Αφηρημένο

βλαστικά υπογραφές έκφραση

καρκινικών κυττάρων (CSC) του γονιδίου που βασίζονται σχετίζονται με την πρόγνωση σε διάφορους τύπους όγκων και ΚΕΠ προτείνεται να είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στα φάρμακα. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν η πρώτη, για να προσδιοριστεί η προγνωστική σημασία της CSC που σχετίζονται με την έκφραση του γονιδίου σε υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα εισαγωγική θεραπεία με γαστρικό καρκίνο (GC) ασθενείς. Δεύτερον, θελήσαμε να εξετάσουμε αν οι μεταβολές έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων πριν και μετά την θεραπευτική όγκων υπάρχουν, συνεπής με εμπλουτισμό ανθεκτικών κυττάρων όγκου φάρμακο. Η έκφραση των γονιδίων 44 αναλύθηκε σε 63 σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα όγκου με μερική υποχώρηση του όγκου (10-50% υπολειμματικό όγκο) μετά εισαγωγική χημειοθεραπεία με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR συστοιχίες χαμηλής πυκνότητας. Μια υπογραφή των συνδυασμένων

GSK3B

υψηλή,

β-κατενίνης (CTNNB1)

υψηλή και

Notch2

χαμηλή έκφραση συσχετίζεται έντονα με την καλύτερη επιβίωση των ασθενών (p & lt? 0.001). Μια προγνωστική σημασία αυτών των γονιδίων επίσης βρέθηκε αναλύει δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Η έκφραση των γονιδίων 9 συγκρίθηκε μεταξύ των προ-θεραπευτικών βιοψίες και μετα-θεραπευτική εκτομή δείγματα. Μια σημαντική μετα-θεραπευτική αύξηση του

ΕΓΚΟΠΗ

2,

LGR5

και

POU5F1

έκφραση βρέθηκε σε όγκους με διαφορετικές ποιότητες υποχώρηση του όγκου. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν για

GSK3B

και

CTNNB1

. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε μια σχετιζόμενη με χημειοθεραπεία αύξηση της έντασης της χρώσης Notch2, αλλά όχι στο ποσοστό των Notch2. Στο σύνολό τους, το

GSK3B, CTNNB1

και

Notch2

υπογραφή της έκφρασης είναι ένα μυθιστόρημα, υποσχόμενος προγνωστική παράμετρο για GC. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης διαφορικής έκφρασης δείχνουν εξέχοντα ρόλο για Notch2 και αντίσταση χημειοθεραπείας σε GC, η οποία φαίνεται να σχετίζεται με μια δράση των φαρμάκων στην έκφραση Notch2 και όχι σε μια εμπλουτισμό Notch2 εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα.

Παράθεση: Bauer L, Langer R, Becker Κ, Hapfelmeier Α, Ott Κ, Novotny A, et al. (2012) Έκφραση προφίλ των Βλαστικών Κυττάρων Τα γονίδια που σχετίζονται με Νεοεπικουρική που έλαβαν Καρκίνος γαστρική: Ένα

Notch2

,

GSK3B

και

β-κατενίνης

Gene Υπογραφή Προβλέπει επιβίωσης. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10.1371 /journal.pone.0044566

Επιμέλεια: Ju-Seog Λι, του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 16, 2012? Αποδεκτές: 8 του Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Bauer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Deutsche Krebshilfe Mildred Scheel Stiftung, χορηγεί αριθμό 108524 στο GK και KB. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Για προχωρημένους γαστρικά καρκινώματα (GC) είναι συχνά αντιμετωπίζονται από λευκόχρυσο /5-φθοριοουρακίλη (5FU) – με βάση εισαγωγική χημειοθεραπεία [1]. Ο σκοπός αυτής της θεραπείας είναι, μεταξύ άλλων, για τη συρρίκνωση του όγκου πριν τη χειρουργική επέμβαση για να αυξηθεί η πιθανότητα πλήρους εκτομής και να βελτιωθεί έτσι την επιβίωση του ασθενούς. Ωστόσο, τα ποσοστά απόκρισης είναι χαμηλά, και πλήρη ή υποσύνολο υποχώρηση του όγκου παρατηρείται μόνο στο 20-40% των ασθενών [1], [2]. Έτσι, η αντίσταση χημειοθεραπεία αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για την επιτυχή θεραπεία

Σύμφωνα με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων υπόθεση, τα καρκινικά κύτταρα είναι ετερογενής, και αυξημένη αντοχή στα φάρμακα είναι ένα ιδιαίτερο φαινότυπο μια μειοψηφία των καρκινικών κυττάρων -. Η έτσι- ονομάζεται καρκίνος-κύτταρα έναρξης ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) [3] – [5]. Μια αύξηση του πληθυσμού CSC μετά τη χημειοθεραπεία έχει καταδειχθεί [6], [7], και το στέλεχος υπογραφές γονιδιακής έκφρασης βασίζονται κυττάρων συνδέεται με κακή πρόγνωση σε διάφορους όγκους συμπεριλαμβανομένων γαστρικά καρκινώματα [8] – [11]. Η υπόθεση CSC είναι ακόμα συζητείται αμφιλεγόμενα, αλλά υπάρχουν ενδείξεις για την ύπαρξη των ΚΕΠ σε αρκετούς τύπους όγκων και μοριακών δεικτών έχουν ταυτοποιηθεί οι οποίες κατά προτίμηση βρίσκονται στην αυτά τα κύτταρα [4], [5]. Η ενεργοποίηση των οδών εμβρυϊκών σηματοδότησης, όπως η Wnt, Notch και μονοπάτια Hedgehog, έχει προταθεί ως κινητήρια δύναμη για το σχηματισμό των ΚΕΠ [4], [12]. Τα στοιχεία σχετικά με την προέλευση και την ύπαρξη των γαστρικών ΚΕΠ παραμένουν ασαφή [13] – [17]. Στα ποντίκια, μυελού των οστών προερχόμενα κύτταρα ή ένα ειδικό πληθυσμό κυττάρου στο άντρο που εκφράζουν το μόριο στόχο Wnt LGR5, έχουν συσχετιστεί με ΚΕΠ στο στομάχι [17], [18]. Επιπλέον, CD44 και CD24 έχουν προταθεί ως ειδικούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, αλλά τα δεδομένα είναι ασυνεπής [19], [20].

Η εισαγωγική πρωτόκολλο θεραπείας για GC παρέχει μια εξαιρετική ευκαιρία για να διερευνήσει τα καρκινικά κύτταρα πριν και μετά τη χημειοθεραπεία σε ασθενείς. Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να αποσαφηνίσει πρώτα, αν η έκφραση των θεωρούμενων CSC που σχετίζονται με τα γονίδια στην μετα-θεραπευτική υπολειμματικού όγκου προβλέπει την επιβίωση και δεύτερο ασθενή, είτε συγκεκριμένα γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των προ-θεραπευτική βιοψίες και τα δείγματα μετα-θεραπευτική όγκων , σύμφωνα με εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπεία ανθεκτικά όπως προβλέπεται από την έννοια CSC. Η ομάδα των ασθενών, οι οποίοι κατέδειξαν σημαντική συρρίκνωση του όγκου μετά την εισαγωγική χημειοθεραπεία, αλλά είχε ακόμα αρκετή υπολειμματική καρκινικά κύτταρα διαθέσιμα για ανάλυση (10-50% υπολειμματικό όγκο) θεωρήθηκαν ως η πιο κατάλληλη ομάδα για να ξεκινήσετε με μια ανάλυση διαλογής για προγνωστικούς σχετικών γονιδίων και τότε εντοπισμό των σχετικών διαφορών στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των προ- και μετα-θεραπευτικές δείγματα όγκων. Αναλύοντας αυτά τα υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα εντοπίσαμε ένα πρότυπο γονιδιακής έκφρασης που περιλαμβάνει

GSK3B, CTNNB1

και

Notch2

, η οποία προβλέπει έντονα την πρόγνωση των ασθενών. Δείχνουμε ότι ο αντίκτυπος των

GSK3B

και

CTNNB1

σε αυτό υπογραφής δεν εξαρτάται από τη χημειοθεραπεία και πιο πιθανό αντανακλά μια ιδιότητα του πρωτογενούς όγκου και τα δεδομένα μας υποδηλώνουν περαιτέρω, ότι ιδιαίτερα

Notch2

θα μπορούσε να διαδραματίσει κάποιο ρόλο για την αντίσταση χημειοθεραπεία σε GC.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Συνολικά, 480 ασθενείς με τοπικά προχωρημένο GC (CT3 /4 ) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με εισαγωγική, λευκόχρυσο /χημειοθεραπεία 5FU που βασίζεται στο Τμήμα Χειρουργικής στο Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου μεταξύ του 1991 και του 2007 και αξιολογήθηκαν για απόκριση βασίζεται σε τυποποιημένη ιστοπαθολογικών πρωτόκολλο [2] – [22]. Η υποχώρηση του όγκου ταξινομούνται σε 3 κατηγορίες: υποχώρηση του όγκου Βαθμός (TRG) 1, το οποίο αποτελείται από TRG1a (σύνολο υποχώρηση του όγκου) και TRG1b (υποσύνολο υποχώρηση του όγκου: & lt? 10% υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα /κρεβάτι όγκου), TRG2 (μερική υποχώρηση του όγκου: 10-50% των κυττάρων υπολειπόμενο όγκο /κρεβάτι όγκου) και TRG3 (ελάχιστη ή καμία υποχώρηση του όγκου: & gt? 50% υπολειπόμενο όγκο /κρεβάτι όγκου). Από τους 480 ασθενείς, 121 ασθενείς έδειξε TRG2 και 63 από αυτά αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το κριτήριο συμπερίληψη ήταν η διαθεσιμότητα επαρκούς ιστού του όγκου για την ανάλυση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με τουλάχιστον το 50% του προβλεπόμενου δόση της χημειοθεραπείας. Ασθενής χαρακτηριστικά και πρωτόκολλα θεραπείας φαίνονται στον Πίνακα 1. Για να επιβεβαιώσετε τον αντιπροσωπευτικό χαρακτήρα των αναλυθεί ασθενών 63, η κατανομή των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων τους συγκρίθηκε με την ομάδα 121 ασθενών και έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές.

Η

Συνέχεια υπολογίζεται από την πρώτη ημέρα της θεραπείας μέχρι την ημερομηνία της τελευταίας επαφή με τους ασθενείς. Η διάμεση παρακολούθηση ήταν 77,1 μήνες (εύρος: 28,5 – 108,5). Η κλινική τελικό σημείο της μελέτης ήταν η συνολική επιβίωση (OS), το οποίο ορίζεται ως ο χρόνος μεταξύ της πρώτης ημέρας της χημειοθεραπείας και του θανάτου από οποιαδήποτε αιτία. Η διάμεση συνολική επιβίωση ήταν 50,9 μήνες (εύρος: 4,5 έως 108,5, 95% CI: 25,6 – 76,3), και 37 από τους 63 ασθενείς πέθαναν κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Αυτό το μέγεθος του δείγματος και τον αριθμό των γεγονότων είναι επαρκώς μεγάλο για μια συνεπή εκτίμηση όλων των μεγεθών επίδρασης διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη διερευνητικής [23], [24].

Η σύγκριση της έκφρασης γονιδίου μεταξύ αντίστοιχων προ- και μετα-θεραπευτική δείγματα όγκων διεξήχθη σε ασθενείς με TRG2 και TRG3 (κάθε n = 22).

για την ανοσοϊστοχημική ανάλυση, πριν και μετά την θεραπευτική δείγματα όγκων από 21 ασθενείς με TRG1b, 21 ασθενείς με TRG2, 22 ασθενείς με TRG3 και των 16 ασθενών που έλαβαν θεραπεία μόνο με χειρουργική επέμβαση είχαν συμπεριληφθεί. Το κριτήριο επιλογής για αυτές τις αναλύσεις ήταν η διαθεσιμότητα των αντίστοιχων προ-θεραπευτική βιοψίες και μετα-θεραπευτική όγκων.

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη και η χρήση ανθρώπινων ιστών εγκρίθηκε από την τοπική Institutional Review Διοικητικό συμβούλιο στο Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου (αναφορά: 2158/08), καθώς και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε σύμφωνα με τις θεσμικές ρυθμίσεις

Εξαγωγή RNA και αντίστροφη μεταγραφή

το συνολικό RNA εξήχθη από φορμόλη σταθερό,. ενσωματωμένες σε παραφίνη (FFPE) ιστούς μετά τη χειροκίνητη μικροδιατομής των περιοχών όγκου αποτελείται από τουλάχιστον 50% των κυττάρων του όγκου. Το RNA καθαρίζεται με φαινόλη και χλωροφόρμιο και υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή όπως περιγράφεται [25].

Γονιδιακής Έκφρασης Ανάλυση

Τα 44 γονίδια που επιλέχθηκαν για ανάλυση με βάση το δυναμικό ρόλο τους στην CSC βιολογία περιλαμβάνονται στον πίνακα 2. η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) επί παραγγελία συστοιχίες χαμηλής πυκνότητας TaqMan® (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA). Κατάλληλα γονίδια αναφοράς που καθορίστηκαν από την ανάλυση των γονιδίων αναφοράς δέκα υποψηφίων στις 8 γαστρικά καρκινώματα χρησιμοποιώντας τον geNorm-αλγόριθμο [26].

IPO8

,

POLR2A

και

UBC

προσδιορίστηκαν να είναι τα πιο κατάλληλα γονίδια αναφοράς και ομαλοποίηση με βάση τη γεωμετρική μέση τιμή αυτών των τριών γονιδίων διεξήχθη όπως περιγράφεται [26] . Τα αντιδραστήρια, οι συνθήκες ποδηλασίας και του λογισμικού που περιλαμβάνονται στο σχετικό πληροφοριακό στοιχείο. έκφρασης σε σχέση γονιδίου ποσοτικά με τη μέθοδο της συγκριτικής ΔΔCt [27].

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

Το μονοκλωνικό αντίσωμα Notch2 (C651.6DbHN) λήφθηκε από την Αναπτυξιακών Μελετών Hybridoma Bank (DSHB, το Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Τμήμα Βιολογίας, Iowa City, USA). Η διαδικασία χρώσης και η εξέταση της ειδικότητας του αντισώματος με κηλίδωση Western περιγράφονται στο Στήριξη της Πληροφορίας και το σχήμα S1 Α.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση βαθμολογήθηκε με τυφλό τρόπο από δύο ανεξάρτητους ερευνητές (Ε.Β. και R.L). Κυτταροπλασματικά και πυρηνική χρώση αξιολογήθηκε χωριστά. Αρνητικό, αδύναμα, μέτρια ή έντονη χρώση εντάσεις βαθμολογήθηκαν ως 0, 1, 2 και 3, αντίστοιχα. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων με χρωματισμένο κυτταρόπλασμα /πυρήνας βαθμολογήθηκε ως 0 (αρνητική), 1 (& lt? 10%), 2 (10 στο & lt? 50%), 3 (50 έως & lt? 80%) και 4 (≥80 %).

Στατιστική Ανάλυση

Υπό όρους δοκιμές συμπέρασμα χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν τις βέλτιστες cut-off τιμές της γονιδιακής έκφρασης για τη σύνδεση με την επιβίωση των ασθενών και να καθορίζει τις τιμές-ρ κατάλληλη για μέγιστη επιλεγμένα στατιστικά στοιχεία [28]. τιμές γονιδιακής έκφρασης πάνω από ή ίση με τη βέλτιστη τιμή αποκοπής ορίστηκαν ως τιμές υψηλή έκφραση γονιδιακή έκφραση κάτω από την τιμή αποκοπής ορίστηκαν ως χαμηλή έκφραση. Τα ποσοστά επιβίωσης εκτιμήθηκαν σύμφωνα με καμπύλες Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με τεστ log-rank. Σχετικοί κίνδυνοι εκτιμήθηκαν με προσδιορισμό αναλογίες κινδύνου (HR) από Cox μοντέλα αναλογικών κινδύνων. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, κλιμακωτή εμπρός μεταβλητή επιλογή έγινε με βάση δοκιμές λόγου πιθανοφανειών. Η αναλογία του αριθμού των μεταβλητών του μοντέλου με τον αριθμό των γεγονότων περιορίστηκε έως 1:10 [24].

Οι συγκρίσεις των κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητών μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν με δοκιμές Mann-Whitney-U. Το χ

2-test και ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των σχετικών συχνοτήτων όπου ενδείκνυται. Στατιστικές διαφορές της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ ζευγαρωμένα δείγματα αναλύθηκαν με Wilcoxon τεστ κατάταξης.

Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ανάλυση συστάδων έγινε με Cluster 3,0 λογισμικού [29] και το λογισμικό Java TreeView (έκδοση 1.1.5r2) [30]. Σχετική δεδομένα έκφρασης του mRNA log-μετασχηματιστεί, διάμεση επίκεντρο και κανονικοποιούνται πριν από την εφαρμογή πλήρης σύνδεση ομαδοποίησης με πίνακα αποστάσεων με βάση τη συσχέτιση Pearson (μη κεντραρισμένη).

Μια βαθμολόγηση κινδύνου υπολογίστηκε συνοψίζοντας τα προϊόντα του πολλαπλασιασμού των ο συντελεστής παλινδρόμησης Cox κάθε γονιδίου στο μοντέλο με τις κανονικοποιημένες τιμές της γονιδιακής έκφρασης για κάθε ασθενή, ουσιαστικά όπως περιγράφεται [31] (λεπτομέρειες στο Υλικό και Μέθοδοι S1 και πίνακες S4 και S6).

Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο -sided και διεξάγεται σε ένα διερευνητικό τρόπο, με ένα επίπεδο σημαντικότητας 0,05 με τη χρήση του λογισμικού SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL 11.5) και R (R Ίδρυμα για στατιστικούς υπολογισμούς, Βιέννη, Αυστρία).

Η μελέτη είναι σύμφωνη με τις συστάσεις αναφοράς για το δείκτη όγκου προγνωστικές μελέτες (κριτήρια ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ) [32].

Η ανάλυση των δεδομένων του δημόσιου μικροσυστοιχιών

δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα σειρά της γονιδιακής έκφρασης των γαστρικών καρκινωμάτων με περιγραφές των κλινικών χαρακτηριστικών και την επιβίωση των ασθενών [33] ελήφθησαν από το αρχείο δεδομένων Εργαλεία BRB-Array (https://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα Εργαλεία για BRB-Array [34] (Υποστήριξη πληροφοριών) . Μόνο προχωρημένο γαστρικό καρκίνωμα (Τ3 /4) (n = 58) συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Οι τιμές βέλτιστη αποκοπής του

GSK3B

,

CTNNB1

, και

Notch2

έκφρασης προσδιορίστηκαν για μια συσχέτιση με την επιβίωση των ασθενών από τις δοκιμές υπό όρους συμπερασματολογία για μέγιστη επιλεγμένα στατιστικά στοιχεία ως που περιγράφεται παραπάνω.

Αποτελέσματα

Gene Expression και την επιβίωση των ασθενών

Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των 63 όγκων των ασθενών με TRG2 έδειξε, ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του

GSK3B

,

DNMT1

και

CTNNB1

σχετίζονταν σημαντικά με καλύτερη επιβίωση (test συμπερασματολογία υπό όρους: p = 0,006, 0,041 και 0,043, αντίστοιχα). Μια μέτρια συσχέτιση με καλύτερη επιβίωση παρατηρήθηκε για υψηλή έκφραση του

ABCG2

και

OLFM4

(p = 0,051, p = 0,055) και για χαμηλή έκφραση του

Notch2

(p = 0,071) (Πίνακας 3). Μονοπαραγοντική Cox-παλινδρόμησης ανάλυση έδειξε περίπου συγκλίνοντα αποτελέσματα (Πίνακας 4).

Η

Μια πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox συμπεριλαμβανομένων των

GSK3B

,

CTNNB1

,

DNMT1

και οι τυπικές προγνωστικές μεταβλητές σε GC, δηλαδή YPT, YPN, YPM και την κατηγορία εκτομή αποκάλυψε

GSK3B

ως το δεύτερο πιο σημαντικό ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα (HR: 0,128, 95% CI: 0,033 – 0,492, p = 0.003) μετά από μακρινή μετάσταση (Πίνακας S1).

μια ανάλυση σύμπλεγμα που περιλαμβάνει όλα τα γονίδια που αναλύθηκαν έδειξαν ότι δεν υπάρχουν ομάδες ασθενών που παρουσίασαν συσχέτιση με το OS. Μια ανάλυση σύμπλεγμα Wnt- και Notch γονίδια σηματοδότησης που σχετίζονται παράγεται η πιο σημαντική σχέση με το λειτουργικό σύστημα όταν

GSK3B

,

CTNNB1

και

Notch2

συμπεριλήφθηκαν (p = 0,002) (Σχήμα 1Α και Β). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης διασποράς, που ομαδοποιούνται τους ασθενείς σε τρεις ομάδες με διαφορετικούς συνδυασμούς υψηλή ή χαμηλή έκφραση του

GSK3B

,

CTNNB1

και

Notch2

, η οποία ορίστηκε από τις βέλτιστες cut-off-τιμές για την έκφραση του γονιδίου σε συνδυασμό με την επιβίωση του ασθενούς. Η ομάδα με το

GSK3B

υψηλή,

CTNNB1

υψηλή και

Notch2

χαμηλή έκφραση έδειξε την καλύτερη επιβίωση, ενώ η ομάδα με

GSK3B

χαμηλή,

CTNNB1

χαμηλή και

Notch2

υψηλή έκφραση είχε το χειρότερο συνολικό αποτέλεσμα (p & lt? 0.001, Εικόνα 1Γ).

Ομαδοποίηση των όγκων με βάση την έκφραση του

GSK3B

,

CTNNB1

και

Notch2

. Β) Οι καμπύλες Kaplan-Meier των συστάδων των ασθενών εμφανίζουν καλύτερη επιβίωση των ασθενών στη συστάδα 2 (διάμεση OS δεν επιτευχθεί) σε σύγκριση με το σύμπλεγμα 1 (διάμεση OS 36.7 mo, 95% CI 24,4 – 49,1) ή ένα σύμπλεγμα 3 (διάμεση OS 55.9 mo , 95% CI 16,7 – 95,0). Γ) Kaplan-Meier καμπύλες των ασθενών με βάση την κατηγοριοποίηση των όγκων, σύμφωνα με τις βέλτιστες τιμές cut-off για τα τρία γονίδια (

GSK3B

υψηλή

CTNNB1

υψηλή

Notch2

χαμηλή: δεν επιτεύχθηκε διάμεση OS?

GSK3B

χαμηλή

CTNNB1

χαμηλή

Notch2

υψηλή: διάμεση OS 18.0 mo, 95% CI μηδέν έως 39,5? Άλλα: διάμεση OS 42.1 mo, 95% CI 28,3 – 55,9). Δ) Ανάλυση των δημοσίως διαθέσιμων δεδομένων σειρά του γαστρικού καρκίνου [32]. Kaplan-Meier καμπύλες των ασθενών σε κατηγορίες ανάλογα με τη συνδυασμένη έκφραση

GSK3B

,

CTNNB1

και

Notch2

στους όγκους χρησιμοποιώντας βέλτιστες τιμές αποκοπής εμφανίζονται (

GSK3B

υψηλή

CTNNB1

υψηλή

Notch2

χαμηλή: διάμεση OS δεν έφτασε? Άλλα: διάμεση OS 14.6 mo, 95% CI 8,6 – 19,3 ). P-τιμές προσδιορίστηκαν από τη δοκιμασία log-rank.

Η

Ο υπολογισμός της βαθμολογίας κινδύνου βασίζεται σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο Cox αναλογικό παλινδρόμησης κινδύνου αυτών των τριών γονιδίων και dichotomisation των ασθενών, σύμφωνα με τη βέλτιστη cut- off τιμή για το OS σε έναν υψηλό (n = 37) και χαμηλής (n = 26) ομάδα κινδύνου έδειξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά για το OS (διάμεση επιβίωση των ασθενών χαμηλού και υψηλού κινδύνου: δεν επιτεύχθηκε και 37 μήνες αντίστοιχα? p & lt? 0.001). Επιπλέον, η διαφορά στα αντίστοιχα ποσοστά επιβίωσης σε 1, 2, 3 και 5 ετών μεταξύ της ομάδας χαμηλού και υψηλού κινδύνου ήταν στατιστικά σημαντικές (Πίνακας S5).

διαφορική γονιδιακή ανάλυση της έκφρασης μεταξύ των αντίστοιχων πριν και μετά θεραπευτικές δείγματα όγκου

επόμενο καθορίζεται, αν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που παρουσίασαν σημαντική ή μέτρια συσχέτιση με το OS (p & lt? 0.1, Πίνακας 3 και 4) διαφέρουν μεταξύ των προ-θεραπευτικών βιοψίες και η αντίστοιχη θέση τους Θεραπευτικές δείγμα όγκου. Επιπλέον,

POU5F1

,

LGR5

και

CCND1

αναλύθηκαν και όγκου δείγματα ασθενών με TRG2 ή TRG3 (κάθε n = 22) μελετήθηκαν.

Σε ασθενείς με TRG2, την έκφραση

Notch2

,

POU5F1

και

LGR5

αυξήθηκαν σημαντικά μεταξύ της προ- και μετα-θεραπευτική δείγματα (p = 0.002, 0.028 και 0.017, αντίστοιχα) και την έκφραση του

DNMT1

μειώθηκε (ρ = 0.009). Στην ομάδα με TRG3,

POU5F1

παρουσίασαν σημαντική αύξηση (p = 0,002), ενώ

DNMT1

και

CCND1

μειωθεί σημαντικά (p = 0,002 και 0,007, αντίστοιχα) .

Όσον αφορά την έκφραση των προγνωστικών-σχετικών γονιδίων

GSK3B

και

CTNNB1,

δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της προ και τα δείγματα μετα-θεραπευτική όγκου ( Πίνακας 5 και πίνακες S2 και S3).

η

Ανάλυση των διαθέσιμων στο κοινό Array δεδομένων

Για να αξιολογηθεί η γενική προγνωστική αξία του

GSK3B

υψηλή,

CTNNB1

υψηλή και

Notch2

χαμηλή πρότυπο έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε μια δημόσια διαθέσιμα δεδομένα συστοιχία έκφρασης που γαστρικών καρκινωμάτων [33]. Το σύνολο των στοιχείων που περιλαμβάνονται τα γονίδια που ενδιαφέρουν και τις σχετικές κλινικές πληροφορίες (OS, το στάδιο του όγκου) που είναι αναγκαία για να εκτελέσει μια ανάλογη ανάλυση. Ο προσδιορισμός των βέλτιστων cut-off τιμές της γονιδιακής έκφρασης για συσχέτιση με την επιβίωση και την αξιολόγηση της συνδυασμένης υπογραφή έκφραση

GSK3B

υψηλή,

CTNNB1

υψηλή και

Notch2

χαμηλή εντοπιστεί μια ομάδα από 10 ασθενείς οι οποίοι είχαν σημαντικά μεγαλύτερο OS (p = 0,017, διάμεση OS: δεν επιτεύχθηκε) σε σύγκριση με τους 47 εναπομείναντες ασθενείς (διάμεση OS: 14,0 mo, 95% CI: 8,7 -19,4) (Σχήμα 1D).

Ο υπολογισμός της βαθμολογίας κινδύνου για αυτή την ομάδα των ασθενών και dichotomisation των ασθενών, σύμφωνα με τη βέλτιστη τιμή αποκοπής για το OS παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερο λειτουργικό σύστημα για την ομάδα χαμηλού κινδύνου (n = 27) σε σύγκριση με την ομάδα υψηλού κινδύνου (n = 30), αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (διάμεση επιβίωση 21 έναντι 13 μηνών, p = 0,110). Λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορές στις αντίστοιχες ποσοστά επιβίωσης σε 1, 2 και 3 ετών έδειξε ανάλογα αποτελέσματα με την πιο εμφανής διαφορά στα 2 χρόνια με ένα ποσοστό επιβίωσης 45% των ασθενών χαμηλού κινδύνου και 21% των ασθενών υψηλού κινδύνου (p = 0,071 ) (Πίνακας S7).

ανοσοϊστοχημική ανάλυση του Notch2

για να αξιολογηθούν οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ των ζευγαρωμένων προ- και μετα-θεραπευτική όγκων σε επίπεδο πρωτεΐνης, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία και επικεντρώθηκε Notch2 (Σχήμα S1B και C). Αναλύσαμε τις ίδιες ομάδες ασθενών που είχαν μελετηθεί σε επίπεδο mRNA. Επιπλέον, συμπεριλήφθηκαν 21 ασθενείς με TRG1b και μια ομάδα ελέγχου από 16 ασθενείς που έλαβαν μόνο από τη χειρουργική επέμβαση.

Μια σύγκριση των εντάσεων κυτταροπλασματικής χρώσης μεταξύ των προ-θεραπευτική βιοψίες και αντίστοιχη μετα-θεραπευτική όγκοι τους αποκάλυψε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε χρώση ένταση στις μετα-θεραπευτική δείγματα από ασθενείς με TRG1b, 2 και 3 (ρ = 0.016, 0.001, και 0.017, αντίστοιχα). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές σε ασθενείς που έλαβαν μόνο με χειρουργική επέμβαση (p = 0,438) (Σχήμα 2). Το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων δεν μετεβλήθη σημαντικά. Αναφορικά με πυρηνική χρώση, μία σημαντική μείωση στην ένταση χρώσης στο δείγμα μετά τη θεραπευτική όγκος βρέθηκε στην ομάδα με TRG2 (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) και στην ομάδα ελέγχου που δεν αντιμετωπίζονται από τη χημειοθεραπεία (p = 0,016) . Μια σημαντική μείωση στο ποσοστό των κυττάρων με χρωματισμένο πυρήνες παρατηρήθηκε στην ομάδα με TRG1b (p = 0,005), TRG2 (ρ & lt? 0.001), TRG3 (p = 0,003), καθώς και στην ομάδα ελέγχου (ρ = 0.001).

οι αλλαγές των κυτταροπλασματικών εντάσεις χρώσης φαίνονται. Κάθε γραμμή υποδεικνύει την αλλοίωση του ανοσοϊστοχημική χρώση βαθμολογίας μεταξύ της προ-θεραπευτικής βιοψία (Pre) και τα αντίστοιχα μετα-θεραπευτική δείγμα όγκου (Post) για κάθε περίπτωση. P-τιμές προσδιορίστηκαν από το Wilcoxon signed rank test (ακριβές).

Η

Συζήτηση

Η μελέτη μας αναλύοντας την έκφραση που σχετίζονται CSC γονιδίων σε υπολειμματικά γαστρικά καρκινικά κύτταρα μετά την εισαγωγική χημειοθεραπεία εντοπίστηκαν γονιδιακή υπογραφή με υψηλή προγνωστική αντίκτυπο που αποτελείται από

GSK3B

, η

β-κατενίνης

γονίδιο

CTNNB1 και Notch2

. Είναι ενδιαφέρον, υψηλά επίπεδα έκφρασης του

CTNNB1

και

GSK3B

σχετίστηκαν με αυξημένη επιβίωση. Β-κατενίνη είναι ένα βασικό μόριο στη μετάδοση των σηματοδότηση Wnt στον πυρήνα και οδηγεί πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες [35]. Η ανώμαλη σηματοδότηση Wnt έχει αποδειχθεί έως και στο 46% των GCs, και οι δύο Wnt /

β-κατενίνης

και πολλαπλασιασμού /βλαστοκυττάρων υπογραφές έκφραση δείχνει την αντίστοιχη ενεργοποίηση μονοπατιού, συσχετίστηκαν με μειωμένη επιβίωση των ασθενών [36].

CTNNB1

επίπεδα του mRNA μπορούν να ρυθμίζουν σηματοδότηση Wnt [37], και Wnt δραστηριότητα έχει συνδεθεί με τον καρκίνο βλαστική ικανότητα στο κόλον [38]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα δεδομένα, μια αρνητική συσχέτιση του

CTNNB1

έκφραση σε υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα μετά τη χημειοθεραπεία και την επιβίωση των ασθενών θα αναμενόταν. Ωστόσο,

β

κατενίνης είναι επίσης μέρος του συμπλέγματος Ε-καδερίνης-κατενίνης και μεταβολές σε αυτό το συγκρότημα κυτταρική προσκόλληση έχουν συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση σε διάφορους όγκους [39]. Σε GC, αντικρουόμενα αποτελέσματα όσον αφορά τη σχέση μεταξύ

β

κατενίνης έκφρασης και την πρόγνωση των ασθενών υπάρχουν [40], [41].

Είναι σημαντικό να σημειωθεί, ότι GSK3B είναι επίσης μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη συμμετέχουν σε διάφορα δίκτυα σηματοδοσίας και ανταγωνίζεται σηματοδότηση Wnt μεσολαβώντας την αποικοδόμηση του

β-κατενίνης

, αν και έχει επίσης περιγραφεί μια λειτουργία Wnt-ενεργοποιώντας [42] – [44]. Αυξημένη έκφραση του

GSK3B

συσχετίστηκε με ευνοϊκή πρόγνωση στη μελέτη μας, η οποία είναι συνεπής με μια έκθεση της τριτοβάθμιας

GSK3B

έκφραση του mRNA που σχετίζεται με καλύτερη επιβίωση σε ωοθηκών υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα [45 ].

Ανώτατη

Notch2

επίπεδα έκφρασης συσχετίζεται με χειρότερη επιβίωση σε ασθενείς GC μας. Η οικογένεια υποδοχέα Notch περιλαμβάνει τέσσερα μέλη, και Notch1 και Notch2 έχουν ενοχοποιηθεί για την ενίσχυση του γαστρικού καρκίνου εξέλιξη [46], [47]. Επιπλέον, μια ένωση της έκφρασης Notch1 με κακή πρόγνωση έχει αναφερθεί [48], η οποία δεν είναι σύμφωνη με τα ευρήματά μας? Ωστόσο, λόγω των διαφορών στους πληθυσμούς της μελέτης, τα αποτελέσματα δεν είναι άμεσα συγκρίσιμα.

Λόγω του ιδιαίτερα σημαντική συσχέτιση του γονιδίου υπογραφής περιλαμβάνει

CTNNB1

,

GSK3B

και

Notch2

με την επιβίωση των ασθενών και του σημαντικού κινδύνου βαθμολογίας με βάση κατάταξη των ασθενών σε μια ομάδα υψηλού και χαμηλού κινδύνου, θα ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρον, αν αυτό ήταν που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία. Η σύγκριση των

GSK3B

και

CTNNB1

επίπεδα έκφρασης μεταξύ πριν και μετά την θεραπευτική δείγματα όγκων δεν αποκάλυψε σαφείς διαφορές, ενώ μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του

Notch2

ήταν θεμελιώ. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι

CTNNB1

και

GSK3B

έκφραση μπορεί να αντανακλά μια ιδιότητα του πρωτοπαθούς όγκου που δεν αλλοιώνεται από τη χημειοθεραπεία και ότι

Notch2

έκφραση στα υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα είναι τουλάχιστον εν μέρει, που σχετίζονται με αυτή τη θεραπεία.

μια ανάλυση της προγνωστικής σημασίας των τριών γονιδίων σε δημόσια διαθέσιμα στοιχεία έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο προηγμένης GC έδειξε μια σημαντική συσχέτιση για το συγκεκριμένο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης του

GSK3B

υψηλή,

CTNNB1

υψηλή και

Notch2

χαμηλή έκφραση και την αύξηση της επιβίωσης των ασθενών και μια παρόμοια τάση την εξέταση της ταξινόμησης των κινδύνων βαθμολογίας με βάση.

το εύρημα αυτό υποστηρίζει την ερμηνεία ότι η προγνωστική επίδραση που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας αντανακλά κυρίως την ιδιότητα του κύριου όγκου του στομάχου, γεγονός που υποδηλώνει έναν κρίσιμο ρόλο για αυτά τα γονίδια στη βιολογία αυτών των όγκων. Επιπλέον, η προγνωστική επίδραση που παρατηρείται θα μπορούσε να ενισχυθεί με μια αύξηση στην έκφραση του

Notch2

στο απομένον όγκου μετά τη χημειοθεραπεία. Έτσι, εάν επικυρώνονται σε μια προοπτική μελέτη, αυτή των τριών γονιδίων υπογραφή μπορεί να είναι χρήσιμη για τη διαστρωμάτωση του κινδύνου των ασθενών GC και επιπλέον μπορεί να καθοδηγήσει τη μετεγχειρητική θεραπεία μετά από εισαγωγική χημειοθεραπεία.

Τα αποτελέσματά μας θυμίζουν μια πρόσφατη μελέτη αναλύει ένα CSC- προερχόμενο γονίδιο υπογραφή που προβλέπει επανεμφάνιση καρκίνου του παχέος εντέρου και καταδεικνύει ότι η αυξημένη έκφραση του Wnt γονιδίων στόχων είναι ενδεικτική μιας ευνοϊκή πρόγνωση [48]. Οι συγγραφείς παρέχουν ενδείξεις ότι αυτή η ένωση πιο πιθανό αντανακλά την κατάσταση διαφοροποίησης του κακοήθους ιστού και όχι τον αριθμό των ΚΕΠ [49].

Κατά την εξέταση των τροποποιήσεων των

Notch2

έκφρασης μεταξύ των αντίστοιχων προ- και μετα-θεραπευτική όγκων, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι συγκρίνοντας την έκφραση του γονιδίου στο mRNA επίπεδο, δεν μπορεί να διακρίνει αν αυτές οι αλλαγές αντανακλούν μια σχετική εμπλουτισμό των κυττάρων που εκφράζουν αυτό το γονίδιο, είτε οφείλονται σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που επηρεάζουν τη μεταγραφή γονιδίων στο κύτταρα

per se

, ή αν οι αλλαγές αντανακλούν απλώς τις διαφορές δειγματοληψίας. Για να διευκρινιστεί το θέμα αυτό αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης Notch2 με ανοσοϊστοχημεία και περιλαμβάνονται οι όγκοι από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χειρουργική επέμβαση και μόνο. Με βάση την κυτταροπλασματική χρώση, τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν μια αύξηση στην έκφραση Notch2 στο επίπεδο πρωτεΐνης στα μετα-θεραπευτική όγκων και αποδεικνύουν ότι οι παρατηρούμενες διαφορές είναι πιθανό να περιορίζεται σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αύξηση στην έκφραση Notch2 σχετιζόταν με μια αύξηση στην κυτταροπλασματική ένταση χρώσης και όχι σε μια αύξηση στον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν Notch2. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει κατά εμπλουτισμό ενός υποπληθυσμού κυττάρων όγκου που εκφράζουν Notch2 και πιο πιθανό προτείνει μια προκαλούμενη από χημειοθεραπεία αύξηση στην έκφραση του γονιδίου στα κύτταρα όγκου, τα οποία μπορεί να σχετίζονται με τα καρκινικά βιολογικά χαρακτηριστικά μετά εισαγωγική θεραπεία. Ωστόσο, μια σαφής διάκριση μεταξύ αυτών των πιθανοτήτων μπορεί να περιορίζεται από την ημιποσοτική εκτίμηση της ανοσοϊστοχημική χρώση. Όπως παρόμοιες μεταβολές στην πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε σε όλες τις ομάδες των όγκων, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου θα θεωρούνται αυτές τις αλλαγές ως άσχετη με χημειοθεραπεία.

Ανεξάρτητα από τον μηχανισμό και την πραγματική φύση των κυττάρων υπολειμματικού όγκου που εκφράζουν

Notch2

, τα αποτελέσματά μας μπορεί να έχει θεραπευτικές επιπτώσεις. σηματοδότηση Notch έχει αναδειχθεί ως μια πιθανή νέα θεραπευτικό στόχο, και γ-σεκρετάσης αναστολείς, οι οποίες αναστέλλουν την επεξεργασία των υποδοχέων Notch, επί του παρόντος αξιολογηθεί σε κλινικές δοκιμές [50]. Η μελέτη μας δείχνει ότι η στόχευση της σηματοδότησης Notch μπορεί επίσης να αντιπροσωπεύει μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία ασθενών GC. Ως δυσμενείς προγνωστικοί επίδραση σχετίζεται μόνο με το

Notch2

και όχι

Notch1

, τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι μια λεπτομερή χαρακτηρισμό των επιμέρους υποδοχείς Notch και μια ενδελεχή λειτουργική έρευνα είναι υποχρεωτική και ευνοούν την περαιτέρω έντονα η ανάπτυξη των ανασταλτικών παραγόντων παράλογο ειδικά Notch.

Μία σημαντική αύξηση σε

POU5F1

έκφραση παρατηρήθηκε μετά τη χημειοθεραπεία στις εκτομή δείγματα στη μελέτη μας. Ο παράγοντας μεταγραφής POU5F1 είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της αυτο-ανανέωση, και υψηλή έκφραση του σε υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα μετά ακτινοχημειοθεραπεία συσχετίζεται με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [51]. Είναι ενδιαφέρον παρατηρήσαμε επίσης μια αυξημένη έκφραση του

LGR5

, μια πολλά υποσχόμενη εντερική δείκτη CSC, μετά τη χημειοθεραπεία σε όγκους με TRG2 [18]. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συμβατά με το δυναμικό εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων ανθεκτικών στο φάρμακο που εκφράζουν

POU5F1

ή

LGR5

, αλλά ο υποκείμενος μηχανισμός για αυτές τις αλλαγές και τις ιδιαίτερες ιδιότητες των κυττάρων που εκφράζουν αυτά τα γονίδια δεν έχουν ακόμη να προσδιορίζεται

στη μελέτη μας, παρατηρήθηκαν καμία συσχέτιση με την επιβίωση για την κυτταρική επιφάνεια μόρια CD44 ή CD133, δύο από τα οποία έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό υποθετικών CSCs σε διάφορους όγκους [4] -. [11]. Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζει τα πρόσφατα ευρήματα καταδεικνύουν ότι αυτά τα μόρια της κυτταρικής επιφάνειας δεν εντοπίζουν ΚΕΠ στην πρωτοβάθμια γαστρικών όγκων [20].

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η υπογραφή έκφραση του

GSK3B

υψηλή,

CTNNB1

υψηλή και

Notch2

χαμηλή σε κύτταρα υπολειπόμενο όγκο GC χημειοθεραπεία ανθεκτική είναι ένα ισχυρό προγνωστικό παράγοντα για την ευνοϊκή πρόγνωση των ασθενών. Αυτή η προγνωστική ενδιαφέρον καταδείχθηκε επίσης για τους ασθενείς GC χρησιμοποιώντας δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης.