον, η παρούσα έκθεση περιγράφει ιδίως σχέδια για τις υπερεκλεκτική εκκινητές, και τροποποιήσεις στη μορφή PCR, που επιτρέπουν multiplex προσδιορισμούς PCR πραγματικού χρόνου για να πραγματοποιηθεί η μέτρηση της αφθονίας των διαφορετικών μεταλλαγμένου αλληλουχίες στόχους σε σχέση με την αφθονία της παραπομπής άγριας τύπου αλληλουχία που υπάρχει σε κάθε δείγμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αστάρια και μοριακών φάρων

υπερεκλεκτική αστάρι αλληλουχίες εξετάστηκαν με τη βοήθεια του web server Mfold [17] και η OligoAnalyzer πρόγραμμα υπολογιστή (Integrated DNA Technologies, Coralville, ΙΑ) να εξασφαλίζουν ότι, υπό τις συνθήκες δοκιμασίας είναι απίθανο να σχηματίσουν εσωτερικές δομές φουρκέτας, και είναι απίθανο να σχηματίσουν αυτο-διμερή ή ετεροδιμερή με τα συμβατικά αντίστροφη αστάρια. Οι εκκινητές αγοράστηκαν από Integrated DNA Technologies? και οι διαφορετικού χρώματος ανιχνευτών μοριακών φάρων για την ανίχνευση των αμπλικόνια αγοράστηκαν από Biosearch Technologies (Petaluma, CA).

πρότυπα DNA

Τα πλασμίδια που περιέχουν

EGFR

ακολουθίες (είτε το L858 μεταλλαγμένη αλληλουχία ή την αλληλουχία άγριου τύπου) παρασκευάσθηκαν με την εισαγωγή ενός θραύσματος γονιδίου ζευγών βάσεων 115 σε pGEM

®-11Zf (+) φορέα (Promega, Madison, WI). Οι αλληλουχίες αυτών των πλασμιδίων επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας. Ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA που κωδικοποιεί το

EGFR

μετάλλαξη L858R απομονώθηκε από την κυτταρική σειρά H1975 (CRL-5908, American Type Culture Collection, Manassas, VA) και το ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA που περιέχει την αντίστοιχη αλληλουχία άγριου τύπου αγοράστηκε από Coriell Κυττάρων αποθετήρια (Camden, NJ). Η μεταλλαγμένη και άγριου τύπου

EGFR

πλασμίδια, και το χρησιμοποιηθέν ανθρώπινο γονιδίωμα DNA, υποβλήθηκαν σε πέψη με επώαση με ενδονουκλεάση περιορισμού MSE Ι (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ). Τα 20-μΙ μίγματα πέψης περιείχε 4 μg DNA, 10 μονάδες MSE Ι, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, /mL λευκωματίνης βοείου ορού 100 μα, και 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.9). Αυτές οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 120 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από επώαση για 20 λεπτά στους 65 ° C για την απενεργοποίηση του ενδονουκλεάσης.

Τα πλασμίδια που περιέχουν

BRAF

αλληλουχίες (είτε η αλληλουχία V600E μεταλλάκτη, η αλληλουχία V600R μεταλλαγμένο, ή την αλληλουχία άγριου τύπου) αγοράστηκαν από την Integrated DNA Technologies, και παρασκευάστηκαν με την εισαγωγή ενός θραύσματος γονιδίου 200 ζευγών βάσεων σε φορείς pIDTSmart Amp. Η

BRAF

πλασμίδια υπέστησαν πέψη με επώαση με ενδονουκλεάση περιορισμού Sca Ι (New England Biolabs). Τα 20-μΙ μίγματα πέψης περιείχε 4 μg DNA, 10 μονάδες Sca Ι, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, και 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.9). Αυτές οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 120 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από επώαση για 20 λεπτά στους 80 ° C για την απενεργοποίηση της ενδονουκλεάσης.

PCR δοκιμασίες

Monoplex πραγματικό χρόνο αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης εκτελέστηκαν σε 30-μΙ όγκους που περιέχει 50 mM ΚΟΙ, 3 mM MgCl

2, 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 250 μΜ άΑΤΡ, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP, 250 μΜ dTTP, 1.5 μονάδες AmpliTaq Gold DNA πολυμεράσης (ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ), 120 ηΜ του κάθε εκκινητή, και 1χ SYBR

® Green (ThermoFisher Scientific) για την παρακολούθηση αμπλικόνιο αφθονία κατά το στάδιο επιμήκυνσης αλυσίδας του κάθε θερμικό κύκλο.

Duplex πραγματικός -Time αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης εκτελέστηκαν σε 30 μΙ όγκων που περιέχει 50 mM ΚΟΙ, 2.5 mM MgCl

2, 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 250 μΜ άΑΤΡ, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP, 250 μΜ dTTP , 1,5 μονάδες Platinum Taq DNA πολυμεράσης (ThermoFisher Scientific), είτε 500 nM (συμμετρική PCR) ή 60 nM (μη συμμετρική PCR) του κάθε

BRAF

υπερεκλεκτική αστάρι, 1,000 nM του συμβατικού

BRAF

κοινή αντίστροφο εκκινητή, και 300 ηΜ του κάθε μοριακών φάρων για την παρακολούθηση της αφθονίας κάθε τύπου αμπλικονίου κατά το στάδιο ανόπτησης κάθε θερμικό κύκλο.

Triplex πραγματικό χρόνο αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης περιείχαν τα ίδια αντιδραστήρια όπως οι duplex αντιδράσεις, εκτός από το ότι περιείχε 60 ηΜ από κάθε

BRAF

υπερεκλεκτική αστάρι, 60 nM του

EGFR

υπερεκλεκτική αστάρι, 1,000 nM του συμβατικού

BRAF

κοινή αντίστροφη αστάρι, και 500 nM του συμβατικού

EGFR

αντίστροφο εκκινητή. Χρησιμοποιήσαμε

EGFR

πλασμίδια άγριου τύπου με το γονίδιο-στόχο αναφοράς σε αυτές τις δοκιμασίες μοντέλο triplex, δεδομένου ότι ήταν διαθέσιμα στο εργαστήριο μας.

Όλες οι ενισχύσεις διεξήχθησαν σε 200 μΙ λευκό πολυπροπυλένιο PCR σωλήνες (ΗΠΑ επιστημονική, Ocala, FL) σε IQ5 φασματοφθορισμομετρικού θερμικό ανακυκλωτή (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Τα μίγματα αντίδρασης επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 95 ° C για να ενεργοποιηθεί το AmpliTaq Gold DNA πολυμεράσης (monoplex αντιδράσεις) ή επωάστηκαν για 2 λεπτά στους 95 ° C για να ενεργοποιηθεί η πολυμεράση Platinum Taq DNA (multiplex αντιδράσεις), που ακολουθείται από 55 ή 60 κύκλους που αποτελούνταν από 95 ° C μετουσίωση επί 20 δευτερόλεπτα, 60 ° C ανόπτηση για 20 δευτερόλεπτα, και 72 επιμήκυνση της αλυσίδας ° C για 20 sec.

Αποτελέσματα

υπερεκλεκτική εκκινητές είναι ολιγοδεοξυριβονουκλεοτίδια των οποίων η λειτουργία σε ένα PCR δοκιμασία έχει διαιρεθεί σε δύο μέρη [10, 14, 18]. Η λειτουργία του αποτελεσματικά δέσμευσης σε ένα γονίδιο που μας ενδιαφέρει έχει εκχωρηθεί σε ένα σχετικά μεγάλο 5 ‘τμήμα αλληλουχίας (που ονομάζουμε «άγκυρα»), και η λειτουργία του να δεσμεύεται επιλεκτικά σε ένα κοντινό υποαλληλουχία εντός αυτού του γονιδίου που περιέχει την μετάλλαξη ενδιαφέροντος, και, στη συνέχεια, την έναρξη της σύνθεση ενός αμπλικονίου, έχει ανατεθεί σε ένα ξεχωριστό, μικρό τμήμα 3 ‘ακολουθία (που ονομάζουμε «πόδι»). Το πόδι περιέχει ένα «διερευνητικό νουκλεοτίδιο» που είναι συμπληρωματικό προς το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο στο μεταλλαγμένο αλληλουχία στόχο, αλλά δεν ταιριάζει με το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο στην αλληλουχία στόχο άγριου τύπου. Σε υπερεκλεκτική εκκινητές, η άγκυρα διαχωρίζεται από το πόδι από μια πρόσθετη, σχετικά μακρύ, δεοξυριβονουκλεοτίδιο τμήμα αλληλουχίας (που ονομάζουμε «γέφυρα»). Η γέφυρα επιλέγεται έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι δεν σχηματίζει δευτερεύουσες δομές και δεν είναι συμπληρωματική με την «παρεμβαλλόμενη αλληλουχία» στο μόριο εκμαγείο που ενώνει την αλληλουχία-στόχο άγκυρα με την αλληλουχία στόχο πόδι. Κατά συνέπεια, όταν ο εκκινητής υβριδοποιείται σε ένα μόριο εκμαγείο, η αλληλουχία γέφυρα στον εκκινητή και η παρεμβαλλόμενη αλληλουχία στο πρότυπο σχηματίζουν ένα μονόκλωνο «φούσκα» που διαχωρίζει λειτουργικά αποτελεσματική διαμόρφωση του υβριδικού άγκυρα από το σχηματισμό του υβριδικού ποδιού . Τα προκύπτοντα εκκινητές είναι διλειτουργικά: υπό συνθήκες ανόπτησης, η μακρά 5 ‘αλληλουχία άγκυρα επιτρέπει στον εκκινητή να δεσμεύουν αποτελεσματικά και επιλεκτικά με την γονιδιωματική περιοχή ενδιαφέροντος που υπάρχει στα θραύσματα του DNA στόχου, ενώ η βραχεία αλληλουχία 3’ πόδι (το οποίο κατέχει το ερωτώντος νουκλεοτίδιο ), επειδή είναι δεμένοι με την αλληλουχία άγκυρας από την αλληλουχία γέφυρα, είναι σε θέση να σχηματίσει ένα ασθενές (τέλεια συμπληρωματικός) υβρίδιο με το μεταλλαγμένο αλληλουχία στόχο? ακόμη λόγω της μικρού μήκους του, το πόδι είναι απίθανο να σχηματίσει ένα σημαντικά ασθενέστερες (παράταιρα) υβρίδιο με την αντίστοιχη αλληλουχία άγριου-τύπου.

Το Σχήμα 1Α δείχνει ένα παράδειγμα ενός υπερεκλεκτική εκκινητή συνδεδεμένο με μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο του. Αυτή η συγκεκριμένη εκκινητής σχεδιάστηκε για να ενισχύσει επιλεκτικά θραύσματα DNA που περιέχει το

BRAF

V600E μονού νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός, των οποίων η παρουσία στα κύτταρα προδιαθέτει τους ασθενείς σε κληρονομικό μη-πολυποειδούς καρκίνο του παχέος εντέρου [19, 20]. Αναφερόμαστε σε αυτό το αλφαβητάρι ως «

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1″, το οποίο δείχνει ότι η ακολουθία άγκυρα είναι μήκους 24 νουκλεοτιδίων, η αλληλουχία γέφυρα έχει μήκος 14 νουκλεοτιδίων (απέναντι από ένα παρεμβαλλόμενη αλληλουχία στο πρότυπο που είναι επίσης μήκους 14 νουκλεοτιδίων), και η αλληλουχία πόδι έχει μήκος 7 νουκλεοτίδια, με το νουκλεοτίδιο ανακρίνει βρίσκεται στην προτελευταία θέση από ‘άκρο του εκκινητή για 3.

(Α) υπερεκλεκτική εκκινητή

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1 περιέχει μια μεγάλη αλληλουχία 5′-άγκυρα που συνδέεται ισχυρά με έλικες προτύπου, μια σύντομη ακολουθία 3′-ποδιού που περιλαμβάνει ένα νουκλεοτίδιο ερωτήσεως που είναι απόλυτα συμπληρωματικό με το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο σε ένα μεταλλαγμένο πρότυπο (αλλά δεν ταιριάζει με το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο σε ένα πρότυπο άγριου τύπου), και μια αλληλουχία γέφυρα που συνδέει την αλληλουχία άγκυρας στην ακολουθία πόδι, και ότι επιλέγεται να μην είναι συμπληρωματική με την αντίστοιχη παρεμβαλλόμενη αλληλουχία στο πρότυπο κλώνο, σχηματίζοντας έτσι ένα μονόκλωνο φούσκα που διαχωρίζει τη λειτουργία της άγκυρας από τη λειτουργία του ποδιού. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR δοκιμασίες που απασχολούν υπερεκλεκτική αστάρι

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1. Έξι αντιδράσεις ξεκίνησαν με το 10

6

BRAF

πρότυπα άγριου τύπου καθώς και διαφορετικές ποσότητες των μεταλλαγμένων πρότυπα (10

1, 10

2, 10

3, 10

4 , 10

5, και 10

6) απεικονίζονται με μπλε? μια αντίδραση που ξεκίνησε με μόνο 10

6 πρότυπα άγριου τύπου σχεδιάζεται με διακεκομμένη γραμμή πορτοκαλί? και μία αντίδραση ελέγχου που δεν περιέχει DNA εκμαγείο σχεδιάζεται με κόκκινο χρώμα. (Γ) Ο κύκλος κατωφλίου που μετρήθηκε για κάθε αντίδραση που περιείχε μεταλλαγμένη templates σχεδιάζεται ως συνάρτηση του λογαρίθμου του αριθμού των μεταλλαγμένων templates αρχικώς παρούσα σε κάθε αντίδραση. Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει την πορτοκαλί κύκλο κατώφλι της αντίδρασης που περιέχει μόνο πρότυπα άγριου τύπου.

Η

δοκιμασίες PCR πραγματικού χρόνου που περιέχει υπερεκλεκτική εκκινητές

σε πραγματικό χρόνο PCR δοκιμασίες διεξήχθησαν, των οποίων η μόνη διαφορά από ένα συμβατικό πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία ήταν η αντικατάσταση του συμβατικού πρόσθιου εκκινητή με το

BRAF

V600E υπερεκλεκτική πρόσθιο εκκινητή δείχνεται στο Σχήμα 1Α. Αυτές monoplex δοκιμασίες περιείχε ένα συμβατικό αντίστροφο έναυσμα που ήταν παρούσα στην ίδια συγκέντρωση όπως το αστάρι υπερεκλεκτική. Οκτώ δοκιμασίες 30 μΙ PCR παρασκευάστηκαν. Επτά από τις αντιδράσεις που περιείχαν θραύσματα DNA από 10

6 πλασμίδια που διαθέτουν το

BRAF

αλληλουχία άγριου τύπου και τα θραύσματα DNA από είτε 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 10

1 ή 0 πλασμίδια που έχουν το single-νουκλεοτιδίων πολυμορφισμό στο

BRAF

αλληλουχία V600E μεταλλαγμένα. Ένα όγδοο αντίδραση που δεν περιείχαν θραύσματα DNA χρησίμευσε ως μάρτυρας. Όλες οι αντιδράσεις περιείχαν την χρωστική DNA παρεμβαλλόμενοι, SYBR

® Green, του οποίου η ένταση φθορισμού κατά τη φάση επιμήκυνσης αλυσίδας του κάθε θερμικού κύκλου αντανακλά τον αριθμό των αμπλικονίων συντεθεί.

Το σχήμα 1Β δείχνει τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος . Η αντίδραση ελέγχου που δεν περιείχαν μήτρα DNA δεν παρήγαγαν κανένα ψευδώς αμπλικονίων, όπως διμερή αρχικά τεμάχια, παρά την μεγαλύτερη διάρκεια των υπερεκλεκτική εκκινητών. Η αντίδραση που περιέχει 1.000.000 πρότυπα άγριου τύπου και μεταλλαγμένου κανένα πρότυπα κατεστάλη σε τέτοιο βαθμό που δεν παρήγαγαν ένα σημαντικό αριθμό αμπλικονίων μέχρι περίπου 50 κύκλους ενίσχυσης είχαν πραγματοποιηθεί. Ωστόσο, οι έξι αντιδράσεις ξεκίνησαν με 1.000.000 πρότυπα άγριου τύπου και διαφορετικούς αριθμούς των μεταλλαγμένων templates έλαβε σημαντικά λιγότερες κύκλους ενίσχυσης για την παραγωγή ενός σημαντικού αριθμού αμπλικονίων. Όταν ο κύκλος ορίου (Ct) του καθενός από τα έξι αυτά αντιδράσεων σχεδιάστηκε έναντι του λογαρίθμου του αριθμού των μεταλλαγμένων πρότυπα σε κάθε αντίδραση, το αποτέλεσμα ήταν μια ευθεία γραμμή (σχήμα 1 C). Αυτή η αντίστροφη γραμμική σχέση μεταξύ του λογαρίθμου του αριθμού των μεταλλαγμένων στόχων αρχικά υπάρχει σε ένα δείγμα και η τιμή Ct που παρατηρείται για το δείγμα αυτό είναι το σήμα κατατεθέν των ποσοτικών δοκιμασιών εκθετική ενίσχυση [21, 22]. Σημαντικά, η τιμή Ct από το δείγμα που περιέχει 10 μεταλλαγμένο πρότυπα παρουσία 1.000.000 πρότυπα άγριου τύπου ήταν διακρίνεται εύκολα από την τιμή Ct που παράγεται από το δείγμα που περιείχε μόνο 1.000.000 πρότυπα άγριου τύπου (φαίνεται στο σχήμα ως διακεκομμένη γραμμή πορτοκαλί) .

σε αυτές τις δοκιμασίες, ο εκλεκτικός βήμα συμβαίνει όταν ένα υπερεκλεκτική εκκινητής δεσμεύεται σε ένα DNA (-) κλώνου εκμαγείου που υπάρχει στο αρχικό δείγμα που αναλύεται. Μόλις η αλληλουχία πρόποδες ενός υπερεκλεκτική εκκινητή εκκινεί τη σύνθεση ενός αμπλικονίου, ολόκληρη η αλληλουχία του εκκινητή υπερεκλεκτική (συμπεριλαμβανομένης της «τεχνητής» ακολουθία γέφυρα) ενσωματώνεται σε αυτό το αμπλικόνιο (+). Σε μεταγενέστερες θερμικών κύκλων, τα προκύπτοντα αμπλικόνια ενισχύεται αποτελεσματικά με τον συνήθη τρόπο, με το σύνολο του υπερεκλεκτική αλληλουχία εκκινητή που χρησιμεύει ως μια μακρά συμβατικό αστάρι που είναι εντελώς συμπληρωματική προς τα (-) αμπλικονίων, που περιλαμβάνουν το συμπλήρωμα της αλληλουχίας γέφυρα του εκκινητή στη θέση της παρεμβαλλόμενη αλληλουχία που ήταν παρούσα στο αρχικό πρότυπο (Σχήμα 2)

Η επιλεκτική βήμα εμφανίζεται μόνο όταν ένα υπερεκλεκτική εκκινητής υβριδοποιείται με ένα DNA. (-) θραύσμα μήτρας που υπάρχει στο δείγμα. Λόγω του μικρού μεγέθους της αλληλουχίας ποδιού, η πιθανότητα για την έναρξη (+) αμπλικόνιο είναι σημαντικά μεγαλύτερη εάν η αλληλουχία στόχος του ποδιού σύμφωνα με την (-) θραύσμα μήτρας είναι ένα πλήρως συμπληρωματικά μεταλλαγμένη αλληλουχία, από ό, τι εάν η αλληλουχία στόχος του το πόδι του (-) θραύσμα μήτρας είναι μια ακατάλληλα αλληλουχία άγριου τύπου. Σε περίπτωση που συμβεί (+) σύνθεση αμπλικόνιο, τότε η προκύπτουσα (+) αμπλικόνιο χρησιμεύει ως πρότυπο για ένα συμβατικό αντίστροφο εκκινητή, και αποτελεσματικά αντιγράφεται κατά τον επόμενο θερμικό κύκλο, δημιουργώντας ένα (-) αμπλικόνιο με την οποία το συμπλήρωμα της μοναδικής γέφυρας αλληλουχία η οποία ήταν παρούσα σε υπερεκλεκτική εκκινητή αντικαθιστά το παρεμβαλλόμενη αλληλουχία που ήταν παρούσα στο αρχικό (-) θραύσμα μήτρας. Ως αποτέλεσμα, σε μεταγενέστερες θερμικών κύκλων, ολόκληρη η αλληλουχία υπερεκλεκτική εκκινητή είναι συμπληρωματικό των (-) κλώνων αμπλικόνιο, και εκθετική ενίσχυση λαμβάνει χώρα αποτελεσματικά, και μπορεί να ακολουθηθεί σε πραγματικό χρόνο

Η

Βελτιστοποίηση του. ο σχεδιασμός της υπερεκλεκτική εκκινητών

Τα τρία μέρη του υπερεκλεκτική αστάρι εξυπηρετούν διαφορετικές λειτουργίες. αλληλουχία άγκυρας Το 5 ‘είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να είναι αρκετά μακρύ και αρκετά ισχυρή ώστε στη θερμοκρασία ανόπτησης της δοκιμασίας PCR συνδέεται με την αλληλουχία στόχο, ανεξάρτητα από το εάν ή όχι η αλληλουχία στόχος είναι μεταλλαγμένη ή άγριου τύπου. Η σύντομη αλληλουχία 3 πόδια, από την άλλη πλευρά, έχει σχεδιαστεί για να είναι σε θέση να συνδεθεί με το εντελώς συμπληρωματικό μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο στη θερμοκρασία ανόπτησης της δοκιμασίας PCR, αλλά να μην δεσμεύονται με την εσφαλμένης σύμπτωσης αλληλουχία άγριου τύπου υπό τις ίδιες συνθήκες . Ο ρόλος της φούσκας, που σχηματίζεται από την αλληλουχία γέφυρα στον εκκινητή και την παρεμβαλλόμενη αλληλουχία στο πρότυπο, είναι διπλός: (i) δια διαχωρισμού της αλληλουχίας άγκυρας από την ακολουθία πόδι, η παρουσία του μονόκλωνου φυσαλίδας αναγκάζει το σχηματισμός των αδυνάτων υβριδικού πόδι να συμβεί ανεξάρτητα από το σχηματισμό του ισχυρού άγκυρα υβρίδιο? και (ii) με την πρόσδεση της αλληλουχίας πόδι στον εκκινητή στο δυναμικό αλληλουχία στόχο στο πρότυπο, η πιθανότητα ότι η μικρή αλληλουχία πόδι (6, 7, ή 8 νουκλεοτίδια σε μήκος) θα σχηματίσουν πραγματικά ένα υβρίδιο είναι σημαντικά αυξημένη. Ένα free-floating ακολουθία το μέγεθος του ποδιού θα σχεδόν ποτέ σχηματίζουν ένα υβρίδιο με μία αλληλουχία στόχο υπό συνθήκες ανόπτησης PCR. Για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο που διαδραματίζουν οι διάφοροι τομείς ακολουθία υπερεκλεκτική εκκινητών, και προκειμένου να κατανοήσουν τον καλύτερο τρόπο για να σχεδιάσουν αυτά τα εναύσματα έτσι ώστε να είναι άκρως επιλεκτική για κάθε συγκεκριμένη αλληλουχία-στόχο, θα πραγματοποιηθεί μια σειρά από δοκιμασίες μοντέλο που διερευνώνται το βέλτιστο σχεδιασμό της ακολουθίας πόδι, και το βέλτιστο σχεδιασμό της φούσκας.

η ακολουθία άγριου τύπου στην οποία το

εμφανίζεται BRAF

μετάλλαξη V600E είναι πλούσια (3′-TAAAGTG-5 ‘), εξασφαλίζοντας έτσι ότι ο αδύναμος ακατάλληλα υβρίδιο που σχηματίζει με το πόδι του το

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1 υπερεκλεκτική αστάρι είναι πολύ απίθανο να σχηματιστεί κάτω από τις συνθήκες ανόπτησης του PCR δοκιμασία [23], που οδηγεί στην σημαντική καταστολή της σύνθεσης αμπλικονίου άγριου τύπου (Σχήμα 1). Ωστόσο, όταν πραγματοποιείται παρόμοιες δοκιμασίες με υπερεκλεκτική εκκινητή σχεδιασμένο για την ανίχνευση της μονής νουκλεοτιδίου πολυμορφισμού στο

EGFR

μεταλλαγμένη αλληλουχία L858R, του οποίου η παρουσία στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου προβλέπει αντίσταση σε αναστολείς κινάσης τυροσίνης [ ,,,0],24, 25], βρήκαμε ότι η παρουσία της σε ένα πλούσιο σε GC αλληλουχία άγριου-τύπου (3′-ACCCGAC-5 ‘) κατέληξε σε λιγότερο καταστολή της σύνθεσης αμπλικονίου άγριου τύπου. Ως εκ τούτου, διεξάγεται μια σειρά πειραμάτων με διαφορετικά

EGFR

L858R υπερεκλεκτική σχέδια εκκινητή (Σχήμα 3) για τη βελτιστοποίηση διάκριση μεταξύ της μεταλλαγμένης αλληλουχίας και σχεδόν ταυτόσημη αλληλουχία άγριου τύπου της.

Η αλληλουχία γέφυρα μέσα σε κάθε υπερεκλεκτική εκκινητή παρουσιάζεται στο μπλε, και το νουκλεοτίδιο ανακρίνει σε κάθε αλληλουχία πόδι εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα. Η

Οι EGFR

εκκινητών L858R διατεταγμένα σε ομάδες που αντανακλούν τη χρήση τους σε συγκριτικά πειράματα. Η

BRAF

αλληλουχίας στόχου V600E έχει μήκος 69 ζεύγη βάσεων? η

EGFR

αλληλουχιών στόχου L858R είναι μήκους μεταξύ 79 και 87 ζεύγη βάσεων, ανάλογα με το αστάρι υπερεκλεκτική που χρησιμοποιείται? και η

EGFR

αλληλουχίας στόχου Τ790Μ έχει μήκος 68 ζεύγη βάσεων.

Η

Επίδραση της μεταβολής του μήκους της ακολουθίας πόδι

Εμείς διερευνηθεί ως αποτέλεσμα τη σύντμηση της διάρκειας αλληλουχίας ποδιού του υπερεκλεκτική εκκινητή για να ξεπεράσει την υψηλότερη πιθανότητα ότι το πόδι θα σχηματίσει ένα υβρίδιο με την πλούσια σε GC αλληλουχία που υπάρχει στο

EGFR

στόχος άγριου τύπου. Πραγματοποιήσαμε τρεις σειρές δοκιμασιών, όπου κάθε σετ χρησιμοποιώντας ένα υπερεκλεκτική εκκινητή του οποίου η αλληλουχία πόδι ήταν 6, 7, ή 8 νουκλεοτίδια σε μήκος. Σε όλες τις άλλες απόψεις, ο σχεδιασμός των εκκινητών ήταν η ίδια: (i) ο ανακρίνει νουκλεοτιδίων βρισκόταν στην προτελευταία θέση στο 3 ‘άκρο του κάθε ποδιού? (Ii) την αλληλουχία άγκυρας είχε μήκος 24 νουκλεοτιδίων? και (iii) την αλληλουχία γέφυρα και η παρεμβαίνουσα σειρά είναι αγορά το καθένα 14 νουκλεοτίδια. Οι αλληλουχίες αυτών των τριών εναρκτήρων (

EGFR

L858R 24-14 /14-6: 1: 1?

EGFR

L858R 24-14 /14-5: 1: 1? Και

EGFR

L858R 24-14 /14-4: 1: 1) δείχνονται στο Σχήμα 3. Κάθε σειρά δοκιμασιών PCR άρχισε με διαφορετικές ποσότητες των μεταλλαγμένων πρότυπο (10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, και 10

1 αντίγραφα) με την παρουσία 10

6 αντίγραφα του προτύπου άγριου τύπου. Οι προκύπτουσες τιμές κατωφλίου παρίσταται ως συνάρτηση του λογαρίθμου του αριθμού των μεταλλαγμένων templates που υπάρχει αρχικά (Σχήμα 4Α).

Η γραμμικότητα της σχέσης μεταξύ του κύκλου κατωφλίου και του λογαρίθμου του αρχικού αριθμού των μεταλλαγμένων templates παρούσα σε αντιδράσεις που περιέχουν 10

6 πρότυπα άγριου τύπου και διαφορετικές ποσότητες των μεταλλαγμένων προτύπου προσδιορίστηκε για PCR δοκιμασίες ξεκίνησαν με διαφορετικά σχέδια υπερεκλεκτική εκκινητή. (Α) PCR αντιδράσεις ξεκίνησαν με το

EGFR

L858R υπερεκλεκτική εκκινητών που διαθέτουν ακολουθίες πρόποδες του διαφορετικού μήκους. αντιδράσεις (Β) PCR ξεκινά με

EGFR

L858R υπερεκλεκτική εκκινητών που σχηματίζουν συμμετρικά φυσαλίδες διαφόρων περιφέρειας.

Η

Οι τιμές Ct που λαμβάνονται με το αστάρι που κατέχει το βραχύτερο μήκος ποδιών (έξι νουκλεοτίδια, 4: 1: 1) όλα εμπίπτουν σε μια ευθεία γραμμή, αποδεικνύοντας ότι ακόμη και αν η

EGFR

αλληλουχία-στόχος είναι πλούσια σε GC, τόσα λίγα όσο 10 μεταλλαγμένο πρότυπα θα μπορούσε να ποσοτικοποιηθεί χωρίς παρεμβολή από τα 1.000.000 πρότυπα φυσικού τύπου που ήταν παρόντες. Οι εκκινητές που διαθέτουν μήκη πλέον πόδι (επτά νουκλεοτίδια, 5: 1: 1? Ή οκτώ νουκλεοτίδια, 6: 1: 1), όμως, οδήγησε σε μια απόκλιση από τη γραμμικότητα όταν τα μεταλλαγμένα στόχοι είναι πιο σπάνια, λόγω της ανεπαρκούς καταστολή της σύνθεσης αμπλικονίου σε τα άφθονα πρότυπα άγριου τύπου. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι βραχύτερα μήκη πόδι, αν και η μείωση της αφθονίας ισορροπία των υβριδίων ποδιού, με αποτέλεσμα μεγαλύτερες καθυστερήσεις πριν επιτευχθεί ο κύκλος κατωφλίου, να οδηγήσουν σε ενισχυμένη επιλεκτικότητα. Από θερμοδυναμική άποψη, η βελτιωμένη επιλεκτικότητα σε μικρότερα μήκη πόδι οφείλεται στην μεγαλύτερη αναλογία αφθονίας ισορροπίας του τέλεια συμπληρωματικός μεταλλαγμένου υβρίδια πόδι σε σύγκριση με την αφθονία του ισορροπία αταίριαστων υβριδίων πόδι άγριου τύπου.

Επίδραση της μεταβολής η θέση του νουκλεοτιδίου ερωτώντος

Ερευνήσαμε επίσης την επίδραση της μεταβολής της θέσης του νουκλεοτιδίου ερωτήσεως στην αλληλουχία πόδι στην ικανότητα του εκκινητή για να διακρίνει μεταλλαγμένο πρότυπα από πρότυπα άγριου τύπου. Πραγματοποιήσαμε μία σειρά δοκιμασιών PCR στην οποία χρησιμοποιήθηκαν έξι διαφορετικά υπερεκλεκτική εναύσματα, έκαστο που διαθέτουν νουκλεοτίδιο ερωτήσεως σε μια διαφορετική θέση μέσα σε ένα 7-νουκλεοτιδίων-μήκους αλληλουχία πόδι. Τα μήκη της αλληλουχίας άγκυρας, αλληλουχία γέφυρα, και παρεμβαίνουσα σειρά διατηρήθηκαν στους 24, 14 και 14 νουκλεοτίδια, αντιστοίχως. Οι αλληλουχίες αυτών των έξι

Οι EGFR

εκκινητές L858R φαίνεται στο Σχ 3. Δύο αντιδράσεις διεξήχθησαν με κάθε εκκινητή, το ένα άρχισε με 1.000.000 αντίγραφα του μεταλλαγμένου προτύπου, και ένας άρχισε με 1.000.000 αντίγραφα του εκμαγείου άγριου τύπου. Οι κύκλοι κατώφλι που παρατηρήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το παράθυρο των διακρίσεων (ΔCt) μεταξύ του κύκλου κατωφλίου για το μεταλλαγμένο και τον κύκλο κατωφλίου για τον άγριο τύπο είναι ευρύτερη όταν η θέση του νουκλεοτιδίου ερωτώντος είναι πιο κοντά στο το 3 ‘άκρο του εκκινητή. Επειδή υπάρχει μόνο μία μικρή διαφορά στην ΔCt μεταξύ του εκκινητή του οποίου η ερωτώντος νουκλεοτιδίων βρισκόταν στο 3 ‘άκρο του ποδιού (ΔCt = 18.8), και ο εκκινητής του οποίου ανακρίνει νουκλεοτιδίων βρισκόταν στην προτελευταία θέση από το 3’ άκρο του πόδι (ΔCt = 18,2), καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η τοποθέτηση του νουκλεοτιδίου ανακρίνει είτε σε θέση λειτουργεί καλά. Από ερωτώντος νουκλεοτίδιο στην προτελευταία θέση από το 3 ‘άκρο του ποδιού δεν σχηματίζει ένα ζεύγος βάσεων με το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο στην αλληλουχία άγριου τύπου, υπό συνθήκες ανόπτησης PCR, το 3’-τερματικό νουκλεοτίδιο του ποδιού είναι πολύ απίθανο για να σχηματίσουν ένα ζεύγος βάσεων με το αντίστοιχο συμπληρωματικό νουκλεοτίδιο στην αλληλουχία άγριου τύπου.

η

επίδραση της μεταβολής της περιφέρειας της φούσκας

Ερευνήσαμε επίσης την επίδραση της μεταβολής της περιφέρειας του η φούσκα μονόκλωνο που χωρίζει λειτουργικά το υβριδικό άγκυρα από το υβριδικό πόδι (βλέπε Σχήμα 1).