Αφηρημένο

Στόχος

Για να διερευνήσει τα βασικά ρυθμιστικά γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα, προκειμένου να να μειώσει την εμφάνιση και την πρόοδο του μέσω φίμωση αυτά τα βασικά γονίδια.

Μέθοδοι

για τον προσδιορισμό των βασικών ρυθμιστικών γονιδίων που εμπλέκονται στον καρκίνο του πνεύμονα, πραγματοποιήσαμε ένα συνδυασμό συστοιχίας γονιδίων και της βιοπληροφορικής ανάλυσης να συγκρίνουν τα προφίλ μεταγραφής γονιδίων σε 3 στελέχη μονοκλωνικών κυττάρων με υψηλή, μέση ή χαμηλή μεταστατική ικανότητες, που διαχωρίστηκαν από τις κυτταρικές γραμμές SPC-Α-1sci και SPC-Α-1 με περιοριστική δοκιμασία monoclone αραίωσης. Στη συνέχεια αναλύθηκαν βιολογικές δραστηριότητες αυτών των γονιδίων μέσω της χτυπήσει κάτω την έκφρασή τους σε κύτταρα SPC-Α-1sci χρησιμοποιώντας siRNA και lenti-ιικών φορέων shRNA, ακολουθούμενο από προσδιορισμούς της εισβολής και της μετανάστευσης των δυνατοτήτων των προκυπτόντων κυτταρικών σειρών in vitro, καθώς και το δυναμικό τους για την επαγωγή εμφάνιση και τη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα in vivo. Να εξετάσει την κλινική σημασία αυτών των ευρημάτων, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που εντοπίζονται σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα (n = 135) και συμφωνημένα δίπλα φυσιολογικούς ιστούς με ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC).

Αποτελέσματα

Τρία στελέχη μονοκλωνικών κυττάρων χαρακτηρίζεται από υψηλή, μεσαία ή χαμηλή μεταστατική ικανότητες επιτυχία επιλεγεί. συστοιχίας γονιδίων και της βιοπληροφορικής αναλύσεις άφησε να εννοηθεί ότι οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 ήταν βασικά γονίδια που εμπλέκονται στον καρκίνο του πνεύμονα. Knockdown αυτών των γονιδίων καταστέλλεται ανθρώπινη εισβολή καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων και τη μετάσταση in vitro και in vivo. Οι αναλύσεις κλινικό δείγμα έδειξε ότι οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, σε σύγκριση με μη-καρκινικές παρακείμενους ιστούς, και συσχετίζεται με μετάσταση του λεμφικού.

Συμπεράσματα

Επιβεβαιώσαμε ότι οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και τη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα, εφόσον έτσι σημαντικά στοιχεία για την κατανόηση του μοριακού μηχανισμού της μετάστασης και συμβάλλοντας στη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Wang XM, Λι J, Γιαν MX, Liu L, Jia DS, Geng Q, et al. (2013) Ολοκληρωμένες αναλύσεις Προσδιορίστε οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 ως Κρίσιμη Pro-Μεταστατικό γονίδια για τον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (2): e55714. doi: 10.1371 /journal.pone.0055714

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 12 του Αύγ του 2012? Αποδεκτές: 29, Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Key πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (2009CB521803), και το «σχέδιο δράσης για την καινοτομία» της Επιστήμης και Τεχνολογίας ταμείο της Σαγκάης (10.140.902.400). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο (

C. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε PBS που περιείχε 5% γάλα για 2 ώρες, ακολουθούμενο από την προσθήκη πρωτογενών αντισωμάτων έναντι οστεοποντίνη (1:400), ITGB1 (1:500), LAMB3 (1:500), και β-ακτίνη (1: 15000) Πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με τα κατάλληλα συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου για 1,5 ώρες. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBST (150 mM NaCl, 10 mM Tris, ρΗ 8,0, 0,05% Tween-20), και ειδικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα HRP.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR ανάλυση

Ολικό RNA από τα καλλιεργημένα SPC-Α-1sci κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπείες siRNA συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή Αντιδραστήρια (Takara) και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR ανάλυση διεξήχθη επί 7300 Real-Time PCR System με SDS λογισμικό RQ Μελέτης (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. πρότυπα cDNA συνδυάστηκαν με SYBR Green πρόμιγμα που περιέχει Rox (Takara) για την εκτέλεση των ποσοτικών PCR αντιδράσεων. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική PCR ήταν ως ακολούθως: οστεοποντίνη εμπρός: 5′-GACAGCCAGGACTCCATT-3 ‘? οστεοποντίνη αντίστροφη: 5’-GATGTCAGGTCTGCGAAA -3 ‘? LAMB3 προς τα εμπρός: 5’-AGGCAAGAACTGTGAGCG-3 ‘? LAMB3 αντίστροφη: 5’-GGGTTGGCGTAGGTGAGT-3 ‘? ITGB1 προς τα εμπρός: 5’-AATGTAACCAACCGTAGC-3 ‘? ITGB1 αντίστροφη: 5’-CAGGTCCATAAGGTAGTAGA-3 ‘? β-ακτίνης προς τα εμπρός: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘? β-ακτίνη αντίστροφη: 5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ‘. Η γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Scratch-επούλωση των πληγών Δοκιμασία

Ο προσδιορισμός γρατσουνιές θα επούλωση έγινε με ελαφρά τροποποίηση από αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν έως περίπου 90% συρροή σε πλάκες 24 φρεατίων, στη συνέχεια πέθαναν σε μέσο χαμηλού ορού (1% FBS σε ϋΜΕΜ) για όλη τη νύχτα. Μια ευθεία γρατσουνιά στην κυτταρική μονοστιβάδα έγινε χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ για την προσομοίωση ενός τραύματος. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και καλλιεργήθηκαν με 1% FBS σε DMEM για άλλες 24 ώρες. Τρεις εικόνες ανά φρεάτιο στη συνέχεια συλλέχθηκαν από τυχαία πεδία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο CKX41 (Olympus, Japan). Το ποσοστό των τραυματιών περιοχή που γέμισε υπολογίστηκε ως εξής: {(μέση τραυματίες εύρος – μέση υπόλοιπο εύρος) /σημαίνει τραυματίες εύρος} × 100 (%)

Μετανάστευση και την εισβολή Αναλύσεις

. δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας θαλάμους trans-6,5-καλά mm (μέγεθος πόρων 8 μm, Corning) όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ορισμένες τροποποιήσεις [27]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 100.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε θαλάμους trans-φρεατίων και επικαλυμμένα με Matrigel trans-φρεατίων θαλάμους για δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή. Τα φρεάτια πλύθηκαν με PBS μετά από 24 ώρες και για τις δύο δοκιμασίες. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει και εισβάλει στο βασικό πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Η &? Ε ή κρυσταλλικό ιώδες, οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν με ένα μικροσκόπιο CKX41 στα 400 × μεγέθυνση και ένα σύστημα DP20 Imaging (Olympus, Japan). Εικόνες τριών τυχαίων πεδίων από τρία πανομοιότυπα βοθρία ελήφθησαν, και ο αριθμός των κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει και εισβάλει μετρήθηκε.

shRNA Πειράματα

Ο lenti-ιικό φορέα shRNA δομήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, αρνητικός έλεγχος, οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 shRNA υποκλωνοποιήθηκαν στο

ΜΙυ

I /

Cla

sites Ι του φορέα pLVTHM (Addgene) χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια: 5′-CGCGTCGTAGCGACTAAACACATCAATTttc aagagaAATTGATGTGTTTAGTCGCTATTTTTTGGAAT -3 ‘και 5′-CGATTCCAAAAAATAGCGACTAAACACATCAATTtctcttgaaAATTGATGTGTTTAGTCGCTACGA-3′ για τον αρνητικό έλεγχο, 5’-CGTCGGCCATGACCACATGGACGATTTT

CAAGAG

AAATCGTCCATGTGGTCATGGCTTTTTTGGAAT-3 ‘και 5’-CGATTCCAAAAAAGCCATGACCACATGGACGATTT

CTCTTG

AAAATCGTCCATGTGGTCATGGCCGA-3′ για οστεοποντίνη, 5′-CGCGTCGCCCGGATCCTAGATGCAAAGA

TTCAAGAGA

TCTTTGCATCTAGGATCCGGGTTTTTTGGAAT-3 ‘και 5’-CGATTCCAAAAAACCCGGATCCTAGATGCAAAGA

TCTCTTGAA

TCTTTGCATCTAGGATCCGGGCGA-3 »για LAMB3 και 5′-CGCGTCGGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT

TCAAGAG

ATGAAACTTCGGATCTGTACACTTTTTTGGAAT-3′ και 5′-CGATTCCAAAAAAGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT

CTCTTGA

ATGAAACTTCGGATCTGTACACCGA -3 ‘για ITGB1. γενεά Lenti-ιού και μόλυνση του SPC-Α-1sci κύτταρα διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Πειράματα σε ζώα

πέντε έως έξι εβδομάδων αρσενικούς γυμνούς ποντικούς διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές παθογόνα ελεύθερο (SPF) συνθήκες. Τα ποντίκια χειραγωγείται και στεγάστηκαν σύμφωνα με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Ιατρική Πειραματική Επιτροπή Φροντίδας Ζώων της Σαγκάης. Να αναλύσει τις in vivo μεταστατικό δυνατότητες των SPC-Α-1sci κύτταρα με νοκ-out οστεοποντίνη, β3 λαμινίνη ή β1 ιντεγκρίνη, 2.0 × 10

6 SPC-Α-1sci κύτταρα εγχέονται μέσα στις φλέβες της ουράς γυμνών ποντικών. Δέκα εβδομάδες αργότερα, όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν, και οι πνεύμονες απομακρύνθηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για ιστολογικές μελέτες από στερέωση σε 10% φορμαλίνη. Τα σταθερά δείγματα εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και τρεις μη διαδοχικές σειριακά τμήματα ελήφθησαν ανά ζώο. Οι τομές χρωματίστηκαν με Η &?. Ε και αναλύθηκαν για την παρουσία των μεταστάσεων

ιστοί Ανθρώπινα NSCLC

Τα δείγματα ασθενούς σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν ακόλουθη ενημερωμένη συγκατάθεση, σύμφωνα με ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή ηθικής και Δεοντολογίας της Σαγκάης Jiao Tong-University School. Τα στοιχεία δεν περιλαμβάνουν όλες τις πληροφορίες που μπορεί να οδηγήσουν στον εντοπισμό των ασθενών. Ζεύγη (n = 135) των πνευμόνων καρκινικούς ιστούς και των παρακείμενων noncancerous ιστοί που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή ενός microarray ιστού (Shanghai Biochip Co., Ltd. Σαγκάη, Κίνα) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (34). Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης του οστεοποντίνη LAMB3, και ITGB1 στους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς. Τα πρωτογενή αντισώματα έναντι οστεοποντίνη, LAMB3, και ITGB1 ελήφθησαν από την Sigma (1:250), Santa Cruz (1:50), και Abgent (1:50). Βαθμολόγηση μετρήθηκε με το ποσοστό των θετικών κυττάρων με τις ακόλουθες εντάσεις χρώσης: λιγότερο από 5% άνοιξε το «0»? 5-24% σημείωσε «1»? 25-49% σημείωσε «2»? 50-74% σημείωσε «3»? και περισσότερο από το 74% δέχεται «4».

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Συγκρίσεις των ποσοτικών δεδομένα αναλύθηκαν με

t-

δοκιμασία του Student μεταξύ των δύο ομάδων (δύο-ουρά?

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική). ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για την σύγκριση ποιοτικές μεταβλητές. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη SAS 9.0 για Windows.

Αποτελέσματα

διαφορετικά στελέχη του SPC-Α-1sci κυττάρων Γραμμή οθόνης Διαφορετικές Μεταστατικό Δυναμικά

Σε προηγούμενη εργασία μας, μια εξαιρετικά καρκινική κυτταρική σειρά μεταστατικού πνεύμονα (ονομάζεται SPC-Α-1sci) καθιερώθηκε από την κακώς μεταστατικό ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή SPC-Α-1 έως τρεις κύκλους in vivo επιλογής. Το σημαντικά υψηλότερο μεταστατικό δυναμικό του SPC-Α-1sci κυτταρική γραμμή σε σχέση με την γραμμή SPC-Α-1 έχει αποδειχθεί από μία σειρά πειραμάτων in vivo και in vitro. Για να διερευνήσουν τα αίτια του υψηλού μεταστατικού δυναμικού της κυτταρικής σειράς SPC-Α-1sci, λάβαμε περαιτέρω τις κυτταρικές στελέχη μονοκλωνικά SPC-Α-1sci H και SPC-Α-1sci M από τα κύτταρα SPC-Α-1sci και το μονοκλωνικό SPC στέλεχος κυττάρου -Α-1L από την κυτταρική γραμμή SPC-Α-1 με περιοριστική αραίωση κλωνική δοκιμασία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις (Σχήμα 1Α).

(Α) Μορφολογία των πέντε στελεχών μονοκλωνικού κύτταρο που επιλέγεται από οι κυτταρικές γραμμές SPC-Α-1 SPC-Α-1sci και περιορίζοντας δοκιμασία αραίωσης. Οι γονική SPC-Α-1sci κύτταρα και SPC-Α-1sci H και SPC-Α-1sci Μ κυττάρων στελέχη όλες σχήμα έκθεμα γύρισμα. (Β) δραστηριότητες Κινητικότητα των SPC-A1sci, SPC-A1sci Η SPC-A1sci Μ, SPC-Α-1 και κύτταρα SPC-A1 L προσδιορίστηκαν από το μηδέν-επούλωση των πληγών δοκιμασίες. (C) δοκιμασίες Εισβολή της SPC-Α-1sci, SPC-A1sci Η SPC-A1sci Μ, SPC-Α-1 και κύτταρα L SPC-A1 (400 × μεγέθυνση). (D) δοκιμασίες Μετανάστευσης της SPC-Α-1sci, SPC-A1sci Η SPC-A1sci Μ, SPC-Α-1 και SPC-A1L κύτταρα (400 × μεγέθυνση). Τρία ανεξάρτητα πειράματα? Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος + SD? * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

Για να εξερευνήσουν τα μεταστατικό δυναμικό των SPC-Α-1sciH, SPC-Α-1sciM και SPC-Α-1L , το μηδέν-επούλωση τραυμάτων (Εικόνα 1Β) και οι δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν (Σχήμα 1 C, D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι τρεις στελέχη μονοκλωνικά κύτταρο παρουσίασε αξιοσημείωτα διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό? SPC-Α-1sci H είχαν μεταστατικό δυναμικό που μοιάζει με εκείνη του SPC-Α-1sci, SPC-Α- L είχαν μεταστατικό δυναμικό παρόμοιο με SPC-Α-1, και SPC-Α-1sciM είχε ένα ενδιάμεσο μεταστατικό δυναμικό.

Bioinformatic αναλύσεις των μονοκλωνικών κυτταρικών στελεχών με υψηλή, μεσαία και χαμηλή μεταστατική Δυναμικά

Κατ ‘αρχάς, εντοπίστηκαν γονίδια που εκφράζονται διαφορικά κατά τουλάχιστον διπλάσια σε SPC-Α-1sciH, κύτταρα SPC-Α-1sciM αντίστοιχα σε σύγκριση σε κύτταρα SPC-Α-1L. Βρήκαμε ότι συνολικά 4.534 γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα ως το σημείο τομής του SPC-Α-1sciH εναντίον SPC-Α-1L και SPC-Α-1sciM εναντίον SPC-A-1L. Αυτών των γονιδίων, 2277 γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω, και 2257 γονίδια ρυθμίζεται προς τα κάτω.

Για να προσδιορίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια τα βασικά γονίδια που σχετίζονται με την μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα, βιοπληροφορική ανάλυση εφαρμόστηκε για την ανάλυση των λειτουργικών και της οδού διαφορές μεταξύ SPC-Α- 1sciM vs SPC-Α-1L και SPC-Α-1sciH vs SPC-Α-1L, αντίστοιχα (Σχήματα S1, S2). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Go-χάρτη αποκάλυψε τις αλληλεπιδράσεις και οι αποδόσεις για τις σημαντικές λειτουργίες των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Με όριο

P

-τιμή & lt? 0,0001, από τη λειτουργική ανάλυση των up-ρυθμίζονται διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, βρήκαμε ότι σημαντικές λειτουργίες σχετίζονταν κυρίως με τη συναρμολόγηση hemidesmosome, θετική ρύθμιση της διαφοροποίησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων, την οργάνωση των κυστιδίων, συναπτογένεση, μικροσωληνίσκων και κυτταροσκελετού οργάνωση και ρύθμιση, κελί σύλληψη του κύκλου και ρύθμιση, κυτταρική προσκόλληση και ενδοκύττωση, η μεταγραφή του DNA, αδρανοποίηση της δραστηριότητας ΜΑΡΚ, αποφωσφορυλίωσης πρωτεϊνών αμινοξέων και ενδοκυτταρική πρωτεΐνη μεταφοράς. Κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση επίσης επηρεαστεί, συνοδευόμενη από τις αντίστοιχες λειτουργίες του ανοσοποιητικού απόκριση και τη φλεγμονή. Την ίδια στιγμή, η πλειοψηφία των κάτω ρυθμισμένα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια είχαν λειτουργίες στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων: της αντιγραφής του DNA και η ρύθμιση κατά τη διάρκεια της μίτωσης, οργάνωση ατράκτου, κεντροσωμάτων επικαλύψεις και το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, νουκλεοτιδίων και αρνητική ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων καθώς και ως απάντηση σε ερέθισμα βλάβη του DNA μέσω επιδιόρθωση του DNA και ανασυνδυασμού, συναρμολόγηση χρωματίνης ή αποσυναρμολόγηση, υδατάνθρακες, μεταβολισμό των λιπιδίων και αμινοξέων και άλλων.

Από την ανάλυση μονοπατιού και Path-Net, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η δημιουργία -regulated γονίδια συμμετέχουν κυρίως στην ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης, μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, μονοπάτι σηματοδότησης JAK-STAT, ΤΟΡ-β μονοπατιού σηματοδότησης, και την προσκόλληση των κυττάρων. Ταυτοποιημένα γονίδια επηρεάζουν επίσης την ικανότητα του κυττάρου να αλλάξει κυτταροσκελετού και την πολικότητα του και εμπλέκονται στην εμφάνιση, τη μετανάστευση και τον μεταβολισμό των όγκων. Εν τω μεταξύ, τα γονίδια κάτω-ρυθμίζονται συμμετείχε κυρίως σε αναντιστοιχία επισκευή και ομόλογο ανασυνδυασμό ή συνδέονταν με την PPAR, TGF-β, και τα μονοπάτια σηματοδότησης p53, αλληλεπιδράσεις ECM-υποδοχέα και πολλές μεταβολικές οδούς (όριο

P-τιμή

& lt?. 0.001) (Σχήματα S3, S4)

σύμφωνα με τις σημαντικές οδούς που προαναφέρθηκαν και τις αλληλεπιδράσεις των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων που εμπλέκονται στις οδούς (σύμφωνα με τη βάση δεδομένων KEGG), ένα μοντέλο σήματος ροής ήταν χτίστηκε το. Μια ποσοτική δίκτυο ρύθμιση, υπολογίζεται από ένα νευρωνικό δίκτυο χρησιμοποιώντας τις εντάσεις σήματος των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Προσδιορίζεται από τη διαφορά βάρους μεταξύ 2 γονίδια και τα γονίδια που κάθε γονίδιο συνδέεται με, την κατάσταση των SPP1, LAMB3, MAPK1 και Ιούνιο, όπως αποδείχθηκε κλειδί ρυθμιστές (Σχήμα 2). Τα επίπεδα έκφρασης του οστεοποντίνη LAMB3, και ITGB1 μετρήθηκαν με qRT-PCR, και τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνη με τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Τα επίπεδα έκφρασης του οστεοποντίνη LAMB3, και ITGB1 ήταν υψηλότερες στις κυτταρικές γραμμές SPC-Α-1sci Η και SPC-Α-1sci Μ σε σχέση με το SPC-Α-1 L κυτταρική γραμμή (Σχήμα S5).

μοντέλο σήματος ροής της Ένωσης διαφορική γονιδιακή έκφραση. Η τελεία αντιπροσωπεύει το γονίδιο και η κατεύθυνση της γραμμής παριστά την κατεύθυνση του κανονισμού. Ο αριθμός της γραμμής είναι το βάρος ρύθμιση: όσο μεγαλύτερο είναι το βάρος, το μεγαλύτερο πάχος της γραμμής και τόσο ισχυρότερη είναι η ρυθμιστική ικανότητα. Το σχήμα βέλους στόχος της γραμμή αναπαριστά τη λειτουργία ρύθμισης ενεργοποίησης.

Η

SPC-Α-1sci κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA Ενάντια οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 Εμφάνιση Χαμηλή τη Μετανάστευση και την εισβολή In Vitro

να διερευνήσει τους ρόλους των οστεοποντίνης, LAMB3 και ITGB1 στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα, επιμολύναμε SPC-Α-1sci κυττάρων με siRNA-οστεοποντίνη, siRNA-LAMB3 ή siRNA-ITGB1 και εκτελούνται δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή. RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western κατέδειξε αποτελεσματική knock-down του οστεοποντίνη LAMB3, και ITGB1 στα κύτταρα SPC-Α-1sci (Σχήμα 3Α, Β). SPC-Α-1sci κύτταρα επιμολυσμένα με είτε siRNA-οστεοποντίνη, siRNA-LAMB3 ή siRNA-ITGB1 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερες δυνατότητες μετανάστευση και εισβολή σε σύγκριση με την γονική κυτταρική σειρά SPC-Α-1 sci (Σχήμα 3C, D). Στη συνέχεια, το mRNA οστεοποντίνη και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης μετρήθηκαν σε SPC-Α-1sci που μορφομετατρέπονται με siRNA κατά LAMB3 και ITGB1, τα αποτελέσματα έδειξαν knock-down του LAMB3 και τα επίπεδα έκφρασης ITGB1 δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση πρωτεΐνης ΟΡΝ. LAMB3 και ITGB1 είχε τα ίδια αποτελέσματα (Σχήματα S6a, Β). Για τον προσδιορισμό της σχέσης μεταξύ οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1, εμείς επιμολυσμένα SPC-Α-1sci κύτταρα με siRNA-οστεοποντίνη + siRNA-LAMB3, siRNA-οστεοποντίνης + siRNA-ITGB1, siRNA-ITGB1 + siRNA-LAMB3 και siRNA-οστεοποντίνη + siRNA-LAMB3 + siRNA-ITGB1, Η μετανάστευση και εισβολή ικανότητα αυτών των κυττάρων συν-επιμολύνθηκαν με δύο ή περισσότερα siRNA σημαντικά μειώθηκαν σε σχέση με την ικανότητα εισβολής και μετανάστευση των κυττάρων συν-επιμολυνθεί με ένα siRNA ((Σχήματα S6 C, D, E). Τα αποτελέσματα δείχνουν μια trans-ρύθμιση ρόλο της οστεοποντίνης, LAMB3 και ITGB1 στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) RT-PCR πραγματοποιήθηκε και έδειξε αποτελεσματική knock-down της έκφρασης που προκαλείται από siRNA-οστεοποντίνη, siRNA-LAMB3 και siRNA-ITGB1. (Β) κηλίδας Western έδειξε μειωμένη έκφραση της οστεοποντίνης, LAMB3 και ITGB1. (Γ και Δ) μετανάστευση και αναλύσεις εισβολή του SPC-Α-1sci, SPC-A1sci /siRNA-οστεοποντίνη, SPC-Α-1sci /. siRNA-LAMB3 και SPC-A1sci /siRNA-ITGB1 (400 × μεγέθυνση) Τρεις ανεξάρτητα πειράματα? τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος + SD? * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

Νοκ-κάτω της οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 Σε SPC-Α-1sci κύτταρα οδήγησε σε χαμηλού μεταστατικού δυναμικού Σε vivo

Για να αποκαλύψει περαιτέρω εάν οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα in vivo, 4 έως 6 εβδομάδων παλιά γυναικεία γυμνά ποντίκια randomnly χωρίζονται σε 4 ομάδες και έλαβαν την ουρά ένεση φλέβα 2 × 10

6 SPC-A-1sci κύτταρα επιμολυσμένα με το shRNA-αρνητικό έλεγχο, shRNA-οστεοποντίνη, shRNA-LAMB3 ή shRNA-ITGB1. Δέκα εβδομάδες αργότερα, οι πνεύμονες συλλέχθηκαν για ανοσοϊστοχημική ανάλυση (Σχήμα 4)

Αντιπροσωπευτικές ιστολογικές εικόνες των πνευμόνων ποντικού επιθεωρήθηκαν για την παρουσία των μικροσκοπικών αλλοιώσεων (20 ×, άνω? 400 ×, χαμηλότερα). Δέκα εβδομάδες από η κοπή φλέβα ενέσεις με SPC-Α-1sci κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Τα siRNAs έναντι του αρνητικού ελέγχου (shRNA-NC, αριστερά 1), οστεοποντίνη (shRNA-οστεοποντίνης? αριστερά 2), λαμινίνη β3 (shRNA-LAMB3, δεξιά 2), και β1 ιντεγκρίνη ( shRNA-ITGB1, δεξιά 1).

η

Μετρήσαμε επίσης τα ποντίκια με μεταστάσεις του καρκίνου του πνεύμονα και μεταστατικού κόμβους σε κάθε ομάδα. Όπως εμφανίζεται στον Πίνακα 1, μερικές πνεύμονα κομβικά μεταστάσεις ανιχνεύθηκαν στα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα SPC-Α-1sci επιμολυσμένα με shRNA-οστεοποντίνη, shRNA-LAMB3 ή shRNA-ITGB1. Σε αντίθεση, οι μεταστάσεις πνεύμονα ήταν εμφανείς σε ποντικούς που ενέθηκαν με κύτταρα αρνητικού ελέγχου. Ως εκ τούτου, είναι προφανές ότι οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταστατική διαδικασία του πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου SPC-Α-1sci.

Η

Η οστεοποντίνη, LAMB3 και ITGB1 Έκφραση Επίπεδα σε πνεύμονα καρκίνου που σχετίζονται με προχωρημένους κλινικό στάδιο, ιστολογικές βαθμού, και μετάσταση λεμφαδένα

Για να επικυρώσει τα αποτελέσματα της οστεοποντίνης, LAMB3 και έκφραση ITGB1 στον καρκίνο του πνεύμονα, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης τους σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα (n = 135) και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών με ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC).