Αφηρημένο

αντίσταση των κυττάρων του καρκίνου σε anoikis οδηγείται από ανώμαλης σηματοδότησης που υπέστη το μικροπεριβάλλον του όγκου προσδίδει υψηλή διεισδυτική ικανότητα και θεραπευτικές αντίσταση. Εμείς παράγεται πρόσφατα μια νέα μόλυβδο κιναζολίνης που βασίζεται παράγωγο Doxazosin®, DZ-50, η οποία εξασθενεί την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση μέσω anoikis. ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο στον προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου DU-145 προσδιορίσει τον πρωταρχικό μειωτικά στόχους του DZ-50, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που εμπλέκονται στην εστιακή ακεραιότητα προσκόλλησης (ινονεκτίνη, ιντεγρίνη-α6 και ταλίνη), σχηματισμός σφιχτά διασταύρωση (κλαουδίνης-11), καθώς και η ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας δέσμευσης πρωτεΐνης 3 (IGFBP-3) και την αγγειογένεση διαμορφωτή θρομβοσπονδίνης 1 (TSP-1). Ομοεστιακό μικροσκόπιο κατέδειξε δομική διάρρηξη των δύο εστιακών συμφύσεων και σφιχτών συνδέσεων από την ρύθμιση προς τα κάτω των εν λόγω στόχων γονιδίου, με αποτέλεσμα μειωμένη κυτταρική επιβίωση, μετανάστευση και προσκόλληση σε εξωκυττάρια μήτρα (ECM) συστατικά σε δύο μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του προστάτη, PC-3 και DU-145. Σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-ECM από υπερέκφραση ταλίνη-1 ή /και εκθέτοντας τα κύτταρα σε φιμπρονεκτίνη-πλούσιο περιβάλλον μετρίασε την επίδραση της DZ-50. Απώλεια της έκφρασης του τελεστών σηματοδότησης ενδοκυτταρικής εστιακής προσκόλλησης Talin-1 και ιντεγρίνη συνδέεται κινάσης (ΙίΚ) ευαισθητοποιημένα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη να anoikis. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η DZ-50 ασκεί αντικαρκινική δράση της με στόχο τις βασικές λειτουργικές ενδοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις, συμφύσεων και σφιχτό κόμβους, υποστηρίζοντας τη θεραπευτική σημασία αυτού του παράγοντα για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Hensley PJ , Desiniotis Α, Wang C, Stromberg Α, Chen CS, Κυπριανού Ν (2014) Μυθιστόρημα Φαρμακολογική στόχευση των σφιχτών συνδέσεων και τοπικές συμφύσεις στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (1): e86238. doi: 10.1371 /journal.pone.0086238

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 του Νοεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 12 Δεκέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιαν, 2014

Copyright: © 2014 Hensley et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, R01-GRANT00491815 και από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων και του Εθνικού Κέντρου για την Προώθηση της Μεταγραφική Επιστημών, UL1RR033173. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Παρακαλώ σημειώστε ότι οι συγγραφείς έχουν δηλώσει τα εξής COI: Όπως το αντίστοιχο συγγραφέα, Νατάσα Κυπριανού δηλώνει ότι χρησιμεύει ως Ακαδημαϊκό Εκδότης του PLoS ONE συντακτικής επιτροπής, αλλά επιβεβαιώνει ότι αυτό δεν αλλοιώνει την τήρηση της σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται στον οδηγό για τους συγγραφείς. Επιπλέον, υπάρχει ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που σχετίζονται με υλικό σχετικό με το άρθρο αυτό, δηλαδή, η παραγωγή του νέου φαρμάκου, DZ-50, από τους συγγραφείς Δρ Chen και ο Δρ Κυπριανού. Δηλώνουν αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας, που ονομάζεται: «Novel Αντικαρκινική παράγοντες και μέθοδοι της χρήσης τους ως προς τη στόχευση του καρκίνου του προστάτη,» Πανεπιστήμιο του Κεντάκι /Ohio State University κοινή εφεύρεση, Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ S.N. 12 /323.073. (Ching-Shih Chen και η Νατάσα Κυπριανού, coinventors.) Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι η κυριότητα /εφεύρεση αυτής της πατέντας δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των ανδρών, με 206.640 άνδρες διαγνώστηκαν και 28.088 πεθαίνουν από καρκίνο του προστάτη, το 2012 [1]. Χημειοθεραπευτικοί στόχευση των ανδρογόνων άξονα στον καρκίνο του προστάτη σηματοδότηση έχει συμβάλει στην καλύτερη ποσοστό επιβίωσης του καρκίνου στους άνδρες. Ωστόσο, ένα υποσύνολο των ασθενών γίνονται ανθεκτικοί σε θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων παραλείποντας απόπτωση και προχωρούν σε ανθεκτικά ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη (CRPC) [2]. Προστάτη αδενικά επιθηλιακά κύτταρα έχουν την εγγενή ανάγκη για σήματα επιβίωσης που προσδίδεται από μεσοκυττάρια και κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) αλληλεπιδράσεις. Εστιακή συμφύσεις είναι ζωτικής σημασίας τόσο για την κανονική επαφή-εξαρτώμενη σηματοδότηση από φυσιολογικά κύτταρα και εισβολή, τη μετανάστευση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων.

Εργασία από αυτό το εργαστήριο προσδιορίζονται νέα δράση κατά των όγκων που ασκείται από τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται κλασικά για τη θεραπεία της καλοήθους υπερπλασία του προστάτη (κιναζολιν-α ανταγωνιστές

1-αδρενεργικών υποδοχέων) μέσω επαγωγής της απόπτωσης εξωγενούς καταρράκτη (ενεργοποίηση του υποδοχέα του θανάτου, κασπάσης-8 διάσπαση και αναστολή επιβίωσης ΑΚΤ σηματοδότηση) [3], [4], [5]. Διαρθρωτικά βελτιστοποίηση οδήγησε στην παραγωγή νέων ενώσεων ικανών επαγωγής anoikis και η αναστολή της αγγειογένεσης [6], [7]. Anoikis, αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αποθετική ανεπαρκούς αλληλεπιδράσεις κυττάρου-ECM, είναι ένα κρίσιμο συστατικό της αγγειογένεσης και της μετάστασης [8]. Επιθετική καρκινικά κύτταρα ανατρέψει αυτό το μηχανισμό, διατηρώντας την επιβίωση μέσω της διάδοσης και της σποράς σε απομακρυσμένα όργανα [9]. αντίσταση Anoikis συνδέεται στενά με αυξημένο μεταστατικό δυναμικό σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [10], καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [11], του καρκίνου του μαστού [12], καθώς και οι όγκοι μεσεγχυματικής προέλευσης [13].

Μετάσταση απαιτεί διάσπαση των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων με το μικροπεριβάλλον του όγκου, αυξημένο μεταναστευτικών και εισβολή ικανότητα και την ικανότητα να ξεπεράσει τα προ-αποπτωτικών σημάτων μεταδίδεται από μειωμένη μεσοκυττάρια και κυττάρου-ECM αλληλεπιδράσεις [14]. Η ECM περιλαμβάνει ένα ευρύ δίκτυο κυτοκινών που επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων, την κινητικότητα και την αγγειογένεση η οποία μπορεί να διατεθεί για την κυτταρική χρήση με ενζυματική πέψη και την αναδιαμόρφωση [15]. Οι διαμεμβρανικές ιντεγκρίνες χαρακτηρίζονται από αμφίδρομη σηματοδότησης. Ο ολιγομερισμός των πρωτεϊνών ιντεγκρίνης για ένα υπόστρωμα ECM επάγει διαμορφωτικές αλλαγές οι οποίες μεταδίδονται μέσω της μεμβράνης του πλάσματος να διαμορφώνει συγγένεια της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης τελεστές για κυτοσολικό ιντεγκρίνης ουρές [16]. Τα συσσωματώματα πρωτεϊνών, συλλογικά γνωστά ως σύνθετη εστιακή πρόσφυση (FAC), περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που δεσμεύονται με ακτίνη (Talin-1, βινκουλίνης, βιμεντίνη, παξιλλίνη, filamin, κλπ.), Τα οποία σταθεροποιούν τον κυτταρικό σκελετό και κινάσες (κινάση εστιακής προσκόλλησης [ΡΑΚ], ιντεγκρίνης -συνδεδεμένης κινάσης [ILK], και SRC μη υποδοχέα κινάση τυροσίνης) που διαδίδονται ενδοκυτταρική σηματοδότηση προς τον πυρήνα. Αυτό διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη «outside-in» σηματοδότηση ελέγχους καταρράκτη επεξεργάζεται ζωτικής σημασίας για την κυτταρική λειτουργία και την ανάπτυξη ως εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την διαφοροποίηση [17].

Καθώς το δίκτυο κυτταροσκελετική ακτίνη υφίσταται δυναμική αναδιαμόρφωση /οργανισμού, οι επάγει ιντεγκρίνης ομαδοποίησης «μέσα-έξω» σηματοδότηση για την αύξηση της συνάφειας των ιντεγκρινών στην ECM, θεσπίζοντας ουσιαστικά ένα κομβικό πρόσφυση [18]. Μετά ανεπαρκής αλληλεπιδράσεις ιντεγκρίνης-ECM, τα κύτταρα ρυθμίζουν προς τα κάτω μέλη της αντι-αποπτωτικής οικογένεια Bcl-2 και ρυθμίζουν προς τα πάνω συνδέτη Fas (FasL), επάγοντας anoikis μέσω της εξωγενούς οδού απόπτωσης [19], [20]. Ταλίν-1 συμβάλλει λειτουργικά στην anoikis-αντίσταση και προστάτη της μετάστασης του καρκίνου με την ενίσχυση της εστίασης σχηματισμό πρόσφυση και σηματοδότηση Akt-επιβίωσης. Δείξαμε πρόσφατα μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ ταλίνη-1 υπερέκφραση και μετάσταση σε ένα μοντέλο ποντικού της ογκογένεσης του προστάτη και στην εξέλιξη της ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη [10].

Φαρμακολογική εκμετάλλευση του doxazosin® ανταγωνιστή α1-αδρενεργικών υποδοχέων οδήγησε στην γενιά των νέων ενώσεων κιναζολίνης που βασίζεται, με τον κύριο παράγοντα, DZ-50, έχει ισχυρή anoikis-επαγωγικές επιδράσεις κατά των καρκινικών κυττάρων [6]. DZ-50 καταστέλλει την ανάπτυξη του ανθρώπινου ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη και αναστέλλει μεταστατικό δυναμικό

in vivo

αλλοιώνοντας την αγγειογένεση, τη μετανάστευση και την εισβολή [7] με στόχο την εστιακή πρόσφυση άξονα [11] σηματοδότησης τους. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τις κυτταρικών στόχων του DZ-50 σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη. ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο εντοπίζονται κρίσιμες τελεστές της εστιακής προσκόλλησης και σφιχτό αλληλεπιδράσεις διασταύρωση που απευθύνονται από το μυθιστόρημα παράγοντα κιναζολίνης.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Η ανδρογόνων ανεξάρτητη από ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC-3 και DU-145 λήφθηκαν από την American Type Tissue Culture Collection και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen) και αντιβιοτικά (PenicilinG /στρεπτομυκίνη, 50 μg /mL). DU-145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pEGFP ή ταλίνη-1 πλασμίδια και κλωνοποιήθηκε υπό επιλογή G418 (Life Technologies Bethesda Research Laboratories). Για αποσιώπηση της έκφρασης Ταλίν-1, ο φορέας shRNA Ταλίν-1 (GIPZ shRNAmir Ταλίν-1) χρησιμοποιήθηκε από Open Biosystems (Hunsville, AL) και shRNA talin1 DU-145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα επιλέχθηκαν στο πλαίσιο πουρομυκίνης. Πολυκλωνικά πληθυσμοί συνενώθηκαν υπό επιλογή, και σταθερές κυτταρικές σειρές χαρακτηρίζονται από ανοσοκηλίδωση. κύτταρα PC-3 διαμολύνθηκαν σταθερά με τον φορέα που περιέχει pTRIPZ TRE-ΙίΚ shRNA (Thermo Scientific). PC-3 κύτταρα shILK διεγέρθηκαν με 2 μg /ml δοξυκυκλίνης (Enzo Life Sciences) για δύο ημέρες. DZ-50, ένα πρώτο γενιάς παράγωγο δοξαζοσίνης (Shaw et al, 2004?.. Garrison et al, 2007), χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 5 μΜ διαλύεται σε DMSO για όλες τις θεραπείες. Στείρα DMSO χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο /ακατέργαστα δείγματα.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα εκτιμήθηκε μετά από αγωγή με 5 μΜ DZ-50 με τη χρήση της χρωματομετρικής ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλθειαζολ – 2-υλ] -2,5 διφαινυλοτετραζολίου) δοκιμασίας (1 mg /ml ΜΤΤ σε PBS), και ποσοτικά με τη χρήση φασματοφωτομετρική μέτρηση. Η στατιστική ανάλυση των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν, εκφράζεται σε σχέση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο.

Κυττάρων Η μετανάστευση Δοκιμασία

Τραυματισμός επιβλήθηκε χρησιμοποιώντας ένα στείρο ρύγχος πιπέτας σε συρρέουσες κυτταρικές μονοστιβάδες σε 6- φρεατίων. Μετά από επώαση για 12-48 ώρες παρουσία του DZ-50 (5 μΜ), τραυματίες περιοχές εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτός (Axiovert 10, Zeiss). Τα κύτταρα μεταναστεύουν προς τις περιοχές τραυματίες μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. δυναμικό μετανάστευση προσδιορίστηκε ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων σε τρία τυχαία υψηλής ισχύος (400 ×) πεδία /φρεάτιο. Τα αριθμητικά δεδομένα που λαμβάνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και εκφράζεται σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Πρόσφυση Κυττάρων Δοκιμασία

Καλλιέργειες των PC-3 και DU-145 sublines υποβλήθηκαν σε επεξεργασία (24 ώρες) με DZ-50 (5 μΜ) και συλλέχθηκαν. Κύτταρα (1 χ 10

5 /φρεάτιο) προστέθηκαν σε πλακίδια 6 φρεατίων επικαλυμμένα με ινονηκτίνη (5 μg /ml, BD Biosciences) και μετά από μια επώαση 30 λεπτών στους 37 ° C, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 100% ( ν /ν) ψυχρή μεθανόλη και υποβάλλεται σε ανάλυση εικόνας. Ο αριθμός των κυττάρων που προσκολλώνται μετρήθηκε σε τρία αντιπροσωπευτικά πεδία /φρεάτιο (400 Χ). Αριθμητικά δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν και εκφράζονται σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Ανάλυση Western Blot

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη, DU-145 και PC-3, υποβλήθηκαν σε αγωγή με DZ-50 (5 μΜ) για διαδοχική χρονικές περιόδους και προϊόντα λύσης κυττάρων παρήχθησαν σε ρυθμιστικό λύσης (150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris (ρΗ 8,0), 0,5% δεσοξυχολικό οξύ, 1% ΝΡ40 με 1 mmol /L φαινυλ μεθυλ-σουλφονύλιο, ρΗ 7,4). Τα δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Hybond-C μεμβράνες (Amersham Pharmacia Biotechnology). Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 ° C με τα ειδικά πρωτογενή αντισώματα: Akt (Cell Signaling Technology), φωσφορυλιωμένου Akt Ser 473 (Cell Signaling Technology), GSK-3β (Cell Signaling Technology), φωσφορυλιωμένα GSK Ser 9 (Cell Signaling Technology), ILK-1 (Cell Signaling Technology), ΖΟ-1 (Invitrogen), κλαουδίνης-11 (Santa Cruz Biotechnology), Talin-1 (Millipore) ή ακτίνης (Calbiochem). Μετά την επώαση με το αντίστοιχο πρωτεύον αντίσωμα, μεμβράνες εκτέθηκαν σε δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας και το σήμα ανιχνεύθηκε με SuperSignal West Dura παρατεταμένη διάρκεια Υπόστρωμα (Pierce) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ. Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ και οι τιμές εκφράζονται σε σχέση με τους μάρτυρες.

Gene (qRT-PCR) Ανάλυση

RNA απομονώθηκε από προϊόντα λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Ambion) και καθαρό RNA Σύνδεσμος Mini Kit (Invitrogen) σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Μετά την ομογενοποίηση και διαχωρισμό φάσεων με φυγοκέντρηση (12.000 g, 4 ° C), RNA καταβυθίστηκε με ισοπροπανόλη. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (12.000 g, 4 ° C) και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας RNA (1 μg) και το σύστημα μεταγραφής Reverse (Promega). ανάλυση της σειράς DNA διεξήχθη στο μικροσυστοιχιών πυρήνα Διευκόλυνση Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip Τεχνολογία. Οι μεταγραφές αξιολογήθηκαν με ΑΒΙ 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc.)? κάθε θεραπεία (5 μΜ DZ-50, 9 ώρες) πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Για την ανάλυση RT-PCR, RNA (1 μ§) υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή με τη χρήση του Συστήματος Μεταγραφή Reverse (Promega). Οι ακόλουθοι εκκινητές σχεδιάστηκαν (Sigma) για το σύστημα της πράσινης ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) SYBR: Ινονεκτίνης-1 (F: 5′- TCATGAGGCAACGTGTTATGATG-3 ‘, R: 5′-CGAGATATTCCTTCTGCCACTGT-3′), TALIN- 1, (F: 5’- GCAGAAGGGAGAGCGTAAGATC-3 ‘, R: 5′-TGAGAGAACGGGCTAGCTTCA-3′), Integrin-α6 (F: 5’-CAGAAAGTGTGCATGGAGGAAA-3 ‘, R: 5′-TGGGAATGGGACGCAGTT-3′), και ΖΟ-1 (F: 5’- GGAGCTGCGCTTACCACACT-3 ‘, R: 5′-TTTGCTCCAACGAGATAATTTGG-3’). Οι ακόλουθοι εκκινητές ελήφθησαν για το σύστημα TaqMan qRT-PCR (Invitrogen): 18 s ριβοσωματικό RNA (rRNA), θρομβοσπονδίνη-1, IGF-ΒΡ3, κλαουδίνης-11, σαλιγκάρι. cDNA χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση qRT-PCR σύμφωνα με τις αντίστοιχες SYBR Green και πρωτόκολλα TaqMan (Bio-Rad). Για τα πειράματα qRT-PCR, κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Αριθμητικά δεδομένα για τα επίπεδα μεταγραφής κανονικοποιήθηκαν σε 18 s rRNA σε ελέγχους και εκφράζεται σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Ανάλυση Ανοσοφθορισμού

κύτταρα επιστρώνονται σε πλάκες θάλαμο 4-φρεατίων επικαλυμμένες με ινονεκτίνη (5 μg /ml , BD Biosciences) εκτέθηκαν σε DZ-50 θεραπεία (5 μΜ) για 12 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 100% (ν /ν) μεθανόλη, και μετά το κλείδωμα στους 4 ° C (5% NGS, 0,3% Triton Χ), εκτέθηκαν στο πρωτογενές αντίσωμα (4 ° C, όλη τη νύκτα). Οι ακόλουθες ειδικές αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: ILK-1 (Cell Signaling Technology), ΖΟ-1 (Invitrogen), κλαουδίνης-11 (Santa Cruz Biotechnology), σαλιγκάρι (Cell Signaling Technology), Talin (Millipore). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα (Invitrogen) (2 ώρες, θερμοκρασία δωματίου) και υποβλήθηκε σε συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας ένα v1.21 της Olympus FV1000 Συνεστιακό μικροσκόπιο. και την έκδοση λογισμικού FV10-ASW 3.1.

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

shTalin ή φορέα DU-145 καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DZ-50. Δείγματα RNA από κύτταρα πριν ή μετά (9 ώρες) θεραπεία υποβλήθηκαν στον πυρήνα εγκατάσταση Microarray Πανεπιστήμιο του Κεντάκυ για ανάλυση στο Affymetrix Human Gene 1,0 συστοιχίες ST (Affymetrix, Santa Clara, CA). Το πείραμα υπό κάθε συνθήκη διεξήχθη εις διπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας RMA και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) μοντέλα, με γονότυπο (shTalin ή φορέα) και θεραπεία (πριν ή μετά) ως τα δύο παράγοντες. Οι αντιθέσεις παράχθηκαν να αξιολογηθούν οι αλλαγές στην έκφραση του mRNA μεταξύ των κατεργασμένων έναντι μη επεξεργασμένα σε κύτταρα φορέα. Ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) και τις σχετικές τιμές Q υπολογίστηκαν με τη χρήση της μεθόδου σε REF. Διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων προσδιορίστηκαν με βάση FDR & lt? 20% και διπλώστε την αλλαγή & gt? 1.5. Οι στατιστικές αναλύσεις για τα δεδομένα από όλα τα άλλα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με βάση ένα δείγμα ή δύο δειγμάτων t-tests ανάλογα με την περίπτωση. Στην P & lt? 0,05 τιμές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Μυθιστόρημα κουιναζολίνης DZ-50 Προκαλεί προστάτη καρκίνο του Anoikis

Η anoikis-επαγωγική δράση του μολύβδου quanazoline ένωση DZ. -50 διερευνήθηκε σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη μεταβλητά εκφράζουν τις πρωτεΐνες FAC, ταλίνη-1 και ILK. Σταθερή επιμόλυνση των DU-145 κύτταρα οδήγησε σε νοκ ντάουν του Ταλίν (DU-145 shTalin) και υπερέκφραση του Ταλίν (DU-145 Ταλίν +) (Σχήμα 1, πίνακας Α). PC-3 κύτταρα τα οποία εκφράζουν έναν επαγώγιμο φορέα shILK αποδειχθεί αποτελεσματική ρύθμιση προς τα κάτω της ILK μετά από επαγωγή με δοξυκυκλίνη για 48 ώρες (Σχήμα 1, πλαίσιο Α). Υπήρξε μια χρονο-εξαρτώμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση προς DZ-50 (Σχήμα 1, πλαίσιο Β). Απώλεια της ILK και Ταλίν έκφραση σε PC-3 και DU-145 καρκινικών κυττάρων του προστάτη αντίστοιχα οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία σε DZ-50, ενώ η ταλίνη υπερέκφραση καταστέλλεται anoikis. Τα δεδομένα στον πίνακα C (Εικ. 1) δείχνουν ότι σε απόκριση προς DZ-50, του προστάτη μετανάστευση καρκίνος ell αυξάνεται σημαντικά. Απώλεια είτε ILK (PC-3 κύτταρα), ή ταλίνη (DU-145 κύτταρα), ανέστειλαν την κυτταρική μετανάστευση, ενώ ενισχύεται περαιτέρω η επίδραση της DZ-50. Απώλεια είτε ΙίΚ ή ταλίνη ανεξάρτητα οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυτταρικής προσκόλλησης στην φιμπρονεκτίνη (εικόνα 1, πίνακας D).

Πίνακας Α, δεξιά, Western blot αποκαλύπτοντας ότι shILK μορφομετατροπέα PC-3 κύτταρα εμφανίζουν ολική απώλεια του ILK-1 έκφραση πρωτεΐνης σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα μετά από επαγωγή με δοξυκυκλίνη (48 ώρες). Στα αριστερά, DU-145 κύτταρα στα οποία ταλίνη υπήρξε σιωπή (shTalin) ή υπερεκφράζεται (Talin +), παρουσιάζουν σημαντική μείωση ή σημειώνονται υπερέκφραση των επιπέδων της πρωτεΐνης ταλίνη αντίστοιχα, σε σχέση με τα γονικά κύτταρα DU-145. Το πάνελ Β, DZ-50 θεραπεία οδηγεί σε μια σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Απώλεια ILK1 ενισχύει τη προκαλείται από την απώλεια DZ-50 της κυτταρικής βιωσιμότητας? σε αντίθεση Talin υπερέκφραση προσδίδει αντίσταση σε DZ-50 θανάτου που επάγεται κυττάρου. Πάνελ C, DZ-50 μειώνει σημαντικά τη μετανάστευση του προστάτη καρκινικών κυττάρων. Απώλεια των αποτελεσμάτων ταλίνη σε σημαντική μείωση της μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με τον γονικό έλεγχο κύτταρα DU-145. Σε απάντηση προς DZ-50, ταλίνη υπερέκφραση αποκαθιστά κύτταρο μεταναστευτικών ικανότητα στα επίπεδα των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Πάνελ Α, λειτουργική απώλεια των ILK σε PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα και Talin απώλεια DU-145 κύτταρα παρεμποδίζει σημαντικά την ικανότητα των αντίστοιχων κυττάρων καρκίνου του προστάτη να συμμορφώνονται με ινονεκτίνη (ECM). Ταλίν υπερέκφραση ενισχύει σημαντικά την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε ινονεκτίνη, σε σύγκριση με τη γονική DU-145 και τα κύτταρα DU-145 shTalin. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο * p & lt?. 0.05

Η

Αναγνώριση των μοριακών στόχων του μολύβδου κουιναζολίνης

Γονιδίωμα-ευρύ ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης στον προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου DU-145 χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει πρωταρχικούς στόχους της DZ-50 (Εικ. 2). Ο χάρτης θερμότητα από την ανάλυση συστοιχίας γονιδίων μετά από θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κυττάρων με DZ-50 (για 9 ώρες) δείχνεται στο Σχήμα 2 (πίνακας Α). DZ-50 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες που σχετίζονται μεμβράνη του πλάσματος, συμπεριλαμβανομένων των ρυθμιστικών της ECM (

φιμπρονεκτίνης

και

ιντεγκρίνη α

6

), και σφιχτών συνδέσεων (

κλαουδίνης-11

), ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνη 3 (δεσμευτική

IGFBP-3

), καθώς και ο μεσολαβητής της αγγειογένεσης θρομβοσπονδίνη 1 (

TSP-1

). Για την επικύρωση του πίνακα των στόχων υποψήφιο γονίδιο που προσδιορίζονται από τη συστοιχία γονίδιο μοριακό προφίλ, μπορούμε στη συνέχεια διεξάγεται η ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) (Εικ. 2, πάνελ Β). Η έκθεση των DU-145 κύτταρα για να DZ-50 (3 και 9 ώρες) οδήγησε σε σημαντική αναστολή της έκφρασης για μια επιλεγμένη υπογραφή γονίδιο που ταυτοποιείται η ανάλυση της σειράς (σχήμα 2, πλαίσιο Α), συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων που κωδικοποιούν για τα βασικά εστιακά τελεστές προσκόλληση σηματοδότησης , ενδοκυτταρικά (Talin) και εξωκυτταρικά (ινωδονεκτίνης) και σφιχτό πρωτεΐνες διασταύρωση (κλαουδίνης-11 και ΖΟ-1). Μια μεταγραφική μεσολαβητής της EMT,

σαλιγκάρι,

μειώνεται επίσης από DZ-50. Η χημική δομή της κιναζολίνης ένωση με βάση DZ-50, δείχνεται στον πίνακα C (Εικ. 2).

Πίνακας Α, χάρτη θερμότητας διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε DU-145 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη πριν και μετά θεραπεία με DZ-50 (9 ώρες). Εντοπίσαμε 17 αξιοσημείωτα κατιούσα ρύθμιση γονιδίων μετά από θεραπεία με DZ-50 (9 ώρες), συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις ρυθμιστικές αρχές ECM

φιμπρονεκτίνης

και

ιντεγκρίνης α6

, σφιχτό μεσολαβητής διασταύρωση

κλαουδίνης-11

και την αγγειογένεση σηματοδότησης τελεστή

θρομβοσπονδίνης 1

. (Πάσο αλλαγή & gt? 1.5, ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη & lt? 20%). Το πάνελ Β, Επικύρωση της έκφρασης γονιδίου χρησιμοποιώντας qRT-PCR μετά DZ-50 θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κύτταρα (5 μΜ) για 3 και 9 ώρες. Μια σημαντική μείωση στο mRNA σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ανιχνεύθηκε για τα γονίδια που εμπλέκονται στην συνιστώσες πρόσφυση σηματοδότησης ECM-εστίασης

(φιμπρονεκτίνη

,

ιντεγκρίνης-α6

και

Ταλίν

), σφιχτό κόμβους (

κλαουδίνης-11

), την αγγειογένεση (

θρομβοσπονδίνης-1

) και EMT (

σαλιγκάρι

). * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά σε ρ & lt? 0,05. Πίνακας C, Μοριακή δομή του παραγώγου Doxazosin ©, DZ-50.

Η

DZ-50 Στόχοι Vital κυτταρικών αλληλεπιδράσεων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Για να χαρακτηρίζουν το φαινόμενο της DZ-50 για σφικτών συνδέσμων (TJ) ο ​​συν-εντοπισμό των ΖΟ-1 και κλαουδίνης-11, δύο πρωτεΐνες απαραίτητες για αυτές τις ενδοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις, αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού συνεστιακή σε δύο διαφορετικές ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές, PC-3 και DU-145 (Σχ . 3, πάνελ Α και Β αντίστοιχα). Η θεραπεία με DZ-50 (12 ώρες) μειώθηκε αισθητά κλαουδίνης-11 έκφραση (κόκκινο) σε αμφότερες τις γονικές κυτταρικές σειρές, έχοντας ως αποτέλεσμα αισθητή φθορά του σχηματισμού TJ. Υποκυτταρικός εντοπισμός της ΖΟ-1 (πράσινο) στην μεμβράνη του πλάσματος οδήγησε σε απόκριση προς DZ-50. Τα κύτταρα που εκφράζουν λειτουργική απώλεια των πρωτεϊνών εστιακής προσκόλλησης ΙίΚ (PC-3 shILK) και Talin (DU-145 shTalin) διατηρείται κάποια έκφραση κλαουδίνης-11 παρά τη θεραπεία με DZ-50 σε σχέση με τις αντίστοιχες γονικές κυτταρικές σειρές (λευκά βέλη). Αυτή η έκφραση του κλαουδίνης-11 σύμπλοκα με ΖΟ-1 στην πλασματική μεμβράνη όπως σαφώς καθορισμένο, σύμπλοκα στικτή TJ παρουσιάζεται στην Εικόνα 3 (σύνθετες εικόνες, πίνακες Α και Β). Σε απάντηση προς DZ-50, υπήρχε μια εξαρτώμενη από το χρόνο αυξητική ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΖΟ-1. ΖΟ-1 έκφραση αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση της εστιακής προσκόλλησης πρωτεΐνης ILK (Σχ. 3, πάνελ C και D). Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση ταλίνη σε DU-145 κύτταρα οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα ΖΟ-1 πρωτεΐνη, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω της ταλίνη συσχετίστηκε με αυξημένη ΖΟ-1 (Σχ. 3, πάνελ Ε, F).

Χαρακτηριστική συνεστιακή μικροσκοπία εικόνες από PC-3 κύτταρα (Πίνακας Α) και DU-145 κύτταρα (Πίνακας Β). Η θεραπεία με DZ-50 (12 ώρες, 5 μΜ) μειώνει κλαουδίνης-11 έκφραση και αναστέλλει τον σχηματισμό σφιχτό διασταύρωση. Tight σύμπλοκα κόμβους (βέλη), που χαρακτηρίζεται από συνεντόπισης των αυστηρών πρωτεΐνες διασταύρωση κλαουδίνης-11 (κόκκινο) και ΖΟ-1) (πράσινο) είναι εντελώς καταργείται από DZ-50. Σε PC-3 shILK και τα κύτταρα DU-145shTalin υπάρχει αδύναμο σχηματισμό συμπλόκων TJ (αιχμές βελών), σε απάντηση DZ-50. ΫΑΡΙ (μπλε) χρησιμοποιείται για την πυρηνική ανίχνευση (Πίνακες Α και Β). Μεγέθυνση x100. Πάνελ C-F, κηλίδες Western και αντίστοιχες πυκνομετρική ανάλυση αποκαλύπτει την έκφραση της TJ πρωτεΐνης ΖΟ-1 σε απόκριση προς DZ-50 σε PC-3 (Πίνακες Γ και Δ) και DU-145 (πάνελ Ε και F), κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη .

η

φθορισμού μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί το αποτέλεσμα DZ-50 επί εστιακό δυναμική προσκόλληση στις δύο διαφορετικές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC-3 (Εικ. 4) και DU-145 (Σχ. 5). Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 4 δείχνουν ότι σε απόκριση προς DZ-50 (12 ώρες), υπήρξε μια σημαντική μείωση στην ταλίνη (κόκκινο) και η έκφραση πρωτεΐνης ILK (πράσινο), θέτει σε κίνδυνο την ακεραιότητα εστιακής προσκόλλησης (σύνθετες εικόνες Σχ. 4, πλαίσιο Α ? DAPI-μπλε πυρηνική χρώση). Για να προσδιοριστεί η επίδραση του ECM στην κυτταρική απόκριση σε DZ-50, PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία της φιμπρονεκτίνης. Η παρουσία της φιμπρονεκτίνης διευκολύνεται εστιακής σταθεροποίηση πρόσφυση και παρατεταμένη έκφραση του ταλίνη και ILK, διάσωση κυττάρων καρκίνου του προστάτη από την επίδραση του anoikis DZ-50 (σύνθετες εικόνες Σχ. 4, πλαίσια Α και Β). Λειτουργική απώλεια ILK σε PC-3 κύτταρα (Σχ. 4, πλαίσιο Β) είχε σαν αποτέλεσμα FAC αστάθεια με ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω του ταλίνη σε σχέση με τη γονική PC-3 κύτταρα (Εικ. 4, πλαίσιο Α). Κατεργασία κυττάρων με shILK DZ-50 οδήγησε σε πλήρη κατάργηση του FAC σηματοδότηση, ένα φαινόμενο που ήταν εν μέρει διασώθηκε με την παρουσία της φιμπρονεκτίνης.

PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα και PC-3 κύτταρα που φιλοξενούν shILK απώλεια ΙίΚ (πίνακες Α και Β, αντίστοιχα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DZ-50 (12 ώρες, 5 μΜ) απουσία ή παρουσία ινονηκτίνης-ECM. Φθορισμού εικόνες αποκαλύπτουν την συν-εντοπισμό των εστιακών ρυθμιστές προσκόλλησης ταλίνη (κόκκινο) και ILK (πράσινο) για να διασπαστούν με DZ-50 θεραπεία, σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους. DAPI (μπλε) χρησιμοποιείται για την πυρηνική ανίχνευση. Αποσιώπηση έκφραση της ΙίΚ οδηγεί σε μειωμένη ανίχνευση του πρωτογενούς ανάντη εταίρου, ταλίνη του και την επακόλουθη διάσπαση των εστιακών συμφύσεων (Πίνακας Β), σε σχέση με τη γονική PC-3 κύτταρα (Πίνακας Α, σύνθετα, εστιακές συμφύσεις που προσδιορίζονται στο κίτρινο). Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα αναπτύσσονται σε ινονεκτίνη-επικαλυμμένο υπόστρωμα (ακεραιότητα ECM) να σταθεροποιεί την εστιακή προσκόλληση συγκρότημα και μειώνει την ικανότητα στόχευσης του DZ-50 σε αυτά τα υποστρώματα στις δύο γονικών και PC-shILK κύτταρα PC-3. Η μεγέθυνση Χ100

Η

DU-145 (πίνακας Α) και DU-145 shTalin (πίνακας Β) καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία φιμπρονεκτίνης-επικάλυψης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DZ-50.? κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ομοεστιακό μικροσκόπιο για την ανίχνευση του ταλίνη (κόκκινο), ΙίΚ (πράσινο), και εστιακές συμφύσεις (κίτρινο). Πυρήνες ανιχνεύθηκαν με χρώση ϋΑΡΙ (Μπλε). DZ-50 μειώθηκε σχηματισμό εστιακή πρόσφυση μέσω της στόχευσης των Ταλίν και οι όμοιοί. Αυτή επιδράσεις ακυρώθηκε από τη παρουσία της φιμπρονεκτίνης-ECM, που παρείχε αντίσταση στην DZ-50 (Πίνακας Α). Απώλεια Talin οδήγησε σε μειωμένη συν-εντοπισμό με ILK και εξαφάνιση των εστιακών συμφύσεων σε κύτταρα DU-145 shTalin (Πίνακας Β). Μεγέθυνση x100. Πάνελ C-Ε, κηλίδα Western και ποσοτική ανάλυση της χρονο-εξαρτώμενη επίδραση της DZ-50 επί κατάντη σηματοδότησης επιβίωση των κυττάρων. DZ-50 οδηγεί σε αποφωσφορυλίωση της επιβίωσης σηματοδότησης τελεστές ΑΚΤ (Πάνελ D) και GSK-3β (πίνακας Ε). Ταλίν υπερέκφραση προσδίδει αντίσταση στην DZ-50 anoikis επιπτώσεις από τη διατήρηση ενεργοποίηση /φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και σηματοδότησης GSK-3β.

Η

Στη συνέχεια εξέτασε τις συνέπειες της μείωσης Ταλίν για τον καρκίνο του προστάτη κυττάρων εστιακό ακεραιότητα πρόσφυση και την ευαισθησία τους να DZ-50. Ομοεστιακή εικόνες μικροσκοπία φαίνεται στο Σχήμα 5, αποκαλύπτουν ότι η παρουσία φιμπρονεκτίνης ανταγωνίστηκε την επίδραση anoikis του φαρμάκου επί εστιακές συμφύσεις σε DU-145 κύτταρα (Σχ. 5, πλαίσιο Α) υπό λειτουργικά επίπεδα Talin. Αποσιώπηση του Talin σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, ωστόσο ως αποτέλεσμα το σχηματισμό εστιακό προσκόλληση συγκρότημα να καταργηθεί ακόμη και παρουσία της φιμπρονεκτίνης (Εικ. 5, πλαίσιο Β). Δεν υπήρξαν τόσο σημαντικές διαφορές σε εστιακές συμφύσεις στα κύτταρα DU-145shTalin.

DZ-50 εξασθενεί μεταγενέστεροι ενδοκυτταρική επιβίωση Σηματοδοσίας

Για να διερευνήσει τις συνέπειες της DZ-50 για την ενδοκυτταρική σηματοδότηση κατάντη της το εστιακό συγκρότημα πρόσφυση και σφιχτό κόμβους, ΑΚΤ και ΟδΚ3β ήταν προφίλ ως ενδιάμεσο επιβίωσης σηματοδότησης δραστών [11], [21]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6 στόχευση αυτών των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων με DZ-50 οδηγεί σε σημαντική μείωση της φωσφορυλίωσης τόσο του ΑΚΤ και ΟδΚ3β εντός 3-6 ωρών της θεραπείας (Πίνακες Β και C). Η υπερέκφραση του Talin σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη που προκαλείται φωσφορυλίωση της Akt και GSK-3β, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη επιβίωση και αντίσταση στη δράση της DZ-50. Σε αντίθεση, DU-145 κύτταρα με μειωμένα επίπεδα ταλίνη, εμφάνισαν μειωμένη Akt και ΟδΚ3β φωσφορυλίωση (Εικ. 6, Πίνακας C).

DZ-50 στόχους αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου (σφικτών συνδέσμων) και αλληλεπιδράσεις κυττάρου-ΕΟΜ (εστιακό συμφύσεις) για να μειώσετε ενδοκυτταρικά σήματα επιβίωσης και να διαταράξουν την ακεραιότητα του κυτταροσκελετού της ακτίνης να προκαλέσει anoikis. Σταθεροποίηση των εστιακών προσκόλλησης σύμπλεγμα σηματοδότησης με ECM συστατικά και αυξημένα ταλίνη, ενισχύει την αμφίδρομη σηματοδότηση ιντεγκρίνης, με αποτέλεσμα την κυτταρική αντίσταση στην anoikis (δεξιά). DZ-50 στόχους εξωκυττάριο, μεσοκυττάρια και ενδοκυτταρικά συμφύσεις και μόρια σηματοδότησης για να προκαλέσει anoikis (αριστερά).

Η

Συζήτηση

Γονιδίωμα-ευρύ ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε DU-145 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα αποκάλυψε ρύθμιση προς τα κάτω των πολλά υποσχόμενων στόχων κατά των όγκων με τη νέα παράγωγο κιναζολίνης DZ-50, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων ΕΜΤ-συνδέονται (ιντεγκρίνη α6, φιμπρονεκτίνη και ταλίνη), που συνδέονται αγγειογένεση γονίδια (TSP-1), γονίδια που σχετίζονται με μεσοκυττάριο TJs (claudin- 11 και 14), καθώς και η θρεονίνη σερίνη κινάση 31 (TSK31) και ινσουλίνη δέσμευσης παράγοντα ανάπτυξης πρωτεΐνη 3 (IGFBP-3). Ομοεστιακή εξέταση μικροσκοπία επιβεβαίωσε ότι DZ-50 στόχους κρίσιμο πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον σχηματισμό των δύο TJs και εστιακές συμφύσεις, συνεπώς αλλοιώνοντας αλληλεπιδράσεων εξωκυτταρικής, ακτίνης του κυτταροσκελετού ακεραιότητα και προ-επιβίωσης ενδοκυτταρικής σηματοδότησης. Έχουμε ήδη συσταθεί το

in vivo

αντικαρκινική δράση της DZ-50 σε δύο ανθρώπινες ανδρογόνα-ανεξάρτητους ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη, PC-3 και DU-145 [7]. Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι ταλίνη προσδίδει αντίσταση anoikis σε καρκινικά κύτταρα προστάτη προς μεταστάσεις, μέσω της ικανότητάς του να σταθεροποιήσει εστιακές συμφύσεις και διαδίδονται εστιακής προσκόλλησης σύμπλεγμα σηματοδότησης μέσω της Akt σηματοδότηση επιβίωσης [10]. Στην παρούσα μελέτη, με τη χρήση δύο διαφορετικών ανεξάρτητος από ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές καρκίνου ανθρώπινου προστάτη και DU-145 και PC-3, όπως

in vitro

πειραματικά συστήματα, αποδείξαμε ότι δύο διακριτές ενδοκυτταρική εστιακής προσκόλλησης σύνθετα συστατικά, ταλίνη και ILK, απευθύνονται από το μόλυβδο κιναζολίνης DZ-50 (Εικ. 6). Talin υπερέκφραση προσδίδει αναισθησία σε DZ-50, ενώ η απώλεια του ταλίνη μειωμένη επιβίωση καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και προσκόλληση, η ευαισθητοποίηση καρκινικών κυττάρων του προστάτη στο φαινόμενο anoikis από DZ-50. Οι φαινοτυπικές αλλαγές και αυξημένη ευαισθησία σε DZ-50 παρατηρείται σε DU-145 κύτταρα με χαμηλή έκφραση ταλίνη, και PC-3 κύτταρα που φιλοξενούν απώλεια της λειτουργίας ΙίΚ, υποστηρίζουν ένα ρυθμιστικό ρόλο για αυτά τα δύο κρίσιμα συστατικά του συμπλόκου εστιακής προσκόλλησης σε καρκινικές κυτταρικές anoikis αντίσταση. Το Σχήμα 6 απεικονίζει μια μηχανιστική σχήμα του DZ-50 σηματοδότηση μέσω anoikis. Οι σφικτές συνδέσεις βρίσκονται στην μεμβράνη του πλάσματος apicobasal, σχηματίζοντας μια επιλεκτικά διαπερατή ουσιαστικό εμπόδιο για ισοζυγίου υγρών και ηλεκτρολυτών. Claudins είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες προσκόλλησης που εκτείνονται σε μεσοκυττάριο χώρο για να σχηματίσουν ομο- ή ετεροδιμερή σε αντίθετες κύτταρα [22]. Κυτοπλασμικές ουρές των claudins αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες ακτίνης σταθεροποίησης, zonula occludins (ΖΟ) [23]. Κλαουδίνης-1 προς τα πάνω ρύθμιση συνδέεται με ορθοκολικό εξέλιξη του όγκου μέσω της αντίστασης anoikis, στοιχεία που συνδέουν anoikis να σφιχτών συνδέσεων επηρεάζονται από Bcl-2 και την επιβίωση AKT σηματοδότησης [24].

Στόχευση των κρίσιμων ενδο- και εξωκυττάριου εστιακό συστατικά πρόσφυση σε