Abstract

Ιστορικό

Η κινάση σερίνης /θρεονίνης Aurora-A (Aur-Α) είναι ένα πρωτο-ογκοπρωτείνης υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων. Η υπερέκφραση του Aur-Α πιστεύεται ότι προκαλείται από γονιδιακή ενίσχυση ή mRNA υπερέκφρασης. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία αποκάλυψαν ότι οι αποκλίσεις μεταξύ ενίσχυση του

Aur-Α

και τα ποσοστά υπερέκφραση Aur Α-mRNA παρατηρήθηκαν σε καρκίνο του μαστού, γαστρικό καρκίνο, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και καρκίνο των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι επιθετικών καρκίνων κεφαλής και λαιμού εμφάνισαν υπερέκφραση και τη σταθεροποίηση της Aur-A πρωτεΐνη χωρίς ενίσχυση γονιδίου ή mRNA υπερέκφρασης. Εδώ ελέγξαμε την υπόθεση ότι η εκτροπή του συστήματος καταστροφής πρωτεΐνη επάγει τη συσσώρευση και, κατά συνέπεια, η υπερέκφραση του Aur-Α στον καρκίνο.

Κύρια Ευρήματα

Aur-Α πρωτεΐνη ubiquitinylated από την APC

Cdh1 και, κατά συνέπεια, αποικοδομείται όταν τα κύτταρα βγήκε μίτωση, και φωσφορυλίωση Aur-Α επί ser51 παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Φωσφορυλίωση Aur-Α για ser51 αναστέλλεται APC

Cdh1 μεσολάβηση ubiquitylation της και η συνακόλουθη υποβάθμιση. Είναι ενδιαφέρον, συστατική φωσφορυλίωση επί ser51 παρατηρήθηκε σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυττάρων με πρωτεΐνη υπερέκφραση και σταθεροποίησης. Πράγματι, η φωσφορυλίωση επί ser51 παρατηρήθηκε σε κεφαλής και του τραχήλου καρκινικούς ιστούς με Aur-A υπερέκφραση πρωτεΐνης. Επιπλέον, ένα Aur-Α ser51 φωσφο-μιμητική μετάλλαξη εμφανίζεται σταθεροποίηση της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και την αυξημένη ικανότητα για κινητά μετασχηματισμού.

Συμπεράσματα /Σημασία

Σε γενικές γραμμές, η μελέτη αυτή εντοπίζει ένα νέο τρόπο Aur-Α υπερέκφραση στον καρκίνο μέσω φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενη αναστολή της πρωτεόλυσης του εκτός από την ενίσχυση γονιδίου και του mRNA υπερέκφρασης. Προτείνουμε ότι η αναστολή της Aur-Α φωσφορυλίωση μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο τρόπο για να μειώσετε τα επίπεδα Aur-Α στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Kitajima S, Kudo Υ, Ogawa Ι, Tatsuka Μ, Kawai Η Pagano Μ , et al. (2007) Συστατική φωσφορυλίωση της Aurora-Α σε ser51 Προκαλεί σταθεροποίηση και την επακόλουθη υπερέκφραση στον Καρκίνο. PLoS ONE 2 (9): e944. doi: 10.1371 /journal.pone.0000944

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 16, Ιουνίου, 2007? Αποδεκτές: 5 Σεπτεμβρίου του 2007? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτεμβρίου, 2007

Copyright: © 2007 Kitajima et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Πολιτισμού της Ιαπωνίας (YK και TT)? επιχορηγήσεις από Uehara μνημείο θεμέλιο (YK) και επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (R37-CA76584, R01-GM57587 και R21-CA125173) (MP)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα υπάρχει.

Εισαγωγή

Μια σειρά περιοδικών αντιδράσεων κινάσης από κυκλίνη-εξαρτώμενες κινάσες (CDKs) να προωθήσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [1]. Μιτωτικής εκδηλώσεις με δραστική και ταχεία μορφολογικές αλλαγές είναι επίσης στενά ρυθμίζονται από άλλες κινάσες, συμπεριλαμβανομένων Aurora-A, -B και -C [2]. Η σερίνη /κινάση θρεονίνης Aurora-A (Aur-Α) είναι απαραίτητη για την μιτωτική είσοδο, κεντροσωμάτων επικαλύψεις, σχηματισμός ατράκτου, χρωμόσωμα διαχωρισμό και την κυτοκίνηση [3]. Ανθρώπινα

Aur-Α /STK 15

βρίσκεται στο χρωμόσωμα 20q13.2, η οποία συνήθως ενισχύεται σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του παχέος εντέρου, της κύστης, των ωοθηκών, του παγκρέατος και το κεφάλι και το λαιμό καρκίνων [4] – [9] , και τα επίπεδα του Aur Α-mRNA και η πρωτεΐνη επίσης αυξημένη σε όγκους [10] – [14]. Έτσι, η υπερέκφραση του Aur-Α δραστικότητας κινάσης έχει θεωρηθεί ότι προάγουν την καρκινογένεση με διαταράσσοντας το μηχανισμό που εξασφαλίζει την διατήρηση του κανονικού κεντροσωμάτων ή χρωμόσωμα αριθμό, ίσως λόγω απομείωσης του κεντροσωμάτων ή λειτουργίας κεντρομερίδιο, κυτοκίνηση, ή ρύθμιση άτρακτος οδοφράγματος [2], [15], [16].

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι οι περισσότεροι ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου υποβαθμιστεί από το σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (UPS) [1], [17]. Aur-Α είναι επίσης αποικοδομείται μέσω της ουμπικουϊτίνης λιγάσης APC (το σύμπλοκο ανάφαση-προώθηση) και συν-ενεργοποιητή του Cdh1 εμπλέκεται [18], [19]. Προτεινόμενες απαιτήσεις για Aur-A ubiquitylation είναι η αναγνώριση του C-τερματικό κουτί Καταστροφή (D-box) από Cdh1 [20], καθώς και ένα επιπλέον A-box /DAD μοτίβο στο

Xenopus

Aur-Α [21], [22]. Περαιτέρω, έχει προταθεί ότι Ser53 (ισοδύναμο με ser51 σε ανθρώπινα Aur-Α) του Α-box φωσφορυλιώνεται κατά τη διάρκεια της μίτωσης και ότι η φωσφορυλίωση σε Ser53 (ή 51 σε ανθρώπινα) είναι απαραίτητη για την μιτωτική σταθεροποίηση του

Xenopus

[23] και την ανθρώπινη Aur-Α [24]. Αν και η μιτωτική τροποποίηση που επηρεάζει Aur-σταθεροποίηση ανακαλύφθηκε, οι φυσιολογικές δυναμική και τη ρύθμιση της παραμένει ελλιπώς κατανοητός.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το επίπεδο των Aur-Α πρωτεΐνης σε όγκους δεν συσχετίζονται πάντα με την ενίσχυση της η

Aur-Α

γονίδιο [25], [26]. Βρήκαμε επίσης ότι κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού χωρίς ενίσχυση γονιδίου που εκφράζεται Aur-A πρωτεΐνη σε υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με εκείνους με γονιδιακή ενίσχυση. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη χρησιμοποιώντας ένα διαγονιδιακό μοντέλο και κύτταρα προερχόμενα απέδειξε ότι διαγονιδιακά Aur-Α πρωτεΐνη προστατεύεται από την UPS μεσολάβηση αποικοδόμηση κατά τη διάρκεια της μίτωσης [27]. Αυτά τα ευρήματα αθροιστική μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι εκτροπή του συστήματος καταστροφής πρωτεΐνη επάγει τη συσσώρευση και κατά συνέπεια υπερέκφραση της Aur-A στον καρκίνο. Εδώ, δείχνουμε ότι αυξημένα επίπεδα Aur-Α παρατηρήθηκε σε γραμμές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυττάρων προκύπτουν από ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση του ser51 η οποία εμποδίζει την APC

Cdh1 μεσολάβηση ubiquitylation και διαδοχική αποικοδόμηση του Aur-A.

Αποτελέσματα

η υπερέκφραση του Aur-Α σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου συσχετίζεται με μία μείωση στην αποικοδόμηση του

η υπερέκφραση του Aur-Α δείχνεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων. Με ανοσοϊστοχημεία, καρκίνο κεφαλής και λαιμού κύτταρα εξέφρασαν Aur-Α σε υψηλότερα επίπεδα, σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του στόματος (Σχήμα 1Α). Σημαντικά, Aur-Α υπερέκφραση συσχετίζεται με φτωχή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου (συμπληρωματικό πίνακα, Πίνακας S1). Όπως Aur-Α χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 20q13.2, η οποία είναι μια περιοχή που συνήθως ενισχύεται σε επιθηλιακές κακοήθειες, η υπερέκφραση του Aur-Α πιστεύεται ότι προκαλείται από γονιδιακή ενίσχυση ή /και υπερέκφραση του mRNA. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η υψηλή έκφραση του Aur-A πρωτεΐνη δεν προκλήθηκε μόνο από γονιδιακή ενίσχυση και έκφραση mRNA σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β). Ειδικότερα, Aur-Α έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα HSC2 και HSC3 ήταν υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα HSC4 που περιέχουν και ενίσχυση γονιδίου και αυξημένα επίπεδα mRNA. Η θεραπεία με αναστολέα πρωτεασώματος, ZLLL, επαγόμενη Aur-A συσσώρευση πρωτεΐνης στα κύτταρα HSC4 και Ca9-22, αλλά όχι σε εκείνες τις κυτταρικές σειρές που εμφανίζουν υψηλή έκφραση του Aur-Α (HSC2, HSC3 και ΗΟ-1-U-1) (Εικόνα 1C). Επιπλέον, ο χρόνος ημίσειας ζωής της Aur-Α πρωτεΐνης ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα HSC2 και HSC3 παρά σε κύτταρα HSC4 συσχέτιση με υπερεκφράζεται Aur-Α πρωτεΐνης (Εικόνα 1D). Αυτά τα ευρήματα μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι, εκτός από την ενίσχυση του γονιδίου ή mRNA υπερέκφρασης, Aur-Α υπερέκφραση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα μπορεί να προκαλείται από μειωμένη αποικοδόμηση πρωτεΐνης

Α:. Ανοσοϊστοχημική έκφραση του Aur-A δείχνεται στο φυσιολογικό βλεννογόνο του στόματος και της κεφαλής και του τραχήλου. Β: Σύγκριση γονιδιακής ενίσχυσης, η έκφραση του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε 6 κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Η γονιδιακή ενίσχυση και έκφραση του mRNA εξετάστηκαν προηγουμένως (9). Η έκφραση της πρωτεΐνης εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Cul1 έκφραση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C: Συσσώρευση Aur-Α πρωτεΐνης με αναστολέα πρωτεασώματος, ZLLL. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 25 μΜ ZLLL για 6 ώρες. Έκφραση του Aur-Α εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western. Cul1 έκφραση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. D: Χρόνος ημιζωής του Aur-Α σε καρκινικά κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CHX για προκαθορισμένο χρόνο. Έκφραση του Aur-Α εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western. μηδενικά Χρόνος ομαλοποιήθηκαν για ίσο Aur-Α και όχι ίση ποσότητα πρωτεΐνης εκχυλισμάτων να συγκρίνει άμεσα τα δύο ημι-ζωές. έκφραση Cul1 χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Η φωσφορυλίωση της Aur-Α για ser51 αναστέλλει APC

Cdh1 μεσολάβηση

υποβάθμιση

κορυφές Aur-Α έκφραση της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της μίτωσης σε θηλαστικά κύτταρα (συμπληρωματική εικόνα, Σχ. S1 Α και Β). θεραπεία ZLLL επαγόμενη Aur-A συσσώρευση σε κύτταρα σε φάση G1, αλλά όχι σε κύτταρα σε μίτωση (συμπληρωματική εικόνα, Σχ. S1c). Στην πραγματικότητα, το επίπεδο πρωτεΐνης του Aur-Α μειώνει στα τέλη της μίτωσης ως συνέπεια της ubiquitylation διαμεσολαβείται από την APC και του συν-ενεργοποιητή Cdh1 [20]. Χρησιμοποιώντας τα πειράματα συνεπιμόλυνσης, βρήκαμε ότι Aur-Α πρωτεΐνη αποικοδομήθηκε μέσω Cdh1, αλλά όχι CDC20 (Σχήμα 2Α), όπως έχει ήδη αναφερθεί [18], [19], [23], [24], [28]. Σε αντίθεση, Aur-Β, ένας Aur-Α παράλογο, δεν αποικοδομούνται από κάθε επιμόλυνση Cdh1 ή CDC20 (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη λεπτομερή μηχανισμό της APC

Cdh1 μεσολάβηση Aur-Α υποβάθμιση. Aur-Α έχει τέσσερις υποθετικές D-Box και ένα κουτί KEN μοτίβα, τα οποία θα μπορούσαν ενδεχομένως να αναγνωρίζονται από την APC

Cdh1 συγκρότημα ουβικιτίνης λιγάση. Στις

Xenopus

, το Ν-τελικό άκρο Α-box και C-τελικό άκρο D-box του Aur-Α είναι απαραίτητη για την αποικοδόμηση της [23]. Σχηματική δομή περιοχή ανθρώπινου Aur-A άγριου τύπου και δύο μεταλλάξεις διαγραφής (ΔΝ και ΔΟ) δείχνονται στο Σχήμα 2Β. Η θέση των δύο μοτίβα υποβάθμιση, Α-box και D-box, υποδεικνύονται επίσης. Άγριου τύπου Aur-Α αποικοδομήθηκε με συν-επιμόλυνση του Cdh1, ενώ τόσο ΔΝ και ΔΟ μεταλλάκτες Aur-A δεν αποικοδομήθηκαν (Σχήμα 2C). Το C-τελικό άκρο D-box μεταλλαγμένο και A-box μεταλλαγμένο επίσης δεν υποβαθμίζεται, δείχνει ότι, παρόμοια με

Xenopus,

οι A-box και D-box μοτίβα είναι απαραίτητα για την υποβάθμιση της ανθρώπινης Aur-Α πρωτεΐνης (Εικόνα 2D)

Α:. FLAG-tagged Aur-Α και Xpress-tagged Aur-Β συν-επιμολύνθηκαν με ή χωρίς ΗΑ-tagged CDC20 ή Cdh1 στο κελί 293Τ. Β: Σχηματική δομή του τομέα του Aur-A άγριου τύπου (wt) και δύο μεταλλάξεις διαγραφής (ΔΝ και ΔΟ) δείχνονται. Η θέση των δύο μοτίβα υποβάθμιση, Α-box και D-box, υποδεικνύονται. C: Aur-A-ΔΝ ή -ΔC μεταλλαγμένου συν-επιμολυσμένα με Cdh1 στο κελί 293Τ. D: A-box μεταλλαγμένο (

46RVL

48 – & gt? AVA) ή μεταλλαγμένο D-box (

371RPML

374 – & gt? ΑΡΜΑ) Aur-Α συν-επιμολυσμένα με ή χωρίς Cdh1 . Ε: ser51 αντικαταστάθηκε με αλανίνη (S51A) ή ασπαρτικό οξύ (S51D). Κάθε κ.β., S51A και S51D μεταλλαγμένη Aur-A συν-επιμολύνθηκε με ή χωρίς Cdh1 ή CDC20. F: Ευαισθησία ubiquitylation της Aur-Α κ.β. και S51 μεταλλάκτες δοκιμάστηκαν

in vitro

. APC ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-Cdc27 αντισωμάτων από τα κυτταρικά λύματα HeLa υποβλήθηκε σε

in vitro δοκιμασία

ubiquitylation όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Η αντίδραση τερματίστηκε σε 60 λεπτά. IVT-Aur-Α (βέλος) χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα. «Aur-Α

Ub» δείχνει ubiquitylated Aur-Α.

Η

Έχει αναφερθεί ότι Ser53, Thr295 και Ser349 της Aur-Α είναι φωσφορυλιωμένη στο

Xenopus

μιτωτική εκχυλίσματα [21]. Είναι ενδιαφέρον, φωσφορυλιωμένη Ser53 στο

Xenopus

υποβάθμιση του μπλοκ Aur-Α από το [23] UPS. Έχουμε δημιουργήσει μια φωσφορυλίωση ελαττωματικό Aur-Α μεταλλαγμένο (ser51 αντικατασταθεί από Ala? S51A) και φωσφο-μιμούνται μεταλλαγμένο (ser51 αντικατασταθεί από Asp? S51D). Κάθε μετάλλαγμα επιμολύνθηκε σε κύτταρα με ή χωρίς Cdh1 ή CDC20. Άγριου τύπου και S51A μεταλλαγμένα είχαν υποβαθμιστεί σχεδόν εντελώς, όταν συνδιαμολύνονται με Cdh1, ενώ η μεταλλαγμένη S51D υποβαθμίστηκε σε μικρότερο βαθμό (Σχήμα 2Ε). Άγριου τύπου, S51A και μεταλλάξεις S51D δεν αποικοδομούνται μέσω APC

CDC20 (Σχήμα 2Ε). Σύμφωνα με τα όσα διαπίστωσε

in vivo

, το μεταλλαγμένο S51D ήταν λιγότερο ubiquitylated

in vitro από

APC

Cdh1 (Σχήμα 2F). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση σε ser51 αναστέλλει την D-box-εξαρτώμενη αποδόμηση των Aur-Α που συμβαίνουν σε κύτταρα G1 μέσω APC

Cdh1.

Aurora-Β (Aur-Β), ένα paralogue της Aur-Α, διαφέρει στον εντοπισμό και τη χρονική στιγμή της ενεργοποίησης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου από AUR-Α, παρά την ταυτότητα ακολουθίας περίπου 60% μεταξύ τους. Σύγκριση της σχηματική δομή μεταξύ Aur-Α και -Β παρουσιάζεται στο Σχήμα 3Α. Σε Ομοίως με Aur-Α, Aur-B έχει ένα υποθετικό KEN κουτί, τέσσερις D-box και μια μοτίβα Α-box. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, ωστόσο, Aur-Β δεν αποδομείται από την συν-έκφραση είτε Cdh1 ή CDC20. Η ευθυγράμμιση που αντιστοιχεί στην Α-box μοτίβο του Aur-Α και -Β δείχνεται στο Σχήμα 3Β. Ser51 σε Aur-Α αντιστοιχεί σε Glu32 στην Aur-B. Νομίζαμε ότι Aur-Β μπορεί να μην υποβαθμίζεται μέσω APC

Cdh1 λόγω των μιμούνται φωσφορυλίωσης Glu32. Για να υποστηρίξει αυτή την υπόθεση, τα αμινοξέα του Aur-B A-box μεταλλάχθηκαν (ΚΕΠ – & gt? PSN, ASN, PSA, KSP, KAP και PEN) και στη συνέχεια επιμολύνονται σε κύτταρα με ή χωρίς Cdh1 (Σχήμα 3C). Το σχηματικό των θέσεων μεταλλαχθεί και τα αποτελέσματα των πειραμάτων συν-επιμόλυνσης φαίνονται στο Σχήμα 3D. Είναι ενδιαφέρον, PSN, ASN, PSA, KSP και μεταλλάξεις KAP ήταν υποβαθμισμένη, ενώ PEN μεταλλαγμένα δεν αποικοδομούνται μέσω APC

Cdh1. Έτσι, Aur-Β φαίνεται να προστατεύεται από την APC

Cdh1 μεσολάβηση αποικοδόμηση εξαιτίας Glu32 ότι μιμείται την επίδραση της φωσφορυλίωσης. Όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση του Aur-Α επί ser51 παίζει σημαντικό ρόλο για τη ρύθμιση της σταθερότητας του

Α:. Σύγκριση σχηματική δομή μεταξύ Aur-Α και -Β δείχνεται. Aur-B έχει πολλά μοτίβα υποβάθμιση παρόμοια με AUR-A. Β: αλληλουχία αντίστοιχο αμινοξύ του Α-box μεταξύ Aur-Α και -Β δείχνεται. C: Aur-Β με μεταλλαγμένα αμινοξέα στην Α-box (

31KEP

33 – & gt? PSN, ASN, PSA, KSP, KAP και PEN) ήταν συν-επιμολυσμένα με ή χωρίς Cdh1. D:. Περίληψη των μεταλλαγμένων sites και τα αποτελέσματά τους παρουσιάζονται

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν η φωσφορυλίωση σε ser51 είχε εμπλακεί στη ρύθμιση της Aur-Α έκφρασης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Θέσαμε ένα φωσφο-ειδικό αντίσωμα έναντι ενός συνθετικού πεπτιδίου που εκτείνεται το φωσφορυλιωμένο υπόλειμμα ser51 του Aur-A. Αυτό το αντίσωμα που αναγνωρίζονται ειδικώς αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο S51D, αλλά όχι S51A μεταλλαγμένο (Σχήμα 4Α), υποδεικνύοντας ότι S51D υποκατάσταση μιμούνται αποτελεσματικά το αρνητικό φορτίο του φωσφορικού σε θέση 51. Η φωσφορυλίωση επί ser51 σε ενδογενή Aur-Α ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με νοκοδαζόλη (η οποία αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων σε μίτωση), αλλά όχι σε αυτούς χωρίς νοκοδαζόλη (Σχήμα 4Β). Ενενήντα λεπτά μετά την απελευθέρωση από τη μίτωση, Aur-Α φωσφορυλιωμένη σε ser51 εξαφανίστηκε με μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης της Aur-Α και φωσφορυλιωμένη Aur-Α για T288 (Σχήμα 4C). Είναι ενδιαφέρον, φωσφορυλίωση επί ser51 δεν βρέθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με ένα ανενεργό μεταλλαγμένη κινάση (K /R? K162R) (Εικόνα 4D). Στο Σχ. 4Ε, αυξημένη ser51 φωσφορυλιωμένη Aur-Α κ.β. παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία NOC /ΟΑ, ενώ FLAG-Aur-Α μεταλλαγμένο K /R δεν παρατηρήθηκε με ή χωρίς επεξεργασία /ΟΑ NOC. Χρησιμοποιήσαμε το οκαδαϊκό οξύ ως αναστολέας φωσφατάσης. Χρησιμοποιήσαμε επίσης νοκοδαζόλη για το συγχρονισμό των κυττάρων σε μίτωση όταν ser51 φωσφορυλιώνεται. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστικότητα κινάσης του Aur-Α είναι απαραίτητη για την φωσφορυλίωση του ser51. Το εύρημα που ser51 φωσφορυλιωμένη Aur-Α αυξήθηκε κατά επεξεργασίας /ΟΑ NOC υποστηρίζεται σθεναρά από την πρόσφατη διαπίστωση ότι η φωσφορυλίωση σε ser51 ήταν dephosphorytated από ΡΡ2Α. Ωστόσο, ο λεπτομερής μηχανισμός της φωσφορυλίωσης επί ser51 χρειάζεται περαιτέρω πειράματα

Α:. Χαρακτηρισμός phosopho-ειδικού αντισώματος έναντι ser51 του Aur-A. Η έκφραση του ser51 φωσφορυλιώθηκαν Aur-Α πρωτεΐνη εξετάζεται με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με ένα phosopho-ειδικό αντίσωμα έναντι ser51 του Aur-Α που ακολουθείται από immunoblottoing ανάλυση (ΙΒ) με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα προς Aur-Α σε βάρος και S51 μεταλλάγματα Aur- Μια επιμολυσμένα κύτταρα 293Τ. Β: Η φωσφορυλίωση του ser51 σε κύτταρα HeLa με ή χωρίς θεραπεία Noc. C: Η φωσφορυλίωση επί ser51 σε κύτταρα HeLa. Τα κύτταρα HeLa που απελευθερώνεται από Noc επαγόμενη προμεταφασικά σύλληψης και συλλέγονται στους χρόνους που υποδεικνύονται. Τα δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western με φωσφο-S51 Aur-A, Aur-Α, φωσφο-T288 Aur-A, φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10) και αντισώματα Cul1 (άνω πάνελ). Γράφημα δείχνει το επίπεδο έκφρασης της Aur-Α, φωσφο-S51 Aur-Α, φωσφο-T288 Aur-Α και φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10) (κάτω πίνακας). D: Έκφραση ser51 φωσφορυλιώθηκαν Aur-Α πρωτεΐνη εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος western σε S51D και Κ /R (κινάση αδρανείς) μεταλλάκτες επιμολυσμένων κυττάρων 293Τ. Η φωσφορυλίωση σε Thr288 εξετάστηκε για να αποδείξει ότι η K /R επηρεάζονται ως ένα κυρίαρχο αρνητικό. Ε: Έκφραση ser51 φωσφορυλιώθηκαν Aur-Α πρωτεΐνη εξετάστηκε με ανάλυση western blot σε βάρος και Κ /R μεταλλαγμένο επιμολυσμένα κύτταρα 293Τ με νοκοδαζόλη (NOC) και το οκαδαϊκό οξύ (ΟΑ)

Η

Aur-A. υπερέκφραση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυττάρων που προκαλείται από την συστατική φωσφορυλίωση σε ser51

Λαμβάνοντας υπόψη τις ανωτέρω διαπιστώσεις, υποθέσαμε ότι Aur-Α υπερέκφραση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα μπορεί να προκληθεί από τη σταθεροποίηση της Aur-Α πρωτεΐνης μέσα από μια συστατική φωσφορυλίωση σε ser51. Επομένως, εξετάσαμε την κατάσταση της φωσφορυλίωσης επί ser51 σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές κεφάλι και το λαιμό. Η φωσφορυλίωση επί ser51 ανιχνεύθηκε σε HSC2, HSC3 και ΗΟ-1-U-1 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν Aur-A πρωτεΐνη σε υψηλότερα επίπεδα. Ωστόσο, HSC2 και HSC3 κύτταρα δεν έδειξαν ενίσχυση του γονιδίου ή mRNA υπερέκφραση. κύτταρα HSC4, τα οποία εμφανίζουν τόσο γονιδιακή ενίσχυση και τα υψηλά επίπεδα του mRNA, αλλά τα επίπεδα πρωτεΐνης χαμηλότερα από εκείνη που υπάρχει στο HSC2 και HSC3, δεν έδειξε τη φωσφορυλίωση επί ser51. Ως εκ τούτου, το καθεστώς του κατάσταση ser51 φαίνεται να επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης. Είναι ενδιαφέρον, φωσφορυλίωση επί ser51 επίσης ανιχνεύθηκε σε HSC2, HSC3 και ΗΟ-1-U-1 κύτταρα όταν τα κύτταρα συγχρονισμένα σε φάση G1, γεγονός που υποδηλώνει ότι ser51 ήταν ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, εξετάσαμε την κατάσταση της φωσφορυλίωσης για ser51 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου περιπτώσεις. Στην πραγματικότητα, η φωσφορυλίωση επί ser51 ανιχνεύθηκε σε 4 από 9 περιπτώσεις καρκίνου κεφαλής και τραχήλου (Εικόνα 5C). Όλες οι περιπτώσεις με φωσφορυλίωση σε ser51 έδειξε εξαιρετικά έκφραση Aur-Α πρωτεΐνη

Α:. Φωσφορυλίωση σε Ser 51 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Η έκφραση του ser51 φωσφορυλιώθηκαν Aur-Α πρωτεΐνη εξετάζεται με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με ένα phosopho-ειδικό αντίσωμα έναντι ser51 του Aur-Α που ακολουθείται από immunoblottoing ανάλυση (ΙΒ) με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα προς Aur-Α σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Η γονιδιακή ενίσχυση και έκφραση του mRNA εξετάστηκαν προηγουμένως [9]. Β: Καταστατική φωσφορυλίωση σε Ser 51 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Ενδείκνυται κυτταρικές σειρές καρκίνου απελευθερώθηκαν από NOC που προκαλείται προμεταφασικά σύλληψη και συλλέγονται σε 4 ώρες. Κύτταρα είχαν σχεδόν εντελώς αποχώρησε από την μίτωση. Η έκφραση του ser51 φωσφορυλιώθηκαν Aur-Α πρωτεΐνη εξετάζεται με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με ένα phosopho-ειδικό αντίσωμα έναντι ser51 του Aur-Α που ακολουθείται από immunoblottoing ανάλυση (ΙΒ) με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα προς Aur-A. Cul1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και Η3 φωσφο-ιστόνης (Ser10) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για μίτωση. C: Έκφραση ser51 φωσφορυλιώθηκαν Aur-Α πρωτεΐνη εξετάζεται με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με ένα phosopho-ειδικό αντίσωμα έναντι ser51 του Aur-Α που ακολουθείται από immunoblottoing ανάλυση (ΙΒ) με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα προς Aur-Α σε κύτταρα σε φυσιολογικά στοματικού βλεννογόνου ιστού και 9 καρκίνο κεφαλής και τραχήλου ιστούς. β-ακτίνη expession χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

ιδρυτική φωσφορυλίωση σε ser51 ενισχυμένη κυτταρική μεταμόρφωση

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η ογκογένεση προκαλείται από υπερέκφραση του Aur-A πρωτεΐνη λόγω φωσφορυλίωση επί ser51, εκτελέσαμε την σταθερότητα του S51D μεταλλαγμένου και μετασχηματισμός κυττάρων σε σύγκριση με άγριου τύπου. Ενώ η έκφραση της άγριου τύπου πρωτεΐνης και του μεταλλαγμένου S51D είναι σχεδόν πανομοιότυπη σε μιτωτικά κύτταρα, το μεταλλαγμένο S51D δεν αποικοδομείται όταν τα κύτταρα βγήκε μίτωση (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, οι χρόνοι ημιζωής της μεταλλαγμένης S51D ήταν μακρύτερα από εκείνα του αγρίου τύπου, S51A και Κ /R μεταλλάγματα (Σχήμα 6Β). Έτσι, S51D μεταλλαγμένο εκφράστηκε σταθερά κατά τη διάρκεια της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της μετατροπής των κυττάρων χρησιμοποιώντας το

γ

3Τ3 A31-1-1 κύτταρα BALB /(Σχήμα 6C). Είμαστε συν-επιμολυσμένα

Aur-Α

και G12V-

HRAS

(T24-

ras

), και παρατήρησε ότι

Aur-Α

ενίσχυσε τη συχνότητα της G12V-

HRAS

επαγόμενη μεταμόρφωση. Είναι ενδιαφέρον, ένα πολύ μεγαλύτερο αριθμό εστιών βρέθηκαν με το μεταλλαγμένο S51D, γεγονός που υποδηλώνει ότι ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση σε ser51 ενίσχυσε ογκογόνο δυναμικό

Α:. Τροποποίηση του ννί και S51D Aur-Α έκφραση μετά νοκοδαζόλη απελευθέρωση σε κύτταρα HeLa. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν παροδικά με wt και S51D Aur-A. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με NOC σύλληψη και μιτωτικό κούνημα-off, που τίθενται σε φρέσκο ​​μέσο, ​​συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται. Τα δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western με FLAG, κυκλίνη Α, ρ27, φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10) και αντισώματα Cul1. Β: Χρόνος ημιζωής του wt και μεταλλάγματα (S51A, S51D και KR) του Aur-A κύτταρα επιμολυσμένα 293Τ (αριστερό πάνελ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CHX για προκαθορισμένο χρόνο. Δικαίωμα πλαίσιο δείχνει αναλογία Aur-Α /Cul1 μετρηθεί με πυκνομετρία. C: Επίδραση της S51D μεταλλαγμένων Aur-Α έκφραση στο μετασχηματισμό των κυττάρων στο

γ

3Τ3 A31-1-1 κύτταρα BALB /. FLAG-tagged κ.β., S51A και S51D μεταλλάκτες Aur-Α επιμολύνθηκαν με ή χωρίς H-Ras (G12V). Έκφραση των wt, S51A και S51D μεταλλάκτες Aurora-Α και Η-Ras επιβεβαιώνονται με ανάλυση Western blot (αριστερό πάνελ). Μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας, οι δίσκοι σταθεροποιήθηκαν με αιθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa (μεσαίο πλαίσιο). Ποσοτικοποίηση του αριθμού των μετασχηματισμένων εστιών όπως προσδιορίζεται με τη χρήση τυποποιημένων κριτηρίων (δεξί πάνελ). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το sd

Η

Συζήτηση

Aur-Α κινάσης συνδέεται με το κεντρόσωμα από τη στιγμή της κεντροσώματος επικάλυψη έως μιτωτική έξοδο, και συνδέεται επίσης με τις περιοχές των μικροσωληνίσκων εγγύς να κεντροσωμάτια στη μίτωση [2]. Σε σωματικά κύτταρα, τόσο τα επίπεδα πρωτεΐνης και η δραστικότητα της κινάσης του Aur-μια αιχμή κατά τη διάρκεια της μίτωσης, και στη συνέχεια πέφτουν (συμπληρωματικό σχήμα, Σχήμα S1) [4], [29]. Έχει αποκαλυφθεί ότι Aur-Α ubiquitylated από την APC

Cdh1 στην έξοδο της μίτωσης [18], [19], [23], [24], [28]. Η APC

συγκρότημα Cdh1 ουβικιτίνης λιγάση αναγνωρίζει τις πρωτεΐνες που περιέχουν είτε D-Box ή μοτίβα KEN-box [30] – [32]. Στην πραγματικότητα, Aur-Α έχει τέσσερις d-box και μια μοτίβα KEN-box. Εδώ, επιβεβαιώσαμε ότι το C-τερματικό D-box και Ν-τερματικό A-box (

47RxLxPSN

52) ήταν απαραίτητες για την υποβάθμιση της ανθρώπινης Aur-Α, παρόμοια με προηγούμενες εκθέσεις [20] – [ ,,,0],22]. Επιπλέον,

Xenopus

Ser53 εντός της συσκευασίας A φωσφορυλιώνεται κατά τη διάρκεια της μίτωσης και της εν λόγω φωσφορυλιωμένης Ser53 (ή 51 σε ανθρώπινα) είναι απαραίτητη για μιτωτική ειδική σταθεροποίηση [23], [24]. Βρήκαμε επίσης ότι η φωσφορυλίωση ser51 ανέστειλε APC

Cdh1 μεσολάβηση της υποβάθμισης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, Aur-Β έχει επίσης τέσσερις d-box, μοτίβα ένα KEN-box και παρόμοιες ακολουθίες Α-πλαίσιο για να Aur-A. Αν και έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι το επίπεδο πρωτεΐνης Aur-Β ελέγχεται επίσης από την APC

Cdh1 [33], [34], στη μελέτη μας, το επίπεδο έκφρασης Aur-Β δεν άλλαξε μετά από συν-διαμόλυνση με Cdh1 (Εικόνα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, Aur-Β Ε32Α και μεταλλάξεις E32S (Glu32 αντιστοιχούν σε ser51 του Aur-Α) αποικοδομείται από την APC

Cdh1 (Σχήμα 3C και D), υποδηλώνοντας έντονα ότι Aur-Β μπορεί να μην υποβαθμίζονται εξαιτίας της φωσφορυλίωσης μιμούνται στο Glu32 . Συνολικά προτείνουν ότι φωσφορυλίωση επί ser51 παίζει σημαντικό ρόλο για τη σταθεροποίηση του Aur-Α πρωτεΐνη. Είναι ενδιαφέρον, φωσφορυλίωση επί ser51 δεν παρατηρήθηκε σε κινάσης ανενεργό μετάλλαγμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση ser51 μπορεί να ρυθμίζεται τουλάχιστον με φωσφορυλίωση Thr288 (Σχήμα 4D και Ε). φωσφορυλίωση ser51 παρατηρήθηκε σε μίτωση και εξαφανίστηκε πριν από μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης της Aur-Α (Σχήμα 4C). Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η φωσφορυλίωση ser51 μπορεί να ελέγχει τη σταθερότητα των Aur-A επίπεδο πρωτεΐνης και απο-φωσφορυλίωση της ser51 μπορεί να είναι ένα έναυσμα για την Aur-υποβάθμιση. Είναι ενδιαφέρον, ότι πρόσφατα έχει αναφερθεί ότι η ΡΡ2Α πρωτεϊνική φωσφατάση και Aur-A συν-εντοπίζονται στους πόλους των κυττάρων κατά τη διάρκεια της μίτωσης [35]. Βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση ser51 του Aur-Α προκλήθηκε μετά από 2 ώρες της αγωγής με αναστολέα ΡΡ2Α σε κύτταρα HeLa (S. Kitajima και Υ Kudo αδημοσίευτα δεδομένα). Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι ΡΡ2Α μπορεί να ελέγχει Aur-υποβάθμιση από de-φωσφορυλίωσης ser51. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι τα ελαττώματα ΡΡ2Α φωσφατάσης ανιχνεύθηκαν σε ορισμένες μορφές καρκίνου και αρκετών αναστολέων ΡΡ2Α μπορεί να προκαλέσει κακοήθη αλλοίωση [36]. Αυτά τα ευρήματα μας έκανε να υποθέτουν ότι η διαταραχή του ΡΡ2Α μπορεί να προκαλέσει ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση σε ser51 του Aur-Α σε καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την κατάσταση της ΡΡ2Α και συσχετίζεται με Aur-Μια κατάσταση φωσφορυλίωσης ser51 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου κεφαλής και του τραχήλου. Ωστόσο, η έκφραση ΡΡ2Α δεν συσχετίστηκε με την κατάσταση φωσφορυλίωσης ser51 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (συμπληρωματική εικόνα, Σχ. S2). Επιπλέον, εξετάσαμε την ανάλυση μετάλλαξης του

PPP2R1B

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί την βήτα ισομορφή της Α υπομονάδας της ΡΡ2Α.

PPP2R1B

αναγνωρίστηκε ως υποθετικό ανθρώπινο ογκοκατασταλτικό γονίδιο και μετάλλαξης του

PPP2R1B

παρατηρήθηκε σε πνεύμονα και του κόλου [37]. Εμείς δεν θα μπορούσε να παρατηρήσει οποιαδήποτε μετάλλαξη του

PPP2R1B

γονιδίου σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δυστυχώς, δεν μπορέσαμε να βρούμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ ΡΡ2Α και Aur-Μια κατάσταση φωσφορυλίωσης ser51 στον καρκίνο. Για να αποδειχθεί η συσχέτιση μεταξύ ΡΡ2Α και Aur-Μια κατάσταση φωσφορυλίωσης ser51 χρειάζεται περαιτέρω πειράματα.

Ομοίως με Aur-A ρύθμιση από φωσφορυλίωση, CDC6 προστατεύεται από APC-deirected υποβάθμιση λόγω του ότι είναι η φωσφορυλίωση [38]. Οι φωσφορυλιωμένες θέσεις CDC6 από κυκλίνη E-CDK2 βρίσκεται σε άμεση γειτνίαση με το D-box, και ως εκ τούτου εμποδίζει την αναγνώριση των CDC6 από APC

Cdh1. Στην περίπτωση Aur-Α, ser51 βρίσκεται μακριά από την D-box, αλλά ser51 βρίσκεται στο Α-box, η οποία είναι επίσης απαραίτητη για ubiquitylation. Ωστόσο, S51D Aur-Α μεταλλαγμένο καθώς και κβ και S51D μεταλλαγμένο μπορεί να συνδεθεί με Cdh1 (συμπληρωματική εικόνα, Σχ. S3A). Παραδόξως, Aur-Α δεσμεύεται με Cdh1 και APC συστατικό, Cdc27 σε Μ φάση (συμπληρωματική εικόνα, Σχ. S3b και C). Ως

in vitro

ubiquitylation ανεστάλη σε S51D μεταλλαγμένο (Σχήμα 2G), προτείνουμε ότι η φωσφορυλίωση ser51 μπορεί να διαταράξει τη διαδικασία ubiquitylation από την APC

Cdh1. Αν και ο ρόλος των υπομονάδων του APC στην αναγνώριση υπόστρωμα είναι πιο μυστηριώδες, όχι μόνο οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υποστρωμάτων και συν-ενεργοποιητών, αλλά επίσης εκείνες μεταξύ των υποστρωμάτων και APC φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από D-box [39], [40]. Μεταλλακτικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι doc1 είναι σημαντικό για την ικανότητα του APC να ubiquitylate υποστρώματα κατά επεξεργαστικό τρόπο [41]. Ως εκ τούτου, η φωσφορυλίωση επί ser51 μπορεί να διαταράξει την αναγνώριση από την APC υπομονάδες όπως doc1, αλλά υπάρχει μια σειρά από άλλες δυνατότητες. Για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός της προστασίας των Aur-υποβάθμιση από φωσφορυλίωση σε ser51 περαιτέρω μελέτες θα απαιτηθούν. Επιπλέον, είναι ενδιαφέρον να εξεταστεί κατά πόσον ή όχι ρύθμιση της APC με τη μεσολάβηση πρωτεόλυση με φωσφορυλίωση, όπως διαπιστώθηκε στην Aur-Α και CDC6, είναι μια κοινή εκδήλωση μεταξύ των άλλων υποστρωμάτων.

Aur-Α έχει αναφερθεί σε υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων, και η υπερέκφραση του επάγει ανευπλοειδία, κεντρόσωμα ενίσχυση και ογκογόνο μετασχηματισμό σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα και τρωκτικού [3] – [5]. Όπως Aur-Α χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 20q13.2, μια περιοχή ενισχύεται συνήθως σε ανθρώπινους καρκίνους [4] – [6], η υπερέκφραση του Aur-Α πιστεύεται ότι προκαλείται από γονιδιακή ενίσχυση ή μεταγραφική ενεργοποίηση. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι η υψηλή έκφραση του Aur-A πρωτεΐνη δεν προκλήθηκε μόνο από γονιδιακή ενίσχυση και υπερέκφραση του mRNA σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές κεφάλι και το λαιμό. Αυτό το εύρημα υποστηρίζεται από προηγούμενη διαπίστωση ότι η ενίσχυση του

Aur-A

εντοπίστηκε μόνο στο 3% των περιπτώσεων, αλλά περισσότερο από το 60% των περιπτώσεων υπερεκφράζεται Aur-Α mRNA και πρωτεΐνης σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [42]. Παρόμοιες διαφορές μεταξύ των ποσοστών ενίσχυσης και υπερέκφραση αναφέρθηκαν επίσης στον καρκίνο του μαστού [5], γαστρικού καρκίνου [26] και τον καρκίνο των ωοθηκών [12]. Αυτή η διαφορά μπορεί να εξηγηθεί από τα ευρήματά μας που παρατηρήθηκε συστατική φωσφορυλίωση ser51 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα με υπερέκφραση του Aur-Α πρωτεΐνη. Πράγματι, η φωσφορυλίωση ser51 παρατηρήθηκε επίσης στο κεφάλι και το λαιμό καρκινικούς ιστούς με Aur-A υπερέκφραση πρωτεΐνης. Καθώς η φωσφορυλίωση ser51 ανέστειλαν την APC

Cdh1 μεσολάβηση αποικοδόμησης, συνιστούμε ότι ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση σε ser51 μπορεί να προκαλέσει σταθεροποίηση πρωτεΐνης και την επακόλουθη συσσώρευση στα καρκινικά κύτταρα που εμφανίζουν υπερέκφραση του Aur-Α πρωτεΐνης (Εικόνα 7). Είναι πρόσφατα Έχει αποκαλυφθεί ότι ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών δεν έδειξε την μετασχηματισμένο φαινότυπο όταν Aur-Α υπερεκφράζεται [43], και ότι διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν Aur-A δεν ανέπτυξαν κακοήθεις όγκους [44]. Επιπλέον, η αντίστοιχη πρωτεΐνη δεν ανιχνεύθηκε σε εκχυλίσματα, παρά αυξημένα μεταγραφές για Aur-Α σε πολλαπλά όργανα των διαγονιδιακών ποντικών, και την επεξεργασία των διαγονιδιακών προερχόμενων εμβρυϊκών ινοβλαστών με αναστολείς πρωτεασώματος σημαντικά αύξησε το επίπεδο της πρωτεΐνης των διαγονιδιακών Aur-A [27]. Ως εκ τούτου, η καταστολή της αποικοδόμησης των πρωτεϊνών μπορεί να είναι σημαντικό για Aur-Α υπερέκφραση και ογκογόνο ρόλο της. Κυτταρική μεταμόρφωση από Aur-Α υπερέκφραση μπορεί να απαιτούν καταστολή της πρωτεϊνικής αποδόμησης, δεν πρόσθετους παράγοντες. Είναι σημαντικό ότι, ένα μεταλλαγμένο Aur-Α S51D έδειξαν σημαντικά υψηλή επιδεκτικότητα σε μετασχηματισμό (Σχήμα 6C). Εν ολίγοις, προτείνουμε ότι η προστασία της πρωτεϊνικής αποδόμησης της από συστατική φωσφορυλίωση σε ser51 μπορεί να προκαλέσει Aur-A υπερέκφραση στον καρκίνο, και ότι η μη-αποικοδόμησης Aur-Α μπορεί να έχει ισχυρό ογκογόνο ρόλους. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση των Aur-Α φωσφορυλίωση μπορεί να είναι ένας νέος στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου.

Κατά τη διάρκεια της μίτωσης, Aur-A είναι φωσφορυλιωμένη επί ser51 στα φυσιολογικά κύτταρα. Στο μιτωτική έξοδο, Aur-Α απο-φωσφορυλιώνεται από ΡΡ2Α και ubiquitylated από την APC

Cdh1. Από την άλλη πλευρά, Aur-A είναι ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη επί ser51 σε καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, Aur-Α δεν μπορεί να ubiquitylated και κατά συνέπεια έχουν συγκεντρωθεί από τα καρκινικά κύτταρα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Proteasome αναστολέα ZLLL (Ζ-Leu -Leu-Leu-CHO) ελήφθη από Peptide Institute inc. (Osaka, Japan). Κυκλοεξιμίδιο (CHX), νοκοδαζόλη (NOC) και το οκαδαϊκό οξύ (ΟΑ) ελήφθησαν από τη Sigma. Η Aur-A φωσφο-ser51-ειδικό αντίσωμα δημιουργήθηκε με ανοσοποίηση κουνελιών με το συνθετικό πεπτίδιο P * SNSSQRIPC, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 50-59 της ανθρώπινης Aur-Α αλληλουχίας με ένα φωσφο-σερίνη στη θέση 51 (* S). Το αντίσωμα καθαρίστηκε από ορό με δύο γύρους χρωματογραφίας συγγένειας σε στήλη πεπτίδιο φωσφο-ser51 ακολουθούμενη από μία στήλη μη φωσφοπεπτιδίου.