Αφηρημένο

Ιστορικό

ομοπεδίου-αλληλεπιδρούν πρωτεϊνική κινάση 2 (HIPK2) είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που εκμεταλλεύεται δραστηριότητα κινάσης της να διαμορφώνει το κλειδί μοριακών οδών στον καρκίνο να συγκρατήσει την ανάπτυξη του όγκου και επάγουν απόκριση θεραπείες. Για παράδειγμα, HIPK2 knockdown επάγει αυξητική ρύθμιση του ογκογόνου υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) δραστηριότητας που οδηγεί σε ιδιοσυστατική υποξική και αγγειογόνο φαινότυπο με αυξημένο ανάπτυξης όγκου

in vivo

. αναστολή HIPK2, ως εκ τούτου, απελευθερώνει οδούς που οδηγούν στην παραγωγή των προ-φλεγμονωδών μορίων όπως αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) ή η προσταγλανδίνη Ε2 (PGE

2). Tumor-φλεγμονωδών μεσολαβητών που παράγονται εκτός από την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου και η ανάπτυξη αγγειακών μπορεί να επιτρέπει διαφυγή του κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων. Έτσι, δενδριτικά κύτταρα (DCs) δυσλειτουργία που επάγεται από τα μόρια όγκο που παράγεται, μπορεί να επιτρέψει καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν ανοσοεπιτήρηση. Εδώ αξιολογείται το μοριακό μηχανισμό της PGE

2 παραγωγή μετά την εξάντληση HIPK2 και πώς να το διαμορφώσουν.

Μεθοδολογία /Κύρια ευρήματα

Θα δείξουμε ότι HIPK2 νοκ ντάουν στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ως αποτέλεσμα της κυκλοοξυγενάσης -2 (COX-2) προς τα πάνω ρύθμιση και COX-2 που προέρχεται PGE

2 γενιάς. Σε μοριακό επίπεδο, η COX-2 προς τα άνω ρύθμιση εξαρτάται από δραστικότητα HIF-1. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η θεραπεία με ψευδάργυρο αναστέλλει τη δράση του HIF-1. Εδώ, η συμπλήρωση ψευδαργύρου να HIPK2 εξαντλημένο κύτταρα που αναστέλλονται HIF-1-επαγόμενη έκφραση COX-2 και την παραγωγή PGE

2 /VEGF. Στο μεταφραστικό επίπεδο, ενώ προσαρμοσμένα μέσα τόσο ελέγχου siRNA και HIPK2 εξαντληθεί κύτταρα αναστέλλεται ΑΧ ωρίμανσης, προσαρμοσμένα μέσα από HIPK2 εξαντληθεί κύτταρα μόνο ψευδαργύρου-αντιμετωπίζονται αποτελεσματικά αποκατασταθεί ΑΧ ωρίμανσης, θεωρείται ως η έκφραση συν-διεγερτικών μορίων CD80 και CD86, κυτταροκινών IL- 10 απελευθέρωση και φωσφορυλίωση STAT3

Συμπέρασμα /Σημασία

Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι:. 1) που προκαλείται HIPK2 νοκ ντάουν COX-2 προς τα πάνω ρύθμιση, κυρίως ανάλογα με τη δραστηριότητα του HIF-1? 2) θεραπεία με ψευδάργυρο μειωτικά HIF-1-επαγόμενη COX-2 και ανέστειλε PGE

2 παραγωγή /VEGF? και 3) τη θεραπεία του ψευδαργύρου HIPK2 εξαντληθεί τα κύτταρα που αποκαθίστανται ΑΧ ωρίμανση

Παράθεση:. Garufi Α, Pistritto G, Ceci C, Di Renzo L, Santarelli R, Faggioni A, et al. (2012) Στόχευση COX-2 /PGE

2 Διαδρομή στην HIPK2 Νοκ ντάουν Cancer Cells: Επιπτώσεις στην ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (11): e48342. doi: 10.1371 /journal.pone.0048342

Επιμέλεια: Kjetil Tasken, Πανεπιστήμιο του Όσλο, Νορβηγία

Ελήφθη: 15 του Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 24 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Garufi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Ιταλική Ένωση για την Έρευνα του Καρκίνου (AIRC) να GDO (αρ. 11377) και AF (n. 10265). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ομοπεδίου αλληλεπιδρούν πρωτεϊνική κινάση 2 (HIPK2) είναι ένα πολυλειτουργικό κινάσης του οποίου η δραστηριότητα συγκρατεί την εξέλιξη του όγκου. HIPK2 φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί oncosuppressor ρ53 για αποπτωτική λειτουργία σε απόκριση σε φάρμακα [1], [2]. HIPK2 καταστέλλει επίσης οδών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου, όπως Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως, μέσω καταλυτικής λειτουργίας δραστηριότητας και μεταγραφή καταστολής της [3], [4]. Πιο πρόσφατα, βρήκαμε ότι HIPK2 αναστέλλει την υποξία παράγοντας 1α (HIF-1α) υπομονάδα σε μεταγραφικό επίπεδο. HIF-1 είναι ένας ετεροδιμερικός παράγοντας μεταγραφής που επάγει την μεταγραφή του πάνω από 60 γονίδια που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, το μεταβολισμό της γλυκόζης και εισβολή [5]. HIF-1 αποτελείται από το HIF-1β υπομονάδα, εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε κύτταρα, και το οξυγόνο ευαίσθητη HIF-1α υπομονάδας. Αυξημένες HIF-1α επίπεδα απαντώνται συχνά σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους και διεγείρονται από χαμηλό οξυγόνο, αλλά και από τις γενετικές αλλαγές. Από αυτή την άποψη, HIPK2 knockdown επάγει HIF-1α προς τα πάνω ρύθμιση με αυξημένη δραστικότητα HIF-1 που οδηγεί σε αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού (VEGF) παραγωγή, την αγγειογένεση των όγκων και χημειοαντίσταση [6], [7]. Σε μια προσπάθεια να στοχεύσουν δραστικότητα HIF-1, μπορούμε προηγουμένως αποδειχθεί ότι τα ιόντα ψευδαργύρου επιτρέπουν αποικοδόμηση πρωτεΐνης HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε καταστολή του HIF-1 μονοπάτι

in vitro

και

in vivo

[8] με την αποκατάσταση της χημειοευαισθησίας [9].

Άλλα από επαγωγή της έκφρασης του VEGF, HIPK2 knockdown οδηγεί σε Ε2 βιοσύνθεση αυξημένη προσταγλανδίνης (PGE

2), η οποία συσχετίζεται με την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[10]. PGE

2 είναι η πιο άφθονη προσταγλανδίνης βρέθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ευνοεί την ανάπτυξη του όγκου με διέγερση του πολλαπλασιασμού, της αγγειογένεσης, και διεισδυτικότητα, και με αναστολή της απόπτωσης [11]. PGE

2 ενεργοποιεί συστατικά του ογκογόνου συστήματος σηματοδότησης Wnt οδηγώντας σε σταθεροποίηση και την ενεργοποίηση των β-κατενίνης ως παράγοντας μεταγραφής για την επαγωγή της έκφρασης διαφόρων γονιδίων, περιλαμβανομένων της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), c-myc, κυκλίνη D1, και ΡΡΑΚδ που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου [12].

Η παραγωγή των προσταγλανδινών μέσω του COX-2 είναι ένα σημαντικό μονοπάτι στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά και άλλων καρκίνων [13]. COX-2, μία επαγώγιμη μορφή κυκλοοξυγονάσης, καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος (ΑΑ) για να ενδοϋπεροξειδίου ενδιάμεσα τα οποία τελικώς μετατρέπονται σε προσταγλανδίνες (PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2, και ΤχΑ2). COX-2 είναι εξαιρετικά επάγεται σε απόκριση προς φλεγμονώδεις μεσολαβητές, παράγοντες ανάπτυξης, ογκογονίδια ενεργοποίησης και προαγωγούς όγκου [14]. Ως εκ τούτου, έχουν αυξημένα επίπεδα COX-2 έχουν βρεθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου [15] – [17]. Μεταγραφικό έλεγχο του γονιδίου COX-2 εξαρτάται από την μοριακή μηχανήματα που αλληλεπιδρά με τον υποκινητή της COX-2, η οποία φαίνεται να ελέγχονται μέσω της δραστηριότητας των διαφόρων οδών σηματοδότησης [18]. Μεταξύ αυτών, ογκογόνο οδοί όπως η σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης [19] ή HIF-1 [20] μπορεί να ενισχύσει την COX-2 μεταγραφή γονιδίου. Έχει βρεθεί ότι HIF-1-ενεργοποιημένη COX-2 /PGE

2 άξονας επάγει VEGF και προάγει την αγγειογένεση [21] η οποία με τη σειρά της ενισχύει HIF-1 μεταγραφικής δραστικότητας [22]. Τέτοια αλληλοπαρεμβολές μεταξύ μονοπατιών σηματοδότησης οδηγεί σε αυτορυθμιστικής βρόχο το οποίο είναι ευεργετικό για την εξέλιξη του όγκου. Ως εκ τούτου, η στόχευση HIF-1 είναι ένα λειτουργικό στρατηγική για την κατάργηση οδών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου, όπως COX-2 /PGE

2 /VEGF.

Τα καρκινικά κύτταρα συχνά παράγουν φλεγμονώδεις μόρια που στο μικροπεριβάλλον, άλλοι από την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου και την αγγειακή ανάπτυξη, επιτρέπουν διαφυγή του κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων [23]. PGE

2, όπως και άλλες όγκου απελευθερώνονται παράγοντες, έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει την ανοσολογική απόκριση και επιτρέπουν στα κύτταρα του όγκου να διαφύγει ανοσοεπιτήρηση επάγοντας, για παράδειγμα, τοπική και συστηματική δενδριτικά κύτταρα (DCs) δυσλειτουργία [24], [25]. DCs είναι ισχυρά κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου (APC) και ως τέτοια έχουν ένα κρίσιμο ρόλο στην έναρξη μίας ανοσολογικής απόκρισης. ΑΧ είναι ιδιαίτερα εξειδικευμένη σε αντιγόνο σύλληψη, επεξεργασία και παρουσίαση, και μετά την ωρίμανση εκφράζουν συν-διεγερτικών μορίων (δηλαδή, CD80 και CD86), οι οποίες δραστηριοποιούνται Τ λεμφοκύτταρα [26]. Ο ρόλος τους στην πρόκληση όγκου-συγκεκριμένες απαντήσεις και την επακόλουθη υποχώρηση του όγκου έχει εκτενώς αποδειχθεί μέσω

in vivo

διέγερση εμβόλιο ή

ex vivo

DC ανοσοθεραπείας [26]. Απομείωση της ΑΧ ωρίμανσης μπορεί να εξαρτάται από τον όγκο που απελευθερώνεται παράγοντες προκαλώντας έτσι ανοσοκαταστολή. Έτσι, ένα ελάττωμα στο σύστημα DC είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που ευθύνονται για τη διαφυγή του όγκου [27], [28].

Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί πρώτα η ρόλος της COX-2 σε PGE

γενεά 2 μετά την εξάντληση HIPK2. Βρήκαμε ότι HIPK2 knockdown οδήγησε σε HIF-1-επαγόμενη COX-2 προς τα πάνω ρύθμιση και COX-2 που προέρχεται PGE

2 παραγωγής. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με ψευδάργυρο μειωτικά την έκφραση της COX-2 και ανέστειλε PGE

2 γενιάς και μονοπάτια σηματοδότησης του, καθώς και HIF-1 που προκαλείται από VEGF. Στη συνέχεια, σε λειτουργικό επίπεδο, ενώ προσαρμοσμένα μέσα τόσο siRNA ελέγχου και HIPK2 εξαντληθεί κύτταρα αναστέλλεται ΑΧ ωρίμανσης, μόνο ρυθμισμένα μέσα από HIPK2 εξαντληθεί κύτταρα ψευδαργύρου-αγωγή, η οποία έδειξε ισχυρή PGE

2 και VEGF ρύθμιση προς τα κάτω, αποτελεσματικά αποκατασταθεί ωρίμανση ΑΧ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Policlinico Umberto I, Πανεπιστήμιο Sapienza, Ρώμη, Ιταλία

Cells., Πολιτισμός Condition, θεραπείες, και κλιματισμός Media

Ανθρώπινο RKO (καρκίνος του παχέος εντέρου) και η σταθερά HIPK2-παρενέβαινε RKO-siHIPK2 [29] κύτταρα συνήθως διατηρούνται σε RPMI-1640 (Life-Τεχνολογία-Invitrogen) μέσο, ​​ενώ HCT116 (καρκίνος του παχέος εντέρου), 293 (ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα) και η Doxyclyclin (Dox) -inducible MCF7 (καρκίνος του μαστού) κύτταρα (MCF7indsi /HIPK2) εκφράζουν HIPK2-παρεμβολών [30], ήταν συνήθως διατηρούνται σε DMEM (Life-Τεχνολογία- Invitrogen) μέσο, ​​όλα που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και γλουταμίνη, σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C. Για συμπλήρωση ψευδαργύρου, τα κύτταρα ταπήτιο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ ΖηΟ

2 για 24 ώρες. Για διεγέρσιμη HIPK2 knockdown, Dox (1 μg /mL) προστέθηκε σε κύτταρα /HIPK2 MCF7indsi κάθε 3 ημέρες έως ότου HIPK2 knockdown επιτυχία επιτεύχθηκε (συνήθως σε περίπου 5 ημέρες). Μετά επιτεύχθηκε HIPK2 knockdown, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς Dox για επιπλέον 5 ημέρες για την αναστροφή της εξάντλησης HIPK2.

Για να ληφθεί το προσαρμοσμένο μέσο (CM), RKO siRNA ελέγχου και siHIPK2 εξαντλημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 × 10

5/60 mm2 τρυβλίο Petri και καλλιεργούνται μέχρι 60% συρροή. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε και τα υπερκείμενα (δηλαδή, ρυθμισμένο μέσο) συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα. ΖηΟΙ

2 (100 mM) προστέθηκε για 24 ώρες.

RNA Εκχύλιση και Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) -PCR Ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε Αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και το ολικό RNA απομονώθηκε μετά από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA syntesized από 2 μg ολικού RNA με κιτ MuLV αντίστροφη μεταγραφάση (Applied Biosystems). Ημι-ποσοτική RT-PCR διεξήχθη με τη χρήση θερμού-Master Taq πολυμεράσης (Eppendorf) με 2 μΐ της αντίδρασης cDNA και τα γονίδια ειδικά ολιγονουκλεοτίδια υπό συνθήκες γραμμικής ενίσχυσης. PCR πραγματοποιήθηκε εις διπλούν σε δύο διαφορετικά σύνολα cDNA. Τα προϊόντα PCR έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου χρησιμοποιώντας υπεριώδες φως. Οι housekeeping β-ακτίνη ή τα γονίδια 28S χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερική σταθερά. Η πυκνομετρική ανάλυση εφαρμόστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό συγκεκριμένων επιπέδων mRNA σε σύγκριση με εσωτερικό πρότυπο. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Western ανοσοαποτύπωσης

Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με επώαση στους 4 ° C για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό λύσης (50 mmol /L Tris-HCI , ρΗ 7,5, 150 mmol /L NaCl, 150 mmol /L KCI, 1 mmol /L διθειοθρεϊτόλης, 5 mmol /L EDTA, ρΗ 8.0, 1% Nonidet Ρ-40) συν ένα μείγμα αναστολέων πρωτεάσης (Sigma Chemical Company) και αναστολείς φωσφατάσης, και αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα που αναγνωρίζουν την COX-2 (Cayman Chemical), β-κατενίνης (Santa Cruz Biotechnology), κυκλίνη D1 (Μ-20, Santa Cruz, ευγενώς από Marco Crescenzi , ISS, Ρώμη, Ιταλία), μονοκλωνικό ποντικού αντι-HIF-1α (Novus Biologicals, UCS Diagnostic, Ιταλία), ρ-STAT3 (Y705), η συνολική STAT3 (και τα δύο από την Cell Signaling Technology), και β-ακτίνη (Calbiochem). Δευτερεύουσα αντίσωμα συζευγμένο με horseradish peroxidise (Bio-Rad) χρησιμοποιήθηκε σε 1:5000. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε με ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας (ECL kit, Amersham Corporation).

Επιμόλυνση και πλασμίδια

293 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τη χρήση του Ν, Ν-δις- (2-υδροξυαιθυλο) -2amino -αιθανοσουλφονικού οξύ ρυθμισμένο salinr (BBS) έκδοση της διαδικασίας φωσφορικού ασβεστίου [31], ενώ RKO και HCT116 διαμολύνθηκαν με τη χρήση της μεθόδου κατιονικού πολυμερούς LipofectaminePlus (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα του πλασμιδιακού DNA εξισώθηκε σε κάθε δείγμα με τη συμπλήρωση με κενό φορέα και αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης οπτικοποιήθηκε με τη χρήση ενός συν-επιμολύνθηκαν φορέα έκφρασης GFP. Τα πλασμίδια έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: η κυρίαρχη αρνητική μορφή του HIF-1α χωρίς DNA τομέα και τον τομέα διενεργοποίησης (pCEP4-HIF-1α-DN) [32] (ευγενώς από τον BH Jiang, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Κίνα), HIF-1α δέσμευσης φορέα έκφρασης (ευγενώς από τον Α Farsetti, Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας, Ρώμη, Ιταλία) και του φορέα HA-VHL έκφρασης (ευγενώς από WK Rathmell, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνα στο Τσάπελ Χιλ, ΗΠΑ).

παρεμβολή RNA

τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε semiconfluence σε δίσκους 35 mm, η ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Control-siRNA και ειδικών siHIF-1α (Dharmacon), ή pSUPER-HIPK2 και φορείς pSuper ελέγχου [29] επιμολύνθηκαν όλη τη νύκτα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο LipofectaminePlus (Invitrogen). 36 ώρες αργότερα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ ΖηΟ

2 για 24 ώρες. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης οπτικοποιήθηκε με τη χρήση ενός συν-επιμολύνθηκαν φορέα έκφρασης GFP κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Η αποτελεσματικότητα της knockdown επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-PCR.

ELISA Δοκιμασία

κύτταρα αναπτύσσονται προς συρροής σε 60 mm τρυβλία Petri καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες με 0.5% FBS πριν από την προσθήκη φρέσκου μέσου με 10 % Φεβρουάριο με ή χωρίς COX-2 εκλεκτικός αναστολέας NS-398 (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ, USA) στους 50 ηΜ για 24 ώρες ή 100 μΜ ΖηΟ

2 για 24 ώρες με. PGE

2 και ανίχνευση VEGF στις κυτταρικές-ρυθμισμένα μέσα προσδιορίστηκε εις τριπλούν με ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) με τη χρήση, αντιστοίχως, το κιτ προσταγλανδίνη Ε2 ΕΙΑ (Cayman Chemical) και το κιτ ανοσοδοκιμασίας ανθρώπινο VEGF Quantikine (Ρ & amp? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PGE επίπεδα

2 και VEGF ομαλοποιήθηκαν με τον αριθμό των κυττάρων και εκφράζονται ως pg /10

6 κύτταρα /ml.

Για την παραγωγή IL-10 από ΑΧ, προσαρμοσμένα μέσα από τον έλεγχο siRNA και siHIPK2 εξαντληθεί κύτταρα , ακατέργαστα ή κατεργασμένα με 100 μΜ ΖηΟ

2 για 24 ώρες, προστέθηκαν σε καλλιέργεια DC σε πλάκες 96 φρεατίων, 1/1 (ο /ο) με μέσο που περιέχει IL-4 και GM-CSF, για 24 ώρες. Επίλογος, ΤΝΡ-α προστέθηκε για 48 h για DCs ωρίμανση. IL-10 παραγωγή από δενδριτικά κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκε με ELISA χρησιμοποιώντας διαθέσιμα στο εμπόριο αντιδραστήρια και πρότυπα (RayBiotech, Inc.). Τα υπερκείμενα προστέθηκαν εις διπλούν σε κατάλληλα προ-επικαλυμμένες πλάκες. Αφού οι πλάκες πλύθηκαν, προστέθηκε χρένο αντίσωμα ανίχνευσης συζευγμένο με υπεροξειδάση. Το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη χρώματος ήταν τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ). Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 450 nm με ένα αναγνώστη μικροπλάκας (Multiskan Ex, Θέρμο Labsystem). Η ελάχιστη δόση ανίχνευση της IL-10 είναι τυπικά λιγότερο από 1 pg /ml.

Δημιουργία παράγωγα μονοκυττάρων δενδριτικά κύτταρα (DCs) και DCs Ωρίμανση

Για να δημιουργήσετε DCs μονοκύτταρο, τα ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), που ελήφθησαν από υγιείς δότες (υπό ενημερωμένη συγκατάθεση) απομονώθηκαν με Fycoll-Paque φυγοκέντρηση διαβάθμισης (Pharmacia, Uppsala, Σουηδία) από φλεγμονώδεις πλακούντες. CD14 + μονοκύτταρα θετικώς επιλέγονται με τη χρήση αντι-CD14 MAb συζευγμένο με μαγνητικά μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec, Auburn, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Καθαρισμένα μονοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 10

6 κύτταρα /3 ml σε πλάκες 12-φρεατίων για 6 ημέρες σε RPMI 1640 (EuroClone) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη G, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη και ανασυνδυασμένο ανθρώπινο παράγοντα διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF, 50 ng /ml) και ιντερλευκίνη 4 (IL-4, 20 ng /ml) (Miltenyi Biotec) για να δημιουργηθεί το ανώριμα DC (iDC). Οι κυτοκίνες αυτές αναπληρώνονται κάθε δεύτερη ημέρα, μαζί με 20% φρέσκο ​​μέσο. Για την ενεργοποίηση iDC, ανθρώπινο ανασυνδυασμένο TNF-α (20 ng /mL? Miltenyi Biotec) προστέθηκε την ημέρα 6 για 48 ώρες για την επαγωγή DCs ωρίμανση

Ανάλυση DC Φαινότυπος με κυτταρομετρία ροής

. Καθαρισμένα μονοκύτταρα καλλιεργήθηκαν για 6 ημέρες με GM-CSF και IL-4, με ή χωρίς 20% (ο /ο) ρυθμισμένων μέσων (CM) από τα καρκινικά κύτταρα χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 100 μΜ ψευδαργύρου για 24 ώρες ή με μονοκλωνικά αντι- αντίσωμα VEGF (R & amp? D Systems, Inc.) (ευγενική προσφορά από τον F. Spinella, Regina Elena Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ρώμη, Ιταλία). Επίλογος, ΤΝΡ-α προστέθηκε για 48 ώρες για την ωρίμανση και DCs φαινότυπο DC αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Phycoerytrin (ΡΕ) αντι-CD80 και FITC-συζευγμένο αντι-CD86 αντισώματα (Becton Dickinson, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκαν για χρώση κυτταρικής επιφάνειας. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τα αντισώματα για 30 λεπτά στους 4 ° C και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS πριν από τις αναλύσεις. DC ήταν περιφραγμένη σύμφωνα με FSC και SSC ιδιότητές τους. Κατάλληλοι έλεγχοι ισοτύπου συμπεριλήφθηκαν και 5000 βιώσιμα DC αποκτήθηκαν για κάθε πείραμα. Η κυτταρομετρία ροής εξαγορά έγινε με κυτταροφθορισμόμετρο EPICS XL Coulter (Hialeah, FL).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα πείραμα εκτός αν αναφέρεται εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Όλα τα πειραματικά αποτελέσματα εκφράζονται ως ο αριθμητικός μέσος όρος και τυπική απόκλιση (S.D.) μετρήσεων δείχθηκε. Του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε για στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανάλυσης της διακύμανσης κατά 5% (ρ & lt? 0,05) ή 1% (ρ & lt? 0,01).

(Α) HIPK2 και COX-2 προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε πρωτογενείς όγκους. Η

οικόπεδα κουτί

αντιπροσωπεύουν HIPK2 (

αριστερό πλαίσιο

) και COX-2 (

δεξί πάνελ

) επίπεδα mRNA σε δείγματα 1) του παχέος εντέρου, 2) του ορθού, και 3 ) αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου πρωτοπαθείς όγκους. * P & lt? 0.001. (Β) Ημι-ποσοτική RT-PCR αναλύσεις HIPK2 και γονιδιακή έκφραση COX-2 σε κύτταρα RKO σταθερώς παρενέβαινε για λειτουργία HIPK2 (siHIPK2) ή με παρεμβολή RNA-μη στόχους (siRNA). 28S χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. ανάλυση (C) Αντιπροσωπευτική RT-PCR των κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με pSuper-HIPK2 (siHIPK2) ή τον έλεγχο pSuper (siRNA) φορέα για 48 ώρες. 28S χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (D, αριστερό πάνελ) Αντιπροσωπευτικά RT-PCR αναλύσεις των κυττάρων MCF7-indsi /HIPK2 αγωγή με Dox (DOX +) για 5 ημέρες (για HIPK2 knockdown) και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν χωρίς Dox (DOX-) για επιπλέον 5 ημέρες (για ανάκτηση HIPK2) . (D, δεξί πάνελ) πυκνομετρική ανάλυση HIPK2 και τα επίπεδα COX-2 (όπως στον αριστερό πίνακα) διεξήχθη και κανονικοποιημένες τιμές σε επίπεδα 28S mRNA απεικονίσθηκαν. * Ρ = 0,001. (Ε) Συνολική κυτταρικά εκχυλίσματα από RKOsiHIPK2 και τα κύτταρα siRNA ελέγχου αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western για την αξιολόγηση της COX-2 επίπεδα πρωτεΐνης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης.

Η

Αποτελέσματα και Συζήτηση

αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ χαμηλής HIPK2 και High COX-2 επίπεδα έκφρασης στα καρκινικά κύτταρα

Για να να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την

in vivo

σχέση μεταξύ της COX-2 και HIPK2 πραγματοποιήσαμε μια

σε-silico

ανάλυση συν-έκφραση σύγκριση διαφορετικών μελετών μικροσυστοιχιών των διαφόρων φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του παχέος εντέρου από την ολοκληρωμένη Oncomine ερευνητικό εργαλείο βάση δεδομένων του καρκίνου (https://www.oncomine.org). Οι αναλύσεις των συνόλων δεδομένων που λαμβάνονται από τα δείγματα των φυσιολογικών ιστών και πρωτογενών αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου αποκάλυψε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ HIPK2 και της έκφρασης COX-2. Έτσι, η έκφραση HIPK2 ήταν υψηλή σε φυσιολογικούς ιστούς και σημαντικά μειωμένη σε αδενοκαρκινώματα κόλου, ενώ η έκφραση της COX-2 ήταν χαμηλή σε φυσιολογικούς ιστούς και σημαντικά αυξημένη σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου (Εικ. 1Α). Είμαστε δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει κατά πόσον HIPK2 έπαιξε κάποιο ρόλο στη ρύθμιση της COX-2. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 1Β, αυξημένη COX-2 επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν σε RKO κύτταρα καρκίνου κόλου σταθερά παρενέβαινε για λειτουργία HIPK2 (siHIPK2) [29], σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου siRNA. Παρόμοια συσχέτιση μεταξύ χαμηλών αντίστροφη HIPK2 και υψηλά επίπεδα COX-2 βρέθηκε σε καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου υφίστανται παροδική εξάντληση HIPK2 με siRNA (Σχ. 1C), υποδηλώνοντας ένα ρόλο για HIPK2 στην έκφραση COX-2 mRNA σε καρκινικά κύτταρα. Για να επιβεβαιώσετε περαιτέρω αυτό το εύρημα, επωφεληθήκαμε από τις Dox επαγόμενου καρκίνου του μαστού MCF7 κύτταρα (MCF7indsi /HIPK2), όπου η θεραπεία Dox προκαλεί HIPK2 ρύθμιση προς τα κάτω [30], την απόκτηση ουσιαστικά παρόμοια αποτελέσματα. Έτσι, η κατεργασία Dox (Dox +) μειωμένη έκφραση HIPK2 mRNA το οποίο συσχετίστηκε σημαντικά με την COX-2 προς τα πάνω ρύθμιση, όπως αποδεικνύεται και από την πυκνομετρική ανάλυση (Σχ. 1D). Στη συνέχεια, αναστροφή της εξάντλησης HIPK2 με απομάκρυνση Dox (Dox -), αποκατέστησε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης COX-2 όπως και τα αρχικά επίπεδα COX-2 από κύτταρα ελέγχου, όπως αποδεικνύεται επίσης με πυκνομετρική αναλύσεις (Σχήμα 1ϋ.). Στη συνέχεια, ανοσοκηλίδωση Western έδειξαν αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης COX-2 σε RKO HIPK2 εξαντλημένο κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου siRNA (Σχ. 1Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν, για πρώτη φορά, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ HIPK2 και της έκφρασης COX-2 σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου που επιβεβαιώθηκε ενδιαφέρουσας ανιχνεύοντας την Oncomine σύνολο δεδομένων των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, υποδεικνύοντας ότι αυτό μπορεί να είναι ένα τυπικό υπογραφή του καρκίνου. Επιπλέον, το αποτέλεσμα των COX-2 προς τα πάνω ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα του μαστού μετά την αναστολή HIPK2 μπορούν επίσης να λαμβάνονται υπόψη.

(Α) Αντιπροσωπευτική RT-PCR αναλύσεις ελέγχου RKO-siRNA και RKO-siHIPK2 κύτταρα επιμολυσμένα με HIF -1α κυρίαρχο αρνητικό (HIF-1αDN) για 36 ώρες. Οι αναστολείς της COX-2 και VEGF mRNA επίπεδα εμφανίζονται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) RT-PCR αναλύσεις των κυττάρων RKO-siHIPK2 επιμολύνθηκαν με ειδικές siRNA για HIF-1α knockdown ή ελέγχουν siRNA. Μετά την επιμόλυνση ολικό RNA εκχυλίστηκε και RT-PCR πραγματοποιήθηκε για την εκτίμηση HIF-1α, COX-2 και την έκφραση του VEGF επίπεδα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχθηκε. (C, αριστερό πάνελ) RT-PCR αναλύσεις των κυττάρων RKO-siHIPK2 επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης VHL (+) ή με κενό φορέα (-). Μετά την επιμόλυνση ολικό RNA εκχυλίστηκε και RT-PCR πραγματοποιήθηκε για την εκτίμηση της COX-2 και την έκφραση του VEGF επίπεδα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (C, δεξί πάνελ) πυκνομετρική ανάλυση COX-2 και VEGF επίπεδα (όπως στο αριστερό πλαίσιο) διεξήχθη και κανονικοποιημένες τιμές σε β-ακτίνης mRNA επίπεδα απεικονίσθηκαν. * Ρ = 0,001. κύτταρα (D) 293 διαμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης HIF-1α (+) ή με κενό φορέα (-). Μετά την επιμόλυνση ολικό RNA εκχυλίστηκε και RT-PCR πραγματοποιήθηκε για την εκτίμηση HIF-1α, COX-2 και την έκφραση του VEGF επίπεδα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχθηκε.

Η

Ενίσχυση της COX-2 Εκφραση σε HIPK2 Knockdown κύτταρα μέσω HIF-1α

Ένας από τους μηχανισμούς που ενισχύουν COX-2 μεταγραφή είναι μέσω HIF-1 δραστηριότητα [20]. HIPK2 knockdown επάγει δραστικότητα HIF-1, που θεωρείται ως αυξημένη μεταγραφή του γονιδίου του VEGF και η αγγειογένεση, με derepressing μεταγραφής HIF-1α υποκινητή [6]. Για να εξεταστεί αν HIF-1α εμπλέκεται στην έκφραση της COX-2, διεξήχθησαν αρκετές γενετικές προσεγγίσεις. RKO σταθερώς παρενέβαινε για λειτουργία HIPK2 (siHIPK2) χρησιμοποιήθηκαν κυρίως και αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης παρακολουθήθηκε με τη χρήση ενός συν-επιμολύνθηκαν φορέα GFP διάρκεια των πειραμάτων. Για να διερευνηθεί η επίδραση της HIF-1α στην μεταγραφή του γονιδίου της COX-2, πρέπει πρώτα διεξάγεται πειράματα απώλειας λειτουργίας με ένα κυρίαρχο αρνητικό HIF-1α (HIF-1αDN) κατασκεύασμα χωρίς δέσμευσης DNA και τον τομέα διενεργοποίησης που αναστέλλει HIF-1 δραστηριότητα [32]. RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση του HIF-1αDN μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της COX-2 σε κύτταρα RKO-siHIPK2 (Εικ. 2Α), προτείνοντας HIF-1 μεταγραφή που εξαρτάται ρύθμιση COX-2. Αυτό το αποτέλεσμα παραλληλίζεται με εκείνη που παρατηρήθηκε σε HIF-1 γονιδίου στόχου VEGF (Σχ. 2Α). Στη συνέχεια, η εξάντληση HIF-1α σε κύτταρα RKO-siHIPK2 από ειδικές παρεμβολή siRNA έδειξε ότι HIF-1α προς τα κάτω ρύθμιση ανέστειλε ισχυρά τόσο COX-2 και του γονιδίου του VEGF έκφραση (Εικ. 2Β). Ως πρόσθετη προσέγγιση για την αναστολή της δραστηριότητας HIF-1, υπερεκφράσαμε νοη Hippel-Lindau (VHL) πρωτεΐνη η οποία έχει δειχθεί ότι αναστέλλει δραστικότητα HIF-1 μέσω στόχευσης HIF-1α για την αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [33]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, VHL υπερέκφραση σε κύτταρα RKO-siHIPK2 επάγεται αποτελεσματική COX-2 καθώς επίσης και VEGF μειορύθμιση, όπως αποδεικνύεται από αναλύσεις πυκνομετρική. Τέλος, για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση του HIF-1 στη ρύθμιση της COX-2, επιμολύναμε φορέα έκφρασης HIF-1α σε 293 κύτταρα παρατηρώντας ότι υπήρχε σημαντική βελτίωση τόσο της έκφρασης COX-2 και VEGF mRNA, σε σύγκριση με κύτταρα μάρτυρες (Εικ . 2D). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η COX-2 προς τα πάνω ρύθμιση, μετά από HIPK2-νοκ ντάουν, εξαρτάται, Al τουλάχιστον εν μέρει, στην δράση του HIF-1, όπως επιβεβαιώνεται από το αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε για το γονίδιο HIF-1- στόχο VEGF.

κύτταρα ρ (Α) 293 διαμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης HIF-1α (+) ή με κενό φορέα (-). κύτταρα HIF-1α-επιμολυσμένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΖηΟ

2 (100 μΜ). 24 ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε χωρίζεται σε δυο τόσο για RNA και αναλύσεις πρωτείνης. RT-PCR διεξήχθη για την εκτίμηση της COX-2 και τα επίπεδα έκφρασης VEGF (άνω πάνελ). 28S χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκε με ανοσοστύπωση (Ι.Β.) για να αξιολογήσει HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης. L.C. (Έλεγχος φόρτωσης). (Β) κύτταρα RKO-siHIPK2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΖηΟ

2 (100 μΜ) για 24 ώρες. Μετά την επιμόλυνση ολικό RNA εκχυλίστηκε και RT-PCR πραγματοποιήθηκε για την εκτίμηση της COX-2 και την έκφραση του VEGF επίπεδα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχθηκε. (Γ) Συνολικός κυτταρικά εκχυλίσματα από RKOsiHIPK2 μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με ΖηΟ

2 (100 μΜ) για 24 ώρες αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western για την αξιολόγηση της COX-2 επίπεδα πρωτεΐνης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης.

Η

ρυθμίζει προς τα κάτω ψευδάργυρος COX-2 τα επίπεδα έκφρασης σε HIPK2 Depleted Κύτταρα

προηγουμένως αποδειχθεί ότι τα ιόντα ψευδαργύρου συμπληρωμάτων σε ιδιοσυστατικά υποξικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη ή σε αγγειογενετική κύτταρα γλοιοβλαστώματος ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του HIF-1α, συνεπώς αναστέλλοντας τη δράση του HIF-1 [8]. Αυτό το εύρημα ήταν δίπλα τεκμηριώνεται από ένα γονιδίωμα-ευρεία αναλύσεις, όπου ψευδαργύρου εξουδετερώνει πράγματι τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από υποξία-ενεργοποιημένα HIF-1 [34]. Εδώ υπερεκφράζεται πρώτα HIF-1α σε 293 κύτταρα και αναλύθηκαν τα επίπεδα mRNA με ημιποσοτική RT-PCR, πριν και μετά τη θεραπεία ψευδαργύρου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, HIF-1-επαγόμενη έκφραση του γονιδίου του VEGF COX-2 και αναστέλλεται αποτελεσματικά με επεξεργασία με ψευδάργυρο. Η υπερέκφραση HIF-1α και προς τα κάτω ρύθμιση του επάνω θεραπείες ψευδαργύρου, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [8], φαίνεται από ανοσοκηλίδωση Western (Ι.Β.) (Σχ. 3Α, κάτω πίνακας). Στη συνέχεια, η θεραπεία με ψευδάργυρο κυττάρων RKO-siHIPK2 έδειξαν σημαντική μείωση τόσο της γονιδιακής έκφρασης COX-2 και VEGF mRNA με ανάλυση RT-PCR (Σχ. 3Β). Κατά συνέπεια, ανοσοκηλίδωση Western επιβεβαίωσε COX-2 προς τα κάτω ρύθμιση σε HIPK2 εξαντλημένα κύτταρα μετά την κατεργασία ψευδαργύρου (Σχ. 3C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στα χέρια μας θεραπεία ψευδαργύρου (100 μΜ για 24 ώρες) δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή COX-2 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε όγκους οδηγεί στην επιθετικότητα του όγκου και κακή πρόγνωση [14], με στόχο την COX-2 μπορεί να είναι ένα σημαντικό επίτευγμα στη θεραπεία του καρκίνου. Έτσι, η COX-2 εκλεκτικοί αναστολείς έχουν δείξει ισχυρά αποτελέσματα κατά των όγκων σε αρκετά διαφορετικά ζωικά μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου? σε συμφωνία, διαγραφή των γονιδίων αποτελέσματα της COX-2 σε σημαντική μείωση του φόρτου αδενώματος τόσο λεπτό και παχύ έντερο σε

Αρο

Δ716

μεταλλαγμένα ποντίκια και

Αρο

min

ποντίκια [35]. Παρ ‘όλα αυτά εκλεκτικοί αναστολείς COX-2 φαίνεται να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό στην πρόληψη των πολυπόδων υποτροπής, οι συνδεδεμένες ανεπιθύμητες καρδιαγγειακές παρενέργειες από αυτά τα φάρμακα μπορεί να επηρεάσουν τα κατάλληλα τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες [36], [37]. Ως εκ τούτου, είναι υποχρεωτικό να αναπτυχθούν νέες προσεγγίσεις για τη στόχευση λειτουργία COX-2. Από την άποψη αυτή, η χρήση του ψευδαργύρου σε προς τα κάτω ρύθμιση HIF-1-επαγόμενη έκφραση της COX-2 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα ενδιαφέρον σημείο εκκίνησης για να ξεπεραστούν οι αρνητικές επιδράσεις του τουλάχιστον ορισμένων ειδικών αναστολέων COX-2? Επιπλέον, ενεργώντας σε HIF-1 ψευδάργυρο δραστηριότητα μπορεί να επηρεάσει πολλά μονοπάτια διασυνδεδεμένα σηματοδότησης. Τέλος, αν ο ψευδάργυρος θα μπορούσε να αναστέλλουν την COX-2 επίσης ανεξάρτητα από HIF-1 πρέπει να διαλευκανθεί περαιτέρω.

(Α) PGE

2 παραγωγή προσδιορίστηκε με ELISA σε RKO-siRNA κύτταρα ελέγχου αφεθεί χωρίς θεραπεία και σε HIPK2 απεμπλουτισμένο κύτταρα (siHIPK2) πριν και μετά ΖηΟΙ

2 θεραπεία (100 μΜ για 24 ώρες) και μετά τη θεραπεία με COX-2 ειδικό αναστολέα NS-398 (50 ηΜ) για 24 ώρες. PGE

2 παραγωγής χαράσσεται ως pg /10

6 κύτταρα. Στήλες, σημαίνει δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν, ± Τ.Α. * P & lt? 0.001. (Β) Συνολική κυτταρικά εκχυλίσματα από RKO-siRNA κύτταρα ελέγχου αφεθεί χωρίς θεραπεία και HIPK2 εξαντλημένα κύτταρα (siHIPK2) πριν και μετά ΖηΟΙ

2 θεραπεία (100 μΜ για 24 ώρες) αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western για την αξιολόγηση της COX-2, β- κατενίνης, και η κυκλίνη D1 επίπεδα πρωτεΐνης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (Γ) Η παραγωγή VEGF αναλύθηκε με ELISA σε RKO-siRNA κύτταρα ελέγχου και σε HIPK2 εξαντλημένα κύτταρα (siHIPK2) πριν και μετά τη θεραπεία ΖηΟΙ

2 (100 μΜ για 24 ώρες). παραγωγή VEGF ήταν χαράσσεται ως pg /10

6 κύτταρα. Στήλες, σημαίνει δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν, ± Τ.Α. * P & lt?. 0.001

Η

Αναστέλλει ψευδάργυρος PGE

2 μονοπάτια σηματοδότησης σε HIPK2-εξαντλημένα κύτταρα

Αφού διαπιστώθηκε ότι ο ψευδάργυρος μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω την COX-2 επίπεδα σε HIPK2 εξαντλημένα κύτταρα, που δίπλα προσπάθησε να αξιολογήσει PGE

2 διαφοροποίησης. δοκιμασία ELISA έδειξε ότι η σχετική ποσότητα της PGE

2 που παράγεται από HIPK2 απεμπλουτισμένο σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10], ανεστάλη σημαντικά με τα συμπληρώματα ψευδαργύρου (Σχ. 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο ψευδάργυρος που προκαλείται PGE

2 αναστολή ήταν τόσο αποτελεσματική όσο το συγκεκριμένο COX-2 αναστολέα NS-398 (Σχ. 4Α). Σε συμφωνία, ανοσοκηλίδωση Western έδειξε ισχυρή μείωση της COX-2 επίπεδα πρωτεΐνης μετά την κατεργασία ψευδαργύρου (Σχ. 4Β), όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα β-κατενίνης και της κυκλίνης στόχο της D1 σε HIPK2 εξαντλημένα κύτταρα, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [3], [4], ήταν σημαντικά ανέστειλε με κατεργασία ψευδαργύρου (Σχ. 4Β), το οποίο παράλληλα με την παραπάνω PGE

2 αναστολή. Αυτή είναι μια ενδιαφέρουσα συσχέτιση, διότι PGE

2 έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν β-κατενίνης ως παράγοντας μεταγραφής για την επαγωγή της έκφρασης διαφόρων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων COX-2 και κυκλίνη D1, δημιουργώντας μια θετική βρόχος αυτορύθμισης που ευνοεί την εξέλιξη του όγκου [12 ], [38].

(Α) Light μικροσκοπία δεικνύει τον έλεγχο που διαφοροποιούνται DCs (Mock, πάνελ 1) και η αναστολή των διαφοροποιημένων DCs μορφολογία παρουσία CM ελέγχου siRNA (πίνακας 2), ή HIPK2 εξαντληθεί κύτταρα ( siHIPK2) (πίνακας 3)? αυτή η αναστολή δεν έλαβε χώρα μόνο εάν DCs όπου καλλιεργούνται παρουσία του CM ψευδαργύρου επεξεργασμένου siHIPK2-CM (πίνακας 5) σε σύγκριση με CM κυττάρων ελέγχου siRNA ψευδαργύρου-αγωγή (πίνακας 4). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχθηκε. Μικροφωτογραφία μεγέθυνσης, 10 ×. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.