Αφηρημένο

Η ανάπτυξη αντίστασης στη χημειοθεραπεία είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με . Η διαλεύκανση των μηχανισμών ανθεκτικότητας στα φάρμακα αναμένεται να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (FGF) -2 σηματοδότηση προκαλεί την συναρμολόγηση ενός συγκροτήματος πολλών πρωτεΐνη η οποία παρέχει τα καρκινικά κύτταρα με τη μοριακή μηχανήματα που απαιτούνται για αντοχή φαρμάκου. Αυτό το συγκρότημα, το οποίο περιλαμβάνει την κινάση πρωτεΐνης C (PKC) ε, ν-raf σαρκώματος ποντικού ιικής ογκογονιδίου ομόλογο Β1 (Β-RAF) και ρ70 S6 κινάση β (S6K2), ενισχύει την επιλεκτική μετάφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως Β-κυττάρου λευχαιμία /λέμφωμα-2 (BCL-2) και αναστολείς της πρωτεϊνικής απόπτωσης (ΙΑΡ) τα μέλη της οικογένειας και αυτά είναι σε θέση να προστατεύσουν πολλαπλούς τύπους καρκινικών κυττάρων από προκαλούμενη από χημειοθεραπεία κυτταρικό θάνατο. Οι κινάσες Janus (JAKs) είναι πιο γνωστή για κρίσιμους ρόλους τους στη μεσολάβηση σηματοδότηση κυτοκινών και ανοσολογικές αποκρίσεις. Εδώ, δείχνουμε ότι JAKs έχουν μυθιστόρημα λειτουργίες που υποστηρίζουν την εξέτασή τους σε νέους στόχους σε θεραπείες που αποσκοπούν στη μείωση της αντίστασης στα φάρμακα. Ως παράδειγμα, δείχνουμε ότι ο Janus κινάση ΤΥΚ2 είναι φωσφορυλιωμένη κατάντη του FGF-2 σηματοδότηση και απαιτείται για την πλήρη φωσφορυλίωση κινάσης εξωκυτταρικού σήματος ρυθμιζόμενη (ERK) 1/2. Επιπλέον, ΤΥΚ2 είναι απαραίτητη για την επαγωγή του κλειδιού αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως BCL-2 και αλληλουχία λευχαιμίας μυελοειδούς κυττάρου (MCL) 1, και για την προαγωγή της κυτταρικής επιβίωσης μετά από FGF-2. Σίγαση JAK1, JAK2 ή ΤΥΚ2 χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA (RNAi) αναστέλλει FGF2 μεσολάβηση πολλαπλασιασμού και έχει ως αποτέλεσμα την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία προκαλούμενη θανάτωση. Οι επιδράσεις αυτές είναι ανεξάρτητες από την ενεργοποίηση του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT) 1, STAT3 και STAT5A /Β, των κανονικών τους στόχους της JAK σηματοδότησης. Αντ ‘αυτού, ΤΥΚ2 συνεργάτες με τις άλλες κινάσες εμπλέκονται προηγουμένως σε αντίσταση στο φάρμακο FGF-2-διαμεσολαβούμενη. Υπό το φως των ευρημάτων αυτών υποθέτουμε ότι ΤΥΚ2 και άλλα JAKs είναι σημαντικοί ρυθμιστές του FGF-2 με γνώμονα την επιβίωση των κυττάρων και ότι οι αναστολείς αυτών των κινασών θα βελτιώσει πιθανότατα την αποτελεσματικότητα των άλλων θεραπειών του καρκίνου

Παράθεση:. Carmo CR, Λυών-Lewis J, Seckl MJ, Κόστα-Pereira AP (2011) A Novel Απαίτηση για Janus κινασών ως μεσολαβητές των ναρκωτικών Αντίστασης Induced από παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών-2 σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 6 (5): e19861. doi: 10.1371 /journal.pone.0019861

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Φλεβάρη, 2011? Αποδεκτές: 5 του Απρίλη 2011? Δημοσιεύθηκε: May 20, 2011

Copyright: © 2011 Carmo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Θεραπεία του καρκίνου και Research Trust που χρηματοδοτούνται από αυτό το έργο. MJS και JLL υποστηρίζονται επίσης από ένα Υπουργείο Υγείας χρηματοδοτείται Πειραματικό Cancer Medicine Centre Grant, και APC-P και MJS από Cancer Research UK. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα από νεοπλασματικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την κακή συνολική επιβίωση παρατηρήθηκε με τους περισσότερους τύπους καρκίνου [1]. Μεταξύ της πληθώρας των μηχανισμών αντοχής φαρμάκου έγκειται αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF) -2 σηματοδότηση. FGF-2 μπορεί να παρέχει τα κύτταρα με σήματα προ-επιβίωσης και μιτογόνο, και προσδίδουν αντίσταση ευρέως φάσματος σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [2], [3], [4]. De-ρυθμιζόμενη σηματοδότηση FGF-2 έχει συσχετιστεί με μια ποικιλία κακοηθειών και αυξημένα επίπεδα αυτού του μορίου στον ορό του ασθενούς καθιερώθηκαν ως ανεξάρτητος φτωχός προγνωστικός παράγοντας για λέμφωμα, καρκίνο του πνεύμονα και οι ασθενείς σάρκωμα [5], [6], [7 ]. Ειδικότερα, ο FGF-2 δείχθηκε να προωθήσει αντοχή φαρμάκου των κυττάρων μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) μέσω του σχηματισμού ενός συμπλόκου πολλαπλών πρωτεΐνη η οποία περιλαμβάνει την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) ε, ν-raf σαρκώματος ποντικού ιικής ογκογονιδίου ομόλογο Β1 (Β -RAF) και p70 S6 κινάσης β (S6K2). Αυτό εξαρτάται από δραστικότητα εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) 1/2 [3], [8], [9]. Ο σχηματισμός αυτού του συμπλόκου οδήγησε έως τη μεταγραφική άνω ρύθμιση των βασικών αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, οι οποίες στη συνέχεια παρέχει αντίσταση στην απόπτωση και αφέθηκε στα κύτταρα να επιβιώνουν όταν προκλήθηκαν με κυτταροτοξικά φάρμακα.

Πιο κυτοκίνες και πολλοί αυξητικοί παράγοντες σηματοδοτούν

μέσω

Janus κινάσες (JAKs) και μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής (stats) [10], [11]. Συστατική STAT φωσφορυλίωση είναι χαρακτηριστική μιας ευρείας ποικιλίας ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και πρωτογενείς όγκους [12]. Υπερενεργοποίηση των JAKs έχει επίσης ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση [13]. Το γεγονός ότι οι JAKs και τα στατιστικά που ενεργοποιούνται από πολλαπλές μιτογόνα έχει ενθαρρύνει τους ερευνητές να αναπτύξουν στρατηγικές για να τους στοχεύσουν σε θεραπείες για τον καρκίνο. Υπάρχει περιορισμένη, κάπως ασαφής, αποδείξεις για JAK /STAT σηματοδότησης κατάντη του FGF-2 και η σημασία της δεν είναι σαφής [14], [15], [16]. Εμείς και άλλοι [17] έχουν παρατηρήσει απορυθμισμένη έκφραση ϋΑΚ /δΤΑΤ σε μια ποικιλία από γραμμές καρκινώματος πνεύμονα και σάρκωμα. Αυτό και το γεγονός ότι οι ασθενείς με αυξημένα FGF-2 στον ορό έχουν χειρότερη έκβαση στην κλινική μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι JAKs ή /και τα στατιστικά έπαιξε ρόλο στην FGF-2 σηματοδότηση διαμεσολαβούμενη οδού (ες) αντοχή φαρμάκου. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η Janus κινάσες JAK1, JAK2 και ΤΥΚ2, αλλά όχι κύριος καθοδικούς τελεστές STAT1 τους, STAT3 ή STAT5A /Β, απαιτούνται για FGF-2-διαμεσολαβούμενη Χημειοπροστασία σε κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS. Αυτό, με τη σειρά του, ανοίγει νέες θεραπευτικές οδούς για καρκίνους που είναι ακόμα δύσκολο να ελεγχθούν.

Αποτελέσματα

FGF-2 προστατεύει τα κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS από σισπλατίνη μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει ΡΚΟε , συμπλέγματα πρωτεϊνών B-RAF και S6K2

από FGF-2 φαίνεται να προστατεύει SCLC κυττάρων από κυτταροτοξικά κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από φάρμακα [4], που αρχικά προσπάθησε να επεκτείνει αυτή την παρατήρηση στις ξεχωριστές U2OS οστεοσαρκώματος καρκίνο κυτταρικό τύπο κύτταρα. Αυτοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με την κλινικά σχετική σισπλατίνη φαρμάκου παρουσία και απουσία του FGF-2 (Εικ. 1). Η συγκέντρωση του αυξητικού παράγοντα που χρησιμοποιείται προσδιορίσθηκε με τη χρήση /2 φωσφορυλίωση ERK1 σαν ανάγνωση (Εικ. S1). Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων WST-1, η οποία απέδωσε ταυτόσημα αποτελέσματα με αυτά που λήφθηκαν με απαρίθμηση κυττάρου με trypan blue (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ολονύκτια επεξεργασία με 60 μΜ cisplatin σκότωσε το 50% των κυττάρων, αλλά προ-επώαση με FGF-2 για 4 ώρες εμπόδισε αυτό, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο FGF-2 προστατεύεται U2OS κύτταρα έναντι σισπλατίνη (Εικ. 1Α). Ο προσδιορισμός WST-1 δεν κάνει διακρίσεις μεταξύ απόπτωσης και νέκρωσης. Επιπλέον, η διάσωση από σισπλατίνη θα μπορούσε να αποδοθεί σε πολλαπλασιασμό, η οποία επίσης επάγεται από FGF-2, και όχι καθαρά στην αναστολή του κυτταρικού θανάτου. Ως εκ τούτου, παρακολουθούνται παράλληλα την επαγωγή απόπτωσης με χρήση διάσπασης των υποστρωμάτων της κασπάσης όπως πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και λαμίνη Β ως αναγνώσεις (Σχ. 1 Β και δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της απώλειας του περιεχομένου DNA, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια άλλη ανάγνωση για την απόπτωση (Σχ. 1 C). Ολονύκτια επεξεργασία με σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα U2OS, η οποία εκδηλώνεται με την εμφάνιση ενός kDa PARP θραύσμα 85 διάσπασης (Εικ. 1Β) και μία αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 κυττάρων (Εικ. 1 C). Αυτά τα γεγονότα αποτράπηκαν με προ-κατεργασία των κυττάρων με FGF-2, η οποία μείωσε επίσης βασικοκυτταρικό κυτταρικού θανάτου ανιχνεύθηκε σε ακατέργαστα δείγματα. Οι γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές που λαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Όπως παρατηρήθηκε για SCLC κυττάρων [8], η μείωση του κυτταρικού θανάτου με FGF-2 θα μπορούσε να προληφθεί με αναστολή του μιτογόνο-ενεργοποιημένη κινάση πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΕΚ) /ERK δραστηριότητα με έναν εκλεκτικό αναστολέα (Εικ. S2), ενώ η αναστολή της φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) και στόχος της ραπαμυκίνης σύμπλοκο (TORC) 1 σηματοδότηση δεν είχε καμία επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι FGF-2 που ασκείται μια αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα σε κύτταρα U2OS που διαμεσολαβείται από ERK1 /2 και εμπόδισε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του cisplatin. Είναι σημαντικό ότι, με την απόσυρση του φαρμάκου, ο FGF-2-διασωθεί κύτταρα παρέμειναν βιώσιμα σε καλλιέργεια για αρκετές εβδομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η περαιτέρω υποστηρίζει την ιδέα ότι ο FGF-2 μπορεί να προωθήσει αποτελεσματικά την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε κυτταροτοξικά φάρμακα.

Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσα άνευ ορού επί μία νύκτα. Μετά από 4 ώρες προ-θεραπεία με FGF-2 (10 ng /ml), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (60 μΜ) επί μία νύκτα. A. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό WST-1. Οι τιμές αντιστοιχούν σε άλας τετραζολίου WST-1 διασπάται σε έγχρωμο φορμαζάνη ενώσεις με μιτοχονδριακές αφυδρογονάσες. Η μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν παρουσιάζονται ως φορές επαγωγής σε σχέση με μη κατεργασμένους ελέγχους. B. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε μία 7,5% γέλη SDS-PAGE και κηλίδωση Western ανάλυση να πραγματοποιηθεί στο σύνολο κυτταρολύματα (ζωντανά και νεκρά κύτταρα) χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι PARP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μια αντιπροσωπευτική Western Blot και μέση ± SEM του πυκνομετρικές τιμές (διασπασμένη PARP) από τρία ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται. C. Τα κύτταρα διαπερατά και το DNA χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). προφίλ κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής και τα δεδομένα που εξορύσσεται με τη χρήση FlowJo. Η μέση ± SEM του υπο-G1 γεγονότα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως πολλαπλή μεταβολή των πληθυσμών sub-G1 πάνω από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα.

Η

SCLC κυττάρων, μονοπάτια αντοχή φαρμάκου FGF-2 με τη μεσολάβηση εμπλέκει ο σχηματισμός ενός συμπλόκου πρωτεΐνης που περιλαμβάνει ΡΚΟε, Β-RAF και S6K2 [4]. Είμαστε δίπλα ρώτησε αν FGF-2 θα μπορούσε να προκαλέσει παρόμοιες αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών στα κύτταρα U2OS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία του FGF-2 για τους χρόνους που υποδεικνύονται λύθηκαν και ανοσοκατακρημνίσθηκαν S6K2 πριν από την κηλίδωση Western για ΡΚΟε, Β-RAF ή S6K2 (Εικ. 2Α). B-RAF και ΡΚΟε συνδέονται με S6K2 σε κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας, ένα αποτέλεσμα που αυξήθηκε σημαντικά με θεραπεία FGF-2 για 10 λεπτά (Σχ. 2Α). Οι αλληλεπιδράσεις ήταν παροδικές και δεν είναι πλέον σημαντική από 30 λεπτά επεξεργασίας μετα-FGF-2. Για να τεκμηριώσει την ιδέα ότι οι τρεις πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν, έχουμε την επόμενη ανοσοκαταβυθίστηκαν είτε ΡΚΟε (Εικ. 2Β) ή Β-RAF (Σχ. 2C) από λύματα κυττάρων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε κηλίδωση Western για την ανίχνευση αυτών των πρωτεϊνών και S6K2. Ενώ B-RAF και ΡΚΟε βασική αλληλεπίδραση αυξηθεί 10 λεπτά μετά την FGF-2 διέγερση και ακολούθως συνεχίστηκε, ήμασταν σε θέση να εντοπίσει S6K2 σε αυτές ανοσοϊζήματα (Σχ. 2Β, 2C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με S6K2 ΡΚΟε και Β-RAF σε κύτταρα U2OS, διακύμανση στοιχειομετρία των ενώσεων ή το σχηματισμό πολλαπλών, διακριτές, σύμπλοκα πρωτεΐνης. Συνολικά, τα στοιχεία δείχνουν ότι ο FGF-2 προάγει μοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ ΡΚΟε, B-RAF και S6K2. Παράλληλα με όλα ανοσοκατακρημνίσεις, τα επίπεδα των τριών πρωτεϊνών αναλύθηκαν επίσης σε κυτταρικά εκχυλίσματα σύνολο (Εικ. S3). Είναι ενδιαφέρον, ένα μικρό (1,5 έως 1,7 φορές), αλλά άκρως αναπαραγώγιμη και στατιστικά σημαντική αύξηση του S6K2 ανιχνεύθηκε 10 λεπτά μετά την προσθήκη του FGF-2, ενώ τα επίπεδα της ΡΚΟε, Β-RAF, ERK1 /2 και β-ακτίνης (το τελευταίο δύο χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες φόρτωσης) δεν επηρεάστηκαν (Εικ. S3 και S5). Το αν η αύξηση του σήματος S6K2 είναι καθαρά λόγω της αύξησης στη φωσφορυλίωση ή σταθεροποίηση της πρωτεΐνης παραμένει να προσδιοριστεί. Η φωσφορυλίωση του ERK1 /2 επίσης παρακολουθήθηκε για την εξασφάλιση της λειτουργικότητας του FGF-2 (Σχ. S3). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι τα κύτταρα U2OS συμπεριφέρθηκαν όπως SCLC απαντώντας σε FGF-2 προ-επιβίωσης σηματοδότησης πρέπει επίσης να καθοριστεί εάν θα μπορούσε να ανιχνευθεί μια αύξηση στην αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών [8]. Όπως είχε προβλεφθεί, ο FGF-2 αυξήθηκε λευχαιμία Β-κυττάρων /λεμφώματος-2 (BCL-2), BCL-2-σαν 1 πρωτεΐνη (BCL-x

L) και Χ-συνδεδεμένη αναστολέας των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης απόπτωση (ΧΙΑΡ) αλλά, επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης επαγωγή του ένα άλλο σημαντικό αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, δηλαδή αλληλουχία μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων (MCL) 1, σε κύτταρα U2OS (Σχ. 2D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα κύτταρα ελεύθερο ορού πεινασμένο όπως και πριν και μετά από διέγερση με FGF-2 (10 ng /ml), πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό λύσης συν-ανοσοκαταβύθιση. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με (Α) S6K2, (Β) ή ΡΚΟε (C.) B-RAF αντισώματα και πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western όπως υποδεικνύεται. Η ανάλυση στυπώματος Western Δ διεξήχθη χρησιμοποιώντας σύνολο κυτταρολύματα και αντισώματα έναντι MCL1 και BCL-2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western και μέση ± SEM από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχνεται στις γραφικές παραστάσεις. «-. Min

Η

Ελάττωση της JAK1, JAK2 ή ΤΥΚ2, αλλά όχι STAT1, STAT3 ή STAT5, αναστέλλει FGF-2 με τη μεσολάβηση της αντίστασης στα φάρμακα στα κύτταρα U2OS

Πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στην έρευνα έχουν απο-ρυθμίζονται JAK σηματοδότησης /STAT. Αυτό αντανακλά το

in vivo

κατάσταση όπως η ίδια παρατηρείται σε δείγματα ανθρώπινου όγκου. Παρά τους παραδοσιακούς ρόλους σε ανοσολογικές αποκρίσεις JAKs και στατιστικά είναι ολοένα και περισσότερο αναγνωρίζονται ως σημαντικά μόρια στη βιολογία του καρκίνου. προηγούμενες δεδομένα μας έδειξαν ότι ο FGF-2 που προκαλείται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ Β-RAF, ΡΚΟε και S6K2, αύξησε την έκφραση των βασικών αντι-αποπτωτική μορίων και προστατεύονται U2OS κυττάρων από σισπλατίνη απόπτωση. Είμαστε δίπλα ρώτησε αν εκφράζεται παντού τα μέλη της οικογένειας JAK ή /και τα στατιστικά του υποστρώματος τους ήταν μέρος αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, παρεμβολής RNA (RNAi) προκλήθηκε με τη χρήση σύντομης παρεμβολής (SI) ολιγονουκλεοτίδια έναντι JAK1, JAK2, ΤΥΚ2, STAT1, STAT3 και STAT5A /B. Σε όλη αυτή τη μελέτη έχουμε χρησιμοποιήσει πισίνες siRNA καθένα περιλαμβάνει τέσσερις siRNA ολιγονουκλεοτίδια που κατευθύνονται έναντι διαφορετικών περιοχών των ίδιων μορίων στόχων. Όλες οι πισίνες siRNA επικυρώθηκαν από αποσυνέλιξη και κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα εγείρονται έναντι του γνωστού στόχου καθώς και στενά συγγενή μόρια, όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο εργαστήριο μας [18]. Σίγαση αποτελεσματικότητας και της ειδικότητας των συγκεντρωμένων siRNAs φαίνονται στο Σχήμα S4. κύτταρα U2OS επιμολυσμένα με siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς FGF-2 για 4 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε σισπλατίνη (Σχ. 3 και 4). Περίπου το 50% των κυττάρων U2OS που είχαν σιγήσει JAK1 (siJAK), JAK2 (siJAK2) ή ΤΥΚ2 (siTYK2) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη υπέστησαν απόπτωση και αυτό δεν θα μπορούσε να προληφθεί με προ-κατεργασία των κυττάρων αυτών με FGF-2 (Εικ. 3). Η απόπτωση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία WST-1 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ή με τη χρήση αποκοπής PARP (Εικ. 3Α) και το DNA του κατακερματισμού (Σχ. 3Β) σαν αναγνώσεις. Σε πλήρη αντίθεση, η αύξηση του πληθυσμού διάσπαση PARP και υπο-G1 κυττάρων που προκαλείται από τη σισπλατίνη εμποδίστηκε από FGF-2 σε κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με ένα μη ειδικό siRNA (NS), και μη επιμολυσμένα κύτταρα. Έτσι, κάθε μία από τις αναλύθηκαν JAKs απαιτήθηκε για την αποτελεσματική FGF-2-διαμεσολαβούμενη Χημειοπροστασία από σισπλατίνη απόπτωση.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 75 ηΜ siRNA έναντι JAK1, JAK2 ή ΤΥΚ2. Τα μη επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικό siRNA (NS) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν σε μέσα ελεύθερα ορού όλη τη νύκτα. Μετά από 4 ώρες προ-θεραπεία με FGF-2 (10 ng /ml), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (60 μΜ) επί μία νύκτα. A. Μέση ± SEM από πυκνομετρικές τιμές (διασπασμένη PARP) από τρία πειράματα δείχνονται. B. προφίλ κυτταρικού κύκλου των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων έχουν παρασταθεί γραφικά ως μέση τιμή ± SEM των πληθυσμών sub-G1. Τα κορυφαία πάνελ παραδείγματα τα δεδομένα και να αντιστοιχούν με κύτταρα ελέγχου.

Η

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 75 ηΜ siRNA κατά STAT1, STAT3 ή STAT5A /B. Τα μη επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικό siRNA (NS) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι (πρβλ. Σχήμα 3). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Σχήμα 3. Α Μέση ± SEM από πυκνομετρικές τιμές (διασπασμένη PARP) από τρία πειράματα δείχνονται. Β προφίλ κυτταρικού κύκλου των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων έχουν παρασταθεί γραφικά ως μέση τιμή ± SEM των πληθυσμών sub-G1.

Η

επόμενο εξέτασε κατά πόσον JAKs μπορεί να δράσει μέσω κανονικών κατάντη στόχους τους STAT1, STAT3 ή STAT5. Ωστόσο, φίμωση κάθε ένα από αυτά τα μόρια είχαν μεμονωμένα καμία επίδραση στην FGF-2 που προκαλείται από την αντίσταση του φαρμάκου. Πράγματι, η διάσπαση PARP (Σχ. 4Α) και υπο-G1 γεγονότα (Εικ. 4Β) ενεργοποιείται από σισπλατίνη παρέμεινε σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα προκατεργάστηκαν με FGF-2, ανεξάρτητα από τα επίπεδα του STAT1, STAT3 ή STAT5A /B.

FGF-2 προκαλεί ΤΥΚ2 αλλά δεν STAT φωσφορυλίωση

STAT1, STAT3 και STAT5A /Β είναι φυσικά υποστρώματα των JAKs, αλλά προηγούνται τα στοιχεία μας δείχνουν ότι δεν μπορεί να απαιτείται για FGF-2 που προκαλείται από προ-επιβίωσης σηματοδότηση. Αν αυτό ήταν αλήθεια, τότε θα περίμενε κανείς FGF-2 για να είναι σε θέση να ενεργοποιήσει STATs, μια διαδικασία που περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση τυροσίνης σε συγκεκριμένα κατάλοιπα για τα οποία υπάρχουν αντισώματα phosphospecific [19]. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερευνηθεί αν δΤΑΤδ τροποποιήθηκαν κατάντη του FGF-2 από την ανάλυση φωσφορυλίωσης τυροσίνης του STAT1 (Tyr

701), STAT3 (Tyr

705) και STAT5A /Β (Tyr

694), με western αποτύπωση . Σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματά μας (Εικ. 4), FGF-2 απέτυχε να προκαλέσει ενεργοποίηση των STAT1, STAT3 ή STAT5 στα κύτταρα U2OS (Εικ. 5Α). Παρ ‘όλα αυτά, όπως αναμενόταν, αυτές οι πρωτεΐνες θα μπορούσαν να φωσφορυλιωθεί από ιντερφερόνη (IFN) -. Γ, ιντερλευκίνη (IL) -6, ή ογκοστατίνη Μ (OSM), τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι (Εικ. 5Α)

ΈΝΑ. FGF-2 δεν διεγείρουν STAT1, STAT3, ή φωσφορυλίωση STAT5. κύτταρα U2OS ήταν άνευ ορού επί μία νύκτα και έπειτα διεγέρθηκαν με FGF-2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Κύτταρα κατεργασμένα με ΙΡΝ-γ (500 IU /ml), IL-6 (200 ng /ml) /sIL-6R (250 ng /ml) και OSM (50 ng /ml) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι για την ενεργοποίηση του STAT1, STAT3 και STAT5, αντίστοιχα. Πρωτεΐνες αναλύθηκαν ως πριν από τη χρήση αντισωμάτων έναντι φωσφορυλιωμένων STAT1 (Tyr

701), φωσφορυλιωμένη STAT3 (Tyr

705), φωσφορυλιωμένη STAT5 (Tyr

694) και αντισώματα που αναγνωρίζουν τόσο φωσφορυλιωμένη και μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνες. Β FGF-2 που προκαλείται από την φωσφορυλίωση ΤΥΚ2 σε κύτταρα U2OS. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με FGF-2 (10 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. ΤΥΚ2 ανοσοκατακρημνίσθηκε και κηλίδωση Western ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένων τυροσίνες και συνολική ΤΥΚ2. ΤΥΚ2 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. κυτταρολύματα C. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκαταβύθιση ΤΥΚ2 και από κύτταρα επιμολυσμένα με siTYK2 διαχωρίστηκαν σε 7,5% γέλη SDS-PAGE και αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Μεμβράνες ανιχνεύθηκαν για ΤΥΚ2, pERK1 /2-Thr

202/185 /Tyr

204/187 και το σύνολο των ERK1 /2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. «-. Min

Η

Μια πιθανή εξήγηση αυτών των ευρημάτων περιλαμβάνει την πιθανότητα ότι ο FGF-2 αποτυγχάνει απλά να ενεργοποιήσετε τις JAKs, μια διαδικασία που περιλαμβάνει επίσης φωσφορυλίωση τυροσίνης. Για να προσδιορίσετε αν JAKs μπορεί να ενεργοποιηθεί από FGF-2, αποφασίσαμε να εστιάσουμε την προσοχή μας σε ΤΥΚ2, ένα από τα λιγότερο μελετημένα JAKs που εκφράζεται ευρέως σε πολλούς τύπους κυττάρων. κύτταρα U2OS υποβλήθηκαν σε θεραπεία με FGF-2 για διαφορετικές χρονικές περιόδους και ΤΥΚ2 ανοσοκατακρημνίστηκε. φωσφορυλίωση τυροσίνης ΤΥΚ2 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα ενάντια φωσφορυλιωμένων τυροσίνες (4G10 και ΡΥ20, 1:01 μίγμα) και η έκφραση πρωτεΐνης ΤΥΚ2 με ένα αντι-αντίσωμα ΤΥΚ2. FGF-2 προκάλεσε μια παροδική 2-πλάσια αύξηση της φωσφορυλίωσης τυροσίνης ΤΥΚ2, η οποία κορυφώθηκε σε 5 λεπτά και επέστρεψαν κοντά στα βασικά επίπεδα από 30 λεπτά (Σχ. 5Β). Αριθ φωσφο-ΤΥΚ2 ή ΤΥΚ2 παρατηρήθηκε σε δείγματα ελέγχου (ανοσοκαταβυθίσεις με σφαιρία μόνο, ή με ένα άσχετο αντίσωμα). Παράλληλα, τα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων που χρησιμοποιούνται για την ανοσοκατακρήμνιση και λύματα από siTYK2-επιμολυσμένα κύτταρα (έλεγχος αντισώματος) αναλύθηκαν (Σχ. 5C). Συνεπώς, τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΤΥΚ2 είναι φωσφορυλιωμένη, και ενδεχομένως ενεργοποιημένο, κατάντη του FGF-2. Τα αποτελέσματα αυτά, μαζί με εκείνα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3 είναι απολύτως σύμφωνη με ένα ρόλο για ΤΥΚ2 κατάντη του FGF-2 που δεν εξαρτάται από την ταυτόχρονη φωσφορυλίωση /ενεργοποίηση των STAT1, STAT3 και STAT5. Απομένει να καθοριστεί εάν JAK1 και JAK2 είναι επίσης φωσφορυλιωμένο κατάντη του FGF-2.

ΤΥΚ2 συνδέεται με ΡΚΟε και Β-RAF κατά την κατεργασία FGF-2 και είναι απαραίτητη για την πλήρη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και MCL1 επαγωγή

Τα προηγούμενα δεδομένα που μας ώθησε να καθορίσει εάν ΤΥΚ2 αλληλεπιδράσει με B-RAF, ΡΚΟε και S6K2. Δεν ήταν ασήμαντο για την ανίχνευση ΤΥΚ2 σε S6K2, Β-RAF και ΡΚΟε σύμπλοκο πρωτεΐνης (ES) πιθανώς λόγω των χαμηλών επιπέδων έκφρασης για αυτήν την πρωτεΐνη στα κύτταρα U2OS. Ως εκ τούτου, ΤΥΚ2 ανοσοκαταβυθίστηκε μετά από αγωγή με FGF-2 και τα προϊόντα ανοσοκαταβύθισης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα κατά της Β-RAF, ΡΚΟε και S6K2 αντ ‘αυτού. Κατά FGF-2 διέγερση ΤΥΚ2 σχετίζεται λίγο με B-RAF και ΡΚΟε (Σχ. 6Α). Η παροδική φύση αυτών των ενώσεων μπορεί επίσης να εξηγήσει γιατί ήταν επίσης δύσκολο να ανιχνευθεί S6K2 σε αυτά τα ανοσοσυμπλέγματα. Τα λύματα ελέγχου φαίνεται στο Σχήμα S5.

Α. FGF-2 που προκαλείται από την αλληλεπίδραση του ΤΥΚ2 με ΡΚΟε και Β-RAF σε κύτταρα U2OS. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως και οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό συνανοσοκαθίζησης. ΤΥΚ2 ανοσοκατακρημνίστηκε από λύματα ολόκληρων κυττάρων και ανοσοκαταβύθισης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδες Western. Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για ΡΚΟε, Β-RAF και ΤΥΚ2, το τελευταίο χρησιμοποιείται εδώ ως έλεγχος φόρτωσης. Β και C. ΤΥΚ2 φίμωση σε κύτταρα U2OS οδηγούν σε μειωμένη /2 φωσφορυλίωση ERK1 και ανέστειλαν την προς τα πάνω ρύθμιση του MCL1 σε απόκριση προς FGF-2. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siTYK2 όπως πριν. Τα μη επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη ειδικό siRNA (NS) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με FGF-2 για το (Β) 10 λεπτά και (Γ) 4 h. B. Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με τη χρήση αντισωμάτων έναντι p-ERK1 /2 (Thr

202/185 /Tyr

204/187) και το σύνολο των ERK1 /2. Τιμές αντιστοιχούν σε φωσφο-ERK1 και -ERK2 επίπεδα. Ανάλυση στυπώματος Western C. εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας συνολική κυτταρολύματα και αντι-MCL1 αντίσωμα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και για ομαλοποίηση. Η μέση ± SEM του πυκνομετρική τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται.

Η

FGF-2 με τη μεσολάβηση απαιτείται Χημειοπροστασία 2 δραστικότητα ERK1 /(Εικ. S2). Για να διαπιστωθεί αν αυτό εξαρτιόταν από ΤΥΚ2, κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με siTYK2, στη συνέχεια κατεργάζεται με FGF-2 και /2 φωσφορυλίωση ERK1 αξιολογείται με κηλίδα western (Σχ. 6Β). Σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα, RNAi έναντι ΤΥΚ2 μείωσε σημαντικά /2 φωσφορυλίωση ERK1 (κατά 40% για ERK1 και 25% για ERK2), ένα φαινόμενο που δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικό siRNA. Αυτό μας ώθησε να διερευνήσει το επόμενο αν η ρύθμιση προς τα άνω των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών με FGF-2 ήταν μειωμένη κατά ΤΥΚ2 αποσιώπηση. RNAi έγινε όπως πριν και, ως ένα παράδειγμα, η έκφραση του MCL1 παρακολουθείται με στύπωμα Western (Εικ. 6C). Τα μη επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με είτε ένα μη ειδικό siRNA ή siERK1 /2 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Σε μη επιμολυσμένα κύτταρα, ή κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη ειδικό έλεγχο, ο FGF-2 οδηγούν σε σημαντική αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης MCL1. Όπως είχε προβλεφθεί, siRNA έναντι ERK1 /2 ανέστειλε την προς τα πάνω ρύθμιση του MCL1 πρωτεΐνης. Σημαντικά, η έκφραση MCL1 δεν αυξάνει σε απόκριση προς FGF-2 σε κύτταρα με μειωμένα επίπεδα ΤΥΚ2, υποδηλώνοντας ότι αυτή η JAK απαιτείται για την ρύθμιση προς τα πάνω του MCL1.

Συζήτηση

Υπάρχουν πολλά μοριακά μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα μπορούν να γίνουν ανθεκτικά σε κυτταροτοξικά φάρμακα και έτσι διαφορετικών τύπων ανθεκτικότητας στα φάρμακα πρέπει να αντιμετωπιστούν για να υποτάξει τα καρκινικά κύτταρα. FGF-2 έχει αναγνωριστεί ως ένα δυσμενές προγνωστικό παράγοντα για πολλούς ασθενείς με καρκίνο [5], [6], [7] και Seckl και Pardo έδειξαν ενδιαφέρον της για την ανθεκτικότητα στα φάρμακα [3], [4], [8], [ ,,,0],9], [20].

Η έξοδος της JAK οδών σηματοδότησης /STAT επιπτώσεις πολύ πέρα ​​από τη σφαίρα της κυτοκίνης. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι JAK σηματοδότηση /STAT είναι εξαιρετικά μεταβλητής [18], [21], [22], [23], [24], ότι είναι σπονδυλωτή στη φύση και ότι περιλαμβάνει τόσο cross-talk και σταυρό -recruitment άλλων οδών [11], [25]. STATs δεν βρίσκονται συνήθως μεταλλαγμένη αλλά θεωρούνται συχνά ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα σε καρκινικά κύτταρα [12], [19]. Σε αντίθεση, JAKs συχνά μεταλλάσσεται και έτσι απορυθμισμένης, ιδιαίτερα σε αιματολογικές κακοήθειες [26], [27]. Για τις γνώσεις μας, JAKs έχουν ποτέ εμπλακεί άμεσα σε αντίσταση στο φάρμακο. Είναι, ωστόσο, αναγνωρίζεται ευρέως ότι πολλοί καρκίνοι συνοδεύονται από φλεγμονή, η οποία προκαλείται από κυτοκίνες και, κατά συνέπεια, JAK και STAT δραστηριότητα [28]. Απορυθμισμένη φλεγμονή, με τη σειρά του, έχει εμπλακεί σε πολλές πτυχές της ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της αντίστασης φαρμάκου [12]. Είναι ενδιαφέρον, JAKs μπορεί να έχει αντιφατικές κυτταρικών αποκρίσεων και, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, αυτό εξαρτάται από τη σκανδάλη και το κυτταρικό περιβάλλον [13], [29]. Πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις μπορεί να προκληθεί άμεσα από τα στατιστικά, ή με άλλα μόρια όπως ras ογκογονίδιο ιού ομόλογο (RAS), ERKs, v-src σάρκωμα ιικό ογκογονίδιο ομόλογο (SRC) και ΡΙ3Κ [επισκοπείται στο [30]]. Η ρύθμιση των αποκρίσεων κυτοκίνης από τα JAKs είναι STAT-εξαρτώμενο αλλά JAK-STAT εξαρτώμενη ανεξάρτητη κυτταρικές αποκρίσεις έχουν επίσης αναφερθεί. Πράγματι, JAK1 και JAK2 ρυθμίζουν την έκφραση των μελών οικογένειας Bcl-2, μόρια κρίσιμη για την κυτταρική ζωή και το θάνατο αποφάσεις, ανεξάρτητα από δραστηριότητα STAT [31], [32]. Μελέτες που χρησιμοποιούν ΤΥΚ2 ανεπάρκεια κυτταρικές γραμμές πρότεινε ότι ΤΥΚ2 ήταν κρίσιμη για την αποκρίσεων σε ΙΡΝ-α /β και ορισμένες κυτοκίνες. Σε αντίθεση, τα ποντίκια knockout, παρά το γεγονός ότι περισσότερο επιρρεπή σε μολύνσεις από ιούς, είχαν ανταποκρίσεις κυτοκίνης τους σε μεγάλο βαθμό ανέπαφο [33]. Μελέτες για έναν ασθενή με μια φυσικώς απαντώμενη ανεπάρκεια ΤΥΚ2, ωστόσο, πρότειναν ότι ΤΥΚ2 απαιτήθηκε για την πλήρη σηματοδότηση κυτοκίνης [επισκοπείται στο [13]]. Οι ακριβείς ρόλοι των ΤΥΚ2, ακόμη και εντός αποκρίσεις κυτοκίνης, παραμένουν έτσι να διευκρινιστεί πλήρως.

Εδώ, έχουμε δείξει ότι σε U2OS κύτταρα ΤΥΚ2 ταχέως φωσφορυλιωμένη κατάντη του FGF-2 (Σχ. 5Β), απαιτείται για την πλήρη ενεργοποίηση του ERK1 /2 (Σχ. 6Β) και για την επαγωγή της MCL1 (Εικ. 6C). Επιπλέον, ΤΥΚ2, JAK1 και JAK2 απαιτούνται για FGF-2-διαμεσολαβούμενη προστασία έναντι σισπλατίνη (Εικ. 1 και 3). Αυτό το αποτέλεσμα φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από τα στατιστικά, καθώς αποσιώπηση STAT1, STAT3 ή STAT5A /Β δεν μπλοκάρουν τις επιδράσεις που προκαλούνται από την επιβίωση FGF-2 (Εικ. 1 και 4). Κάθε STAT σίγησε ανεξάρτητα και είναι πιθανό ότι η ταυτόχρονη εξουδετέρωση των τριών STATs, ή ακόμη και από άλλα μέλη της οικογένειας STAT, ενδέχεται να επηρεάσουν την FGF-2 ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Το γεγονός ότι δεν φωσφορυλίωση των STAT μπορεί να ανιχνευθεί μετά την αγωγή FGF-2 δείχνει, ωστόσο, διαφορετικά (σχ. 5Α). Δεν είναι ακόμη γνωστό πώς ΤΥΚ2 φωσφορυλιώνεται κατάντη του FGF-2. ΤΥΚ2 μπορεί να προσληφθεί απευθείας προς τον υποδοχέα FGF, ή μπορεί να φωσφορυλιωθεί κατάντη περαιτέρω από μια άλλη κινάση όπως SRC [30]. Η έλλειψη φωσφορυλίωσης STAT κατάντη του FGF-2 και έλλειψη επιπτώσεων στις FGF-2 αντοχή φαρμάκου (Εικ. 4 και 5Α) υποδηλώνει επίσης ότι οι κυτοκίνες δεν ενέχονται σε μονοπάτια αντοχής φαρμάκου που προκαλούνται από αυτού του αυξητικού παράγοντα. Ο ρόλος των ΤΥΚ2 σε αντίστασης φαρμάκου FGF-2 με τη μεσολάβηση μπορεί να είναι ενζυμικές και /ή δομικές (Εικ. 5Β και 6Α). Πράγματι, ένα δομικό ρόλο για ΤΥΚ2 έχει αποδοθεί στην ΤΥΚ2 σε ΙΡΝ-α αποκρίσεις /β όπου η παρουσία της δεν απαιτείται μόνο για την σηματοδότηση, αλλά και για την κυτταρική επιφάνεια έκφραση της αλυσίδας IFNAR1 [34]. Περαιτέρω εργασίες είναι, ως εκ τούτου, πρέπει να εξεταστεί αν δραστηριότητα και /ή τη δομή ΤΥΚ2 κινάση χρειάζεται να μεσολαβήσουν στην FGF-2 που προκαλείται φαινότυπο προ-επιβίωσης και αντοχής φαρμάκου.

Όσον αφορά SCLC κυττάρων [4], θεραπεία κυττάρων U2OS με FGF-2 επάγει σχηματισμό συμπλοκών πρωτεΐνης που περιλαμβάνουν Β-RAF, ΡΚΟε και S6K2 (Σχ. 2Α-2C). Εννοιολογικά, ο FGF-2 μπορεί να οδηγήσει στον σχηματισμό τριών διαφορετικών διμερή (B-RAF /ΡΚΟε? Β-RAF /S6K2? S6K2 /ΡΚΟε) και /ή το σχηματισμό ενός τριμερούς (Β-RAF /ΡΚΟε /S6K2). Η ακριβής στοιχειομετρία των πρωτεϊνικών συμπλοκών που επάγεται από FGF-2 μένει να καθοριστεί. Η αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των τριών πρωτεϊνών συμβαίνει εντός 10 λεπτών από τη θεραπεία FGF-2 και είναι παροδικές, μειώνοντας σημαντικά από 30 λεπτά. Αν και ο ακριβής ρόλος του συγκροτήματος εξακολουθεί να κατέρρευσε, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η λειτουργία του μπορεί να είναι να παρέχει μια πλατφόρμα για τη σηματοδότηση, όπου αυτές οι κινάσες μπορούν να συγκεντρωθούν και να υποβληθούν σε συγκεκριμένα γεγονότα φωσφορυλίωσης που απαιτούνται για την περαιτέρω προς τα κάτω τις βιολογικές απαντήσεις που ενδεχομένως να οδηγήσει σε κυτταρική επιβίωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα S6K2 αυξάνουν γρήγορα μετά τη θεραπεία FGF-2 που δείχνει ότι, εκτός από την επαγωγή φωσφορυλίωσης S6K2, FGF-2 μπορεί επίσης να σταθεροποιήσει S6K2 (Εικ. S3 και S5). Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτό είναι ένα νέο εύρημα, που δικαιολογεί μια πιο λεπτομερή έρευνα. ΤΥΚ2 ανοσοκαταβύθιση εξής FGF-2 θεραπεία συν-ανοσοκαταβυθίσματα ΡΚΟε και Β-RAF, υποδηλώνοντας περαιτέρω έναν σημαντικό ρόλο για ΤΥΚ2 σε FGF-2-διαμεσολαβούμενη αντοχή φαρμάκου (Εικ. 6Α). Κατά συνέπεια, φίμωση είτε ΤΥΚ2, JAK1 ή JAK2 χρησιμοποιώντας RNAi μπλοκάρει FGF-2 αντοχή φαρμάκου έναντι σισπλατίνης (Εικ. 3). Θα είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για τον προσδιορισμό εάν ο σχηματισμός συμπλεγμάτων πρωτεΐνης περιλαμβάνουν ΡΚΟε, Β-RAF και S6K2 εξαρτάται από ΤΥΚ2 αφού φωσφορυλίωση ΤΥΚ2 είναι σχετικά γρήγορη και μπορεί να ανιχνευθεί από 5 λεπτά θεραπεία μετα-FGF-2. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει MCL1 ως ΤΥΚ2-ρυθμιζόμενη μόριο. Πράγματι, υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες, η αυξημένη έκφραση του MCL1 εξής FGF-2 εξηρτάτο από άθικτα ΤΥΚ2 (Εικ. 6C). Αυτό είναι πιθανό ένα σημαντικό εύρημα καθώς, όπως BCL-2, MCL1 δεν επάγει τον πολλαπλασιασμό, αλλά μάλλον προάγει τη βιωσιμότητα των κυττάρων του καρκίνου αναστέλλοντας την απόπτωση [35]. Επιπλέον, είναι ένα από τα γονίδια τονίζεται σε μια μελέτη από Meyerson και τους συνεργάτες του, που σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει γενωμική περιοχές μεταβάλλονται συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους [36].

Συλλογικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι ΤΥΚ2, JAK1 και JAK2 είναι νέα στόχους που μπορούν να αποδειχθούν χρήσιμες για την παράκαμψη της αντοχής στα φάρμακα που διαμεσολαβείται από FGF-2, ένα παράγοντα ανάπτυξης συχνά εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, ή υποστηρικτικούς ιστούς τους, και είναι αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο. Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι επί του παρόντος υπό έρευνα στο εργαστήριό μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

U2OS κύτταρα από την ATCC αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco ( DMEM) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (FirstLink), 2 mM L-γλουταμίνη, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (Biowhittaker) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 10% CO

2 στους 37 ° C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. FGF-2 ήταν από την Calbiochem.

Αντισώματα

Anti-ΤΥΚ2 (C-20), STAT3 (Ν-τερματικό), STAT5A (L-20), STAT5b (G-2), ERK1 (subdomain XI), Β-RAF (H145) και BCL-2 (100) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. STAT1 (Ν-τερματικό) και ΡΥ20 αντισώματα ελήφθησαν από BD Transduction Laboratories. Αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένης STAT1 (pSTAT1-Tyr

701), φωσφορυλιωμένη STAT3 (pSTAT3-Tyr

705), φωσφορυλιωμένη STAT5 (pSTAT5-Tyr

694), φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 (pERK1 /2-Thr

202/185 /Tyr

204/187) και PARP αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Anti-MCL1 ήταν από BD Pharmingen. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.