Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι αλλαγές στο DNA μεθυλίωση του καρκίνου περιλαμβάνουν την παγκόσμια υπομεθυλίωσης και γονιδιακών ειδικά υπερμεθυλίωση. Δεν είναι σαφές εάν αυτές οι δύο επιγενετικές λάθη είναι μηχανιστικά συνδέονται ή συμβαίνουν ανεξάρτητα. Αυτή η μελέτη διεξήχθη για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ υπομεθυλίωσης DNA, υπερμεθυλίωση και αστάθεια μικροδορυφόρου στον καρκίνο.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εξετάσαμε 61 καρκινικές κυτταρικές σειρές και 60 ορθοκολικά καρκινώματα και γειτονικούς ιστούς τους χρησιμοποιώντας LINE-1 όξινο θειώδες-PCR ως υποκατάστατο για την παγκόσμια απομεθυλίωση. Ορθοκολικό καρκίνωμα με σποραδικές αστάθεια μικροδορυφορικού (MSI), οι περισσότερες εκ των οποίων οφείλονται σε CpG φαινότυπο νησί μεθυλίωσης (CIMP) και συνδέονται μεθυλίωση MLH1 υποκινητή, έδειξε κατά μέσο όρο καμία διαφορά στη LINE-1 μεθυλίωσης μεταξύ της κανονικής γειτονικά και καρκινικούς ιστούς. Είναι ενδιαφέρον ότι, μερικά δείγματα όγκων σε αυτή την ομάδα έδειξε αύξηση LINE-1 μεθυλίωσης. Σε αντίθεση, MSI-έδειξε σημαντική μείωση στην LINE-1 μεθυλίωσης μεταξύ της κανονικής γειτονικά και καρκίνος ιστούς (Ρ & lt? 0.001). ανάλυσης μικροσυστοιχιών των επαναλαμβανόμενων μεθυλίωσης στοιχείο επιβεβαίωσε αυτή την παρατήρηση και έδειξε υψηλό βαθμό μεταβλητότητας στην υπομεθυλίωσης μεταξύ των δειγμάτων. Επιπλέον, χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση εντόπισε μια ομάδα πολύ μεθυλιωμένος όγκων, που αποτελείται κυρίως από τους όγκους χωρίς να μικροδορυφόρων αστάθεια. Εμείς επεκταθεί LINE-1 ανάλυση για καρκινικές κυτταρικές γραμμές από διάφορους ιστούς και διαπίστωσε ότι 50/61 ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε σύγκριση με λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι εν λόγω κυτταρικές σειρές καρκίνου παρουσίασαν επίσης μια μεγάλη διακύμανση στην απομεθυλίωση, η οποία ήταν ιστο-ειδικά και έτσι είναι απίθανο να είναι συνισταμένη από μια στοχαστική διαδικασία.

Συμπέρασμα /σημαντικότητα

Παγκόσμια υπομεθυλίωση μερικώς αντιστρέφεται σε καρκίνους με μικροδορυφόρων αστάθεια και επίσης δείχνει υψηλή μεταβλητότητα του καρκίνου, η οποία μπορεί να αντανακλά εναλλακτικές πορείες εξέλιξης σε καρκίνο

Παράθεση:. Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, Ιμπραήμ ΑΕ, Doshi Κ, Ο R, et al . (2007) LINE-1 υπομεθυλίωση στον Καρκίνο είναι εξαιρετικά μεταβλητή και αντιστρόφως ανάλογη με αστάθεια μικροδορυφόρου. PLoS ONE 2 (5): E399. doi: 10.1371 /journal.pone.0000399

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Μ Cristina Cardoso, Max Delbrueck Κέντρο Μοριακής Ιατρικής, Γερμανία

Ελήφθη: 10 Ιαν 2007? Αποδεκτές: 4 Απρ 2007? Δημοσιεύθηκε: 2 Μαΐου 2007

Copyright: © 2007 Estecio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (ΗΠΑ) χορηγεί CA098006, CA100632 και CA105346 (JP.JI) και από FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa κάνει Estado de São Paulo, Βραζιλία) χορηγεί 99 /09368-1 (MRHE) και 00 /12.361 – 8 (ΕΗΤ)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια περίπλοκη νόσος, η οποία προκύπτει από τόσο γενετικοί όσο και επιγενετικές λάθη. Η σημασία των γενετικών αλλοιώσεων σε καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των χρωμοσωμικών ανωμαλιών και γενετικών μεταλλάξεων, καθώς και των αιτιολογικών παραγόντων της (π.χ. ιονίζουσα ακτινοβολία και χημικά καρκινογόνα) είναι τώρα καλά γνωστές. Η επιγενετική συστατικό του κυτταρικού μετασχηματισμού, ωστόσο, ήταν μέχρι πρόσφατα ελάχιστα κατανοητή. Είναι γνωστό εδώ και δεκαετίες ότι γονιδιώματος σε επίπεδο υπομεθυλίωση συμβαίνει σε όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικά κύτταρα [1] – [4] και η υπερέκφραση των ογκογονιδίων είχε τεκμηριωθεί ότι είναι ένα αποτέλεσμα αυτής της υπομεθυλίωσης. DNA υπερμεθυλίωση στον καρκίνο κέρδισε την προσοχή από λίγα χρόνια αργότερα με μελέτες από Baylin et al. [5], [6] και Jones et al. [7]. Η τελευταία μεταβολή λαμβάνει χώρα σε CpG νησί υποκινητές των γονιδίων μονού αντιγράφου και εξασθενίζει τη μεταγραφή γονιδίων, με αποτέλεσμα την αποσιώπηση γονιδίων καταστολέα όγκου. Αρκετές μελέτες περιέγραψαν μία ιστο-ειδικό πρότυπο μεθυλίωσης στον καρκίνο και εκατό των στόχων γονίδια είναι γνωστά, συμπεριλαμβανομένων των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και των γονιδίων που εμπλέκονται στην εισβολή, την αγγειογένεση και την απόπτωση [8], [9]. Η σχετιζόμενη με την ηλικία φύση των υπερμεθυλίωση προαγωγού σε φυσιολογικούς ιστούς [10] έχει προταθεί ως παράγοντας προδιάθεση στον καρκίνο.

Ένα σημαντικό και άλυτο ερώτημα είναι αν το γονιδίωμα κλίμακα υπομεθυλίωση και μονού αντιγράφου υπερμεθυλίωση CpG νησιού υποκινητής είναι δύο ανεξάρτητες αλλαγές ή αν είναι μηχανιστικά συνδεθεί. Προτάσεις μελέτες αλλαγές μεθυλίωσης του DNA έχουν προσδιορίσει τόσο συχνές υπερμεθυλίωση και υπομεθυλίωση σε διάφορους τύπους νεοπλασιών [11] – [14]. Προσπάθειες για να απαντηθεί το ερώτημα αυτό οδήγησε σε αντιφατικά ευρήματα, με κάποιες ομάδες υποστήριξης [15], [16] και άλλοι αντικρούοντας [17], [18] μια σύνδεση μεταξύ των δύο αλλοιώσεις.

Εδώ, πραγματοποιήσαμε μια γονιδίωμα ευρεία μελέτη μεθυλίωσης σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές και πρωτογενείς όγκους να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ υπομεθυλίωσης DNA, υπερμεθυλίωση και αστάθεια μικροδορυφόρου στον καρκίνο. Η ρετροενδομετάθεσης στοιχείο LINE-1 χρησιμοποιήθηκε ως υποκατάστατο του γονιδιώματος-ευρεία υπομεθυλίωσης και μικροσυστοιχίες μεθυλίωση εκτεταμένη ανάλυση μας με άλλες κατηγορίες των επαναλαμβανόμενων στοιχείων. Γονιδίωμα-ευρύ μεθυλίωση διέφεραν σε ορθοκολικό καρκίνωμα που ανήκουν σε διαφορετικές CpG νησί μεθυλίωση φαινότυπο (CIMP) ομάδων, κυρίως σε αυτές με τη σχετική μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI), όπου υπομεθυλίωση ήταν σπάνια σε σύγκριση με τα δύο CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI- ομάδες. καρκινικού κυττάρου γραμμές παρουσίασαν μεγάλη διακύμανση στο γονιδίωμα-ευρεία απομεθυλίωση, η οποία ήταν ιστο-ειδικά και έτσι είναι απίθανο να είναι μια στοχαστική διαδικασία. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι γονιδιώματος σε επίπεδο υπομεθυλίωση στον καρκίνο είναι εξαιρετικά μεταβλητή, οι αιτίες των οποίων είναι άγνωστη, και η ύπαρξη ενός ισχυρή αντίστροφη σχέση μεταξύ της παγκόσμιας υπομεθυλίωση και αστάθεια μικροδορυφόρου στον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών και κυτταρικών σειρών

Εξήντα ζεύγη του όγκου και προφανώς κανονική γειτονικά δείγματα κόλου ελήφθησαν από ασθενείς στους οποίους χορηγήθηκε στο Johns Hopkins University (Βαλτιμόρη, ΜΑ). CpG φαινότυπο νησί μεθυλίωσης (CIMP) και ανάλυση μικροδορυφορικών προηγουμένως προσδιορίστηκαν για τα δείγματα αυτά [19]. Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος ελήφθησαν από πέντε υγιείς δότες, και φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου ιστού ressected από πέντε άτομα που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για πυροβολισμό πληγές ή μη-κακοήθεις αλλοιώσεις. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Johns Hopkins (Βαλτιμόρη, ΜΑ), και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες.

Εξήντα-ένα καρκινικές κυτταρικές σειρές από οκτώ διαφορετικούς ιστούς (μαστού, του κεντρικού νευρικού συστήματος, κόλον, λευχαιμία, του ήπατος, του πνεύμονα, των ωοθηκών και του προστάτη) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας τις τυπικές μεθόδους. DNA από ασθενείς και κυτταρικές σειρές εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας τυποποιημένες μεθόδους εκχύλισης φαινόλης-χλωροφορμίου.

όξινο θειώδες Pyrosequencing LINE-1 ανάλυση

κατεργασία όξινου θειώδους διεξήχθη όπως αναφέρθηκε [20]. Ανάλυση μεθυλίωσης των LINE-1 υποκινητής (GenBank αριθμός X58075) ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση μεθυλίωσης Pyrosequencing-based. Πραγματοποιήσαμε 50 μΙ PCR σε 60 mM Tris-HCI ρΗ 8.5, 15 mM θειικό αμμώνιο, 2 mM MgCl2, 10% DMSO, 1 mM dNTP μείγμα, 1 μονάδα πολυμεράσης Taq, 5 pmol του εκκινητή (5′-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG -3 ‘), 5 pmol του αντίστροφου-βιοτινυλιωμένο εκκινητή (5′-BIO-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3′) και 50 ng του κατεργασμένου με όξινο θειώδες ϋΝΑ γονιδιώματος. συνθήκες κύκλων της PCR ήταν 95 ° C για 30 s, 50 ° C για 30 s και 72 ° C για 30s για 50 κύκλους. Το βιοτινυλιωμένο προϊόν της PCR καθαρίστηκε και έκανε μονόκλωνο να ενεργεί ως ένα εκμαγείο σε μια αντίδραση Pyrosequencing όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας το κενό Pyrosequencing Prep Εργαλείο (Pyrosequencing, Inc., Westborough, ΜΑ). Εν συντομία, το προϊόν PCR συνδέθηκε με Στρεπταβιδίνη Sepharose ΗΡ (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) και τα σφαιρίδια Sepharose που περιέχουν το ακινητοποιημένο προϊόν PCR καθαρίστηκαν, πλύθηκαν, μετουσιώνονται χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα 0.2 Μ ΝαΟΗ, και πλύθηκε ξανά. Στη συνέχεια, 0,3 μΜ εκκινητή Pyrosequencing (5’-GGGTGGGAGTGAT-3 ‘) ανασυνδέθηκε με το καθαρισμένο προϊόν μονόκλωνο PCR και Pyrosequencing διεξήχθη χρησιμοποιώντας το PSQ HS 96 Pyrosequencing System (Pyrosequencing, Inc.).

μετουσιωμένος ενίσχυση νησί CpG (MCA) /CpG νησί μικροσυστοιχιών

Δεκαέξι παχέος όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικά εμφανίζεται παρακείμενο ιστό τους, χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο CpG νησί μικροσυστοιχιών που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας. Για κάθε δείγμα, MCA αμπλικόνια παρήχθησαν σύμφωνα Toyota et al. [20] χρησιμοποιώντας RXMA PCR προσαρμογείς. Για να ελαχιστοποιηθεί η προκατάληψη ενίσχυση οφείλεται στην διαφορική ενσωμάτωση φθορίζουσες χρωστικές, έχουμε επιλέξει ένα πρωτόκολλο έμμεση επισήμανση. Για το σκοπό αυτό, η ενσωμάτωση του αμινο-αλλυλ dUTP (αα-dUTP, Sigma) σε 600 ng καθενός από DNA όγκου και φυσιολογικών DNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο σύστημα DNA σήμανσης Bioprime (Life Technologies). Cy5 και Cy3 φθορίζουσες χρωστικές συζεύχθηκαν για να aa-dUTP επισημασμένο όγκου και φυσιολογικών γειτονικών αμπλικονίων, αντίστοιχα, και cohybridized στην HCGI12K-Ανθρώπινο CpG 12Κ Array (Microarray Centre, University Δίκτυο Υγείας, Toronto, Canada). Οι διαδικασίες υβριδισμού και πλύσης μετά την υβριδοποίηση σύμφωνα με DeRisi και οι συνεργάτες του και μπορεί να βρεθεί σε https://www.microarrays.org. Οι υβριδοποιημένες πλάκες σαρώθηκαν με σαρωτή GenePix 4000A (Αχοη Instruments, Foster City, CA) και τα αποκτώνται εικόνες αναλύθηκαν με το λογισμικό GenePix Pro 6.0. Μόνο κηλίδες με σχολιασμένα αλληλουχία DNA με 90% ή περισσότερο του μήκους τους επικαλυπτόμενων επαναληπτική στοιχείο χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. Ένα σύνολο 770 σημείων που αντιπροσωπεύουν επαναλαμβανόμενο DNA διαφορετικών τάξεων αξιολογήθηκαν με τη χρήση αυτής της μεθόδου και των στοιχείων μεθυλίωσης για κάθε κηλίδα παρουσιάστηκε ως ημερολόγιο

2ratio του όγκου (Cy5, κόκκινο) /φυσιολογικό (Cy3, φυσιολογικό) εντάσεις. Values≥1.0 (2-φορές αλλαγή) ήταν ενδεικτικό της αυξημένης μεθυλίωσης (υπερμεθυλίωσης) και values≤-1.0 ήταν ενδεικτική της μειωμένης μεθυλίωσης (υπομεθυλίωση) σε όγκο. Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε με τη χρήση του CIMminer πρόγραμμα (https://discover.nci.nih.gov/cimminer/) με υπολογισμό για την απόσταση, χρησιμοποιώντας την απόλυτη συσχέτιση και πλήρη σύνδεση ομαδοποίηση.

Η στατιστική ανάλυση

Η σημασία των διαφορών που παρατηρούνται μεταξύ των μέσων εκτιμήθηκε με τη χρήση t-test δύο όψεων του Student. P αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε κατά τη σύγκριση της ομοιότητας για τρεις ή περισσότερες ομάδες. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με Statistica πακέτο λογισμικού (StatSoft, Tulsa, OK).

Αποτελέσματα

LINE-1 μεθυλίωση σε ορθοκολικό καρκίνωμα συσχετίζεται με MSI κατάσταση

Εμείς εφαρμοστεί η μέθοδος Pyrosequencing για τον προσδιορισμό της πυκνότητας μεθυλίωση στον υποκινητή LINE-1. Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε επικύρωσε την εφαρμογή αυτής της μεθόδου για την αξιολόγηση του γονιδιώματος σε επίπεδο περιεχομένου μεθυλίωση [21], [22] και έδειξε μία ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ LINE-1 μεθυλίωση και LC-MS (υγρή χρωματογραφία /φασματομετρία μάζας) δεδομένα. Έτσι, LINE-1 επίπεδα μεθυλίωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο του γονιδιώματος σε επίπεδο απομεθυλίωση. Ο χάρτης του LINE-1 προαγωγέα με εκκινητές και θέσεων ανιχνευτή παρουσιάζεται στην εικόνα 1Α. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην κατεργασία όξινου θειώδους του DNA το οποίο τροποποιεί μη μεθυλιωμένη κυτοσίνες σε θυμιδίνες ενώ μεθυλιωμένα κυτοσίνες είναι μη-αντιδραστικά. PCR του κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA αποτελέσματα σε πισίνες των προϊόντων που περιέχουν τόσο μεθυλιωμένου και μη μεθυλιωμένου DNA που μπορούν να διακριθούν και να ποσοτικοποιηθεί με τη χρήση της μεθόδου Pyrosequencing. Αντιπροσωπευτικά πυρογραμμάτων LINE-1 παρουσιάζονται στο Σχήμα 1Β. Ερευνήσαμε πέντε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου και πέντε δείγματα DNA λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος (PBL) από υγιείς δότες για τον προσδιορισμό των φυσιολογικά επίπεδα LINE-1 μεθυλίωσης. Η μεθυλίωση LINE-1 ήταν παρόμοια στις δύο αυτές διαφορετικούς ιστούς, με μέσο όρο 71,9% σε PBL και 70,8% σε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου.

Η ποσοτικοποίηση της μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση διθειώδους LINE-1 PCR και Pyrosequencing. Α) Διάγραμμα της νήσου προαγωγού CpG (GenBank αριθμός πρόσβασης Νο. X58075, θέση νουκλεοτιδίου 108-520 bp) που συνδέονται με το πλήρους μήκους LINE-1. Κάθε κάθετη γραμμή αντιπροσωπεύει έναν απλό χώρο CpG. Το 3’UTR, 5’UTR και δύο ORFs του LINE-1 δείχνονται στην κορυφή. Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για διθειώδες PCR (R-Biot και F) και Pyrosequencing (S). Β) Αντιπροσωπευτικά LINE-1 πυρογραμμάτων για τα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές (ΜΒ-468 και SKBR3). Η πυρόγραμμα ποσοτικοποιεί C για μετουσιωμένο και Τ για μη μεθυλιωμένου DNA. Η σκιασμένη περιοχή αντιπροσωπεύει την τοποθεσία CpG ποσοτικοποιήθηκε στη γραμμή 1-στοιχεία, και η επί τοις εκατό μεθυλίωσης φαίνεται πάνω από την κορυφή.

Η

επόμενο αξιολογούνται LINE-1 μεθυλίωσης σε εξήντα πρωτογενή ορθοκολικά καρκινώματα και τους κανονική ταιριάζουν βλεννογόνου και συσχετίζονται αυτό με τα δημογραφικά, clinopathologic και μοριακή μεταβλητές (Πίνακας 1). Ορθοκολικών όγκων κατά μέσο όρο 54,9% μεθυλίωση (SEM = 1.1%) έναντι 64,3% (SEM = 0.5%) μεθυλίωση σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό, που αντιστοιχεί σε μια μέση σχετική απομεθυλίωση 14,6% (Ρ & lt? 0.001). Σε σύγκριση με LINE-1 μεθυλίωσης σε φυσιολογικό κόλον, η οποία κατά μέσο όρο 70,8% (SEM = 1,3%), τόσο του όγκου και δίπλα στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου όγκου απομεθυλιώνεται, με ένα αντίστοιχο μέσο όρο 22,5% και 9,2% σχετική απομεθυλίωση (Ρ = 0,001). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη LINE-1 μεθυλίωση βρέθηκαν από την ηλικία ή το φύλο, αλλά μια σημαντική διαφορά βρέθηκε για την πλευρά, με χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε φυσιολογικά παρακείμενα δεξιό κόλον (63,0%) σε σύγκριση με το αριστερό κόλον (65,5%, P = 0,016) και στάδιο, με χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης για όγκους σε στάδια 3 και 4 (51,9%) σε σύγκριση με τα στάδια 0 έως 2 (57,1%, Ρ = 0,028).

Η

Τα πρωτογενή ορθοκολικό όγκοι παρουσίασαν υψηλή διακύμανση σε LINE-1 μεθυλίωσης μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων (Σχήμα 2Α), και την διαστρωμάτωση των εν λόγω ορθοκολικών όγκων και φυσιολογικό γειτονικό ιστό τους αποκαλύπτει ένα μη ομοιόμορφη μεταβλητότητα στη LINE-1 μεθυλίωση. CRC με σποραδικές μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI), οι περισσότερες εκ των οποίων οφείλονται σε μεθυλίωση υποστηρικτής MLH1, δεν έδειξε καμία διαφορά στην LINE-1 μεθυλίωσης μεταξύ της κανονικής γειτονικών και του καρκίνου ιστούς (62,6% ± 1,1% έναντι 60,6% ± 1,7%, p = 0,33) , με μέση μείωση στην μεθυλίωση μόνο 3,12% ± 2,3%. Αντιθέτως MSI-περιπτώσεις είχαν σημαντική μείωση στην LINE-1 υπομεθυλίωση μεταξύ της κανονικής γειτονικά και καρκίνος ιστούς (64,6% ± 0,5% έναντι 53,8% ± 1,2%, Ρ & lt? 0,0001). Προφανώς, LINE-1 υπομεθυλίωση ήταν ανεξάρτητη από το καθεστώς CIMP, αφού CIMP + /MSI-περιπτώσεις και CIMP-υποθέσεις ήταν εξίσου μεθυλιωμένος (15,4% ± 2,7% έναντι 17,7% ± 2,7%, p = 0,56). Αυτή η άνιση κατανομή της σχετικής απομεθυλίωση με την παρουσία των μικροδορυφόρων αστάθειας εκπροσωπείται στο Σχήμα 2Β, το οποίο απεικονίζει τη διατήρηση των LINE-1 μεθυλίωσης στο CIMP + /MSI + όγκους σε σύγκριση με την κανονική εμφάνιση βλεννογόνο, ενώ CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI- υφίστανται σοβαρές υπομεθυλίωση, με μία υπόθεση παρουσιάζει μια ακραία σχετική διμεθυλιοποίηση (61,3%).

Διαφορικό LINE-1 μεθυλίωσης μεταξύ των ομάδων CIMP /MSI σε δείγματα καρκίνου του παχέος πρωτογενή (CRCs). Α) DNA του παχέος όγκου και φυσιολογικό να εμφανίζονται δίπλα βλεννογόνο τους από εξήντα ασθενείς αξιολογήθηκαν για LINE-1 μεθυλίωσης. Αυτοί οι όγκοι είχαν προηγουμένως αξιολογήθηκαν για CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP), χρησιμοποιώντας ένα πάνελ ανάλυση μονού αντιγράφου γονιδίων μεθυλίωση, και αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) κατάσταση, με αποτέλεσμα την ταυτοποίηση τριών ομάδων CIMP /MSI. Σε κανονική εμφάνιση βλεννογόνο (κορυφή) μικρή διακύμανση στη LINE-1 μεθυλίωσης παρατηρείται μεταξύ των δειγμάτων και των ομάδων CIMP /MSI (μέσος όρος μεθυλίωση = 64,3%), ενώ σε όγκο (κάτω) διάφορα δείγματα υποβάλλονται σε υψηλή LINE-1 απομεθυλίωση (25/60 όγκου δείγματα έχουν πυκνότητα μεθυλίωσης παρακάτω 55%), πιο αξιοσημείωτη στην CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI-ομάδες. Β) Σχετική LINE-1 απομεθυλίωση σε CRCs. Σχετική απομεθυλίωση υπολογίστηκε ως η ποσοστιαία αλλαγή του LINE-1 μεθυλίωσης σε όγκο σε σύγκριση με φυσιολογικά εμφανίζονται βλεννογόνο του. Τόσο CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI-δείγματα που παρουσιάζονται κατά μέσο όρο 16% απομεθυλίωση για LINE-1, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές για τους + /MSI + δείγματα CIMP. Για την ομάδα CIMP +, 4-9% αύξηση της πυκνότητας μεθυλίωσης για LINE-1 παρατηρήθηκε για ένα μικρό κλάσμα των δειγμάτων, οι περισσότεροι από αυτούς που προσδιορίζονται ως + /MSI + δείγματα CIMP.

Η

Η μεθυλίωση ανάλυση επαναλαμβανόμενα στοιχεία χρησιμοποιώντας MCA /CpG νησί μικροσυστοιχίες

Εκτός από LINE-1 ανάλυση μεθυλίωσης με όξινο θειώδες PCR και Pyrosequencing, αξιολογήσαμε επίσης την κατάσταση μεθυλίωσης των επαναλαμβανόμενων στοιχείων, συμπεριλαμβανομένων LINE (μακρύ διάσπαρτες πυρηνικά στοιχεία), ΣΙΝΕ (σύντομη διανθίζονται πυρηνική στοιχεία), LTR (μακρές τερματικές επαναλήψεις), DNA και δορυφορική επαναλήψεις, με σύζευξη MCA (μεθυλιωμένη CpG νησίδα ενίσχυση? 20) σε ένα νησί μικροσυστοιχία CpG που περιέχουν συνολικά 770 σημεία που αντιπροσωπεύουν επαναλαμβανόμενο DNA διαφορετικών τάξεων. Η πρώτη ανάλυση έγινε με την καταμέτρηση υπερμεθυλίωση (log

2ratio & lt? 1,0) και μεθυλιωμένος (log

2ratio & lt? -1.0) Επαναλήψεις χωρίζονται ανάλογα με τις διαφορετικές τάξεις τους (Εικόνα 3Α). Για την CIMP + /MSI + δείγματα, το καθένα έναν από τους κλάδους επαναλήψεις εκτός δορυφορική επαναλήψεις βρέθηκαν να εμπλουτισθεί σε υπερμεθυλίωση στο DNA του όγκου σε σύγκριση με φυσιολογικά παρακείμενα βλεννογόνο (υπερμεθυλίωση /υπομεθυλίωση = 2,4 φορές σε μέσο όρο). Ο εμπλουτισμός για υπερμεθυλιωμένων ακολουθίες μειώθηκε απότομα το CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI- (0,88-και 0,71 φορές αντίστοιχα). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι υπάρχει μια ισχυρή πίεση για τη συντήρηση και /ή απο-novo μεθυλίωση των επαναλαμβανόμενων στοιχείων στην ομάδα MSI +. Επικύρωση της μεθόδου μικροσυστοιχιών μας έγινε με σύγκριση των αποτελεσμάτων για την γραμμή-1 για να Pyrosequencing δεδομένα με τον ίδιο παχέος δείγματα. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι οι όγκοι με το χαμηλότερο LINE-1 απομεθυλίωση από Pyrosequencing ανάλυση έδειξε την υψηλότερη εμπλουτισμού για επαναλήψεις υπερμεθυλιωμένων LINE (Σχήμα 3Β), ενώ η αντίστροφη κατάσταση που παρατηρείται για όγκους με την υψηλότερη LINE-1 απομεθυλίωση. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι η ανάλυση μικροσυστοιχιών μας είναι μια κατάλληλη τεχνική για να αποκτήσετε πρόσβαση αλλαγές μεθυλίωσης σε επαναλαμβανόμενα στοιχεία.

Methylated CpG νησί amplication (MCA) /CpG νησί μικροσυστοιχιών για επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA. Α) Σχετική αφθονία υπερμεθυλιωμένων και μεθυλιωμένος επαναλήψεις για κάθε ομάδα CIMP /MSI. Παρατηρήθηκε μία αύξηση του αριθμού των υπερμεθυλιωμένων σε σύγκριση με μεθυλιωμένος επαναλήψεις για την ομάδα CIMP + /MSI +, και μια σταδιακή αλλαγή στην εκπροσώπηση των υπερμεθυλιωμένων και μεθυλιωμένος επαναλήψεων παρατηρήθηκε για τις CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI-ομάδες, με αποτέλεσμα την υπεραντιπροσώπευση της μεθυλιωμένος επαναλήψεων σε μικροδορυφόρων σταθερές ομάδες. Β) Επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών για επαναλήψεις LINE. Σημειώστε ότι CIMP /MSI ομάδες με υψηλότερη απομεθυλίωση, όπως καθορίζεται από το όξινο θειώδες-Pyrosequencing των LINE-1, παρουσίασε επίσης μια αύξηση του αριθμού των μεθυλιωμένος LINE επαναλαμβάνει με ανάλυση μικροσυστοιχιών, όπως αντιπροσωπεύεται από μια μικρότερη αναλογία υπερ /υπομεθυλίωση. Γ) Ανεξέλεγκτη ιεραρχική συσταδοποίηση εφαρμόστηκε στα δεδομένα μεθυλίωση από ένα σύνολο 770 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA απέναντι δεκαέξι όγκους παχέος εντέρου σε συνδυασμό με την κανονική εμφανίζονται DNA βλεννογόνο τους. Οι όγκοι του παχέος δενδρόγραμμα εμφανίζεται, και το αναγνωριστικό δείγματος για κάθε περίπτωση περιλαμβάνεται στην δεξιά. Οι τερματικό κλάδοι είναι χρώμα που κωδικοποιείται να εκπροσωπεί την κατάσταση CIMP /MSI του δείγματος όγκου (κόκκινο, CIMP + /MSI +? Μπλε, CIMP + /MSI-? Πράσινο, CIMP- /MSI-). Συνολικά, τα δείγματα της ίδιας ομάδας CIMP /MSI συγκεντρωμένα μαζί, ενισχύοντας τη διαφορετική μοίρα μεθυλίωσης για επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA μεθυλίωση σε κάθε ομάδα. LINE, πολύ διάσπαρτες πυρηνικά στοιχεία? ΣΙΝΕ, βραχυπρόθεσμα διανθίζονται πυρηνικά στοιχεία, LTR, μακριές τερματικές επαναλήψεις? επαναλήψεις DNA? Δορυφορική επαναλήψεις.

Η

Τέλος, χρησιμοποιώντας την κανονικοποιημένη ημερολόγιο

2ratio τιμές των επιμέρους σημεία, πραγματοποιήσαμε χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση για να αποκαλύψει τις ομοιότητες μεταξύ των 16 παχέος περιπτώσεις όγκων που μελετήθηκαν. Το προκύπτον σύμπλεγμα χάρτη εικόνας έδειξε μια καλή συμφωνία με την αναμενόμενη διαχωρισμό των μεμονωμένων δειγμάτων με γνωστές κατάσταση CIMP /MSI (Σχήμα 3C), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι υπογραφές μεθυλίωση αυτών των όγκων δεν περιορίζονται σε γονίδια μονού αντιγράφου, αλλά επίσης περιλαμβάνουν επαναλαμβανόμενα στοιχεία DNA.

υπομεθυλίωση του LINE-1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου παρουσιάζει ιστο-ειδική μεταβλητότητα

για να επαληθεύσετε εάν η μεταβλητότητα στο γονιδίωμα-ευρεία μεθυλίωση περιορίζεται σε πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνωμα ή συμβαίνει και σε άλλους τύπους όγκων, εφαρμόσαμε την μέθοδο με όξινο θειώδες Pyrosequencing LINE-1 έως εξήντα μία κυτταρικές γραμμές καρκίνου από οκτώ διαφορετικούς ιστούς τύπων (μαστού, του κεντρικού νευρικού συστήματος, κόλον, λευχαιμία, πνεύμονα, των ωοθηκών, του προστάτη και του ήπατος). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε μία αξιοσημείωτη μείωση στην LINE-1 μεθυλίωση στις περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν (Σχήμα 4). Συνολικά, 50/61 δοκιμάζονται κυτταρικές σειρές καρκίνου ήσαν υπο-μεθυλιωμένα για LINE-1, με σχετική απομεθυλίωση 15% ή περισσότερο (απόλυτη πυκνότητα μεθυλίωσης κάτω από 60%) σε σύγκριση με λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Ομοίως με πρωτογενείς ορθοκολικούς όγκους, αυτοί οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν υψηλή μεταβλητότητα LINE-1 μεθυλίωσης, που κυμαίνονται από 6,5% (Κ562, μία κυτταρική γραμμή CML με χαρακτηριστικά ερυθρολευχαιμίας) έως 74,2% (CEM, μια οξεία λεμφοβλαστική κυτταρική γραμμή λευχαιμίας). Υπάρχει μια εμφανής ιστο-ειδικότητα για απομεθυλίωση? τα χαμηλότερα επίπεδα LINE-1 μεθυλίωση παρατηρήθηκαν στο ήπαρ (24,0%), ακολουθούμενη από CNS (28,9%), του μαστού (29,8%), του πνεύμονα (35,1%), προστάτη (41,9%), ωοθήκη (49,7%), του παχέος εντέρου (46,7%) και λευχαιμία (56,1%). Ενώ ένα ενδιαφέρον εύρημα, προειδοποιούν γενίκευση των δεδομένων, διότι: (i) LINE-1 μεθυλίωση δεν έχει μελετηθεί για φυσιολογικούς ιστούς εκτός του παχέος εντέρου και του περιφερικού αίματος? και (ii) ένας μικρός αριθμός κυτταρικών σειρών αναλύθηκαν για το ήπαρ και ο καρκίνος του προστάτη.

LINE-1 μεθυλίωσης μεταβλητότητα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. δείγματα DNA κανονικών λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος, φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου και εξήντα μία κυτταρικές γραμμές από οκτώ τύπους διαφορετικούς ιστούς ερευνήθηκαν για LINE-1 μεθυλίωση χρησιμοποιώντας διθειώδους PCR ακολουθούμενη από Pyrosequencing. Οι φυσιολογικοί ιστοί που παρουσιάζονται υψηλά επίπεδα LINE-1 μεθυλίωσης (άνω του 70% κατά μέσο όρο), και μια μεγάλη διακύμανση στα επίπεδα μεθυλίωσης παρατηρήθηκε για καρκινικές κυτταρικές σειρές, με ελάχιστη πυκνότητα μεθυλίωσης του 6,5% που παρατηρήθηκε για το λευχαιμίας κυτταρική γραμμή Κ562. Λαμβάνεται ως ομάδα, κυτταρικές γραμμές λευχαιμίας ήταν μέτρια απομεθυλιώνεται (μέσος όρος 56,1%), ακολουθούμενη από την ωοθήκη, κόλον, προστάτη και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (παραλλαγή από 49,7% έως 35,1%). Κεντρικό νευρικό σύστημα (CNS), του μαστού και οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ήπατος ενός δοκιμάστηκαν ήταν βαθιά απομεθυλιώνεται (κάτω του 30% κατά μέσο όρο). Διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει κατά μέσο όρο μεθυλίωση σε φυσιολογικούς μάρτυρες.

Η

Ένα άλλο σημαντικό εύρημα είναι ότι ορισμένες κυτταρικές σειρές δείχνουν ακραία υπομεθυλίωση. Ενώ λευχαιμίες σε γενικές γραμμές τα σημερινά επίπεδα LINE-1 μεθυλίωση ίσο με PBL, 3/15 κυτταρικές σειρές έχουν περισσότερο από 50% σε σχέση με απομεθυλίωση (Κ562, HEL και TF-1). Μια παρόμοια κατάσταση παρατηρείται και σε άλλους ιστούς, ήταν «πρωταθλητές απομεθυλίωση» κυτταρικές σειρές αναγνωρίστηκαν (SKBR3 στο στήθος και OVCA420 στη ωοθηκών). Μια ελκυστική εξήγηση είναι ότι τα γονίδια που εμπλέκονται στη συντήρηση μεθυλίωσης του DNA που λείπουν ή μεταλλάσσεται σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

Συζήτηση

μεθυλίωσης του DNA διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στα φυσιολογικά κύτταρα, να εμπλέκονται στην απενεργοποίηση Χ-χρωμοσώματος , αποτύπωση και την καταστολή των επαναληπτικών στοιχείων όπως ρετρομεταθετόνια και ενδογενείς ρετροϊούς [23], [24]. Ταυτόχρονα, CpG νησίδες στην περιοχή προαγωγού των γονιδίων μονού αντιγράφου είναι μεθυλίωσης-free, η οποία είναι σημαντικό να επιτραπεί η μεταγραφή. Στον καρκίνο, μια αντίστροφη σενάριο βρεθεί, με μονό αντίγραφο CpG νησί υπερμεθυλίωση και γονιδιώματος-ευρεία υπομεθυλίωση. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ αυτών των δύο παθολογικά γεγονότα, χρησιμοποιώντας καρκινικές κυτταρικές σειρές από διάφορους ιστούς-τύπων και πρωτογενείς όγκους του παχέος ως μοντέλο.

Ενώ γονιδιώματος-ευρεία απομεθυλίωση και μόνο-αντίγραφο CpG νησί υπερμεθυλίωση συμβαίνουν στον καρκίνο, είναι ελάχιστα κατανοητή αν οι δύο αυτές αλλαγές συνδέονται μεταξύ τους. Τα στοιχεία μας με βάση τα επίπεδα μεθυλίωσης των επαναλαμβανόμενων στοιχείων, χρησιμοποιώντας τόσο μια ειδική δοκιμασία για ανάλυση LINE-1 μεθυλίωσης και μια πλατφόρμα μικροσυστοιχία η οποία περιλαμβάνει περίπου 800 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA από διαφορετικές κατηγορίες, δείχνουν ότι οι όγκοι με τα υψηλότερα επίπεδα των μη-φυσιολογικών υπερμεθυλίωσης (CIMP + /MSI + ), έδειξε επίσης τα χαμηλότερα επίπεδα γονιδιώματος σε επίπεδο υπομεθυλίωση, σε σύγκριση με την κανονική παρακείμενο βλεννογόνο. Πράγματι, αυτοί οι όγκοι εμφάνισαν συχνή αύξηση στην μεθυλίωση του επαναληπτικών στοιχείων, όπως αποκαλύπτεται από τόσο ανάλυση LINE-1 και μικροσυστοιχίας. Είναι ενδιαφέρον, CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI-έδειξαν υψηλότερα επίπεδα LINE-1 υπομεθυλίωση, ενισχύοντας τη μοναδικότητα του + /MSI + όγκους CIMP. Παρά το γεγονός ότι, CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI-ομάδες ήταν εξίσου μεθυλιωμένος για LINE-1, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αστάθεια μικροδορυφορικού είναι η κύρια μοριακή μεταβολή που σχετίζονται με την έλλειψη LINE-1 υπομεθυλίωση. Τα ευρήματα αυτά είναι σύμφωνη με τις προηγούμενες εκθέσεις της έλλειψης παγκόσμιας υπομεθυλίωσης σε μικροδορυφορικού ασταθείς όγκους [15]. Η συναίνεση ερμηνεία αυτών των δεδομένων είναι ότι όγκους παχέος εντέρου προέρχονται από δύο διαφορετικές πορείες εξέλιξης: παγκόσμια υπερμεθυλίωση με μικροδορυφόρων αστάθεια και την παγκόσμια υπομεθυλίωσης με το χρωμόσωμα αστάθεια. Ωστόσο, είναι απαραίτητο να σημειωθεί ότι η ομάδα CIMP + /MSI + όχι μόνο χαρακτηρίζεται από αστάθεια μικροδορυφόρου, αλλά και για μια υψηλότερη συχνότητα υπερμεθυλιωμένων νησιών CpG. Πράγματι, η αιτιολογικός παράγοντας της παρατηρούμενης αστάθειας μικροδορυφόρου είναι ο αποκλειστικός υπερμεθυλίωση MHL1 σε αυτούς τους όγκους, και άλλα γονίδια, όπως το ρ16 και THBS1 επίσης απαντώνται συχνότερα σε μεθυλιωμένα CIMP + /MSI + σε σύγκριση με CIMP + /MSI- [25]. Επιπλέον, η ανάλυση μικροσυστοιχιών των επαναλαμβανόμενων DNA υποστήριξε την ύπαρξη μιας ομάδας όγκων (CIMP + /MSI +) κάτω από ισχυρή πίεση για την de novo μεθυλίωση των δύο νησιού υποστηρικτές CpG και επαναλαμβανόμενα στοιχεία και εκ νέου διαβάθμιση των όγκων του παχέος εντέρου σε γνωστές ομάδες τους CIMP /MSI . Αξίζει να σημειωθεί ότι, CIMP + /MSI-και CIMP- /MSI-ως επί το πλείστον συγκεντρωμένα εκτός, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε κάποια ειδικά χαρακτηριστικά της κάθε ομάδας δεν έχουμε δει από LINE-1 όξινο θειώδες-pyrosequecing. Για παράδειγμα, ΣΙΝΕ επαναλήψεις δείχνουν μια σταδιακή αλλαγή στην υπερμεθυλίωση /υπομεθυλίωση σύμφωνα με την CIMP /MSI, με CIMP + /MSI-είναι μια ενδιάμεση ομάδα. Επίσης, δορυφορική επαναλήψεις (που αντιπροσωπεύεται κυρίως από κεντρομερική και pericentromeric επαναλήψεις) έδειξε ένα πιο σταθερό μοτίβο μεθυλίωσης και ίσως σχετίζονται με το λειτουργικό τους ρόλο στο χρωμόσωμα διαχωρισμού κατά την κυτταρική διαίρεση. Αντίθετα, Ehrlich et al. [18] διαπίστωσε ότι υπομεθυλίωσης και υπερμεθυλίωση είναι ανεξάρτητες σε καρκίνους των ωοθηκών, που βασίζεται στην ικανότητα αυτών των αλλαγών για την πρόβλεψη του βαθμού κακοήθειας στους όγκους των ωοθηκών. Ωστόσο, οι άμεσες συγκρίσεις των υπομεθυλίωσης σε καρκίνους με και χωρίς υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης (δηλ CIMP) δεν μελετήθηκαν. Περισσότερες μελέτες είναι αναγκαίες για να απαντήσει γιατί διαφορά επαναλαμβανόμενα στοιχεία τάξεις έχουν διαφορετική ευαισθησία στο DNA υπομεθυλίωση. Σε γενικές γραμμές, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας δείχνουν ότι ορισμένες κατηγορίες επαναλαμβανόμενα στοιχεία μπορεί να υπόκεινται στις ίδιες πιέσεις μεθυλίωσης που ασκείται σε CpG νησίδες στις CIMP καρκίνους +.

Χρησιμοποιώντας LINE-1 μεθυλίωσης ως υποκατάστατο για την παγκόσμια απομεθυλίωση, βρήκαμε μια μεγάλη διακύμανση στα επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών, με εξειδίκευση ιστού. Μερικά ιστούς, όπως του μαστού, του κεντρικού νευρικού συστήματος και των πνευμόνων υφίστανται σημαντική LINE-1 απομεθυλίωση σε καρκίνους σε μια αρκετά ομοιογενή τρόπο. Σε άλλες δοκιμάστηκαν ιστούς, όπως το κόλον και λευχαιμία, μερικές κυτταρικές σειρές είχαν επίπεδα μεθυλίωσης παρόμοιες με αυτές που δείχνουν φυσιολογικό κόλον και το αίμα ιστούς, ενώ άλλοι βαθιά απομεθυλιώνεται. Παρά το γεγονός ότι μια μελέτη παρακολούθησης, συμπεριλαμβανομένων των κανονικών δειγμάτων από το ίδιο μελετημένα ιστούς καλείται να επιβεβαιώσει αυτήν την παρατήρηση, την ανάλυση που πραγματοποιήθηκε από Chalichagorn et al. [26] δεν έδειξε αξιοσημείωτη διαφορά στη μεθυλίωση μεταξύ κανονικών δειγμάτων από διάφορους ιστούς. Παρομοίως με τα αποτελέσματά μας, μια προηγούμενη μελέτη από Florl et al. [27] είχε βρει μια αισθητή διαφορά μεταξύ της ουροδόχου κύστης και των νεφρών καρκινώματα, με μόνο το πρώτο εκθεσιακό LINE-1 απομεθυλίωση. Η μεγάλη διακύμανση στις παγκόσμιες υπομεθυλίωση παρατηρείται εμπλέκει μη στοχαστική μηχανισμοί για αυτό το ελάττωμα, και προτείνει επίσης ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για τους όγκους με σοβαρή υπομεθυλίωση. Πράγματι, πρόσφατα πειράματα δείχνουν ότι ο σχηματισμός όγκων επάγεται σε ποντίκια μετά παγκόσμια γενωμική υπομεθυλίωση [28], [29]. Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία διαγονιδίου όρους για τη μείωση της έκφρασης της DNMT1, Gaudet et al. [28] που παρατηρήθηκε αυθόρμητος σχηματισμός των Τ-κυττάρων λεμφώματα με απόκτηση πρόσθετων γονιδιωματικών μεταβολών. Holm et al. [29] που δημιουργείται ποντίκια που μιμούνται απώλεια αποτύπωσης (LOI), που υποτίθεται ότι οφείλεται σε υπομεθυλίωση, και σε αυτά τα ζώα παρατηρήθηκε επίσης σχηματισμός όγκων. Τα αίτια αυτών των διαφορικών απομεθυλίωσης μεταξύ καρκίνος διαφορετικών ιστών είναι άγνωστα, και τα δύο γενετικά και έκθεσης παράγοντες μπορεί να παίζουν ρόλους σε αυτό. Ριζική υπομεθυλίωση, όπως παρατηρείται στην κυτταρική σειρά Κ562 και άλλοι θα μπορούσαν να σχετίζονται με συγκεκριμένες απώλεια της λειτουργίας των γονιδίων που ελέγχουν τη μεθυλίωση των επαναληπτικών στοιχείων. Υποψήφια γονίδια είναι εκείνα που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που έχουν περιγραφεί να ασκήσουν λειτουργία ως «φύλακες ετεροχρωματίνη». Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη LSH, μέλος των SnF2 /οικογένεια ελικάση πρωτεΐνες, είναι απαραίτητη για γονιδιώματος σε επίπεδο μεθυλίωσης. knockout ποντίκια για το γονίδιο Lsh εμφανίζεται περιγεννητικής θνησιμότητας και έδειξε αξιοσημείωτη απομεθυλίωση των επαναλαμβανόμενων στοιχείων που είναι ανεξάρτητη από αλλαγές στα επίπεδα του RNA του DNMT1 [30].

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το γονιδίωμα-ευρεία υπομεθυλίωσης είναι εξαιρετικά μεταβλητή σε καρκινικά κύτταρα, όπως είναι μονού αντιγράφου CpG νησί υπερμεθυλίωση. Αμφότερες οι αλλοιώσεις μπορεί να βρεθεί σε όγκους και ο καθένας μπορεί να προωθήσει ογκογένεση με ανεξάρτητες διαδικασίες. Η μελέτη μας παρέχει επίσης στοιχεία για μια ισχυρή αντίστροφη σχέση μεταξύ της παγκόσμιας υπομεθυλίωσης και μικροδορυφορικού αστάθειας στον καρκίνο.