Αφηρημένο

Αλλαγή στον ξενιστή ή /και των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) προφίλ μεθυλίωση του DNA είναι ίσως ένας από τους κύριους παράγοντες που ευθύνονται για την κακοήθη εξέλιξη των βλαβών του τραχήλου της μήτρας με τον καρκίνο. Για να διερευνήσουν αυτές τις αλλαγές μελετήσαμε 173 τραχηλικών δειγμάτων με διαφορετικές ποιότητες του τραχήλου της μήτρας βλάβης, από την κανονική σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η κατάσταση μεθυλίωσης των εννέα προωθητές κυτταρικού γονιδίου,

CCNA1

,

Cdh1

,

C13ORF18

,

DAPK1

,

HIC1

,

RARβ2

,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

, ερευνήθηκε από ειδικούς μεθυλίωσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (MSP). Η μεθυλίωση του HPV 18 L1 γονιδίου διερευνήθηκε επίσης με MSP, ενώ τα μεθυλιωμένα κυτοσίνες εντός τεσσάρων περιοχών, L1, 5’LCR, ενισχυτή, και υποκινητή του γονιδιώματος HPV16 που καλύπτουν CpG θέσεις 19 αξιολογήθηκαν με όξινο θειώδες αλληλούχιση. Στατιστικά σημαντική βιοδείκτες μεθυλίωση διάκριση μεταξύ του τραχήλου της μήτρας προκαρκινικές αλλοιώσεις από την κανονική του τραχήλου της μήτρας ήταν κυρίως

C13ORF18

και δεύτερον

CCNA1

, και εκείνων που διακρίνει τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας από το κανονικό ή του τραχήλου της μήτρας πρόδρομης βλάβες ήταν

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

. Επιπλέον, η ανάλυση μεθυλίωσης των επιμέρους τόπους CpG του γονιδιώματος HPV16 σε διαφορετικές ομάδες του δείγματος, ιδίως τα 7455 και 7694 sites, αποδείχθηκε ότι είναι πιο σημαντικό από τη συνολική συχνότητα μεθυλίωσης. Η πλειοψηφία των HPV 18 θετικά δείγματα περιείχαν τόσο μετουσιωμένο και μη-μεθυλιωμένων γονιδίων L1, και τα δείγματα με L1-γονίδιο μετουσιωμένο μορφές μόνη είχαν καλύτερη πρόγνωση όταν συσχετίζεται με τα προφίλ μεθυλίωσης των υποκινητών γονιδίων του κυττάρου ξενιστή ». Εν κατακλείδι, οι δύο βιοδείκτες κυτταρικές και ιικές μεθυλίωσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση του τραχήλου της μήτρας βλάβη εξέλιξη για την πρόληψη διηθητικού καρκίνου του τραχήλου

Παράθεση:. Μιλούτιν Gašperov Ν, Sabol Ι, Πλάνινιτς P, Γκρουμπίσιτς G, Fistonić Ι, Ćorušić Α, et al. (2015) Methylated υποδοχής κυττάρων Gene υποψήφιοι και Ανθρωπίνων Θηλωμάτων τύπου 16 και 18 Πρόβλεψη τραχηλικών βλαβών και του Καρκίνου. PLoS ONE 10 (6): e0129452. doi: 10.1371 /journal.pone.0129452

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Robert Dante, Institut national de la Santé et de la recherche médicale, Γαλλία

Ελήφθη: 24, Δεκεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 8 Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 9 Ιούνη, 2015

Copyright: © 2015 Μιλούτιν Gašperov et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το υπουργείο Επιστημών, Παιδείας και Αθλητισμού (επιχορήγηση 098-0982464-2510) της Κροατίας. MG υποστηρίχθηκε επίσης από το Έβδομο Πρόγραμμα Πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης για την έρευνα, την τεχνολογική ανάπτυξη και την επίδειξη στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης Δεν 316289. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η σχέση μεταξύ του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) την κατάσταση και τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CC) ανάπτυξη είναι καλά εδραιωμένη. Υπάρχουν τουλάχιστον 15 ογκογόνο ή υψηλού κινδύνου (HR) είδη-HPV, εκ των οποίων οι τύποι 16 και 18 συνεισφέρει έως 71% των περιπτώσεων καρκίνου [1]. Σε αντίθεση, το DNA μεθυλίωση των κυτταρικών και ιικών γονιδίων, με αποτέλεσμα την σίγηση της γονιδιακής έκφρασης, έχει μελετηθεί σε λιγότερο του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεσης [2], ακόμα κι αν είναι ένα από τα πρώιμα γεγονότα της καρκινογένεσης σε πολλούς άλλους τύπους καρκίνου του [3]. Μεθυλίωσης του DNA συμβαίνει συχνά σε κυτοσίνες σε CpG δινουκλεοτίδια γονιδίων για καταστολείς όγκων, παράγοντες μεταγραφής και ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου αναστέλλοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου με υποκινητή αποσιώπηση [4].

Η εμφάνιση CC είναι σχετικά σπάνια σε σύγκριση με την εκτεταμένη μόλυνση HPV ? οι περισσότερες γυναίκες είναι πιθανόν μολυνθεί με ένα τουλάχιστον αν όχι διάφορους τύπους HPV κατά τη σεξουαλική τους ζωή, και μόνο ένα μικρό ποσοστό θα αναπτύξει τραχήλου προκαρκινικών βλαβών και, στη συνέχεια, διηθητικός καρκίνος [5,6]. Παράγοντες που σχετίζονται με την εξέλιξη από προκαρκινικές αλλοιώσεις του τραχήλου της μήτρας,

i

.

e

. υποκλινική μόλυνση HPV με τον καρκίνο δεν είναι καλά εδραιωμένη. Τόσο ιού και ξενιστή κύτταρα γονίδια μπορούν να στοχευθούν από τη μηχανή μεθυλίωσης του DNA [4]. Το γεγονός ότι η μεθυλίωση κυτταρικών γονιδίων μπορούν να ανιχνευθούν ακόμη και σε δείγματα που λαμβάνονται μέχρι επτά ετών πριν από τη διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [7], ήταν ένας από τους λόγους για αυτή τη μελέτη. Επιπλέον, με βάση την παρατήρηση μας, οι ομάδες μεθυλίου είναι σταθερά για χρόνια μετά την απομόνωση του DNA και αποθήκευση στους -20 ° C και σύμφωνα με τη διάγνωση που λαμβάνονται κατά τη δειγματοληψία. Επιπλέον, η μεθυλίωση του HPV γονιδιώματος θα μπορούσε να είναι ένας μηχανισμός άμυνας ξενιστή για την καταστολή της μεταγραφής του ξένου DNA ή στρατηγική που χρησιμοποιεί ο ιός για να διατηρήσει μια μακροπρόθεσμη μόλυνση από διαφυγή immunosurveilance, ή και τα δύο [8,9]. Υποθέσαμε ότι η μεθυλίωση των θέσεων CpG σε HPV16 και HPV18 γονιδιώματα που καταστέλλει τη μεταγραφή των γονιδίων HPV είναι ένας από τους παράγοντες που ενδεχομένως έχουν σημασία στο αυχενικό καρκινογόνο εξέλιξη. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, επικεντρωθήκαμε στην HPV16 και HPV18 θετικών τραχηλικών δειγμάτων και ανέλυσε τη μεθυλίωση CpG των HPV16 και HPV18 γονιδιώματα, καθώς και πολλά βασικά γονίδια των κυττάρων του ξενιστή.

Υπάρχει μεγάλη ανάγκη για τη δημιουργία ακριβούς διάγνωσης και προγνωστική προφίλ μεθυλίωσης για ένα πάνελ γονιδίων που θα μπορούσαν να διακρίνουν μεταξύ της κανονικής τραχήλους, τραχηλικές αλλοιώσεις και καρκίνο. Μετά την εξέταση της βιβλιογραφίας με έμφαση για το θέμα αυτό με τη χρήση παρόμοιων πισίνα δείγμα και εργαστηριακό εξοπλισμό [10-14], έχουμε περιοριστεί η επιλογή σε εννέα κυτταρικά γονίδια που πρέπει να διερευνηθούν σε αυτή τη μελέτη:

CCNA1

(CCNA1, κυκλίνη Α1) ,

Cdh1

(Cdh1, καντερίνη 1, τύπου 1, E-cadherin),

C13ORF18

(KIAA0226L, KIAA0226-όπως),

DAPK1

(DAPK1, το θάνατο που σχετίζεται με πρωτεϊνική κινάση 1),

HIC1

(HIC1, υπερμεθυλίωση στον καρκίνο 1),

RARβ2

(RaRb, υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος, β),

hTERT1

,

hTERT2

(TERT, τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης), και

TWIST1

(TWIST1, οικογένεια συστροφή bHLH μεταγραφικός παράγοντας 1). Υποστηρικτής μεθυλίωση του

CCNA1

,

C13ORF18

και

RARβ2

οδηγεί σε διαταραχή του κυτταρικού κύκλου, η μεθυλίωση του

Cdh1

,

DAPK1

,

hTERT1

,

hTERT2

και

HIC1

συμβάλλουν στην εξέλιξη του καρκίνου με την αύξηση του πολλαπλασιασμού, εισβολή, και /ή μετάσταση, ενώ μεθυλιωμένο

TWIST1

σημαίνει διαταραγμένη κυτταρική διάκριση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει το προφίλ μεθυλίωσης των υποκινητών γονιδίων του κυττάρου ξενιστή και ταυτόχρονα την κατάσταση μεθυλίωσης του HPV16 και 18 γονιδιώματα για να προσδιορίσει την καλύτερη μεθυλίωση διαγνωστικούς και προγνωστικούς βιοδείκτες για την αυχενική αλλαγές.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Αυτή είναι μία από τις λίγες μελέτες σχετικά με μια ολοκληρωμένη σειρά συλλογή των τραχηλικών δειγμάτων με σαφώς καθορισμένες κυτταρολογικές /ιστοπαθολογική διάγνωση που αναλύει μεθυλίωσης του DNA πολλών υποκινητές κυτταρικού γονιδίου, καθώς και HPV16 και HPV18 γονιδιώματα. Παρόμοιες μελέτες έχουν διεξαχθεί από διάφορους συγγραφείς, αλλά είτε σε περιορισμένο αριθμό προαγωγών κυτταρικού γονιδίου ή περιορισμένο αριθμό ανέλυσε τους τύπους του HPV [15-17].

Υπάρχουν κάποια σχετικά δεδομένα της βιβλιογραφίας σχετικά με την κατάσταση μεθυλίωσης των κυτταρικών γονιδίων, τα ακόλουθα

CCNA1

,

Cdh1

,

C13ORF18

,

DAPK1

,

HIC1

,

RARβ2

,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές CaSki, SiHa και HeLa [12,18-20]. Στο παρόν, προφίλ μεθυλίωση των εννέα υποκινητές γονιδίων που δοκιμάζονται σε κυτταρικές σειρές CaSki και SiHa επιβεβαίωσε ότι όλα τα δοκιμαστεί υποκινητές γονιδίων μεθυλιώνονται σε CC. Στην κυτταρική σειρά HeLa, μόνο

DAPK1

προαγωγού μη μεθυλιωμένο. προφίλ Η μεθυλίωση του προαναφερθέντος υποκινητές γονιδίων αξιολογήθηκαν σε διαφορετικές ομάδες δείγματος: με κανονικό, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 και HSIL /CIN3 κυτταρολογία και ιστοπαθολογικά επιβεβαιώθηκε CC (Πίνακας 1). Στην ομάδα δείγματος με φυσιολογική κυτταρολογία υπήρχαν 20,0% (8/40) HPV θετικά με ένα ή περισσότερα HR-HPV, εκ των οποίων τέσσερα HPV16. Η πλειονότητα των δειγμάτων μεθυλιωμένα στις περισσότερες δοκιμαστεί υποκινητές γονιδίων.

Cdh1

βρέθηκε να είναι μεθυλιωμένα στις περισσότερες περιπτώσεις (82,5%), ακολουθούμενη από

HIC1

(67,5%),

RARβ2

(62,5%), και

DAPK1

(55,0%). Δεδομένου ότι έχουν βρεθεί υψηλά μεθυλιωμένη στην κανονική τράχηλο, αυτοί οι προαγωγοί γονιδίου δεν είναι ιδανικές βιοδείκτες μεθυλίωσης για την αυχενική καρκινογένεση. Σε αντίθεση με τα ευρήματά μας, Flatley

et al

. [21] βρέθηκε

Cdh1

υποστηρικτής μεθυλιώνονται σε μόλις 2,3% της κανονικής του τραχήλου της μήτρας δείγματα. Σε αντίθεση,

hTERT1

βρέθηκε μη μεθυλιωμένη σε όλες τις περιπτώσεις. Η

hTERT1

υποκινητή φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης μεθυλίωση είναι μη μεθυλιωμένες στην κανονική του τραχήλου της μήτρας. Όσον αφορά αυτό, υπάρχουν αντιφατικά ευρήματα του Ηλιόπουλου

et al

. [22] ο οποίος βρήκε το

hTERT1

υποστηρικτής μεθυλιώνεται σε ένα υψηλότερο ποσοστό 26,6% το φυσιολογικό τράχηλο. Το γεγονός ότι το προφίλ μεθυλίωση του

hTERT1

υποκινητή παραμένει σχετικά χαμηλή σε αυχενική πρόδρομος αλλαγές, δηλαδή LSIL /CIN 1 (12,5%), HSIL /CIN2 (5,1%) και HSIL /CIN3 (7,1%), και αυξήσεις στα δείγματα CC (70,0%) ευνοεί την υπόθεσή μας (Πίνακας 1). Παρά το γεγονός ότι, ελαφρώς λιγότερο εξέφρασε παρόμοια δυναμική μεθυλίωση παρατηρείται με τις

hTERT2

και

TWIST1

υποστηρικτές. Κατά συνέπεια, υπερμεθυλίωση των τριών υποκινητές γονιδίων,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

θα μπορούσε να είναι καλό τραχήλου της μήτρας βιοδεικτών του καρκίνου, μετά την επιβεβαίωση σε μεγαλύτερα πισίνα του δείγματος. Στην ομάδα δείγματος με διάγνωση LSIL /CIN1 υπήρχαν 55,0% (22/40) HPV θετικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων έξι HPV16 και HPV18 εννέα. Οι

Cdh1

και

HIC1

υποστηρικτές υπέστησαν μεθυλίωση στο μεγαλύτερο ποσοστό των περιπτώσεων (75,0%, και τα δύο), ενώ

TWIST1

ήταν μη μεθυλιωμένα σε όλες τις περιπτώσεις. Σε αντίθεση, Flatley

et al

. [21] έχουν βρει

Cdh1

και

HIC1

υποστηρικτές μεθυλιώνονται σε πολύ μικρότερη έκταση σε δείγματα με την ίδια διάγνωση, σε 1,8% και 7,7% των περιπτώσεων, αντίστοιχα. Σύμφωνα με το εύρημα μας, υψηλή

HIC1

μεθυλίωσης (67,6%) και εντελώς έλλειψη μεθυλίωσης σε

TWIST1

υποκινητή μέσα στην ίδια διάγνωση βρέθηκε από Feng

et al

. [23]. HPV ανιχνεύτηκε σε 32 από 40 δείγματα (80,0%) με τη διάγνωση HSIL /CIN2, συμπεριλαμβανομένων έξι HPV16 και HPV18 επτά. Λόγω της αποτυχημένη μετατροπή όξινο θειώδες σε ένα δείγμα, η ομάδα μελέτης περιελάμβανε επιπλέον 39 δείγματα /CIN2 HSIL, τα οποία χαρακτηρίζονται ειδικά ως τέτοιες από την κροατική του τραχήλου της μήτρας ταξινόμηση κυτταρολογίας, «του Ζάγκρεμπ το 2002» [24], προκειμένου να αποκρυπτογραφήσουν λεπτές διαφορές μεταξύ των LSIL και HSIL. Εδώ πάλι, η πλειοψηφία των δειγμάτων μεθυλιωμένα στις περισσότερες δοκιμαστεί υποκινητές γονιδίων,

Cdh1

που μεθυλιωμένα στις περισσότερες περιπτώσεις (79,5%), ενώ

hTERT2

ήταν μη μεθυλιωμένη σε όλες τις περιπτώσεις. Μεταξύ των 42 δειγμάτων με HSIL /CIN3 διάγνωση του HPV ανιχνεύθηκε σε 36 δείγματα (85,7%), συμπεριλαμβανομένων των 17 HPV16 και HPV18 πέντε. παρατηρήθηκε ο μεγαλύτερος αριθμός των μεθυλιωμένων περιπτώσεις στο

Cdh1

(76,2%), και το χαμηλότερο στην υποκινητή

hTERT2

(2,4%). Άλλοι συγγραφείς ανέφεραν μεθυλίωση των ίδιων γονιδίων εντός της ίδιας ομάδας δείγμα αλλά ελαφρώς διαφορετικά ποσοστά μεθυλίωσης ανά κάθε υποκινητή του γονιδίου [21,23]. Ωστόσο, όσον αφορά τη δυναμική του προφίλ μεθυλίωσης αυτών των δύο υποκινητών γονιδίων, φαίνεται ότι

Cdh1

προαγωγός υπερμεθυλίωση συνεχώς, ενώ

hTERT2

υποκινητής είναι πολύ λιγότερο μεθυλιωμένο από φυσιολογική έως υψηλού βαθμού τραχηλικών βλαβών . Στην ομάδα CC υπήρχαν 81,8% (9/11) δείγματα θετικά για HR-HPV, εκ των οποίων επτά HPV16 και HPV18 μία. Ένα δείγμα CC, στάδιο IV-A, ιδιαίτερα νεκρωτικές, HPV-αρνητική και μη μεθυλιωμένα είτε γονίδιο υποκινητή εξαιρέθηκε από περαιτέρω ανάλυση. Οι περισσότεροι από τους υποστηρικτές διερευνηθεί γονίδιο μεθυλιώνεται σε αυτή την ομάδα του δείγματος, που κυμαίνονται από 60,0% για το

DAPK1

στο 100,0% για το

Cdh1

υποκινητή. Μεταξύ CC διάγνωση

hTERT2

υποστηρικτής μεθυλιώθηκε το 60,0% των δειγμάτων. Στην περίπτωση του

hTERT

υψηλότερη έκφραση του γονιδίου επιτυγχάνεται με υπερμεθυλίωση. Στη μελέτη της Kumari

et al

. [25] αγωγή με 5-αζακυτιδίνη και επακόλουθη απομεθυλίωση

hTERT

υποκινητή οδήγησαν σε μείωση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτό ήταν σε αντίθεση τι έχει παρατηρηθεί για τους συμβατικούς ογκοκατασταλτικά γονίδια. Η πιθανή εξήγηση του φαινομένου αυτού είναι ότι η μεθυλίωση του

hTERT

υποκινητές είναι ετερογενής και ότι μόνο μη μεθυλιωμένων αλληλίων εκφράζονται [12]. Πράγματι, παρατηρήθηκε ότι στη μελέτη του Zinn

κ.ά.

. [26], όπου οι περισσότερες από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που είχαν

hTERT

υποκινητή πυκνά μεθυλιωμένο, αλλά CpGs γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής ενός σημαντικού αριθμού

hTERT

αλληλόμορφα ήταν μεθυλιωμένη. Εν κατακλείδι, στο παρόν παρατηρείται υπομεθυλίωση στην κανονική τράχηλο σημαίνει χαμηλότερη έκφραση του

hTERT

γονιδίων και χαμηλότερη δραστηριότητα της τελομεράσης. Αυτό μπορεί να εξηγήσει καλύτερη πρόγνωση των ασθενών με CC των οποίων τα καρκινικά κύτταρα στερούνται

hTERT

μεθυλίωση υποκινητή [27]. Τα ευρήματα μεθυλίωση υποστηρικτής των άλλων συγγραφέων σε δείγματα CC συσχετίζονται καλά με τη δική μας. Η μεθυλίωση κυμαίνεται πάνω από 65% για το

hTERT

και

DAPK

υποστηρικτές [22], 41% για το

DAPK

, και λιγότερο για

Cdh1

,

HIC

και

RARβ

υποστηρικτές [21]. Για έναν μεγαλύτερο αριθμό των δικαιούχων,

hTERT

,

Cdh1

,

DAPK

,

HIC1

και

RARβ

η μεθυλίωση ποικίλλει ακόμη περισσότερο, που κυμαίνονται από 0 έως 100% [27-29].

Η

Εδώ, έχουμε εντοπίσει πέντε βασικοί υποψήφιοι μεθυλίωση των βιοδεικτών,

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

, και

TWIST1

, των οποίων η κατάσταση μεθυλίωσης υποστηρικτής διακρίνει CC από την κανονική και HSIL δείγματα /CIN3 (Πίνακας 2). Η εξέλιξη από HSIL /CIN1 να HSIL /CIN2 φαίνεται να σχετίζεται με υψηλότερο μεθυλίωση του

RARβ2

και

TWIST1

υποστηρικτής, αν και η στατιστική σημαντικότητα είναι μικρότερη για

RARβ2

( ακριβής δοκιμασία Fisher ρ = 0.024696) από ό, τι

TWIST1

(ακριβής δοκιμασία Fisher ρ = 0,001030). Το τελευταίο στάδιο του τραχήλου της μήτρας αλλαγές, CC φαίνεται να χαρακτηρίζεται από υψηλή μεθυλίωση του

hTERT1

,

hTERT2

, και

TWIST1

υποστηρικτής, και σε μικρότερο βαθμό σε

RARβ2

υποκινητή. Εμείς ομαδοποιούνται και του τραχήλου της μήτρας προκαρκινικές αλλοιώσεις (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 και HSIL /CIN3) για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ της κανονικής, τραχηλικών αλλοιώσεων, και CC. Σε μια τέτοια σύγκριση

CCNA1

και

C13ORF18

υποστηρικτές αποκάλυψε ότι είναι στατιστικά υπερμεθυλίωση σημαντικά στην αυχενική προκαρκινικές αλλοιώσεις σε σύγκριση με φυσιολογικούς τραχήλους (ακριβής δοκιμασία Fisher ρ = 0,023742 και 0,022603, αντίστοιχα). Επιπλέον, η μεθυλίωση αυτών των δύο δυνητικών βιοδείκτες σε σύγκριση με φυσιολογικούς τραχήλους φαίνεται να είναι ένα πρώιμο γεγονός στην αυχενική καρκινογένεσης, με

C13ORF18

προαγωγό που στατιστικώς σημαντικά μεθυλιώνεται LSIL /CIN1 και HSIL /CIN2 (ακριβής δοκιμή Fisher ρ = 0.036738 και στις δύο περιπτώσεις), ενώ

CCNA1

υποκινητή που μεθυλιώνονται στατιστικά σημαντικά σε HSIL /CIN3 (ακριβής δοκιμασία Fisher ρ = 0,010994). Ως εκ τούτου, στατιστικά σημαντικές διαφορές μεθυλίωσης μεταξύ της κανονικής cervices, βλάβες και CC έχουν παρατηρηθεί για πέντε υποστηρικτές του γονιδίου:

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST

. Εν ολίγοις, αυτοί οι υποκινητές γονιδίων αντιπροσωπεύουν το δυνατόν καλή βιοδείκτες μεθυλίωση για την ανίχνευση του τραχήλου της μήτρας αλλαγές και θα μπορούσε να είναι χρήσιμο στην κλινική πρακτική. Φαίνεται ότι στην αυχενική καρκινογένεσης υπάρχει ένας καταρράκτης της μεθυλίωσης του DNA. Κατά κύριο λόγο ορισμένοι υποκινητές γονιδίων είναι μεθυλιωμένα, όπως

C13ORF18

ακολουθούμενο από

CCNA1

, και στη συνέχεια τους άλλους, δηλαδή

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

(Σχήμα 1)

Η

LSIL, χαμηλού βαθμού πλακώδους επιθηλίου ενδοεπιθηλιακή βλάβη.? HSIL, υψηλής ποιότητας πλακωδών κυττάρων ενδοεπιθηλιακή βλάβη? CIN, τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία? ↑, υπερμεθυλίωση? ↓, μεθυλιωμένος.

Η

Άλλοι συγγραφείς προσδιορίζονται μερικά από τα επιλεγμένα γονίδια τόσο καλή βιοδείκτες, αλλά κυρίως ως ένα ενιαίο βιοδείκτη να διακρίνει μια συγκεκριμένη διάγνωση. Για παράδειγμα, Yang

et al

. [13] επιλεγεί

CCNA1

και

C13ORF18

τόσο καλή βιοδείκτες μεθυλίωση να διακρίνει δείγματα με CIN2 + διάγνωση από φυσιολογικά δείγματα. Kitkumthorn

et al

. [18] επέλεξε υπερμεθυλίωση

CCNA1

υποστηρικτής ως βιοδείκτη για την έγκαιρη διάγνωση της εν τω βάθει CC, De Wilde

et al

. [12] επέλεξε διαφοροποιούνται μεθυλίωση του

hTERT

για τη διάγνωση CC, ενώ Eijsink

et al

. [14] εντοπίζονται

C13ORF18

και

TERT

, μαζί με το

EPB41L3

και

JAM3

, ως το καλύτερο βιοδείκτες μεθυλίωσης για CC. Ως εκ τούτου, από τη βιβλιογραφία, είναι δύσκολο να προσδιοριστεί καλύτερα βιοδείκτες μεθυλίωσης. Σε μια μελέτη του γονιδιώματος σε επίπεδο με τη μέθοδο Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip μας επιβεβαίωσε το υψηλό επίπεδο μεθυλίωσης του

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

υποστηρικτές στην CC σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό. Ωστόσο, η χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση οδήγησε σε ένα άλλο σύνολο των γονιδίων ως υποψήφιος βιοδείκτες,

RGS7

,

LHX8

,

STGALNAC5

,

TBX20

,

KCNA3

, και

ZSCAN18

[30], η οποία δεν αξιολογήθηκαν στην παρούσα. Επιπλέον, στην ίδια μελέτη [30], με τη χρήση των συνόλων δεδομένων έκφρασης mRNA για εξωτερική επικύρωση, έχουμε επιδείξει καλές συνοχή μεταξύ των δεδομένων μεθυλίωσης του DNA και της συστοιχίας γονιδιακής έκφρασης. Ως εκ τούτου, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η μεθυλίωση του DNA είναι μια καλή ένδειξη της γονιδιακής έκφρασης? ως εκ τούτου, οι δοκιμές μεθυλίωση του DNA είναι καλή και επαρκής επιλογή για τη βελτίωση της διάγνωσης, στάσης και προγνωστικά στην κλινική έρευνα, λόγω του κόστους και του χρόνου όφελος σε σχέση με την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης.

Ερευνήσαμε επίσης την κατάσταση μεθυλίωσης CpG του HPV16 και HPV18 γονιδιώματα σε συσχέτιση με κυτταρολογική /ιστοπαθολογική διάγνωση και την κατάσταση μεθυλίωσης των κυτταρικών γονιδίων. Τα μοτίβα μεθυλίωσης του γονιδιώματος HPV16 έχει αναλυθεί από θειώδους αλληλουχίας για κάθε ένα από 19 τοποθεσίες CpG λόγω αντιφατικά δεδομένα της βιβλιογραφίας. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα μοτίβα μεθυλίωσης του γονιδιώματος HPV16 σε 12 δείγματα με διαφορετικές διαγνώσεις, συσχετίζονται με εκείνες της κυτταρικής γραμμής SiHa (S1 πίνακα). Οι περισσότεροι μεθυλιωμένα CpGs σε γονιδίωμα HPV16 των κυττάρων SiHa ανιχνεύθηκαν σε L1 και περιοχή προαγωγέα, ενώ οι περισσότερες μη μεθυλιωμένες CpGs του στην περιοχή 5’LCR και ενισχυτή (Σχήμα 2). Συχνά τα δύο αντίγραφα του HPV16, μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων βρέθηκαν σε όλα διάγνωση που κυμαίνονται από φυσιολογικούς τραχήλους σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, στην οποία τα προφίλ μεθυλίωση των δειγμάτων CC ήταν πολύ παρόμοιο με ένα από κυτταρική σειρά SiHa. Σε σχεδόν όλα τα δείγματα με φυσιολογική κυτταρολογία (Ν) το προφίλ μεθυλίωση ήταν διαφορετικές από εκείνες σε κύτταρα SiHa και τα δείγματα CC. Και οι τρεις ομάδες δειγμάτων με αυχενική πρόδρομος αλλαγές (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 και HSIL /CIN3) είχαν πολύ παρόμοια προφίλ HPV16 μεθυλίωσης. Εξαιτίας αυτής της ομοιότητας του προτύπου μεθυλίωσης, οι τρεις αυχενική πρόδρομος αλλαγές εμφανίζονται μαζί στο Σχ 3Β. Επιπλέον, όλες οι τοποθεσίες CpG που μεθυλιωμένα και μη μεθυλιωμένη στο ίδιο δείγμα παρουσιάζονται ως μεθυλιωμένο (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τα ευρήματα της Kalantari

et al

. [31] ότι το γονιδίωμα του HPV είναι συνήθως υπερμεθυλιωμένων και χρειάζεται μόνο ένα αντίγραφο για να είναι μεταγραφικά ενεργή. Επιπλέον, όπως παρουσιάζεται στο παρόν, για ένα καλό μεθυλίωση βιοδείκτη είναι πιο σημαντικό να προσδιοριστεί με ακρίβεια το ποσοστό μεθυλίωσης ειδικές θέσεις CpG εντός του γονιδιώματος HPV16 από τη συνολική μεθυλίωση σε διαφορετικές ομάδες δειγμάτων. Στο παρόν, παρατηρήσαμε ότι η αυχενική προκαρκινικών αλλοιώσεων ομάδα είχε το χαμηλότερο συνολικό ποσοστό μεθυλίωσης (33%), ενώ τα δείγματα με φυσιολογική κυτταρολογία και CC είχαν συνολικό ποσοστό μεθυλίωσης 53%, και οι δύο. Αυτά τα αποτελέσματα είναι εν μέρει σε διαφωνία με τα συμπεράσματα των άλλων συγγραφέων, οι οποίοι ισχυρίζονται ότι η μεθυλίωση του HPV16 είναι το χαμηλότερο στην κανονική και η υψηλότερη στα δείγματα CC [17,32,33]. Σε αυτή τη μελέτη, από την ομάδα των 19 εξετάστηκαν CpG θέσεις του γονιδιώματος HPV16, δύο φαίνεται να είναι η πιο σημαντική, CpG 7455 (5’LCR) και CpG 7694 (ενισχυτής), στην οποία η πλήρης έλλειψη μεθυλίωσης βρέθηκε στα δείγματα καρκινώματος και SiHa κυτταρική γραμμή, ενώ είχαν υψηλά μεθυλιωμένη (100% της κανονικής cervices και 83% του προδρόμου βλαβών σε CpG 7455) και μέτρια μεθυλιωμένου (75% της κανονικής cervices και το 33% των πρόδρομων βλαβών σε CpG 7694) και σε άλλες ομάδες δείγμα. Περαιτέρω, CpGs στις θέσεις 7434 και 7461 ήταν μεθυλιωμένα στο 50% των δειγμάτων με φυσιολογική κυτταρολογία αλλά όχι μεθυλίωση παρατηρήθηκε σε πρόδρομες βλάβες, CC ή κυτταρική γραμμή SiHa. Σε αντίθεση, CpG 31 μεθυλιώθηκε μόνο σε δείγματα CC (50%) και την κυτταρική γραμμή SiHa. CpGs στις θέσεις 37 και 52 μεθυλιώθηκαν σε% δείγματα 75 με φυσιολογική κυτταρολογία και 100% της πρόδρομες βλάβες, CC και κυτταρική γραμμή SiHa. CpG 58 μεθυλιώθηκε σε% δείγματα 50 με φυσιολογική κυτταρολογία και 100% του προδρόμου αλλοιώσεων και CC, καθώς και σε κυτταρική γραμμή SiHa. Η μεθυλίωση δεν παρατηρήθηκε σε CpGs στις θέσεις 7535 και 7862 και στις δύο ένα από τα δείγματα ή κυτταρικής γραμμής SiHa. Σε αντίθεση, CpG 7682 μεθυλιώθηκε σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν, πρόδρομος τραχηλικών αλλοιώσεων, CC και κυτταρική γραμμή SiHa (Σχήματα 2 και 3). έχουν διαφορετικές συχνότητες μεθυλίωσης στο γονιδίωμα HPV16 στις ίδιες θέσεις CpG από τα ευρήματά μας και σε διαφορετικά συμπεράσματα έχουν αναφερθεί από Kalantari

et al

. [34]. Ωστόσο, παρόμοια ευρήματα στο προφίλ μεθυλίωσης CpG σε δείγματα CC με το δικό μας προσδιορίστηκαν στη μελέτη της Bhattacharjee και Sengupta [35]. Έτσι, η πλήρης έλλειψη ή η χαμηλή μεθυλίωση CpG σε 5’LCR και ενισχυτή, και όχι σε περιοχή προαγωγού είναι ζωτικής σημασίας για τον HPV δραστηριότητα και, κατά συνέπεια αθανατοποίηση κυττάρων ξενιστών

N, φυσιολογική κυτταρολογία.? Εγώ, LSIL /CIN1 διάγνωση? II, LSIL /CIN2 διάγνωση? ΙΙΙ, HSIL /CIN3 διάγνωση? CC, ο καρκίνος του τραχήλου? SiHa, του τραχήλου της μήτρας καρκίνου κυτταρική γραμμή? Μ, μετουσιωμένες? U, μη μεθυλιωμένες? Μ + U, μετουσιωμένο και μη μεθυλιωμένα με κυρίως μεθυλιωμένο DNA? U + M, μετουσιωμένο και μη μεθυλιωμένα με κατά κύριο λόγο μη μεθυλιωμένου DNA

Η

Κανονική cervices (Ν = 40).? του τραχήλου της μήτρας πρόδρομες βλάβες, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 και HSIL /CIN3 (Ν = 121)? Δείγματα κολπικού καρκινώματος (Ν = 10). Οι θέσεις CpG που ήταν μεθυλιωμένα και μη μεθυλιωμένη στο ίδιο δείγμα που παρουσιάζεται εδώ ως μεθυλιωμένο.

Η

Διερεύνηση HPV 18 L1 γονίδιο μεθυλίωσης σε 22 δείγματα (S1 Πίνακας) με την μέθοδο MSP παρατηρήσαμε ότι συσχετίζεται με την κυτταρολογική /ιστοπαθολογική διάγνωση και μπορεί να προβλέψει καλύτερη πρόγνωση της νόσου. Ιδιαίτερα, τα περισσότερα από τα δείγματα που αναλύθηκαν και κυτταρική σειρά HeLa που περιέχονται τόσο μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων μορφές HPV 18 L1 γονίδιο (Πίνακας 3). Το γεγονός είναι ότι η L1-γονίδιο παραμένει ανέπαφη σε τραχηλικές αλλοιώσεις και τα δείγματα καρκίνου, ακόμη και όταν HPV γονιδιώματος ενσωματώνει σε ένα κύτταρο-ξενιστή [36]. Η μεθυλίωση του HPV 18 L1 γονιδίου εντός του τραχήλου της μήτρας πρόδρομης αλλοιώσεις και δείγματα CC ήταν σύμφωνη με τη διάγνωση και το προφίλ μεθυλίωση κυτταρικής γραμμής HeLa. Ιδιαίτερα, τα δείγματα μας περιέχει μόνο μεθυλιωμένη μορφή HPV18 L1-γονιδίου είχαν καλύτερη πρόγνωση?

i

.

e

. σε αυτά τα δείγματα κυτταρικών γονιδίων μεθυλιώθηκαν σε χαμηλότερο βαθμό και κυρίως εκείνα που δεν έχουν αποδειχθεί στατιστικά ως πιθανοί βιοδείκτες. Turan

et al

. [37,38] βρήκε επίσης και τα δύο αντίγραφα του HPV 18 στην κυτταρική σειρά HeLa, με την περίσσεια του μεθυλιωμένη μορφή, ενώ υπερμεθυλίωση HPV 18 L1 σε όλα τα καρκινώματα και η έλλειψη μεθυλίωσης στην πλειονότητα των ασυμπτωματικών επιχρισμάτων και χαμηλού βαθμού αλλοιώσεις. Επιπλέον, Badal

et al

. [39] έχουν δηλώσει ότι γονιδίωμα HPV18 υπερμεθυλίωση στην κυτταρική σειρά και CC δείγματα HeLa δείχνουν ότι ο HPV είναι πράγματι στόχαστρο μηχανήματα μεθυλίωση κυτταρικό DNA που μπορεί να επηρεάσουν τις καθυστερήσεις και τις αρχές της μεταγραφής του γονιδίου.

Η

Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να επικυρώσει το χρήση μεθυλιωμένο HR-HPV ως έξυπνη και /ή διαγνωστικών βιοδείκτη για τον κίνδυνο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας μεταξύ των HPV-θετικών γυναικών [32,40,41]. Ιδιαίτερα, MSP εναρκτήρες για γονιδιώματος HPV16 που καλύπτουν CpGs 7455 και 7694 θα πρέπει να σχεδιαστεί έτσι ώστε να αποφευχθεί η δαπανηρή και χρονοβόρα διθειώδες αλληλούχιση, και, ως εκ τούτου, να απλοποιήσει κλινικές εφαρμογές. υπόψη μας HPV δοκιμών γονιδιώματος μεθυλίωση μαζί με τη δοκιμή κυτταρικής γονιδιακής μεθυλίωση όπως διαλογή των γυναικών υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, επίσης, έχει ήδη συζητηθεί [10,27,42], αλλά το ερώτημα παραμένει ποιους τύπους του HPV, οι οποίες περιοχές HPV γονιδιώματος και η οποία κυτταρικά γονίδια να αναλυθούν. Πιστεύουμε ότι τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη, η τεκμαρτή μετά την επιβεβαίωση σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων, θα μπορούσε να επιλύσει αυτές τις ανησυχίες. Ως εκ τούτου, θα προτείναμε ότι όλοι HR-HPV-θετικές γυναίκες να ελεγχθεί για μεθυλίωση του

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

και

TWIST1

υποστηρικτές, καθώς και τουλάχιστον HPV16 CpG 7455 και 7694 sites, και HPV18 L1-γονίδιο μεθυλίωσης. Τα αποτελέσματα των δοκιμών θα πρέπει να συσχετίζονται, και σε περίπτωση αυξημένης μεθυλίωσης των γονιδίων υποψήφιο βιοδείκτη και άλλαξε το προφίλ μεθυλίωσης του HPV16 και 18 γυναίκες γονιδίωμα θα πρέπει να διαχειρίζονται και στη συνέχεια να παρακολουθείται πιο προσεκτικά (Σχήμα 1). Επιπλέον, με βάση την πραγματική γνώση για το κινητό και το ιικό μεθυλίωσης του DNA με την πιθανή χρήση ναρκωτικών απομεθυλίωση [27,43], όπως μεθυλτρανσφεράσες DNA αναστολείς θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως θεραπευτικά μέσα, αλλά θα πρέπει να εφαρμόζεται με μεγάλη προσοχή.

Υλικό και Μέθοδοι

μελέτη ομάδα

Η ομάδα μελέτης περιελάμβανε 173 του τραχήλου της μήτρας δείγματα των γυναικών με φυσιολογική κυτταρολογία, προκαρκινικές αλλοιώσεις (ενδοεπιθηλιακές βλάβες πλακωδών κυττάρων, χαμηλού βαθμού, LSIL και υψηλής ποιότητας, HSIL),

i

.

e

. τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) βαθμού 1 έως 3, κατατάσσονται σύμφωνα με την «Ζάγκρεμπ το 2002», που είναι σύμφωνη με το «Σύστημα Bethesda NCI 2001» [24], και ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε CC [44]. Από την πισίνα των δειγμάτων που συλλέγονται για την τακτική διάγνωση στο Μπόσκοβιτς Ινστιτούτο Rudjer, Ζάγκρεμπ, 40 δείγματα με φυσιολογική κυτταρολογία, 40 με LSIL /CIN1, 40 με HSIL /CIN2 και 42 δείγματα με HSIL /CIN3 διάγνωση ελήφθησαν τυχαία για αναλύσεις μεθυλίωση. Επιπλέον, 11 CC δείγματα (8 πλακώδες καρκίνωμα και 3 αδενοκαρκίνωμα) ελήφθησαν με κυτταρική ψήκτρα λίγο πριν από τις χειρουργικές επεμβάσεις.

Δήλωση Ηθικής

προφορική συγκατάθεση του ασθενούς /συμμετέχοντα ελήφθη για κάθε δείγμα του τραχήλου της μήτρας ότι συλλέχθηκε τόσο για διαγνωστικούς και ερευνητικούς σκοπούς HPV. Γραπτή ασθενή /συμμετέχοντα συναίνεση αυτή δεν ήταν αναγκαία, διότι κάθε του τραχήλου της μήτρας δείγμα συνοδεύεται από τα έντυπα αίτησης Εργαστήριο υπηρεσία, η οποία θα πρέπει να υπογραφεί και να εγκριθεί από την εξάσκηση ιατρό ο οποίος είναι υπεύθυνος για την προφορική συγκατάθεση του ασθενούς /συμμετέχοντα (που καταγράφεται από τον κλινικό ιατρό σχετικά με το Εργαστήριο αίτηση υπηρεσίας μορφές). Έτσι, μόνο τα δείγματα των ασθενών /συμμετεχόντων που συμφωνήθηκε προφορικά συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Τα σχετικά δεδομένα του ασθενούς (ηλικία, κυτταρολογική διάγνωση, την ανίχνευση του HPV και αποτέλεσμα πληκτρολόγηση) και η εκχύλιση του DNA περαιτέρω κωδικοποιημένα και επεξεργασία ανώνυμα στο εργαστήριο. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του ερευνητικού έργου «παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA σε συνδεδεμένες HPV βλάβες» (Grant 098-0982464-2510 υποστηρίζεται από το από το κροατικό υπουργείο Επιστημών, Παιδείας και Αθλητισμού), η οποία εγκρίθηκε, καθώς και η διαδικασία συλλογής δειγμάτων από η Ηθική Διοικητικού συμβουλίου του Ινστιτούτου Μπόσκοβιτς Rudjer, και την ηθική Διοικητικό συμβούλιο της Sisters of Mercy Hospital, και Κλινικής Νοσοκομείο Κέντρο του Ζάγκρεμπ, που είναι σύμφωνη με τη δήλωση του Ελσίνκι (Department of Health /Oct2008).

προετοιμασία του DNA

DNA από δείγματα τραχήλου απομονώθηκε στο BioRobot EZ1 (Qiagen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την εκχύλιση του DNA, το καθαρισμένο DNA διαλύεται εντός 50-100 μΙ τρι-απόσταγμα αποστειρωμένο νερό και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση. Κάθε DNA αναλύθηκε φασματοφωτομετρικά και οπτικά σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%, και ορατές με υπεριώδη ακτινοβολία για την Alliance 4.7 (UVItec Cambridge, UK) [45].

ανίχνευσης του HPV και του γονότυπου

Ανίχνευση και προσδιορισμό του γονότυπου των HPVs περιγράφηκε προηγουμένως από τον Μιλούτιν-Gasperov

et al

. [46] Εν συντομία, τρία σύνολα συναίνεσης εκκινητές (PGMY09 /PGMY11, L1C1 /L1C2-1 /L1C2-2 και GP5 + /GP6 +) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του HPV, και τύπου-ειδικούς εκκινητές για τον HPV προσδιορισμό του γονότυπου των τύπων 6/11, 16 , 18, 31, 33, 45, 52 και 58. PCR προϊόντα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης 2% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο.

οι κυτταρικές σειρές

Απομονωμένα DNA από HPV 16 θετική CC κύτταρο γραμμές, CaSki (ATTC CRL-1550) και SiHa (ATCC ΗΤΒ-35), και HPV18 θετική, HeLa (ATTC CCL-2), χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι ανώμαλων προφίλ μεθυλίωσης κυτταρικών γονιδίων και των αντίστοιχων HPV γονιδιωμάτων. CaSki κύτταρα περιέχουν ένα ολοκληρωμένο γονιδίωμα HPV16 (περίπου 600 αντίγραφα ανά κύτταρο) όπως επίσης και αλληλουχίες που σχετίζονται με HPV 18. SiHa κύτταρα περιέχουν ένα ολοκληρωμένο γονιδίωμα HPV16 (1 έως 2 αντίγραφα ανά κύτταρο), ενώ τα κύτταρα HeLa περιέχουν αλληλουχίες HPV18.

μετατροπή διθειώδους DNA

DNA του τραχήλου της μήτρας δειγμάτων τροποποιήθηκε με όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, USA) και στη συνέχεια καθαρίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, όλες οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες μετατρέπονται σε ουρακίλη με όξινο θειώδες θεραπεία, ενώ μετουσιωμένο κυτοσίνες παραμένουν αμετάβλητες.

υποκινητές γονιδίων του κυττάρου-ξενιστή », αποφασιστικότητα μεθυλίωση

Τα προφίλ μεθυλίωσης του

CCNA1

( χρωμοσώματος 13: 36.432.177 έως 3.643.232),

Cdh1

(χρωμόσωμα 16: 68.737.114 με 6.873.722),

C13ORF18

(χρωμόσωμα 13: 46387345 έως 4.638.746),

DAPK1

(χρωμόσωμα 9 : 87497883-87497981),

HIC1

χρωμοσώματος 7: 19117831 έως 19118031,

RARβ2

(χρωμόσωμα 3: 25428191 έως 2.542.842),

hTERT1

(χρωμόσωμα 5: 1.295.019 έως 1295259 ),

hTERT2

(χρωμόσωμα 5: 1294824 έως 1.295.014) και

TWIST1

(χρωμοσώματος 7: εντοπίστηκαν 19117831 με 19.118.031) υποκινητές γονιδίων. Gene κατάσταση μεθυλίωσης προαγωγός λήφθηκε με ειδικούς μεθυλίωσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (MSP) με εναρκτήρες ειδικούς για μεθυλιωμένο μορφές υποκινητές γονιδίων. Η ίδια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του μη-μεθυλιωμένου μορφές της ίδιας υποκινητές γονιδίων εκτός από το

C13ORF18

υποκινητή. Η θετικότητα των δειγμάτων με μη μεθυλιωμένη μορφές υποκινητών γονιδίων χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος, αφού τραχηλικών επιχρισμάτων περιέχουν μίγματα των κυττάρων με διάφορες κατάσταση μεθυλίωσης των υποκινητών γονιδίων ξενιστή [17]. Η μέθοδος και οι συνθήκες MSP για τα επιλεγμένα γονίδια είχαν ήδη περιγραφεί από Yang

et al

. [13,47], Feng

et al

. [23], Kitkumthorn

et al

. [18], και Dessain

et al

. [19], αλλά οι συνθήκες τροποποιήθηκαν στις περισσότερες περιπτώσεις στο παρόν. Εν συντομία, 5 λεπτά μετουσίωση στους 95 ° C ακολουθήθηκε από 45 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 30s, ανόπτηση στους 56-61 ° C για 30s, επιμήκυνση στους 72 ° C για 50s, και η τελική παράταση 7 λεπτών σε 72 ° ΝΤΟ. Η θερμοκρασία ανόπτησης μεταβάλλεται με διαφορετικούς εκκινητές: 56 ° C για

hTERT1

(U, μη μεθυλιωμένη αστάρια) και

TWIST1

(Μ, μεθυλιωμένη εκκινητές), 58 ° C για

CCNA1

(Μ) και

CCNA1

(U), 59 ° C για

Cdh1

(U),

C13ORF18

(Μ),

DAPK1

(