Αφηρημένο

Για να αναλύσει ταυτόχρονα μεταλλάξεις και τα επίπεδα έκφρασης πολλαπλών γονιδίων σε ένα πλατφόρμα ανίχνευσης, προτείναμε μια μέθοδο που ονομάζεται «ενίσχυση multiplex απολίνωση-εξαρτώμενο ανιχνευτή ενίσχυσης ψηφιακό συνδυασμό με υδρογέλη χάντρα-array» (MLPA-ΟΑΒΑ) και εφαρμόζεται για τη διάγνωση καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). κυττάρων και ιστών CRC δειγματίστηκαν για την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων, εκτελούν MLPA με αλληλουχία-σημασμένων ιχνηθετών, εκτελέστε ψηφιακό αλυσιδωτή αντίδραση γαλάκτωμα πολυμεράσης (PCR), και παράγουν ένα υδρογέλη χάντρα-συστοιχίας να ακινητοποιήσει σφαιρίδια και σχηματίζουν ένα ενιαίο στρώμα χάντρα στη συστοιχία. Μετά από υβριδοποίηση με φθορίζοντες ανιχνευτές, ο αριθμός των χρωματιστές χάντρες, η οποία αντανακλά την αφθονία των εκφρασμένων γονιδίων και ο ρυθμός μετάλλαξης, μετρήθηκε για τη διάγνωση. Μόνο το κόκκινο ή πράσινο χάντρες συνέβη στις μάρκες στα μικτά δείγματα, που δείχνει την επιτυχία του single-μόριο PCR. Όταν ένα δείγμα ενός πηγή αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μικτή ανιχνευτές MLPA, χάντρες από μόνο ένα χρώμα εμφανίστηκε, υποδηλώνοντας την υψηλή εξειδίκευση της μεθόδου στην ανάλυση CRC μετάλλαξης και γονιδιακή έκφραση. Στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης ενός ιστού CRC από ένα CRC ασθενή, το μεταλλαγμένο ποσοστό ήταν 3,1%, και τα επίπεδα έκφρασης του CRC που σχετίζονται με τα γονίδια ήταν πολύ υψηλότερες από εκείνες των φυσιολογικών ιστών. Το εξαιρετικά ευαίσθητο MLPA-ΟΑΒΑ καταφέρνει σχετική ποσοτικοποίηση των μεταλλάξεων και του γονιδίου εκφράσεις αποφλοιωμένα κύτταρα σε δείγματα κοπράνων των ασθενών CRC στην ίδια πλατφόρμα τσιπ. MLPA-ΟΑΒΑ σε συνδυασμό με υδρογέλη χάντρα-πίνακας είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο της μη-επεμβατική διάγνωση του CRC

Παράθεση:. Huang Η, Li S, η Sun L, Zhou G (2015) Ψηφιακή Ανίχνευση πολλαπλών μεταλλάξεων μειοψηφίας και τα επίπεδα έκφρασης των πολλαπλών καρκίνου του παχέος εντέρου-σχετιζόμενα γονίδια Χρησιμοποιώντας Digital-PCR συνδυασμό με Χάντρα-Array. PLoS ONE 10 (4): e0123420. doi: 10.1371 /journal.pone.0123420

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Ken Mills, Βασιλικό Πανεπιστήμιο του Μπέλφαστ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 17 Δεκ του 2014? Αποδεκτές: 23 του Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 16, Απρ 2015

Copyright: © 2015 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 21305069 και 21275161) προβλέπεται χρηματοδότηση για την απόφαση να δημοσιεύσει και την προετοιμασία του χειρογράφου. Το πρόγραμμα κατάρτισης νέων ταλέντων στην επαρχία Jiangsu Μητέρας και Παιδιού Νοσοκομείο Υγεία (FRC201302) παρείχε χρηματοδότηση για τη συλλογή και την ανάλυση δεδομένων. Επαρχίας Jiangsu Κλινική Επιστήμη & amp? Τεχνολογία Ειδικών Έργων (SBL2012061) παρείχε χρηματοδότηση για το σχεδιασμό της μελέτης

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες παγκοσμίως [1]. Στην Κίνα, CRC είναι μια από τις πιο κοινές κακοήθεις καρκίνους και έχει υψηλό ποσοστό θνησιμότητας. Παραδοσιακά, CRC διάγνωση χρησιμοποιεί Dukes σύστημα ταξινόμησης, το οποίο κατατάσσει τον καρκίνο σε στάδια Α, Β, Γ, ή Δ Τα δεδομένα που σχετίζονται δείχνουν ότι τα ποσοστά 5-year-επιβίωση της CRC ασθενών μετεγχειρητικά είναι 81-85% στο στάδιο Α, 64- 78% στο στάδιο Β, 27-33% στο στάδιο C, και 5-14% στο στάδιο D? Ως εκ τούτου, η έγκαιρη διάγνωση του CRC και η επακόλουθη επεξεργασία μπορεί να αυξήσει αποτελεσματικά ποσοστά επιβίωσης. τεστ έγκαιρης ανίχνευσης είναι το κλειδί για την έγκαιρη διάγνωση της CRC και βελτίωση των ποσοστών επιβίωσης [2]. δοκιμές προσυμπτωματικού ελέγχου CRC περιλαμβάνουν διαδικασίες όπως η κολονοσκόπηση, κοπράνων εξέταση αίματος, και fibersigmoidoscopy [3]. Αν και αυτές οι μέθοδοι έχουν καλά κλινικά αποτελέσματα, έχουν επίσης μειονεκτήματα. Για παράδειγμα, οι επεμβατικές τεχνικές μπορεί να προκαλέσει εύκολα αιμορραγία και διάτρηση, και την ευαισθησία και την εξειδίκευση των μερικών μεθόδων είναι ανεπαρκείς? Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ενός απλού, μη επεμβατική προσέγγιση με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα είναι αναγκαία για την έγκαιρη διάγνωση του CRC.

Οι πρόσφατες ταχεία πρόοδος στην μοριακή βιολογία καθιστά δυνατή την έγκαιρη εκτέλεση μη επεμβατική διάγνωση του CRC με ευαισθησία ανάλυσης αποφλοιωμένα κύτταρα στα δείγματα κοπράνων των ασθενών CRC. Επειδή η ογκογένεση του CRC, η οποία περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση πολλαπλών γονιδίων, είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων [4], όπως ενεργοποίηση του πρωτο-ογκογονιδίων και αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, η μέθοδος ανίχνευσης ενός μόνο γονιδίου λανθασμένες διαγνώσεις συχνά την ασθένεια? Ως εκ τούτου, η συνδυασμένη ανίχνευση πολλαπλών γονιδίων είναι χρήσιμο για την αύξηση του ποσοστού των θετικών διαγνώσεων της νόσου. Η εμφάνιση και η ανάπτυξη του CRC συνοδεύει συχνά μετάλλαξη γονιδίων και αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση [5]? Ως εκ τούτου, CRC διάγνωση περιλαμβάνει την ανίχνευση αυτών των δραστηριοτήτων [6-11]. Αν και η τεχνική της αλληλουχίας του DNA είναι ένα κλασικό μέθοδος με την οποία ανιχνεύονται μεταλλάξεις γονιδίων, δεν μπορεί να αναλύσει δείγματα στα οποία ο αριθμός των μεταλλάξεων είναι & lt? 20% [12]. Για την ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίου σε χαμηλά επίπεδα κατά τα πρώτα στάδια του καρκίνου, μια μέθοδος /λιγάσης που βασίζεται σάρωση μετάλλαξη EndoV αναπτύχθηκε με όριο ανίχνευσης του 1,0% [13]? Ωστόσο, η μέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύει μεταλλάξεις (MutS) σε πολύ χαμηλότερο επίπεδο λόγω της ποσοτικής ανάλυσης του με βάση το αναλογικό σήμα. Αν και η μέθοδος ψηφιακή ανάλυση, που ονομάζεται ακτινοβολούν [14,15], αναπτύχθηκε για να ανιχνεύσει MutS σε εξαιρετικά χαμηλό επίπεδο (0,1% των MutS), το κυτταρόμετρο ροής που χρησιμοποιείται στη διαδικασία είναι δαπανηρή και μόνο ένα γονίδιο ανιχνεύεται σε ένα δίκη. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας και της υψηλής εξειδίκευσης, ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) θεωρείται ότι είναι η καλύτερη μέθοδος με την οποία η έκφραση του γονιδίου μπορεί να αναλυθεί? Ωστόσο, λόγω του περιορισμένου αριθμού των φθοριζόντων δεικτών, qPCR δεν είναι κατάλληλη για την ανάλυση πολλαπλών γονιδίων κατά την ίδια αντίδραση. Παρά το γεγονός ότι το DNA μικροσυστοιχιών μπορεί να αναλύσει ταυτόχρονα πολλαπλά γονίδια, το πρόβλημα παραμένει χαμηλό όριο ανίχνευσης και κακή ποσοτική απόδοση για την ανάλυση των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο που εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στην πρώιμη διάγνωση της CRC. Επιπλέον, αν και η συνδυασμένη ανάλυση των μεταλλάξεων και η έκφραση του γονιδίου σχετίζεται με τον καρκίνο μπορεί να αυξήσει την ακρίβεια και την ευαισθησία της CRC διάγνωση, σχεδόν όλες οι αναφερόμενες τεχνικές ισχύουν για ένα μόνο τομέα της ανίχνευσης είτε μεταλλάξεις ή γονιδιακής έκφρασης.

Εδώ, προτείναμε μια μέθοδο που ονομάζεται «ενίσχυση πολυπλέκτη απολίνωση εξαρτώμενη ανιχνευτή ενίσχυσης ψηφιακό συνδυασμό με υδρογέλη χάντρα-array» (MLPA-ΟΑΒΑ) με την οποία οι μεταλλάξεις και τα επίπεδα έκφρασης πολλαπλών γονιδίων σε χαμηλά επίπεδα μπορούν να αναλυθούν ταυτόχρονα σε μία πλατφόρμα ανίχνευσης. Με βάση την προηγούμενη εργασία [3,16,17], η τεχνική πλατφόρμα του MLPA-ΟΑΒΑ αναπτύχθηκε με τη βελτίωση των ακόλουθες τρεις πτυχές: πρώτον, MLPA, αντί των συμβατικών PCR ή στόχου εμπλουτισμένο πολλαπλή PCR (ΤΕΜ-PCR), χρησιμοποιήθηκε για να προετοιμάσει πρότυπα με κοινά άκρα? Δεύτερον, οι μεταλλάξεις και εκφράσεις πολλαπλών γονιδίων, αντί μόνο το ένα ή το άλλο, ταυτοχρόνως μετράται με την τεχνική πλατφόρμα με την αλλαγή του σχεδιασμού των ειδικών ανιχνευτών MLPA? Τρίτον, βαφή-free και ειδικών γονιδίων MLPA ανιχνευτών, αντί του υψηλού κόστους και φθορίζοντες ανιχνευτές ειδικών γονιδίων, χρησιμοποιήθηκαν για την επισήμανση πολλαπλών MutS και γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο. Τα προβλήματα των αβέβαιων αριθμούς βαφής επισημασμένου τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTP) ενσωματώνεται σε μία έλικα του DNA και του ανταγωνισμού μεταξύ αντίδραση επέκτασης και την αντίδραση υβριδισμού που αναφέρονται στο προηγούμενο έργα επιλύθηκαν? Ως εκ τούτου, η υψηλή εξειδίκευση, χαμηλό κόστος, και η υψηλή σταθερότητα της μεθόδου επιτεύχθηκαν. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε με επιτυχία για CRC διάγνωση αναλύοντας την έκφραση των γονιδίων πέντε (

β-ακτίνης

,

C-myc

,

H-ras

,

CD44v6

,

Cox-2

, και

N-ras

) και τρεις θέσεις μετάλλαξης στο APC γονίδια (κωδικόνια 1406, 1338, και 1356) σε ιστούς CRC, τα κύτταρα CRC, και σκαμπό δείγματα από ασθενείς CRC. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μέθοδος μπορεί να είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Ν-υδροξυηλεκτριμιδεστέρα (NHS) -ενεργοποιημένου sepharose στήλη συνάφειας ΗΡ και dNTPs αγοράστηκαν από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Taq

DNA πολυμεράση ήταν από την Promega (Madison, WI). DC 5225C Διατύπωση βοήθεια και DC 749 Fluid αγοράστηκαν από την Dow Chemical Co. (Midland, MI). Ar20 Έλαιο Σιλικόνης ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Amplicase αγοράστηκε από Epicenter (Madison, WI). Άλλα χημικά ήταν ένα εμπορικά επιπλέον καθαρή βαθμού. Όλα τα διαλύματα παρασκευάστηκαν με απιονισμένο και αποστειρωμένο νερό.

Ακολουθίες των εκκινητών και ανιχνευτών

Το αλφαβητάρι αμίνη-τροποποιημένο (5′-ΝΗ

2-ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ TCC ATC TGT TGC ΟΤΟ CGT GTC-3 ‘) συντέθηκε από την Takara Βιοτεχνολογία Co, Ltd (Dalian, Κίνα). Όλοι οι άλλοι εκκινητές συντέθηκαν από την Invitrogen Inc. (Σαγκάη, Κίνα). Ένα ζευγάρι των κοινών εκκινητών, common-1 (5’-CCA TCT GTT GCG TGC ΟΤΟ TC-3 ‘) και common-2 (5′-CCT TGG CAA TCA GGC ΟΑΑ TC-3′) χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει τα προϊόντα MLPA. Το γονίδιο-ειδικά MLPA ανιχνευτές για την ανίχνευση μεταλλάξεων είχαν παρατίθενται στον Πίνακα 1. Το γονίδιο-ειδικούς ανιχνευτές MLPA για την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης εισήχθησαν στον Πίνακα 2. Οι ανιχνευτές φθορισμού για χάντρα-αποκωδικοποίηση ήταν 5’-Cy3-TGC CTT GTC ΑΤΤ CGG- 3 ‘και 5′-Ογ5-GGA ΑΑΑ GAG CCA Α-3’. Το αστάρι αντίστροφης μεταγραφής ήταν ολιγο (dT) 15.

Η

προετοιμασία Πρότυπο

Δείγματα των κυττάρων των ιστών και CRC CRC ελήφθησαν από Jiangsu Αντικαρκινικό Νοσοκομείο (Nanjing, Κίνα) . Η συγκομιδή των ιστών, κυττάρων και κοπράνων από τους συμμετέχοντες εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της First Affiliated Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing και οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση. Ολικά RNAs εκχυλίσθηκαν από τους ιστούς των ασθενών και των κυττάρων CRC CRC χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το εκχυλισμένο RNA προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής πραγματοποιήθηκε σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% και UV-vis φασματοφωτόμετρο (Naka Instruments, Ιαπωνία). Το cDNA πρώτου κλώνου συντέθηκε από ολίγο (dT) 15 εκκινητές χρησιμοποιώντας SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από ιστούς και κύτταρα με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Πριν από την εκχύλιση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό αλατούχο διάλυμα και κόπηκαν ιστούς και ομογενοποιήθηκαν σε 1 ml φυσιολογικού αλατούχου διαλύματος. Η εκχύλιση DNA διαλύθηκε σε ρυθμιστικό ΤΕ και προσδιορίζεται από την UV-VIS φασματοφωτόμετρο.

Σκαμπό από έναν ασθενή CRC σε Jiangsu Αντικαρκινικό Νοσοκομείο (Nanjing, Κίνα) ομογενοποιείται σε ρυθμιστικό ASL και εκχυλίζεται με QIAamp DNA κοπράνων Mini Kit (Qiagen, Germany).

Multiplex ενίσχυση ενίσχυση ψηφιακό ανιχνευτή απολίνωση εξαρτώμενη

Μετά την προσθήκη των ζευγών ιχνηθετών (100 fmol από το καθένα) και 1,0 U Ampligase, το μίγμα της αντίδρασης που περιέχει το δείγματα DNA ή cDNA επωάστηκε στους 94 ° C για 1.0 λεπτό ακολουθούμενη από 60 ° C για 4,0 min? Αυτός ο κύκλος επαναλήφθηκε 10 φορές.

Ψηφιακές γαλάκτωμα PCR (emPCR)

Τα συσκευασμένα σφαιρίδια (10 μmol NHS sites /ml) από 1 ml της στήλης NHS-ενεργοποιημένης συγγένειας Sepharose ΗΡ απομακρύνθηκαν από η στήλη και διάσπαρτα σε ισοπροπανόλη. Μετά πλύση με 1 mM HCl για την εξάλειψη των σε βάθος ισοπροπανόλη, τα σφαιρίδια ενεργοποιήθηκαν με 1 mM παγωμένο HCl στους 4 ° C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα ενεργοποιημένα σφαιρίδια και εκκινητές αμίνης τροποποιημένου (10 mM) επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (0,5 Μ NaCl, 0,2 Μ NaHCO

3, ρΗ 7,5) στους 20 ° C για 5 ώρες. Τα σφαιρίδια διατηρούνται μακριά από καθίζηση στην επώαση. Μετά την επώαση, τα σφαιρίδια εκκινητή ακινητοποιημένα φυλάχθηκαν στους 4 ° C για χρήση.

Το σύστημα του μείγματος emPCR περιέχει ελαιώδη φάση και υδατική φάση. Η υδατική φάση χωρίζεται σε δύο μέρη, Mock μείγμα ενίσχυσης και μίγμα της αντίδρασης PCR. Τα προϊόντα σύνδεσης χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα για PCR. Πρώτον, για να κάνουν πιο σταθερό γαλάκτωμα, 225 μΙ mock μείγμα ενίσχυσης (1 χ Promega

Taq

Buffer, 2 mM MgCl

2, 0,1% BSA και 0,01% Tween-80) ομογενοποιήθηκε με 375 μλ του γαλακτώματος ελαίου (40% (β /β) DC 5225C Σκεύασμα Aid, 30% (β /β) DC 749 Fluid και 30% (w /w) Ar20 Silicone Oil) από ένα μαγνητικό microstir-bar στις 1200 rpm για 5 λεπτά σε ένα φιαλίδιο των 5 ml. Δεύτερον, 200 μΙ του μίγματος αντίδρασης PCR (1 χ Promega

Taq

Buffer, 2 mM MgCl

2, 0,5 mM dNTP μείγμα, 0.125 U /ml

Taq

DNA πολυμεράση, 0.1 % BSA, 0,01% Tween-80, 0,06 mM common-2 εκκινητή και 0.6 mM κάθε ένα από κοινού 1-εκκινητές), σφαιρίδια αστάρι επικαλυμμένα και τα πρότυπα προστέθηκαν στο φιαλίδιο και στη συνέχεια το φιαλίδιο αναδεύτηκε σε 1500 rpm για 3 λεπτά για την ανάμιξη των γαλακτωμάτων καλά. Τα γαλακτώματα κλασματοποιήθηκαν με 100 μΙ έκαστο σε 8 PCR-σωληνάρια. Τρίτον, η θερμοκυκλοποίηση εκτελέστηκε επί PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, INC.) Σε μία αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 3 λεπτά, κατόπιν 40 κύκλοι (94 ° C, 58 ° C και 68 ° C για 30 s , 60 s, 90 s το καθένα) για ενίσχυση και 13 κύκλους (94 ° C και 58 ° C για 30 s, 360 s έκαστο) για υβριδισμό και επέκταση.

Ψηφιακές χάντρα βασιζόμαστε σε αυτο-παραγωγής υδρογέλη bead- συστοιχία

Μετά την ενίσχυση, τα γαλακτώματα αναλύονται με την προσθήκη ισοπροπανόλης. Τα γαλακτώματα με ισοπροπανόλη διηθήθηκαν μέσω μεμβράνης μικροπόρων 25-mm-διαμέτρου και τα σφαιρίδια εγκλωβίστηκαν επί της μεμβράνης. Μετά τα σφαιρίδια επί της μεμβράνης ήταν επιθυμούσε με ισοπροπανόλη, 80% αιθανόλη σε διάλυμα (4,0 mM Tris, ρΗ = 7,5), και 0,1% Tween 20, που ανακτήθηκαν σε 1,0 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA). DNA (dsDNA) ακινητοποιημένα σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.1 mM NaOH για 5,0 λεπτά για την παρασκευή μονόκλωνου DNA (ssDNA) ακινητοποιημένα σφαιρίδια. Μετά το υπερκείμενο απομακρύνθηκε, τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με DDH

2Ο και αποθηκεύεται στο διάλυμα.

Acryl-τροποποιημένες πλάκες παρασκευάστηκαν σύμφωνα με Xiao et al [18]. Οι πλάκες μικροσκοπίου (Shanghai Jinglun Industrial Glass Co., Ltd, Shanghai, Κίνα) καθαρίστηκαν με εμβάπτιση σε 10% υδατικού διαλύματος νιτρικού οξέος για 2.0 ώρες.

Η υδρογέλη χάντρα-array παρασκευάστηκε με την προσθήκη των σφαιριδίων να ένα διάλυμα μονομερούς ακρυλαμιδίου και επάνω πλάκες ακρυλο-τροποποιημένα και την άμεση κάλυψη με καλυπτρίδα (20 × 20 mm) για να συγκρατεί το στρώμα μονού σφαιριδίου. Μετά συμπολυμερισμού, το οποίο διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, το καλυπτρίδα αφαιρέθηκε προσεκτικά από την υδρογέλη. Οι ανιχνευτές φθορισμού (1,0 pmol /μL) υβριδοποιήθηκαν με ssDNA στα σφαιρίδια στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου στους 40 ° C για 1,0 h. Για να αφαιρέσετε τα ελεύθερα και αταίριαστων ανιχνευτές από το τσιπ γέλη, τα πλακίδια ανιχνευτή υβριδοποιήθηκε υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 4,0 ° C υπό 50 V για 5,0 λεπτά σε 1 χ Tris /ρυθμιστικό διάλυμα βορικών /ΕϋΤΑ. Μετά από έκπλυση με νερό, οι εικόνες από τις διαφάνειες έγιναν με την LuxScanner (CapitalBio Corporation, Beijing, Κίνα). Τέλος, η εικόνα σάρωσης του σφαιριδίου-συστοιχία ήταν εισόδου σε GenePix Pro 4.0 για να μετρήσετε τις χάντρες χρώμα στη συστοιχία.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Αρχή

Απευθύνεται σε ταυτόχρονη αναλύοντας πολλαπλές μεταλλάξεις και της έκφρασης πολλαπλών γονιδίων, ένας στόχος εμπλουτισμένο MLPA συνδυάστηκε με βάση σφαιρίδια emPCR για πολλαπλή ενίσχυση μονού μορίου. Τα πρωτόκολλα της ανιχνεύσεως φαίνονται στην Εικόνα 1 και περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια:. προετοιμασία πρότυπο, γαλακτωματοποίηση, single-μοριακής ενίσχυσης, απογαλακτωματοποίησης, παρασκευή υδρογέλης χάντρα-συστοιχία, η υβριδοποίηση ανιχνευτή και καταμέτρηση χάντρα

Η δοκιμασία περιλαμβάνει τα εξής τρία βήματα: (1) MLPA για την παρασκευή πρότυπα ετικέτα με την καθολική ακολουθίες? (2) γαλάκτωμα (em) PCR για την παρασκευή σφαιρίδια επικαλυμμένα με αμπλικόνια που παράγεται από ένα μόνο μόριο των προϊόντων MLPA? και (3) την αποκωδικοποίηση χάντρα με υβριδοποίηση καθολική Cy5-ιχνηθετημένων ανιχνευτών και καθολική Cy3-σημασμένους ανιχνευτές. Αν ένα σφαιρίδιο εμφανίζει ως πράσινο, τα αμπλικόνια που επικαλύπτουν το σφαιρίδιο πρέπει να ενισχυθεί από τα πρότυπα MUT ή στόχους του CRC που σχετίζονται με γονίδια, ενώ ένα κόκκινο χάντρα σημαίνει πρότυπα ή στόχους γονιδίων housekeeping άγριου τύπου.

Η

Πρώτο, το DNA και cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως στόχοι σε MLPA για την παρασκευή των προτύπων προσόντα για emPCR, η οποία είναι μια εξαιρετικά ακριβή ψηφιακή τεχνική PCR στην οποία υπάρχει ένας αντίδραση για την ενίσχυση ενός μορίου να συνειδητοποιήσουμε ενίσχυση μονού μορίου. Στην ανίχνευση μετάλλαξης, απολίνωσης χρειάζεται τρεις ανιχνευτές για μία τόπους, δηλαδή το «αριστερό ανιχνευτή», «δεξιά ανιχνευτής 1», και «δεξιά ανιχνευτής 2». Υπάρχουν δύο μέρη στο αριστερό ανιχνευτή και τρία μέρη σε καθένα από τα δύο δεξιά ανιχνευτές. Τα δύο τμήματα στο αριστερό ανιχνευτή είναι ένα κοινό ουρά στο 5′-άκρο για την παροχή ενός κοινού θέση έναρξης που χρειάζονται στην επακόλουθη ενίσχυση PCR και ένα γονίδιο-ειδική αλληλουχία στο 3′-άκρο για ανόπτηση του στόχου. Οι σωστές ανιχνευτές περιέχουν ένα γονίδιο-ειδική αλληλουχία με μία θέση μετάλλαξη ενδιαφέροντος στο πρώτο βάση του 5′-άκρο, μία πηγή-ειδική αλληλουχία για υβριδοποίηση φθορίζοντες ανιχνευτές στη μέση, και μια κοινή θέση έναρξης στο 3′-άκρο. Δικαίωμα ανιχνευτές 1 και 2 αντιστοιχούν στο MUT και τα άγρια ​​είδη (ΣΜΑ), αντίστοιχα. Στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, δύο ανιχνευτές, αριστερά και δεξιά ανιχνευτή ανιχνευτή, χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση απολίνωσης. Το αριστερό ανιχνευτής περιέχει μια κοινή θέση έναρξης και ένα γονίδιο-ειδική αλληλουχία. Το δικαίωμα ανιχνευτής περιέχει ένα γονίδιο-ειδική αλληλουχία στο 5′-άκρο, μία πηγή-ειδική αλληλουχία στη μέση, και μια κοινή θέση έναρξης στο 3′-άκρο. Στη συνέχεια, η ενίσχυση μονού μορίου πραγματοποιήθηκε σε γαλάκτωμα νερού-σε-έλαιο. Επειδή και οι δύο χάντρες και πρότυπα από MLPA αραιωμένο έτσι ώστε να μην μόριο περισσότερα από ένα στόχο και ένα σφαιρίδιο είναι παρούσα σε κάθε διαμέρισμα, αμπλικόνια χάντρες που παράγεται από emPCR προέρχονται από ακριβώς ένα μόριο-στόχο. Μετά απογαλακτωματοποίησης, τα σφαιρίδια συλλέγονται και ορίζονται ως ένα στρώμα μονού σφαιριδίου (40 μm πάχος) σε μία υδρογέλη χάντρα-συστοιχία. Τα σφαιρίδια ενισχύθηκε από το γονίδιο καθαριότητα (ή WT αμπλικόνια) έχουν αποκωδικοποιηθεί με υβριδισμό 3′-Cy5-σημασμένους ανιχνευτές, ενώ τα σφαιρίδια ενισχύθηκε από CRC-σχετιζόμενα γονίδια (ή MutS) έχουν αποκωδικοποιηθεί με υβριδισμό 3′-Cy3-σημασμένους ανιχνευτές? Ως εκ τούτου, ο αριθμός των ερυθρών (βαφής Cy5) σφαιρίδια και ο αριθμός των πράσινων (βαφής Cy3) σφαιρίδια αντανακλούσε τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου housekeeping (ή αμπλικόνια WT) και CRC-σχετιζόμενα γονίδια (ή mutS), αντίστοιχα. Το κόστος της δοκιμασίας είναι δραματικά μειωμένα κατά τη χρήση κοινών φθορίζοντες ανιχνευτές για την αποκωδικοποίηση των σφαιρίδια επικαλυμμένα με τα αμπλικόνια του MutS, WT αμπλικόνια, το γονίδιο οικοκυρική, και CRC-σχετιζόμενα γονίδια.

Εξειδίκευση του σφαιριδίου-συστοιχίας

Η ειδικότητα της πλατφόρμας τσιπ υδρογέλης για την ανάλυση των στόχων από διαφορετικές πηγές ερευνήθηκε. Το cDNA του

β-ακτίνης

συνδέθηκε με το γονίδιο-ειδικούς ανιχνευτές MLPA περιέχει την ετικέτα-αλληλουχία για την κωδικοποίηση Cy5-σημασμένο ανιχνευτές για την παραγωγή προϊόντων από MLPA

β-ακτίνης

. Τα προϊόντα MLPA στη συνέχεια ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας δύο κοινές εκκινητές και το 5 ‘άκρο του ενός εκκινητή τροποποιήθηκε με βιοτίνη. Αφού οι τροποποιημένων με βιοτίνη PCR προϊόντων ακινητοποιήθηκαν επί σφαιριδίων στρεπταβιδίνης-τροποποιημένο, το σφαιρίδιο-συστοιχία παρασκευάστηκε και καλύπτονται με Cy5- και Cy3-επισημασμένο ανιχνευτών για ανάλυση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, υπάρχουν μόνο κόκκινες χάντρες στις εικόνες. Ομοίως, όταν το cDNA του CRC-σχετικών γονιδίων συνδέθηκε με το γονίδιο-ειδικά MLPA ανιχνευτές που περιέχουν την αλληλουχία ετικέτα για την κωδικοποίηση Cy3-επισημασμένο ανιχνευτές, μόνο πράσινο σφαιρίδια μπορούν να σαρωθούν (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ηλεκτροφόρησης απομακρύνει αποτελεσματικά τα αταίριαστα ανιχνευτές στην επιφάνεια των σφαιριδίων ή των υπόλοιπων ανιχνευτές μέσα στην υδρογέλη. Ο υβριδισμός μεταξύ φθοριζόντων ανιχνευτών και στόχων στο εσωτερικό της υδρογέλης είναι συγκεκριμένη. Η πλατφόρμα του σφαιριδίου-συστοιχία μπορεί να εφαρμοστεί για την ακριβή διάκριση των στόχων από διαφορετικές πηγές σε MLPA-ΟΑΒΑ.

Τόσο το Cy5-σημασμένο και Cy3-επισημασμένους ανιχνευτές προστέθηκαν στο σφαιρίδιο συστοιχίας για υβριδοποίηση, και ηλεκτροφόρηση διεξήχθη για να αφαιρέσετε τα αταίριαστα και δωρεάν ανιχνευτές. Τέλος, οι τρεις εικόνες του πίνακα Α ή του πίνακα Β που λαμβάνονται από τη χρήση τριών ειδών καναλιών φθορισμού, τόσο Cy3 και Cy5 κανάλια, μόνο Cy3 κανάλι, και μόνο κανάλι Cy5, αντίστοιχα.

Η

Ιδιαιτερότητα MLPA -DABA για την ανάλυση των μεταλλάξεων και γονιδιακή έκφραση

για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, το κλάσμα των σφαιριδίων CRC ψευδώς σημειωθούν στο 100% του cDNA του

β-ακτίνης

και το κλάσμα των σφαιριδίων καθαριότητας ψευδώς σημειωθούν στο 100 % cDNA των γονιδίων CRC προσδιορίστηκαν. Μετά τον υβριδισμό και την ηλεκτροφόρηση, οι εικόνες λήφθηκαν από τα σφαιρίδια επικαλυμμένα με 100% θραύσματα από

β-ακτίνης

και 100% θραυσμάτων από CRC-συναφή γονίδια? τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3Α και 3Β. Υπήρχαν σχεδόν καμία ψευδώς σκόραρε χάντρες που βρέθηκαν σε κάθε δοκιμή? Ως εκ τούτου, η χρήση MLPA-ΟΑΒΑ είναι πολύ ειδικό για την ανάλυση έκφρασης CRC-σχετικών γονιδίων σε CRC

Τα δείγματα ήταν 100% στόχους του

β-ακτίνης

(Α).? 100% των στόχων του CRC-σχετικών γονιδίων (Β)? 100% DNA WT του κωδικονίου 1338 σε κανονικό ιστό (C)? και 100% MUT DNA του κωδικονίου 1338 σε κύτταρα SW480 (D). Επτά ζεύγη ανιχνευτών του CRC-σχετικών γονιδίων και

β-ακτίνης

προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης MLPA (Α και Β), και όλοι οι ανιχνευτές των κωδικονίων 1406, 1338 και 1356 χρησιμοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις MLPA (C και D). Μετά γαλάκτωμα PCR, τόσο οι Cy5-σημασμένο και Cy3-επισημασμένους ανιχνευτές προστέθηκαν στο σφαιρίδιο συστοιχίας για υβριδισμό.

Η

SW480 κύτταρα (ανθρώπινα κύτταρα CRC) με ομόζυγο μετάλλαξη στο κωδικόνιο 1338 (4012 C & gt? T) επιλέχθηκαν ως στόχο MUT. Κανονική ιστός χρησιμοποιήθηκε ως στόχος WT ήταν ταυτοχρόνως αναλύθηκε. Το κλάσμα των ψευδώς σημειωθούν χάντρες σε 100% MUT DNA ή σε ένα 100% WT DNA ανιχνεύθηκε. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3C και 3D δείχνουν ότι το ποσοστό των ψευδώς δέχεται σφαιρίδια (συμπεριλαμβανομένων των ακαθαρσιών) και στις δύο είναι σχεδόν μηδέν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μέθοδος είναι επίσης ειδικά για ανίχνευση μετάλλαξης σε CRC.

Ποσοτικοποίηση των δύο γονιδίων χρησιμοποιώντας MLPA-ΟΑΒΑ

για την επαλήθευση της σκοπιμότητας της χρήσης MLPA-ΟΑΒΑ να αναλύσει διαφορετικά γονίδια, δύο γονίδια καθαριότητας χρησιμοποιήθηκαν ως παράδειγμα. Σε ένα σωλήνα, οι στόχοι του

β-ακτίνης

συνδέθηκαν με τους ανιχνευτές MLPA που θα μπορούσαν να υβριδοποιηθούν τα Cy5-σημασμένο ανιχνευτές, ενώ οι στόχοι του

GAPDH

συνδέθηκαν με τους ανιχνευτές που θα μπορούσαν MLPA υβριδοποιούν τις Cy3-επισημασμένο ανιχνευτές. Μετά την ψηφιακή ενίσχυση των προϊόντων σύνδεσης και ανιχνευτής υβριδοποίησης των σφαιριδίων, τα κόκκινα και πράσινα σφαιρίδια μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4. Ο αριθμός των ερυθρών χάντρες και πράσινες χάντρες αντικατοπτρίζουν τα επίπεδα έκφρασης του

β-ακτίνης

και

GAPDH

, αντίστοιχα. Μετρώντας τις χρωματιστές χάντρες πάνω στο τσιπ, διαπιστώθηκε ότι η αναλογία της έκφρασης του

β-ακτίνης

με εκείνη του

GAPDH

ήταν σχεδόν 1: 1, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα δύο γονίδια ήταν housekeeping επιτυχώς εντοπιστεί. Δεν υπήρχαν κίτρινες χάντρες, υποδεικνύοντας ότι μονής μοριακής ενίσχυσης επιτεύχθηκε με τη διατήρηση κανένα μόριο περισσότερες από μία στόχου σε κάθε διαμέρισμα, και ότι είναι πιθανό ότι MLPA-ΟΑΒΑ μπορούν να αναλύσουν τα γονίδια από διάφορες πηγές.

Ένα κόκκινο χάντρα προέρχεται από ένα μόριο

β-ακτίνης

και μια πράσινη χάντρα προέρχεται από ένα μόριο

GAPDH

.

Η

Εφαρμογή

Για να αποδείξουν η εφαρμογή της MLPA-ΟΑΒΑ στην ανίχνευση των κλινικών δειγμάτων, ανιχνεύθηκαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του πέντε CRC-σχετικών γονιδίων και MutS και στις δύο ιστούς όγκων και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από CRC ασθενείς. Οι τυπικές σαρωμένες εικόνες ενός ασθενή που φαίνεται στο Σχ 5. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των συνολικών πέντε CRC-συναφή γονίδια στο

β-ακτίνης

στον ιστό του όγκου είναι πολύ υψηλότερα από εκείνα στο διπλανό φυσιολογικό ιστό (Σχ 5Α και 5Β). Όλα τα σφαιρίδια ήταν κόκκινα στην ανάλυση του DNA του γειτονικού φυσιολογικού ιστού (Σχήμα 5C), υποδεικνύοντας ότι ήταν MUT αρνητικά, ενώ τα πράσινα σφαιρίδια (Σχήμα 5D) δείχνουν ότι ήταν MUT θετικά στον ιστό του όγκου. Ο ρυθμός MUT ήταν 3,1%, που υπολογίζεται από το λόγο των πράσινων σφαιριδίων σε κόκκινο χάντρες. Σημαντικές διαφορές στην έκφραση μετάλλαξη και γονιδίων μεταξύ του ιστού του όγκου και του παρακείμενου φυσιολογικού ιστού έδειξε ότι MLPA-ΟΑΒΑ μπορούν να εφαρμοστούν για την έγκαιρη διάγνωση του CRC με μεταλλάξεις χαμηλού επιπέδου και χαμηλή αφθονία της γονιδιακής έκφρασης.

( Α) Η ανάλυση έκφρασης του CRC-σχετικών γονιδίων σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό? (Β) Ανάλυση της έκφρασης του CRC-σχετικών γονιδίων σε ιστό όγκου? (Γ) την ανίχνευση μετάλλαξης του παρακείμενο φυσιολογικό ιστό? (Δ) την ανίχνευση μετάλλαξης του ιστού του όγκου. Κόκκινο χάντρες προήλθε από την cDNAs του

β-ακτίνης

και άγριου τύπου DNA? πράσινο χάντρες προέρχονται από τα cDNA του CRC που σχετίζονται με γονίδια (

C-myc

,

H-ras

,

N-ras

,

CD44v6

, και

Cox-2

) και του μεταλλαγμένου DNA.

η

Για την αξιολόγηση της σκοπιμότητας της MLPA-ΟΑΒΑ στην μη επεμβατική ανίχνευση των κλινικών δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκαν τα κόπρανα από έξι CRC ασθενείς. Όπως δείχνεται στο Πίνακα S1, μόνο το 50% από τους έξι ασθενείς CRC (3/6) ήταν MUT θετικά και 83% από τους έξι ασθενείς CRC (5/6) δοκιμάστηκαν με υψηλή έκφραση του CRC-σχετικών γονιδίων σε μη επεμβατική αναλύσεις δείγματα κοπράνων. Το συνολικό ποσοστό ανίχνευσης του MLPA-ΟΑΒΑ είναι 83%. Με βάση τα αποτελέσματα ανίχνευσης και του Dukes ‘στάδιο των ασθενών, συνάγεται το συμπέρασμα ότι η μέθοδός μας είναι πολλά υποσχόμενη στην πρώιμη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου, επειδή το ποσοστό ανίχνευσης των ασθενών στα αρχικά στάδια (Dukes’ τα στάδια Α και Β) είναι τόσο υψηλές όσο 75% (3/4). Πιστεύουμε ότι το ποσοστό ανίχνευσης θα μπορούσε να αυξηθεί περαιτέρω με την αύξηση του μεγέθους του πίνακα του loci μετάλλαξης και CRC-σχετιζόμενα γονίδια. Τυπικά αποτελέσματα από MLPA-ΟΑΒΑ χρησιμοποιώντας ένα από τα κόπρανα των ασθενών CRC και ότι από υγιή εθελοντή δείχνονται στο Σχήμα 6. ανιχνεύθηκε Το σκαμνί από τον ασθενή CRC να είναι MUT θετικός με υψηλή έκφραση του CRC που σχετίζονται με γονίδια, ενώ το σκαμνί από το υγιείς εθελοντές δεν ανιχνεύθηκε για να MUT αρνητικά με χαμηλή έκφραση της CRC που σχετίζονται με γονίδια

(Α) ανίχνευση μεταλλάξεων του δείγματος κοπράνων από τον ασθενή CRC.? (Β) ανάλυση του CRC που σχετίζονται με έκφραση γονιδίου του δείγματος κοπράνων από τον ασθενή CRC? (Γ) την ανίχνευση μεταλλάξεων του δείγματος κοπράνων από υγιή εθελοντή? (Δ) ανάλυση των CRC που σχετίζονται με το γονίδιο έκφρασης του δείγματος κοπράνων από το υγιείς εθελοντές.

Η

Συμπέρασμα

Σε αυτή τη μελέτη, μια ευαίσθητη και ειδική δοκιμασία για την ψηφιακή ανίχνευση MutS και της έκφρασης αναπτύχθηκε επίπεδα πολλαπλών γονιδίων σε υδρογέλη χάντρα-συστοιχία. Με το συνδυασμό MLPA και με βάση σφαιρίδια emPCR, επετεύχθη ενίσχυση μονού μορίου με κοινούς εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για όλους τους στόχους. MLPA εφαρμόστηκε στην παρασκευή των προτύπων με καθολική άκρα από DNA και τα δείγματα cDNA από διαφορετικές πηγές, η οποία ευνοεί πολλαπλή ενίσχυση. Σε αντίθεση με την αναλογική ενίσχυση σε συμβατικές αντιδράσεις PCR, & gt? 10

6 επιμέρους αντιδράσεις πολλαπλασιασμού μπορούν να εκτελεστούν ταυτόχρονα σε ένα σωληνάριο με βάση σφαιρίδια emPCR

Τα σφαιρίδια ακινητοποιημένου ως ένα ενιαίο στρώμα σε ένα τσιπ υδρογέλης να. ολοκληρώσει ανίχνευσης υψηλής απόδοσης. Σε σύγκριση με τις κοινές μεθόδους που χρησιμοποιούν ακρυλαμιδίου σε ηλεκτροφόρηση για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, MLPA-ΟΑΒΑ χρησιμοποιεί γέλη πολυακρυλαμιδίου να ενσωματώσετε τα σφαιρίδια. Το προπολυμερές του μονομερούς ακρυλαμιδίου με χάντρες είναι διάσπαρτη σε ακρυλικό τροποποιημένο με γυαλί και ο πολυμερισμός εκτελείται για να ενσωματώσετε τα σφαιρίδια πάνω στην επιφάνεια του γυαλιού τσιπ με υπερθειικό αμμώνιο και τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη. Λόγω της υψηλής διαπερατότητας γελών με ένα 3-διάστατο πορώδη δομή, τα ακατάλληλα ανιχνευτές και άλλες ακαθαρσίες ενσωματωμένες στην πορώδη δομή μπορούν να περνούν ελεύθερα διαμέσου της δομής? Ως εκ τούτου, οι ανιχνευτές και ακαθαρσίες μπορεί να εξαλειφθεί αποτελεσματικά με ηλεκτροφόρηση. Η υψηλή απόδοση της υδρογέλης υπερνικά τα προβλήματα που αντιμετωπίζουν με άλλες μεθόδους, όπως η υψηλή φόντο παρεμβολή από ανεπαρκή έκπλυση των υπόλοιπων ανιχνευτών. Σε MLPA-ΟΑΒΑ, το φόντο ήταν σημαντικά μειωμένη? Στη συνέχεια, η ευαισθησία και η ειδικότητα του MLPA-ΟΑΒΑ είχαν βελτιωθεί σημαντικά. Επιπλέον, επειδή πηκτή πολυακρυλαμιδίου έχει αμφίφιλες και αφόρτιστων χαρακτηριστικά, η βιοσυμβατότητα είναι ευνοϊκό για υβριδοποίηση των ανιχνευτών και στόχων σε ένα διάλυμα που μοιάζει με το περιβάλλον.

Επειδή η διάγνωση των ασθενειών γίνεται με βάση την γενική ενημέρωση πολλαπλών γονιδίων, δεν είναι απαραίτητο να μετρηθεί μια γενετική MUT ή την έκφραση ενός ειδικού γονιδίου σχετίζονται με τον καρκίνο. Μια ομάδα από πολλαπλά γονίδια ως ένα ενιαίο διαγνωστικό βιοδείκτη δείχνει μια πιο σημαντική διαφορά από μεμονωμένα γονίδια. Σε MLPA-ΟΑΒΑ, ένας τύπος σήματος φθορισμού με ένα χρώμα εφαρμόστηκε να αντανακλά πολλαπλές MutS και εκφράσεις πολλαπλών CRC-συναφή γονίδια. Τόσο γενικές πληροφορίες σχετικά με τη συνολική έκφραση των γονιδίων του καρκίνου που σχετίζονται και με συνολικό ποσοστό MUT επιτυγχάνονται με υπολογισμό της αναλογίας του συνολικού αριθμού των πράσινων σφαιριδίων από διάφορες πηγές προς τον αριθμό των ερυθρών χάντρες. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα κύρια βήματα στη διαδικασία της ανίχνευσης MUT και η διαδικασία ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης είναι πανομοιότυπες? Ως εκ τούτου, MLPA-ΟΑΒΑ είναι ικανά να αναλύουν δύο ταυτόχρονα στην ίδια πλατφόρμα τσιπ, το οποίο είναι ιδιαίτερα επιθυμητό στην διάγνωση του καρκίνου. Η χρήση του MLPA-ΟΑΒΑ, η οποία έχει τα πλεονεκτήματα του να είναι ογκοειδικό? που απαιτούν εύκολη δειγματοληψίας, έχει μεγάλη ακρίβεια? είναι μη επεμβατική για το σώμα? και δεν απαιτεί προετοιμασία δίαιτα πριν από τη δοκιμή σε σύγκριση με άλλες μη επεμβατικές μέθοδοι, όπως η κολονοσκόπηση και Τεστ Κρυφού Αίματος, είναι πολλά υποσχόμενη για την ανάλυση αποφλοιωμένα κύτταρα σε δείγματα κοπράνων από ασθενείς CRC και θα γίνει ένα ισχυρό εργαλείο για την μη επεμβατική και νωρίς διάγνωση της CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1. Λεπτομέρειες και ανίχνευση αποτελέσματα των 6 ασθενών με τη χρήση σκαμνί ως πρώτη ύλη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123420.s001

(PDF)