Αφηρημένο

καρκίνωμα του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες με λίγα, μετρήσιμα, βιοδείκτες. Καρκίνο του προστάτη ανακάλυψη βιοδεικτών έχει παρεμποδιστεί λόγω υποκειμενική ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης σε τομές ιστών. Μια αμερόληπτη, ποσοτική ανοσοϊστοχημική προσέγγιση που παρέχονται εδώ, για τη διάγνωση και τη διαστρωμάτωση του καρκίνου του προστάτη θα μπορούσε να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα. Αντισώματα έναντι τέσσερις πρωτεΐνες BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 χρησιμοποιήθηκαν σε μία συστοιχία προστατικό ιστό (& gt? 500 μεμονωμένους πυρήνες ιστού από 82 ασθενείς, τα ζεύγη 41 περίπτωση συνδυάζεται με έναν ασθενή σε κάθε ζεύγος είχε βιοχημική υποτροπή). έκφραση της πρωτεΐνης, ποσοτικά κατά τρόπο αμερόληπτο, χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο ανάλυση στο λογισμικό ImageJ, αυξήθηκε σε κακοήθη έναντι των μη-κακοήθεις του προστάτη (από 2-2,5 φορές, σ & lt? 0,0001). λειτουργικά χαρακτηριστικά δείχνουν ευαισθησία στο εύρος των 0,68 – 0,74? συνδυασμός των δεικτών σε ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης καταδεικνύει περαιτέρω βελτίωση σε διαγνωστικές δύναμη. Triple-επισημασμένο ανοσοφθορισμού (BTF3, HINT1 και NDRG1) σε συστοιχία ιστό παρουσίασαν σημαντική (p & lt? 0,02) αλλαγή των συντελεστών συν-εντοπισμού για BTF3 και NDRG1 συν-έκφραση στη βιοχημική υποτροπή vs μη υποτροπής επιθηλίου καρκίνου. BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 θα μπορούσε να αναπτυχθεί ως επιθηλιακά συγκεκριμένες βιοδεικτών για τη διάγνωση και τη διαστρωμάτωση του καρκίνου του προστάτη με βάση ιστού.

Παράθεση: Symes AJ, Eilertsen Μ, Millar Μ, Nariculam J, Freeman Α, Νοταρά M, et al. (2013) Ποσοτική Ανάλυση BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 πρωτεΐνη υπερ-έκφραση στα ανθρώπινα Καρκίνος του προστάτη ιστών. PLoS ONE 8 (12): e84295. doi: 10.1371 /journal.pone.0084295

Επιμέλεια: Domenico Κόπολα, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Αύγ του 2013? Αποδεκτές: 13 Νοεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 27, Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Symes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το φιλανθρωπικό ίδρυμα του καρκίνου του προστάτη Κέντρο Έρευνας και Εμπιστοσύνη του Αγίου Πέτρου. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες στον Mike Millar, Sheila MacPherson και Nancy Evans του Πανεπιστημίου του Εδιμβούργου για βοήθεια σχετικά με τη χρώση και Daniel Ciantar, UCL για Huygens χρήση του λογισμικού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του προστάτη είναι μια ασθένεια του επιθηλίου, η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η αιτία της σημαντικής νοσηρότητας και θνησιμότητας [1]. Κάθε χρόνο, πάνω από 30.000 άνδρες διαγνώστηκαν του καρκίνου του προστάτη και πάνω από 10.000 πεθαίνουν από την ασθένεια στο Ηνωμένο Βασίλειο. Το 2010, 217.730 νέες περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη διαγιγνώσκονται στις ΗΠΑ, με 32.050 αμερικανική άνδρες πεθαίνουν από την ασθένεια [2].

Διάγνωση και πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη βασίζεται στην μορφολογία του ιστού από βιοψίες (~ 1 εκατομμύριο διαδικασιών στις ΗΠΑ και ~ 70.000 στο Ηνωμένο Βασίλειο /έτος). Πρώτη βιοψίες χρόνο εντοπίσει τον καρκίνο σε 38% των περιπτώσεων, ενώ αμφίβολη διάγνωση ή ψευδώς αρνητικά συνιστούν ~ 25-30% των περιπτώσεων [3]. Περιγραφείς της επιθετικότητας (π.χ. Gleason βαθμού) καθορίζουν τη διαχείριση και τη θεραπεία του καρκίνου, αλλά έχει σημαντικά μειονεκτήματα και υψηλή διακύμανση, ιδιαίτερα για τα χαμηλά καρκίνους ποιότητας. Ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρησιμοποιείται για την επίλυση διφορούμενη διάγνωση, ωστόσο, έχουν πλέον βιοδείκτες IHC έχουν ταυτοποιηθεί χρησιμοποιώντας ανάλυση υποκειμενική (scoring) εισαγωγή μεγάλης ποικιλίας [4]. Για όργανο περιορίζεται η βιοψία του προστάτη νόσος παραμένει ένα κρίσιμο κλινικό εργαλείο, ωστόσο, υπάρχει η ανάγκη να επιλυθεί ψευδώς αρνητικά και να τελειοποιήσει τη διάγνωση. Με τον προσδιορισμό των καρκίνων που έχουν καλή πρόγνωση υπερβολική θεραπεία θα μπορούσε να μειωθεί, αλλά δεν υπάρχουν ποσοτικοί δείκτες πρωτεΐνης για να βελτιώσουν την ποιότητα της διάγνωσης. Ένα επαναλήψιμη, ποσοτική προσέγγιση θα μπορούσε να διευκολύνει σημαντικά τη διαδικασία αυτή.

Ανακάλυψη των δεικτών IHC, σε μεγάλο βαθμό, και την ανάλυσή τους, διεξάγεται από ημι-ποσοτικές προσεγγίσεις (π.χ. βαθμολόγησης των τμημάτων ιστού βάφονται με χρωμοσωμάτων ή φθορισμοφόρο) με μεγάλα σφάλματα μεταξύ των παρατηρητών [4,5]. Βαθμολόγηση της έντασης ενός χρωμοφόρου (ή φθοροφόρου) περιλαμβάνει οπτική επιθεώρηση που ακολουθείται από ένα αποτέλεσμα εντός μιας προκαθορισμένης περιοχής από τον πειραματιστή. Μια προσέγγιση με βάση την οπτική παρατήρηση μοτίβο αντικείμενα όπως ιστούς θηλαστικών, με ξεχωριστή αρχιτεκτονική, ή οπτική Εκτίμηση της έντασης του φωτός σήματος, όπως γίνεται για IHC βαθμολόγησης, συνεπάγεται με σοβαρούς περιορισμούς της αντίληψης του φωτισμού και την κρίση, γενικά [6], καθώς και για την αξιολόγηση του καρκινώματος του προστάτη, ειδικά [7]. Ένα περαιτέρω μειονέκτημα της χρήσης μια υποκειμενική προσέγγιση βαθμολόγησης είναι ότι η επιλογή των πρωτεϊνών στόχων που πρέπει να διερευνηθούν έλκεται προς τα άκρα (είτε εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνο (π.χ. EZH) ή απουσιάζει στον καρκίνο (π.χ. κυτοκερατίνες 5 και 6). Αυτό σημαίνει ότι ένα μεγάλο ορισμένες σημαντικές βιολογικές αλλαγές που αναπόφευκτα συμβαίνουν εντός αυτών των άκρων δεν επιβιβάζονται και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατανόηση των μηχανισμών της καρκινογένεσης ή αναπτύχθηκαν ως βιοδεικτών για τη διάγνωση, ή διαστρωμάτωση ή την πρόγνωση του καρκίνου. Ποσοτική IHC [8] μπορεί να προσδιορίσει νέων βιολογικών δεικτών σε μια αμερόληπτη, επαναλήψιμο τρόπο, και σε συνδυασμό με φθορίζοντες ανιχνευτές θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα για την τελευταία. είναι πιθανό ότι όχι μόνο η έκφραση αλλά συν-εντοπισμό των δύο ή περισσότερων πρωτεϊνών μπορεί επίσης να αλλάξει, ως αποτέλεσμα της νόσου ή της θεραπείας [9, 10]. Ένα προαπαιτούμενο για πρόγνωση της νόσου με βάση το μοριακό, αντί μορφολογικά κριτήρια απαιτεί επίσης ισχυρή και αναπαραγώγιμη ανίχνευση έκφρασης πρωτεΐνης στα τμήματα IHC που θα μπορούσε να ακολουθηθεί από τον ποσοτικό προσδιορισμό αλλαγών συν-εντοπισμό σε ανοσοφθορισμό [10].

Σε προηγούμενη μελέτη έχουμε αναπτύξει μια ημι-αυτοματοποιημένη, ποσοτική μέθοδος για να μετρηθεί η έκφραση του Wnt5A σε ιστό προστάτη [8] σε μία συστοιχία προστατικό ιστό (& gt? 500 πυρήνες ιστού από 82 ασθενείς, τα ζεύγη 41 περίπτωση συμφωνημένα με έναν ασθενή σε κάθε ζεύγος είχε βιοχημική υποτροπή). Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να χρησιμοποιηθεί η ποσοτική προσέγγιση IHC να εκτιμήσει αν αυτή η μέθοδος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό υποθετικών δείκτες καρκίνου για διαγνωστικούς σκοπούς. Εμείς επιλέξαμε τέσσερα γονίδια BTF3, NDRG1, HINT1 και ODC1 που ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνωμα του προστάτη (oncomine.org? Κριτήρια επιλογής: p = 0.0001, 2 αλλαγή φορές και στο 10% των γονιδίων που υπερεκφράζεται στο συνολικό σύνολο δεδομένων) σε τουλάχιστον τέσσερις κανονικές vs σύνολα δεδομένων ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του προστάτη [11-14]. Χρησιμοποιήσαμε ποσοτική ανοσοϊστοχημεία [8] για να δείξει ότι η έκφραση του BTF3, HINT1, NDRG1 και πρωτεΐνες ODC1 αυξάνεται σε ιστό καρκίνου του προστάτη και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως πιθανούς στόχους του για τη διερεύνηση της καρκινογένεσης ή βιοδείκτες για τη νόσο. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται μια ποσοτική προσέγγιση ανοσοφθορισμού για τη διαστρωμάτωση του καρκίνου του προστάτη με τη χρήση συντελεστών συν-εντοπισμό των BTF3, HINT1 και NDRG1.

Αποτελέσματα

Ποσοτική ανοσοϊστοχημική ανάλυση των πρωτεϊνών υπερ-εκφράζεται σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη

Η έκφραση της BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 ήταν σε μεγάλο βαθμό επιθηλιακά και αυξήθηκε σε κακοήθεις σε σύγκριση με καλοήθεις ή μη κακοήθη πυρήνες του προστάτη (Σχήμα 1). Έχουμε ποσοτικοποιήσει την κλίμακα του γκρι DAB-ετικέτα (Σχήμα 1 και Σχήμα S1), κατά τρόπο αμερόληπτο, με τη χρήση ενός να αναπαραχθεί, ημι-αυτοματοποιημένη ανάλυση σωματιδίων (Analyze σωματίδια) πρωτόκολλο [8] με ασπρόμαυρες εικόνες του χρωματισμένο ιστού από πάνω από 450-500 μεμονωμένους πυρήνες προστατικού ιστού για κάθε βιοδεικτών (Σχήμα 2). Οι υπολογισμοί της συνολικής έκτασης και το κλάσμα περιοχή δίνονται στον Πίνακα 1. Ενσωμάτωση της AUC αποκάλυψε μια αύξηση στην έκφραση της BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 σε κακοήθη πυρήνες, που είχαν διαγνωστεί με ιστοπαθολογική, σε σύγκριση με μη-κακοήθεις πυρήνες (p & lt? 0,0001, Mann Whitney τεστ U). Τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίζουν BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 ως πρωτεΐνες που είναι υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του προστάτη.

(άνω των 500 πυρήνων ιστού χρωματίστηκαν για κάθε αντίσωμα) από συστοιχίες ανθρώπινο προστάτη. Αυτά είναι εκπρόσωποι των άνω 450-500 πυρήνα ιστού εικόνες αναλύθηκαν για κάθε αντίσωμα βιοδείκτη χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο ανάλυσης εικόνας (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι – ανάλυση των σωματιδίων της εικόνας). Κάθε πυρήνας είχε απεικονιστεί χρησιμοποιώντας ένα όρθιο μικροσκόπιο Leica (10x) και να αποθηκευτεί ως αρχείο jpg. Κάθε εικόνα χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η έκφραση πρωτεΐνης (ετικέτα DAB, καφέ, σε μεγάλο βαθμό σε κυψελοειδή κύτταρα). εικόνες Χρωματιστά RGB (Α-Η) μετατράπηκαν σε αντίστοιχες εικόνες κλίμακας του γκρι (Ι-Ρ) για την ποσοτικοποίηση του σήματος DAB χρησιμοποιώντας Αναλύστε το πρωτόκολλο Σωματιδίων στο λογισμικό ImageJ για την απόκτηση Συνολική επιφάνεια βάφονται, σε pixel. έκφραση της πρωτεΐνης για BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 αυξήθηκε σε κακοήθη κατά καλοήθεις πυρήνες (p & lt? 0,0001).

Η

Μία αμερόληπτος, αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό Συνολική επιφάνεια βάφονται (σε ​​pixel) ανάγεται σε ποσότητα ιστού σε κάθε πυρήνα (βλέπε Μέθοδοι). TA μετατρέπεται στην Περιοχή κλάσμα (συνολική έκταση διαιρούμενο με το σύνολο των pixel στην εικόνα). Κάθε κάδος είναι τα δεδομένα για ένα άτομο, κακοήθη (κόκκινο) ή μη κακοήθη ιστό (πράσινο) πυρήνα. Υπάρχει μια σημαντική αύξηση στην AUC της έκφρασης πρωτεΐνης σε κακοήθη ν μη κακοήθη ιστό προστάτη (ρ & lt? 0,0001).

Η πρωτεΐνη

Κατάσταση (

ν

)

Συνολική επιφάνεια

κλάσμα Περιοχή

*

Η Fold αύξηση

BTF3Benign ( 236) 22301 ± 16.971,66 ± 0.12Malignant (228) 54750 ± 35.884,09 ± 0,27

2.5HINT1Benign (214) 28564 ± 18.822,13 ± 0.14Malignant (225) 67.173 ± 39.774,93 ± 0.292.3NDRG1Benign (230) 27.752 ± 18.752,07 ± 0.14Malignant ( 223) 72.297 ± 43.805,4 ± 0.332.6ODC1Benign (261) 38.621 ± 41.842,80 ± 0.31Malignant (243) 65428 ± 53.894,88 ± 0.41.8Table 1. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης της πρωτεΐνης σε κακοήθη και μη κακοήθη arryas ιστό ανθρώπινου προστάτη χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

ετικέτα DAB, που αντιπροσωπεύουν την έκφραση της πρωτεΐνης για BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1 ήταν ποσοτικά κατά τρόπο αμερόληπτο, με τη χρήση ενός να αναπαραχθεί, ημι-αυτοματοποιημένη ανάλυση σωματιδίων (Analyze σωματίδια) πρωτόκολλο με το λογισμικό ImageJ. Πάνω από 500 επιμέρους πυρήνες του ιστού του προστάτη (βλέπε μεθόδους) εικόνες RGB μετατράπηκαν σε 16 αποχρώσεις του γκρι bit. Τα αποτελέσματα είναι μέσοι όροι ± SE για τις υπολογιζόμενες παράμετροι της συνολικής έκτασης και του κλάσματος περιοχή. Αυτά τα δεδομένα τυποποιηθεί για ποσότητα ιστού σε κάθε πυρήνα, χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο αντίστροφο επί ImageJ (βλέπε μεθόδους). Πλάσια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης σε κακοήθη σε σύγκριση με μη κακοήθη (καλοήθη) πυρήνων επιβεβαιώθηκε με AUC υπολογισμούς των δεδομένων από το Σχήμα 2. (n) = αριθμός χρησιμοποιήσιμων πυρήνων περιλαμβάνονται στην ανάλυση.

*

Στατιστική ανάλυση: έκφραση, για όλες τις πρωτεΐνες, είναι σημαντικά διαφορετική σε κακοήθεις σε σύγκριση με μη κακοήθη προστάτη σε Ρ & lt? 0,0001 χρησιμοποιώντας Mann Whitney U test. CSV Λήψη CSV

Για να διερευνηθεί η χρησιμότητα των πρωτεϊνών ως υποτιθέμενο βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, υπολογίσαμε την αληθινή θετικό ποσοστό (ευαισθησία) και ψευδώς θετικό ποσοστό (1-ειδικότητα) από την καμπύλη ROC (Σχήμα 3). Τα δεδομένα κλάσμα περιοχή μεταμορφώθηκε σε probit και εφαρμόστηκε σε μια συνάρτηση Gauss. Τιμές AUC του 1,0 για ένα καμπύλη ROC αντιπροσωπεύει υψηλή εκλεκτικότητα και την ευαισθησία, ενώ 0,5 υποδηλώνει ότι η δοκιμή δείκτης δεν μπορεί να διακρίνει μεταξύ μη-κακοήθη και κακοήθη κατηγορίες. Τα διαγράμματα στιγμών των μετασχηματισμένων δεδομένων δίνονται στο Σχήμα S2. Ευαισθησία και 1-ειδικότητα υπολογίστηκαν για τις τιμές κλάσματος περιοχή για NDRG1, BTF3, HINT1 και ODC1 (Πίνακας S1). Σταθερό όριο (κριτήρια & gt?) Τιμές για το υποτιθέμενο βιοδεικτών για τη σειρά διάγνωση μεταξύ 0,68 και 0,74 (Πίνακας S1), υποδεικνύοντας υψηλή ευαισθησία για NDRG1, BTF3 και HINT1, ως διαγνωστικοί δείκτες για τον εντοπισμό του καρκίνου του προστάτη σε πυρήνες ιστού από αμερόληπτη, ποσοτική ανοσοϊστοχημεία. Θετικές αναλογίες πιθανότητα (LR +) για κάθε βιοδείκτη στα καθορισμένα κριτήρια (Πίνακας S1) κυμαινόταν 1,7 έως 2,4. Μια αναλογία πιθανότητα μεγαλύτερη από 1 υποδεικνύει ότι το αποτέλεσμα συσχετίζεται με την ύπαρξη της νόσου [15]. NDRG1, BTF3 και HINT1 έδειξε επίσης LR + της & gt? 10 σε διάφορα κριτήρια αποκοπεί σημεία? LR + s πάνω από 10, για ένα διαγνωστικό τεστ, θεωρείται ότι παρέχει ισχυρά αποδεικτικά στοιχεία για να αποφανθεί στη νόσο [15,16]. Η διαγνωστική ισχύς ενισχύθηκε περαιτέρω με την ενσωμάτωση δεδομένων από δύο βιοδείκτες σε ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης (Πίνακας 2). Gleason βαθμούς 4 + 3 και 3 + 4 απαρτίζεται & gt? Το 80% των δειγμάτων κακοήθους ιστού μαζεύτηκαν στη συστοιχία ιστού (μεταξύ 221-241 πυρήνων ιστού, βλέπε Πίνακα S2). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση των τεσσάρων βιοδεικτών όταν διαχωρίζονται για ανάλυση με βάση Gleason βαθμίδας. (4 + 3 και 3 + 4? Σχήμα S3)

καμπύλη ROC καταδεικνύει την διακριτική απόδοση της έκφρασης πρωτεΐνης στο διαφοροποίηση μεταξύ των κακοήθεις και μη κακοήθεις πυρήνες ιστού χρησιμοποιώντας το κλάσμα περιοχής (probit) στοιχεία για BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1. Τα λειτουργικά χαρακτηριστικές τιμές που αναφέρονται στον πίνακα S1. Η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει την περιοχή ROC 0.5. συνδυασμός

Η πρωτεΐνη

% των περιπτώσεων σωστά identfied *

BTF 3 και HINT172BTF3 και NDRG178BTF3 και ODC193HINT1 και NDRG181HINT1 και ODC185NDRG1 και ODC197Table 2. Logistic μοντέλο παλινδρόμησης για τον εντοπισμό συνδυασμός των δεικτών που μπορούν να βελτιώσουν διαγνωστική ισχύ.

A μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης με την χρησιμοποίηση του λογισμικού MedCalc να αναλύσουν τη σχέση μεταξύ ενός διχοτομική εξαρτημένη μεταβλητή (μη κακοήθη v κακοήθη) και μία ή περισσότερες ανεξάρτητες μεταβλητές (δύο βιοδείκτες). Το αποτέλεσμα (ποσοστό των υποθέσεων που έχουν αναγνωριστεί σωστά) υποδηλώνει ότι στην ομάδα αυτή των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, η διαγνωστική ισχύς για τον εντοπισμό κακοήθων περιπτώσεων αυξάνεται με το συνδυασμό των BTF3 και ODC1 και NDRG1 και ODC1. * Το επίπεδο σημαντικότητας του συνολικού μοντέλου κατάλληλα για την ανάλυση για όλους τους συνδυασμούς είναι p & lt? 0,0001. CSV Λήψη CSV

διαστρωμάτωση Νοσημάτων χρήση πολλαπλών δεικτών και χρώση ανοσοφθορισμού

Εκτιμάται ότι περίπου το 30% των ασθενών που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή για κλινικά εντοπισμένη νόσο θα βιώσουν βιοχημική υποτροπή (ορίζεται ως ανιχνεύσιμο PSA ≥ 0,2 ng ml

-1 εντός 2 ετών από τη χειρουργική επέμβαση). Μία ομάδα ασθενών που χρησιμοποιείται για τη συστοιχία ιστού σε αυτή τη μελέτη, είχαν υποβληθεί σε βιοχημική υποτροπή [17]. Υποθέσαμε ότι όχι μόνο μια αλλαγή στην έκφραση, αλλά και συν-εντοπισμό των προσδιορισθέντων βιοδεικτών αλλαγές στο επιθήλιο του καρκίνου του προστάτη. Αυτό διερευνήθηκε με πολυ-σημασμένο χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας BTF3, HINT1 και αντισώματα NDRG1 (Σχήμα 4). Τα 3 πρωτεΐνες εκφράζονται διαφορικά σε μη κακοήθη (Σχήμα 4Α) σε σύγκριση με κακοήθη (Σχήμα 4Β) πυρήνες και βρέθηκε να είναι σε μεγάλο βαθμό στο επιθήλιο του προστάτη, επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα από ξεχωριστά αντισώματα χρώση χρησιμοποιώντας 3,3-διαμινοβενζιδίνης-υπεροξειδάση ραδικιού ( DAB-HRP, Εικόνα S1 και Σχήμα 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι όχι μόνο η έκφραση αυτών των πρωτεϊνικών βιοδεικτών, μεμονωμένα, αυξάνεται σε καρκίνο προστάτη (Σχήμα 2), αλλά ότι η έκφραση είναι σε μεγάλο βαθμό επιθηλιακά και έτσι ειδικά για την διεργασία της ασθένειας (Εικόνα 4).

Συν-έκφραση των τριών πρωτεϊνών BTF3 (FITC-πράσινο), HINT1 (Cy3- μπλε) και NDRG1 κακοήθη πυρήνες προστατικό ιστό (Cy5-κόκκινο) σε μη-κακοήθεις (Α) και (Β)? οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές πυρήνες ιστού από τη συστοιχία ιστού με πάνω από 200 δείγματα. Τα τρία αντισώματα επωάστηκαν ταυτοχρόνως και επισημάνθηκαν με τρία Cy5 -Κεά διαφορετικά φθοροφόρα χρησιμοποιώντας Bond αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης. Ολόκληρα πυρήνες ιστού απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα συνεστιακής Leica και 4×4 πλακάκια στις ίδιες ακριβώς ρυθμίσεις για σύγκριση. Οι εικόνες μεγεθυνθεί 3x χρήση του ψηφιακού ζουμ στην ImageJ. Κλίμακα bar = 100 μm

Η

Η συν-εντοπισμό των BTF3, HINT1 και NDRG1 ήταν δίπλα διερευνώνται στις multi-επισημασμένο πυρήνες ιστού ανοσοφθορισμό από υποτροπιάζον και μη υποτροπή ασθενείς από σύνθετα φθορίζουσες εικόνες (Εικόνα 5.? BTF3, HINT1 και NDRG1, πράσινο, μπλε και κόκκινο, αντίστοιχα) με σκοπό τον προσδιορισμό της χρησιμότητας αυτής της προσέγγισης για τη διαστρωμάτωση του καρκίνου του προστάτη. Υπάρχει μια εμφανής και μετρήσιμη μεταβολή του τρόπου διεξαγωγής των χρώση αυτών των πρωτεϊνικών βιοδεικτών σε βιοχημικές πυρήνες υποτροπής ιστού: έκφραση BTF3 εμφανίζεται λιγότερο σε υποτροπή, σε σύγκριση με μη-υποτροπιάζουσα δείγματα, ενώ HINT1 και έκφραση NDRG1 εμφανίζεται κυρίαρχο στην δείγματα υποτροπιάζουσα ιστού (εκπρόσωπος ιστού οι πυρήνες από ασθενείς βιοχημική υποτροπή και ελέγχου που απεικονίζεται στο Σχήμα 5Α και Β)? ποσοτική ανάλυση συνεντόπισης μεγάλη μεγέθυνση αποσυσπειρωμένο εικόνες (Σχήμα 5C και ϋ) έδειξε ότι το μεγαλύτερο μέρος της εμφανούς μεταβολή του τρόπου διεξαγωγής της έκφρασης, για τα τμήματα πολυ-επισημασμένο ιστού σε μη-υποτροπιάζουσα vs υποτροπιάζον δείγματα, ήταν λόγω της αλλαγής στην συν-έκφραση της BTF3 (ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη, FITC, πράσινο) και HINT1 (Κυανίνης 3, Cy3, μπλε). Υπολογίστηκαν οι συντελεστές Pearson για colocalization για μη υποτροπή vs υποτροπή ήταν 0,73 ± 0,02 έναντι 0,60 ± 0,07 (μέσο ± SD, η = 4, σημαντικότητα της διαφοράς ρ & lt? 0,02). Ποσοτική συν-εντοπισμός δείχνει ότι η προσέγγιση πολλαπλών επισήμανσης θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διαστρωμάτωση του καρκίνου του προστάτη σε πυρήνες ιστού.

Συν-έκφραση των τριών πρωτεϊνών BTF3 (FITC-πράσινο), HINT1 (Cy3- μπλε) και NDRG1 (Cy5 -Κόκκινο) σε κακοήθη πυρήνες προστατικό ιστό (Α έως Δ). Σύνθετο μικρογραφίες ανοσοφθορισμό βάφονται πυρήνων προστατικό ιστό από ασθενείς με βιοχημική υποτροπή (οριζόμενη ως PSA ≥ 0,2 ng /ml εντός 2 ετών από ριζική προστατεκτομή). Οι πυρήνες ιστού από 4 ασθενείς (ζεύγη για το σκορ Gleason και PSA), μη-υποτροπιάζουσα (Α) και βιοχημική υποτροπή (Β) εκπρόσωπο εικόνες που χρησιμοποιούνται για την ποσοτική ανάλυση συν-εντοπισμού (βλέπε μεθόδους) εμφανίζεται. Απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Leica μικροσκόπιο συνεστιακό? Α και Β είναι χαμηλή μεγέθυνση? Γ και Δ μεγαλύτερη μεγέθυνση? Ε είναι ένα παράδειγμα της έκφρασης των τριών δεικτών σε μη κακοήθη ιστό και σε μεγαλύτερη μεγέθυνση. Η έκφραση του BTF3 (πράσινο), για παράδειγμα, είναι εμφανής σε μη-υποτροπιάζουσα δείγματα λαμβάνοντας υπόψη ότι δεν είναι πολύ εμφανής σε πυρήνες από υποτροπή ασθενείς. Απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο της Olympus (40x πλακάκια (Α και Β) ή 40x με ψηφιακό ζουμ 3,5-4 (C, D και E). Υψηλής μεγέθυνσης εικόνων (C, D και Ε) deconvolved χρησιμοποιώντας το λογισμικό Huygens επάγγελμα. 16bit ΔΕΘ αρχεία για κάθε φθοροφόρο (FITC, Cy3 και Cy5) εισήχθησαν ImageJ και ψευδο χρωματιστό (FITC, πράσινο, Cy3, μπλε και Cy5, κόκκινο). τα Ζ-προβλέψεις για έως και 27 εικόνες που παρουσιάζονται για κάθε πυρήνα ιστού. μπαρ Κλίμακα = 100 μm για τα Α και Β και 20 μm για το C και D. η ποσοτική ανάλυση συνεντόπισης των εικόνων (π.χ. Σχήμα 5C και ϋ) έδειξε ότι πιο σημαντική αλλαγή στο πρότυπο της έκφρασης, σε μη-υποτροπιάζουσα vs υποτροπιάζον δείγματα, οφείλεται στη μεταβολή συν-έκφραση του BTF3 (FITC, πράσινο) και HINT1 (Cy3, μπλε) με συντελεστές Pearson για colocalization για μη υποτροπή vs υποτροπή = 0,73 ± 0,02 έναντι 0,60 ± 0,07 (μέσο ± SD, η = 4, σημαντικότητα της διαφοράς ρ & lt? 0.02).

η

Συζήτηση

με τη χρήση της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης παγκόσμια, τεράστια πρόοδος στον εντοπισμό των απορυθμισμένης γονιδίων στον καρκίνο του προστάτη κατά την τελευταία δεκαετία. Αυτό που έλειπε είναι η μετάφραση των γονιδίων αυτών σε κλινικά χρήσιμες βιοδείκτες για τη διάγνωση και τη διαστρωμάτωση της νόσου. Ανθρώπινα προστάτη ήταν ένα από τα πρώτα ιστών που πρέπει να διερευνηθούν για παγκόσμιες αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση σε ασθένεια σχεδόν πριν από μια δεκαετία. Παρεμπιπτόντως, η έγκριση των νέων δεικτών από Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ, ιδιαίτερα πρωτεϊνικών δεικτών, έχει μειωθεί κατά την τελευταία δεκαετία. Η μείωση αυτή θα μπορούσε να αποδοθεί σε τρία μεγάλα προβλήματα στον προσδιορισμό και την ανάπτυξη που βασίζεται ιστού πρωτεΐνης βιοδεικτών για τη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη: 1. Η έλλειψη της ειδικότητας, δηλαδή όχι επιθήλιο συγκεκριμένο (το χώρο για την έναρξη της νόσου) 2. Έλλειψη από μια αμερόληπτη, αυτοματοποιημένη, ποσοτική ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης που θα μπορούσε να προσδιορίσει ισχυρή, reprdoucible στοιχεία για την υποτιθέμενη βιοδείκτες 3. έλλειψη ποσοτική, πρωτεομική προσεγγίσεις σε μια μοριακή βάση για την πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη.

Ανοσοϊστοχημική δείκτες θα μπορούσαν να είναι εξαιρετικά χρήσιμα στην πρωτοβάθμια ή επιβεβαίωση της διάγνωσης για την υποστήριξη της ιστοπαθολογική, αλλά λόγω των δυσκολιών στην ταυτοποίηση ή την επικύρωση [18] μόνο μια χούφτα τέτοιων δεικτών υπάρχει. Φαίνεται επίσης πιθανό ότι ιστοπαθολογική ανάλυση θα παραμείνει προπύργιο για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη στο εγγύς και μεσαίου μέλλον. Έτσι, εκτός από τη συνέχιση της αναζήτησης για τον εντοπισμό των μη επεμβατική βιοδείκτες που θα μπορούσε να ανιχνευθεί στα σωματικά υγρά, είναι σημαντικό να διατηρηθεί το ραφινάρισμα και βελτίωση των ανοσοχημική βιοδείκτες ιστού που θα μπορούσαν να διευκολύνουν τη διάγνωση, τη βελτίωση της πρόγνωσης και παρέχουν χρήσιμες προγνωστική διαστρωμάτωση του καρκίνου του προστάτη. Λόγω της αύξησης της υπολογιστικής ισχύος κατά την τελευταία δεκαετία δύο τεχνολογίες έχουν ωριμάσει οι οποίες θα μπορούσαν να βοηθήσουν στην επίτευξη αυτών των στόχων. Αυτά συζητούνται παρακάτω.

Η μορφολογική ανάλυση χρησιμοποιείται συνήθως για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, αν και IHC χρησιμοποιείται για να βοηθήσει μορφολογική διάγνωση, ιδιαίτερα σε αμφίβολες περιπτώσεις, π.χ. σε δείγματα ιστών από βιοψίες βελόνας, διουρηθρική εκτομή τα δείγματα και τα δείγματα μεταστατικού όγκου [19]. Ένα περιπλέκει το ζήτημα που εμποδίζουν την ανακάλυψη νέων βιοδεικτών για τη διάγνωση και την ασθένεια διαστρωμάτωση του προστάτη (και άλλα) καρκίνο (s) από δείγματα βιοψίας, υπήρξε μια έλλειψη αντικειμενικών, ποσοτικών μεθόδων για την ανίχνευση σημαντικές αλλαγές από πειράματα IHC για την ταυτοποίηση βιοδεικτών. Υπάρχουν, ωστόσο, ορισμένες εξαιρέσεις σε αυτή την προσέγγιση. Rubin και οι συνεργάτες του [20] επινόησε μια ποσοτική προσέγγιση για τον εντοπισμό α-μεθυλακυλοσυνένζυμο-CoA ρακεμάση (AMACR). Αρχικές μελέτες έδειξαν σχεδόν ομοιόμορφη έκφραση αυτής της πρωτεΐνης σε καρκινικό ιστό αλλά σε μεταγενέστερη ανάλυση η έκφραση βρέθηκε να είναι λιγότερο και, με επιφύλαξη, αυτή η πρωτεΐνη χρησιμοποιείται ως διαγνωστικός δείκτης.

Για να αντιμετωπιστεί το ζήτημα της προκατάληψης και εξάρτηση από υποκειμενική εκτίμηση της έκφρασης ενός δεδομένου βιοδείκτη, αναπτύξαμε μια μέθοδο, χωρίς προκατάληψη πειραματιστή, να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης στον καρκίνο του προστάτη [8] χρησιμοποιώντας ένα ελεύθερα διαθέσιμο λογισμικό [21]. Σε αντίθεση με τις συμβατικές, μέθοδοι βαθμολόγησης (π.χ. χρώσης DAB) για να εκτιμηθεί η έκφραση σε συστοιχίες ιστών, η προσέγγισή μας επιτρέπει αμερόληπτη ποσοτικό προσδιορισμό του συνολικού σήματος DAB. Αν και ποσοτικοποίηση συνολικό σήμα DAB μπορεί να μην είναι ιδανικό, με την τυποποίηση μέτρησης του σήματος και την εξάλειψη των αυθαίρετων βαθμολόγησης εντοπίσαμε BTF3, NDRG1, HINT1 και τα επίπεδα πρωτεΐνης ODC1 ότι υπερ-εκφράζεται σε καρκίνωμα του προστάτη, ποσοτικώς και επαναλήψιμα, επιβεβαιώνοντας το γονίδιο υπερέκφραση που παρατηρείται από προκαταρκτικό κατάλογο γονιδίων μας. χαρακτηριστικά λειτουργίας (Σχήμα 3 και Πίνακας S1) για BTF3, HINT1 και NDRG1 δείχνουν AUC του 0,71 – 0,76? η AUC της & gt? 0,7 θεωρείται αποδεκτή για ένα διαγνωστικό δείκτη [22] δείχνει ότι, ατομικά, αυτά είναι επαρκή βιοδείκτες της νόσου. Η διαγνωστική ισχύς μπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω όταν αυτές οι δείκτες αναλύονται για συγκεντρωτικών διαγνωστική ισχύς (Πίνακας 2). Επιπλέον, BTF3, NDRG1 και HINT1, σε ποσοτικές μελέτες συν-εντοπισμού (Σχήμα 5) φαίνεται ικανό να διακρίνει μεταξύ των βιοχημικών υποτροπής και του καρκίνου του προστάτη μη υποτροπής. Οι βιοδείκτες που προσδιορίζονται εδώ είναι νέες για τη χρήση τους στη διάγνωση και επίσης στους συνδυασμούς που περιγράφονται για βιοχημική υποτροπή του καρκίνου του προστάτη. Οι πιθανοί μηχανισμοί με τους οποίους αυτές οι υποθετικές βιοδείκτες καρκίνωμα του προστάτη μπορεί να συμβάλλει στην καρκινογένεση που συζητούνται παρακάτω.

BTF3 είναι μία πρωτεΐνη 27kDa που σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με RNA πολυμεράση ΙΙΒ και απαιτείται για μεταγραφική έναρξη [23] και είναι γνωστό ότι να υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα από καρκίνωμα παγκρεατικού πόρου τόσο

in vitro

και

in situ

[24]. NDRG1 (παλαιότερα γνωστό ως

Cap43

), ένα γονίδιο απόκριση στρες, έχει εμπλακεί σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες στην υγεία και την ασθένεια. Σε αντίθεση με την έκφραση άλλων βιοδεικτών που παρουσιάζονται εδώ, η έκφραση του NDRG1 έχει διερευνηθεί σε προστατικό ιστό, αλλά είναι ένα αντικείμενο της διαμάχης με τις εκθέσεις που είναι αυξημένη [25] και μειωμένη [26] στον καρκίνο του προστάτη. Είναι σημαντικό να σημειωθεί, ωστόσο, ότι καμία από αυτές τις μελέτες χρησιμοποιούνται μια αμερόληπτη ποσοτική τεχνική και ως εκ τούτου η ανάλυση έκφρασης μπορεί να είναι ο λόγος για αυτές τις διαφορές.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι παίζει σημαντικό ρόλο καρκίνο του προστάτη [8,27]. NDRG1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι επηρεάζουν σηματοδότηση Wnt και υπάρχει ένα

εκ πρώτης όψεως

περίπτωση για τη συμμετοχή των NDRG1 στη ρύθμιση της σηματοδότηση Wnt σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη [28]. γονίδιο NDRG1 είναι επίσης ένας εταίρος σύντηξης ETS-οικογένεια στην ERG εκφράζουν τον καρκίνο του προστάτη, αλλά σε αντίθεση με TMPRSS2-ERG και SCL45A3-ERG συγχωνεύσεις, επικρατεί σε καρκίνους του προστάτη, η σύντηξη NDRG1-ERG πιστεύεται ότι κωδικοποιεί για μια χιμαιρική πρωτεΐνη [29]. Δεν υπάρχει πληροφορία σχετικά με την έκφραση της πρωτεΐνης NDRG1 στον καρκίνο του προστάτη? αν βρεθεί να συντηχθεί με ERG ή όχι, NDRG1 μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο πρωτεΐνη βιοδείκτης για τον καρκίνο του προστάτη.

HINT1 ανήκει στην τριάδας ιστιδίνης (HIT) της οικογένειας και μια πρωτεϊνική κινάση C αλληλεπιδρά πρωτεΐνη [30]. Δεν υπάρχουν πληροφορίες για την έκφραση HINT1 ή λειτουργία σε καρκίνο του προστάτη, αν και μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκων σε ποντικούς [31]. Σε μια κυτταρική σειρά ηπατώματος, HINT1 αναστέλλει τη δράση του Wnt /σηματοδότηση SS-κατενίνης και γονιδιακή μεταγραφή μέσω TCF4 [32]. Έχουμε δείξει προηγουμένως, ότι υπάρχει καταστολή της SS-κατενίνης /TCF4 διαμεσολαβούμενη γονιδιακή μεταγραφή των στόχων μεταγραφής TCF4 [8]. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι HINT1 μπορεί να συμβάλει στην παρεμπόδιση της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης στον καρκίνο του προστάτη [8].

L-ορνιθίνης δεκαρβοξυλάσης 1 (ODC1) είναι ένα ένζυμο στην οδό σύνθεσης πολυαμίνης [33] ένα βασικό παράγοντα για την κανονική του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και νεοπλασματική ανάπτυξη. ODC1 έχει ταυτοποιηθεί ως ένας γενετικός δείκτης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου [34] και η υπερ-έκφραση του ODC1 έχει συνδεθεί με νευροβλάστωμα υψηλού κινδύνου [35] και του παχέος και του μαστού [36]. Τα δεδομένα αυτά συσχετίζονται με

in vivo

πειράματα με ODC1 ποντίκια knock-out που αναπτύχθηκε λιγότερους όγκους σε απάντηση σε διάφορες καρκινογόνες υποστηρικτές σύμφωνα με τον αριθμό μειωμένο αντίγραφο του γονιδίου [37].

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη, ποσοτική προσέγγιση για τον εντοπισμό επιθήλιο συγκεκριμένες βιοδείκτες σε συνδυασμό με ανοσοφθορισμό θα μπορούσε να αποδειχθεί χρήσιμη στη διάγνωση, διαστρωμάτωση και την πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

προστάτη σειρά ιστού

επιλογή των ασθενών, την κατάσταση της νόσου και την κατασκευή λεπτομέρειες των τμημάτων ιστού δίνονται αλλού [8,17]. Εν συντομία, τεμάχια ιστού κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας αρχειακό φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα ριζική προστατεκτομή από τους 82 ασθενείς με παθολογικό στάδιο pT3a ή β και προ-εγχειρητικό στάδιο PSA του & gt? 3. 41 ζεύγη περίπτωση αντιστοιχήθηκαν για τις ακόλουθες κατηγορίες: παθολογικό στάδιο, βαθμό Gleason και προεγχειρητική συγκέντρωση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA). Ένας ασθενής σε κάθε ζεύγος είχε βιοχημική υποτροπή (που ορίζεται ως PSA ≥ 0,2 ng mL-1 εντός 2 ετών από την επέμβαση) και η άλλη παρέμεινε βιοχημικά απαλλαγμένες από τη νόσο (που ορίζεται ως μη ανιχνεύσιμο PSA τουλάχιστον 3 χρόνια μετά την επέμβαση). Οι πυρήνες διαγνώστηκαν (ως καλοήθης ή μη κακοήθεις και κακοήθεις) και χαρακτηρίζεται από έναν παθολόγο και 5-6μm τομές κόπηκαν από τα συστοιχίες ιστό πάνω σε επικαλυμμένα πλακίδια. Για την εξάλειψη των προκαταλήψεων, οι πειραματιστές ήταν τυφλός από τη βαφή, απεικόνισης και ανάλυσης, με το τελευταίο να είναι αυτοματοποιημένη (βλέπε παρακάτω). Τα κλινικά στοιχεία από τα δείγματα ιστού που χρησιμοποιούνται δίνονται στον Πίνακα S2 και [17]? παθολόγους σημείωσε μια πλειοψηφία των δειγμάτων (& gt? 80%) ως Gleason βαθμού 4 + 3 και 3 + 4. Ένας υπολογισμός του μεγέθους του δείγματος έγινε για τη διαφοροποίηση μεταξύ των υπερ-έκφραση χρησιμοποιώντας DAB-IHC? το μέγεθος του δείγματος για την έκφραση της πρωτεΐνης υπολογίστηκε πριν από την κατασκευή της συστοιχίας ιστού (με α και β του 0,05 και αναμενόμενη διαφορά των 2,5 πτυχώσεις μεταξύ των μέσων των κακοήθων και καλοήθων δείγματα να είναι 41 ασθενείς ανά ομάδα).

ηθική έγκριση

Ηθικά δόθηκε έγκριση από τις επιτροπές κοινή UCL /UCLH σχετικά με την ηθική της ανθρώπινης έρευνας. Το διοικητικό συμβούλιο επανεξέτασης (RB) ενέκρινε τη χρήση ανθρώπινων ιστών για την έρευνα για τον καρκίνο του προστάτη, σύμφωνα με τη Διεθνή Επιτροπή για την εναρμόνιση της Ορθής Κλινικής Πρακτικής (ICH GCP). Για την κατασκευή συστοιχίας ιστού τα δείγματα ανώνυμα κατά τη διάρκεια της κατασκευής των συστοιχιών ιστού [17] και χρησιμοποιούνται για διάφορες ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε ένα έργο που έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας UCL /UCLH. Το RB παραιτηθεί από την ανάγκη για πληροφορημένη συναίνεση, διότι τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για τη σειρά των ιστών ήταν αρχειακό παθολογικά δείγματα.

3,3-διαμινοβενζιδίνη-υπεροξειδάση ραδικιού (DAB-HRP) χρώση

Όλα χρώση ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Bond αυτοματοποιημένο σύστημα [8] σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι λεπτομέρειες της διαδικασίας χρώσης για την IHC χρησιμοποιώντας DAB και αντισώματα (BTF3, HINT1, NDRG1 και ODC1) που χρησιμοποιούνται δίνονται στις Μεθόδους S1.

χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας 3 αντισωμάτων σε συστοιχίες ιστό προστάτη

Το πρωτόκολλο για χρώση ανοσοφθορισμού ήταν παρόμοια με εκείνη που περιγράφεται για χρώση DAB, παραπάνω, εκτός του ότι BTF3, HINT1 και NDRG1 αντισώματα επωάζονται συγχρόνως και βάφτηκαν με FITC, Cy5 και Cy3 αντίστοιχα, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας μια Leica 710 ομοεστιακό μικροσκόπιο με αντικειμενικό ΕΚ Σχέδιο Neofluar (40x).

ανάλυση των σωματιδίων Εικόνα χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ

Μία αμερόληπτος, να αναπαραχθεί, μέθοδος αυτοματοποιημένης ανάλυσης σωματιδίων [8] χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιήσει το σήμα DAB σε μη-κακοήθεις (καλοήθεις) και κακοήθεις πυρήνες ιστό ανθρώπινου προστάτη χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ [21]. Μακροεντολές γράφτηκαν για να εκτελέσει την παρακάτω ακολουθία των γεγονότων για λαμβανόμενων εικόνων JPEG: 1. Ανοίξτε την εικόνα 2. Μετατροπή σε 16-bit εικόνα κατώφλι 3. Ορισμός 4. Αναλύστε σωματιδίων (Μέγεθος 0,5- Infinity, κυκλικότητα 0,00 – 1,00) 5. Αποθήκευση εικόνας 6. Αποθήκευση πληροφοριών σωματιδίων (μετράνε, συνολικής έκτασης, μέσου μεγέθους και το κλάσμα της περιοχής) σε ένα υπολογιστικό φύλλο Excel (rsb.info.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf). Οι μονάδες είναι η προεπιλεγμένη ρύθμιση ImageJ (pixels). Τυποποίησης για την ποσότητα του ιστού ανά πυρήνα επίσης ποσοτικά με τη χρήση της αντίστροφης συνάρτησης (EditInvert εικόνας) σε ImageJ με το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω. σήμα ποσοτικοποιημένους DAB εκφράζεται ως σήμα /ποσότητα ιστού σε κάθε πυρήνα ιστό. Ένα διάγραμμα ροής για DAB ποσοτικοποίηση του σήματος δίνεται στο σχήμα S1. Για όλα τα αντισώματα που ελέγχθηκαν, η έκφραση παρατηρήθηκε σε μεγάλο βαθμό τα επιθηλιακά και επίσης ανάλυση περιορίζεται στην επιθηλιακή έκφραση? σετ παραμέτρων κατώφλι επιλέχθηκαν μετά τη χειροκίνητη ανάλυση τυχαίων πυρήνων για τη μετέπειτα ποσοτικοποίηση του σήματος. Ένα συνεχόμενο φύλλο για όλες τις χρησιμοποιήσιμες πυρήνες (μεταξύ 211 και 260 πυρήνες) για μη-κακοήθεις vs κακοήθη σύγκριση, για διάφορα αντισώματα κατασκευάστηκε.