Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ένας από τους κορυφαίους του καρκίνου που σχετίζονται με τις αιτίες θανάτου στον δυτικό κόσμο με μια επείγουσα ανάγκη για νέες στρατηγικές θεραπείας. Πρόσφατα, υπερφορίνη και nemorosone έχουν περιγραφεί ως πολλά υποσχόμενη ενώσεις μολύβδου κατά του καρκίνου. Ενώ υπερφορίνη έχει διερευνηθεί διεξοδικά

in vitro

και

in vivo

,

in vivo

στοιχεία για nemorosone εξακολουθούν να αγνοούνται. Έτσι, ερευνήσαμε την ανασταλτική της ανάπτυξης του δυναμικού nemorosone επί του παγκρέατος ξενομοσχεύματα καρκίνου σε NMRI ηυ ηυ /και προσδιορίστηκε βασικές φαρμακοκινητικές παραμέτρους. Ξενομοσχεύματος όγκοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με nemorosone και γεμσιταμπίνη, το τρέχον πρότυπο της περίθαλψης. Τομές όγκων υποβλήθηκαν σε Η &? Ε, καθώς και κασπάσης 3 και χρώση Κί-67. Nemorosone κινητική πλάσματος προσδιορίστηκαν με HPLC και φασματομετρία μάζας. Επαγωγή του CYP3A4 και άλλα ένζυμα που μεταβολίζουν από nemorosone και υπερφορίνη δοκιμάστηκε σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα με τη χρήση qRT-PCR. Σε μια δόση των 50 mg /kg ανά ημέρα nemorosone, μια σημαντική αύξηση ανασταλτική επίδραση παρατηρήθηκε σε παγκρεατικά ξενομοσχεύματα καρκίνου. Η ένωση ήταν καλά ανεκτή και απορροφάται ταχέως στην κυκλοφορία του αίματος με ένα χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 30 λεπτά. Διαφορετικοί μεταβολίτες εντοπίστηκαν, πιθανώς μοιάζει με τα προϊόντα οξείδωσης του CYP3A4-ανεξάρτητη. Το συμπέρασμα είναι ότι nemorosone είναι μια πιθανή ένωση μολύβδου κατά του καρκίνου με καλή βιοδιαθεσιμότητα, λίγο παρενέργειες και πολλά υποσχόμενη ανάπτυξη-ανασταλτική δράση, αντιπροσωπεύοντας έτσι μια πολύτιμη ένωση για μια προσέγγιση της θεραπείας συνδυασμού

Παράθεση:. Wolf RJ, Hilger RA, Hoheisel JD, Werner J, Holtrup F (2013)

In Vivo

Δραστηριότητα και Φαρμακοκινητική της Nemorosone για καρκίνο του παγκρέατος ξενομοσχεύματα. PLoS ONE 8 (9): e74555. doi: 10.1371 /journal.pone.0074555

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιούλη 2013? Δεκτές: 2, Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπτέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Wolf et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε οικονομικά από μια ερευνητική υποτροφία τρία χρόνια από την Helmholtz Διεθνές Graduate School για την έρευνα του Καρκίνου στο FH. Η χρηματοδότηση από το γερμανικό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας ως μέρος της κοινοπραξίας NGFN PaCaNet αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τις πολλές προόδους στον τομέα της έρευνας και της θεραπείας του καρκίνου, ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει μια από τις πιο προκλητικές όγκους, με ποσοστό θνησιμότητας σχεδόν ταιριάζουν με την συχνότητα εμφάνισης [1]. Αυτό οφείλεται κυρίως στις δυσκολίες στη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος σε πρώιμο στάδιο και χειρουργήσιμη προφέρεται χημειο-αντίσταση της. Έτσι, περισσότερο από το 80% των ασθενών παρουσιάζουν έναν όγκο προχωρημένου σταδίου ήδη κάνει μετάσταση σε τοπικούς λεμφαδένες και το ήπαρ [2]. Γεμσιταμπίνη, το ισχύον πρότυπο περίθαλψης για τον καρκίνο του παγκρέατος, βελτιώνει μόνο μετρίως μέσους χρόνους επιβίωσης μεταξύ 5 και 6 μηνών [3], υπογραμμίζοντας έτσι την ανάγκη να διερευνηθούν νέες θεραπευτικές ενώσεις.

Οι πολυκυκλικοί polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs) είναι ένα κατηγορία ενώσεων με διάφορες βιολογικές δραστηριότητες που κυμαίνονται από αντικαταθλιπτικά, αντι-καρκίνου και αντι-φλεγμονώδη σε αντι-μικροβιακή δράση [4]. Μεταξύ αυτών, υπερφορίνη (Σχήμα 1), μια θεραπεία από το βαλσαμόχορτο (

Hypericum

perforatum

), έχει κερδίσει το δημόσιο συμφέρον ως ένα δημοφιλές αντικαταθλιπτικό φυσικής προέλευσης με ένα νέο μηχανισμό δράσης [5]. Έχει επίσης δειχθεί ότι έχει αντικαρκινικές ιδιότητες

in vitro

και

in vivo

[6-8]. Ωστόσο, μέσω δέσμευσης με τον υποδοχέα πρεγνανίου X (PXR), υπερφορίνη ρυθμίζει προς τα πάνω έντονα την έκφραση του CYP3A4, ένα μέλος της οικογένειας του κυτοχρώματος Ρ450 που εμπλέκονται στον μεταβολισμό ξενοβιοτικών [9]. Έτσι, αν συνδυαστεί με χημειο-θεραπευτικά φάρμακα που μεταβολίζονται από το CYP3A4, υπερφορίνη θα μείωνε σημαντικά την αποτελεσματικότητα του δυνητικού προσέγγιση συνδυαστική θεραπεία κατά του καρκίνου επειδή επιταχύνει μεταβολισμό του φαρμάκου (ων) συνδυάζεται με.

Στενά που σχετίζονται με χημικές δομές των υπερφορίνη (αριστερά) και nemorosone (δεξιά), δύο πολυκυκλικών polyprenylated acylphloroglucinols.

Η

το να σχετίζεται δομικά με υπερφορίνη, προφέρεται αντικαρκινικές ιδιότητες έχουν επίσης αποδειχθεί

in vitro

για nemorosone (Σχήμα 1) σε κυτταρικές σειρές διαφόρων προελεύσεων, μεταξύ των οποίων νευροβλάστωμα και λευχαιμία [10,11]. Πιο λεπτομερείς αναλύσεις των μηχανισμού δράσης της επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έδειξαν ταχεία ανύψωση του cyctosolic επίπεδα ασβεστίου και αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης που ακολουθείται από την ενεργοποίηση της απόπτωσης μέσω μιας οδού απόκρισης στρες είναι γνωστή ως η ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνη [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, διαφοροποιημένα κανονικά κύτταρα βρέθηκαν να είναι 10-φορές λιγότερο ευαίσθητος σε επεξεργασία με nemorosone, ανοίγοντας έτσι ένα δυνητικό θεραπευτικό παράθυρο για να διερευνήσει επίσης αντικαρκινική δράση του

in vivo

.

Αυτή η μελέτη, που αποδεικνύει ότι, σε αντίθεση με υπερφορίνη, nemorosone δεν επάγει το CYP3A4 και να ερευνήσει τη βιολογική δράση της, καθώς και τις βασικές φαρμακοκινητικές

in vivo

σε ένα παγκρεατικό μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου. Έχει αποδειχθεί ότι nemorosone απορροφάται ταχέως στην κυκλοφορία του αίματος και είναι σε θέση να αναστέλλουν την ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του περιφερειακού συμβουλίου της Καρλσρούης, Γερμανία (Αριθμός Άδειας: G-204/09). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό ξυλαζίνη /κεταμίνη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Εμφύτευση και τη θεραπεία των όγκων ξενομοσχεύματος

Έξι έως οκτώ εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς NMRI nu /nu άτριχων ποντικών (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Γερμανία) στεγάστηκαν σε ομάδες των 4 έως 6 σε ατομικά αεριζόμενα κλουβιά (IVCs? Techniplast, Γερμανία) στους 22 ° C με ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός και αφέθηκε να προσαρμοστούν στις συνθήκες στέγασης για ένα εβδομάδα πριν την εμφύτευση των όγκων. ΜΙΑ-ΡΑΟΑ-2 κύτταρα διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], και 200 ​​μΙ ενός κυτταρικού εναιωρήματος (~ 2 × 10

6) εγχύθηκε s.c. στο δεξί πλευρό του κάθε ποντικού για τη δημιουργία υποδόριους όγκους ξενομοσχεύματος. Ο όγκος του όγκου παρακολουθούνται τακτικά χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο, και τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία οργανώνονται σε ομάδες θεραπείας και ελέγχου σημαίνει μία φορά τον όγκο του όγκου έφθασε περίπου 100 mm

3.

Nemorosone, καθαρίζεται από μεθανολικό εκχυλίσματα λουλουδιών όπως αναφέρθηκε νωρίτερα [ ,,,0],12], διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε 50 mg /ml, και υδροχλωρική γεμσιταβίνη (Eli Lilly, Γερμανία) διαλύθηκε σε διάλυμα NaCl 0,9%. διαλύματα έγχυσης έγιναν διηθούνται στείρα και χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς (ε.π.) με τη χρήση 0,3 ml σύριγγες ινσουλίνης (Becton Dickinson, Germany) μετά την αποστείρωση της ένεσης. Το σωματικό βάρος ήταν ελεγχόμενη σε καθημερινή βάση πριν από ενδοπεριτοναϊκώς ένεση. 1 μl /g σωματικού βάρους εγχύθηκε για να επιτευχθεί μια τελική συγκέντρωση των 50 και 120 mg /kg για nemorosone και gemcitabine, αντίστοιχα. Nemorosone εγχύθηκε μία φορά την ημέρα, ενώ για γεμσιταμπίνη το πρότυπο πρόγραμμα θεραπείας κάθε τρίτη ημέρα για τέσσερις κύκλους χρησιμοποιήθηκε [13].

Ανοσοϊστοχημική χρώση των όγκων ξενομοσχεύματος

Μια μέρα μετά την τελευταία θεραπεία, τα ποντίκια θυσιάστηκαν με αποκόπηκαν αυχενική εξάρθρωση και ξενομοσχεύματος όγκους, snap-καταψυχθεί σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Οι όγκοι τοποθετήθηκαν σε cryomicrotome (Leica, Germany) στους -25 ° C και 5 μm τομές δημιουργήθηκαν από τα περιθώρια και τα κέντρα των όγκων που πρέπει να μεταφερθεί σε γυάλινα slides

Για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Χρώσης , τομές όγκων μονιμοποιήθηκαν επί 5 s σε ακετόνη στους -20 ° C, ξηραίνεται και χρωματίστηκαν σε αιματοξυλίνη (Carl Roth, Γερμανία) για 15 s και όξινα 1,5% ηωσίνη σε 96% EtOH (Merck, Γερμανία) για 4 s. Μετά την αφυδάτωση με επακόλουθη επώαση σε 70%, 96% και 2 χ 100% EtOH, χρώση ορίστηκε σε διάλυμα RotiClear (Carl Roth, Germany) και το κάλυμμα γυαλιά στερεώθηκαν σε ύψιστης μέσο στερέωσης (ϋΑΚΟ, USA).

για ανοσοϊστοχημική χρώση με Ki-67 και δραστική κασπάση 3 αντισώματα, οι τομές δεσμεύτηκαν με 3% περοξειδάση σε μεθανόλη μετά από στερέωση σε ψυχρή ακετόνη και πλύση σε ρυθμισμένο με tris SLINE (TBS) συμπληρωμένο με 0,1% (w /v) λευκωματίνη βόειου ορού (BSA). Μετά ένα άλλο στάδιο πλύσης, οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε 1: 100 αραιώσεις του κουνελιού αντι-ανθρώπινης Ki-67 ή δραστική κασπάση 3 αντισώματα (ϋΑΚΟ, USA) σε TBS /0,1% BSA. Τα πλακίδια πλύθηκαν σε TBS /0,1% BSA συμπληρωμένο με 0,1% (ν /ν) Tween-20 και στη συνέχεια σε TBS /0,1% BSA πριν από την προσθήκη του αλόγου-raddish υπεροξειδάσης (HRP) αντι-κουνελιού IgG δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας (ϋΑΚΟ , USA) για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι τομές χρωματίστηκαν με υγρό χρωμογόνο 3,3 ‘διαμινοβενζιδίνη (DAB) αραιωμένο 1: 500 σε ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος (ϋΑΚΟ, USA). Η ανάπτυξη χρώματος παρακολουθήθηκε μικροσκοπικά και σταμάτησε σε dH

2O. Οι τομές στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν σε αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και να τοποθετηθεί, όπως προαναφέρθηκε.

ανάλυση φαρμακοκινητικής nemorosone

50 mg /kg nemorosone χορηγήθηκαν ε.π. και τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με 7 mg /kg ξυλαζίνης και 100 mg /kg κεταμίνης 5, 20, 40, 60, 80, 100 και 120 λεπτά μετά την εφαρμογή του nemorosone. Ελήφθη αίμα σε ηπαρινισμένους σύριγγες από την καρδιά στίξης και ακολούθως φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 16.000 χ g για την προετοιμασία του πλάσματος. Nemorosone εκχυλίζεται από το πλάσμα με την προσθήκη 400 μΐ ακετονιτριλίου (ACN) σε 100 μΐ πλάσματος και φυγοκέντρηση στα 21.000 χ g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα νέο φιαλίδιο και συμπυκνώνεται σε συμπυκνωτή κενού. Το προκύπτον ίζημα διαλύεται σε διαλύτη για την υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) (50% Η

2O, 30% MeOH, 20% ACN). 10 μΙ από κάθε δείγμα εγχύθηκαν για ανάλυση σε ένα Waters 2690 HPLC System (Waters, Γερμανία) εξοπλισμένη με ένα 996 PDA και έναν ανιχνευτή ZQ2000 ESI-MS (Waters, Γερμανία). Ο διαχωρισμός έγινε χρησιμοποιώντας μία στήλη C18 συμμετρία ανάστροφης φάσης (μέγεθος πόρου 5 μm, 4.2 χ 250 χλστ? Waters, Germany) και μία σταθερή ταχύτητα ροής 1 ml /min χρησιμοποιώντας μια βαθμίδωση διαλύτη. Nemorosone απορρόφηση ανιχνεύθηκε στα 303 nm.

Nemorosone περιοχή κορυφής στο χρωματογράφημα ποσοτικοποιήθηκε με τη βοήθεια μιας καμπύλης βαθμονόμησης (Σχήμα S3) που προέρχεται από δείγματα ανθρώπινου πλάσματος εμπλουτίστηκαν με καθορισμένες συγκεντρώσεις του nemorosone (10 ng /ml έως 100 μg /ml). HPLC χρωματογραφήματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ενίσχυση 2, και κινητική συγκέντρωση nemorosone πλάσμα μετά από ε.π. ένεση είχαν τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας TopFit 2.0 [14], με την παραδοχή των δύο διαμερισμάτων διάθεση μετά την απορρόφηση του ενός τμήματος.

Ανάλυση των μεταβολών της έκφρασης των ενζύμων που μεταβολίζουν σε πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα

Περίπου 7.5 × 10

5 πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (Zen-Bio, NC, USA) επιστρώθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας κολλαγόνου Ι-επικαλυμμένες 12-φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων σε επίστρωση μέσο (Zen-Bio, NC, USA) και αφέθηκε να προσκολληθούν για 10 ώρες. Επιμετάλλωση μέσο αλλάχθηκε με μέσο συντήρησης (Zen-Bio, NC, USA) και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή πριν από την επώαση με 0.5 και 1 μΜ nemorosone και υπερφορίνη δικυκλοεξυλαμμώνιο άλας (Sigma Aldrich, Γερμανία) ή 10 μΜ ριφαμπικίνη (Sigma Aldrich , Γερμανία) για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και το ολικό RNA απομονώθηκε με μία RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA υποβλήθηκε σε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση χρησιμοποιώντας το QuantiFast SYBR Green RT-PCR κιτ (Qiagen, Germany) και QuantiTect εκκινητές (Qiagen, Germany) όπως περιγράφεται προηγουμένως [12].

Στατιστική δοκιμές

Όλα τα πειράματα έγιναν τουλάχιστον εις τριπλούν, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Για όλα τα πειράματα, έλεγχος τ (σε SigmaPlot 10.0) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ των δύο ομάδων.

Αποτελέσματα

Nemorosone δεν επάγει την έκφραση του CYP3A4 σε πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα

μεταβολισμού είναι ένα σημαντικό μέρος από τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες ενός φαρμάκου. Τα περισσότερα ξενοβιοτικών μεταβολίζονται από την οικογένεια του κυτοχρώματος Ρ450 (CYP) στο ήπαρ μετά ανιχνεύεται από πυρηνικούς υποδοχείς [15-17]. Όντας δομικά πολύ παρόμοια με nemorosone, υπερφορίνη (Σχήμα 1) έχει αποδειχθεί ότι επάγει την έκφραση CYP3A4 με σύνδεση του πυρηνικού υποδοχέα πρεγνανίου X (PXR) και, ως εκ τούτου, μια ταχύτερη μεταβολισμό των φαρμάκων συγχορηγείται με υπερφορίνη [9,18]. Για να δοκιμαστεί εάν επίσης nemorosone ανιχνεύεται από το PXR και επάγει την έκφραση του CYP3A4, καθώς και άλλα σημαντικά ένζυμα μεταβολίζον φάρμακο, πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία nemorosone, υπερφορίνη και ριφαμπικίνη, ένα φάρμακο που είναι γνωστό ότι επάγουν την έκφραση του CYP3A4 με σύνδεση προς τον υποδοχέα PXR (θετικός έλεγχος). Μετά από 48 ώρες επώασης, RNA εκχυλίστηκε από ηπατοκύτταρα και υποβλήθηκαν σε ανάλυση qRT-PCR για την αξιολόγηση της έκφρασης των επιλεγμένων ενζύμων.

Πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ριφαμπικίνης, υπερφορίνη, nemorosone ή όχημα μόνο. RNA εκχυλίστηκε μετά από 48 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση qRT-PCR για την ανίχνευση μεταβολών της έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των φαρμάκων. Οι τιμές έκφρασης είναι σχετικές με τον έλεγχο του οχήματος και αντιπροσωπεύουν μέσες ± SD τριπλών μετρήσεων.

Η

Το Σχήμα 2 δείχνει ότι η θεραπεία των ανθρώπινων ηπατοκυττάρων με υπερφορίνη και ριφαμπικίνη οδήγησε σε σημαντική αυξητική ρύθμιση του

CYP3A4

γονιδιακή έκφραση των 15 έως 20-πλάσια σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Σε αντίθεση με αυτό, η θεραπεία με 1 μΜ nemorosone μόνο επάγεται

CYP3A4

έκφραση 3-φορές, ενώ δεν υπήρξε σχεδόν καμία διέγερση κατά την κατεργασία με 0,5 μΜ nemorosone. επεξεργασία υπερφορίνη επίσης ελαφρώς πάνω ρυθμισμένα

CYP1A2

,

ΟΥΡ1Β1

και

CYP2B6

έκφραση, αλλά δεν υπήρξε καμία αλλαγή ανιχνεύσιμη για την άλλη δοκιμή ένζυμα μεταβολισμού, όπως αφυδρογονάση αλδεΰδη 1Α1 (ALDH1A1 ), εποξείδιο υδρολάσης 1 (EPHX1) ή γλουταθειόνη S-τρανσφεράση Α2 (GSTA2). Έτσι, μπορεί να υποτεθεί από αυτά τα δεδομένα, ότι υπερφορίνη μεταβολίζεται κυρίως από το CYP3A4, αφού γίνεται αισθητή από τον PXR. Παρά το γεγονός ότι είναι δομικώς παρόμοια με υπερφορίνη, nemorosone δεν φαίνεται να δεσμεύει την PXR και, ως εκ τούτου, ένζυμα που μεταβολίζουν μόνο ασθενώς επάγονται απόδοση nemorosone δυνητικά χρήσιμα σε μια προσέγγιση συνδυασμού αντι-καρκινική θεραπεία.

Nemorosone αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος in vivo

το Σχήμα 3 δείχνει ότι η καθημερινή έγχυση /kg nemorosone 50 mg είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική και πλήρη κατάργηση της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με το μέσο όρο των όγκων ελέγχου η οποία αυξήθηκε 5 φορές σε όγκο. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στην ομάδα ελέγχου που λαμβάνει 120 mg /kg γεμκιταβίνη. Ταυτόχρονα, η θεραπεία με nemorosone έδειξαν μια καλή ανεκτικότητα, επειδή το σωματικό βάρος παρέμεινε σταθερή κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας των 28 ημέρες (Σχήμα S1). Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι τα ζώα που έλαβαν nemorosone άρχισε να hyperventilate λίγο μετά την ένεση. Κανονική αναπνοή αποκαταστάθηκε και πάλι 5-10 λεπτά μετά την ε.π. αίτηση.

Για να εξετασθεί ιστολογικά αποτελέσματα της θεραπείας nemorosone, τα ζώα θυσιάστηκαν μετά την περίοδο θεραπείας και οι όγκοι αποκόπηκαν. Επεξεργασμένα και ιστός ελέγχου μετά χρωματίστηκαν για απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό δείκτες.

ιστολογικές διαφορές μεταξύ αγωγή και όγκων ελέγχου ήταν ορατές στην Η &? Ε-χρωματισμένες τομές όγκου (Σχήμα 4). Ενώ οι όγκοι ελέγχου επέδειξε μία ομογενή κατανομή των βιώσιμων κυττάρων, τα τμήματα των όγκων nemorosone αγωγή κατέδειξε μεγάλες περιοχές του νεκρωτικού ή αργά-αποπτωτικών κυττάρων που χαρακτηρίζεται από μόνο χρώση ηωσίνη. Η απουσία χρώσης αιματοξυλίνης στις περιοχές αυτές υποδηλώνει karyolysis. Ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι δραστική κασπάση 3 επαληθεύονται περιοχές υπερβολικής απόπτωσης (σκούρο-καφέ κύτταρα), ενώ τα τμήματα ελέγχου παρουσίασε κάποια απόπτωση φόντο μόνο (Σχήμα 4C και D). Σε περιοχές που στερούνται κασπάσης-θετικών κυττάρων, βρέθηκε να μειωθεί στα τμήματα των όγκων nemorosone αγωγή (Σχήμα 4F) ο αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν τον δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67. Σε αντίθεση με αυτό, ένα ομοιογενή κατανομή των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που χαρακτηρίζεται από ένα σκούρο-καφέ χρώση ήταν ορατή στα τμήματα ελέγχου.

Εν περιλήψει, η θεραπεία των όγκων nemorosone MIA-PaCa-2 ξενομοσχεύματος

in vivo

αποδείχθηκε να μειωθεί ο αριθμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων και διεγείρουν απόπτωση, οδηγώντας έτσι σε μείωση της μάζας του όγκου που χαρακτηρίζονται από μεγάλες περιοχές του θανάτου καρκινικών κυττάρων.

Φαρμακοκινητική ανάλυση αποκαλύπτει ταχεία απορρόφηση και μεταβολισμό του nemorosone

Απορρόφηση και μεταβολισμού του nemorosone

in vivo

εκτιμήθηκε με αφαίρεση αίματος πριν και σε διάφορα χρονικά σημεία μετά ip ένεση 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone καθώς και πιθανών μεταβολιτών εκχυλίστηκαν από το πλάσμα ποντικού, και συγκέντρωση στο πλάσμα αναλύθηκε για κάθε χρονικό σημείο με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ανεστραμμένης φάσεως (RP-HPLC? Ανίχνευση στα 303 nm)

ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθημερινές ε.π.. ενέσεις 50 mg /kg nemorosone, μόνο ή 120 mg /kg γεμκιταβίνη στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία (πράσινες κουκκίδες) του οχήματος. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε 2-3 φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από 8 ζώα ανά ομάδα

* p & lt.? 0.05, ** p & lt? 0.01 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος).

Η

Πέντε λεπτά μετά την ε.π. εφαρμογή, περίπου 40 μg /ml (80 μΜ) nemorosone ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα ποντικού, που δείχνουν προς μια πολύ ταχεία απορρόφηση στην κυκλοφορία του αίματος (Σχήμα 5Α). Την ίδια χρονική στιγμή, 7 επιπλέον κορυφών που μοιάζουν πιθανών μεταβολιτών βρέθηκαν στο χρωματογράφημα HPLC (σχήμα 5Α, σχήμα S2). Ωστόσο, η συγκέντρωση των πιθανών μεταβολιτών (M01-M09) στο πλάσμα υπολογίστηκε ότι είναι 20 έως 200 φορές μικρότερη από εκείνη του nemorosone. Κατά τη διάρκεια του χρόνου που παρατηρείται από 120 min, η συγκέντρωση στο πλάσμα μειώθηκε nemorosone λογαριθμικά από 40 να 2,7 μg /ml, με χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 30 λεπτά. Φαρμακοκινητική της nemorosone μετά από ε.π. αίτηση βρέθηκαν να περιγραφεί καλύτερα από ένα μοντέλο δύο διαμερισμάτων διάθεση δίνοντας ένα διφασικό γραμμή στο διάγραμμα log-κλίμακας στο σχήμα 5Β. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, nemorosone απορροφάται ταχέως και διανέμεται στην κυκλοφορία του αίματος εντός των πρώτων 10 λεπτών μετά την ένεση. 20 λεπτά μετά την εφαρμογή, την εξάλειψη φαίνεται να είναι η κυρίαρχη μέθοδος χαρακτηρίζεται από την ευθεία γραμμή τοποθετηθεί. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί, ότι οι διαδικασίες πριν από το χρονικό σημείο 5 λεπτά (απορρόφηση και διανομή) υποτεθεί και απαιτούν περαιτέρω επιβεβαίωση σε μια πιο λεπτομερή μελέτη. Έτσι, η μέγιστη συγκέντρωση μέσα στα πρώτα λεπτά θα μπορούσε να είναι πολύ υψηλότερη (~ 100 μg /ml)

Τμήματα 5 μm του nemorosone επεξεργασμένου και όγκους ελέγχου βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &?. Ε? Α και Β) ή ανοσοϊστοχημικά αναλύθηκαν με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον δραστική κασπάση 3 (C και D) ή Κί-67 (Ε και F). Επεξεργασμένα όγκων αποδεικνύεται μειωμένη μάζα του όγκου λόγω της απόπτωσης /νέκρωσης (μαύρα βέλη) και χαμηλότερο αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων σε σύγκριση με τον μάρτυρα (σκούρο καφέ κύτταρα).

Η

Τα δείγματα πλάσματος ελήφθησαν σε προ καθορισμένα χρονικά σημεία μετά από ip εφαρμογή 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone και οι μεταβολίτες της προσδιορίζονται ποσοτικά με RP-HPLC, με τη βοήθεια μιας καμπύλης βαθμονόμησης (Σχήμα S3). συγκέντρωση (Α) στο πλάσμα του nemorosone (επάνω πράσινη γραμμή) και το δυναμικό τους μεταβολίτες της (M01 έως M09). (Β) Οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες της nemorosone ήταν το καλύτερο που περιγράφεται από ένα πρότυπο δύο διαμερισμάτων με χρόνο ημιζωής 30 λεπτά.

Η

Ταυτότητα του nemorosone επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από ένα ESI ανιχνευτή φασματομετρίας μάζας εμφανίζει κορυφές μόριο για πρωτονιωμένα nemorosone και τα άλατα νατρίου και καλίου του (Σχήμα S4). Επιπλέον, η μάζα των κορυφών μορίου ορισμένων μεταβολιτών βρέθηκε να είναι αυξημένη κατά 16 u, υποδεικνύοντας ότι η οξείδωση του nemorosone θα μπορούσε να είναι ένα από τα κύρια στάδια μεταβολισμού. Ωστόσο, λόγω της χαμηλής ανάλυσης του ανιχνευτή ESI-MS, η δομή των μεταβολιτών nemorosone δεν θα μπορούσε να χαρακτηριστεί λεπτομερώς.

Συζήτηση

υπερφορίνη και nemorosone είναι από τα καλύτερα μελετημένα μέλη της ποικιλόμορφη κατηγορία πολυκυκλικών polyprenylated acylphloroglucinols και αμφότερες θεωρούνται ενώσεις μολύβδου για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπευτικών [4,6,12,19]. Ωστόσο, μέχρι τώρα αντικαρκινική δράση

in vivo

έχει επιδειχθεί μόνο για υπερφορίνη αλλά όχι για nemorosone [6]. Έτσι, αυτή η πιλοτική μελέτη με στόχο την αξιολόγηση της δραστηριότητας των nemorosone εναντίον του παγκρέατος καρκινικών όγκων ξενομοσχεύματος

in vivo

καθώς και τον εντοπισμό βασικές φαρμακοκινητικές παραμέτρους όπως την κινητική απορρόφησης και μεταβολισμού.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι nemorosone ισχυρά αναστέλλει την ανάπτυξη του παγκρεατικού ξενομοσχεύματα καρκίνου

in vivo

και φαίνεται να είναι ακόμη πιο αποτελεσματική από ό, τι το ισχύον πρότυπο της γεμσιταβίνης φροντίδας (Σχήμα 3). Ενώ η χορηγούμενη δόση nemorosone 50 mg /kg ανά ημέρα ήταν καλά ανεκτή κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας, υπεραερισμό παρατηρήθηκε αμέσως μετά την εφαρμογή του nemorosone υποδεικνύοντας κάποιο συστημική δραστικότητα αυτής της ένωσης αμέσως μετά την απορρόφηση στην κυκλοφορία του αίματος. Παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν για χουμουλόνη, μία ένωση δομικά συγγενών απομονώνονται από λυκίσκο, μετά από ενδοφλέβια ένεση σε γάτες [20]. Αυτό δείχνει συγκρίσιμη φαρμακοδυναμικές ιδιότητες που θα μπορούσε να οφείλεται στη δράση αυτών των ενώσεων στην ομοιόσταση του ασβεστίου στους μυς. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από τη στιγμιαία nemorosone επαγόμενη διατάραξη της κυτταρικής ομοιόστασης ασβεστίου παρατηρήθηκε

in vitro

[12]

Επιδράσεις της θεραπείας nemorosone επί ξενομοσχεύματος όγκοι επιβεβαιώθηκαν με Η &?. Ε χρώση του ιστού τομές καθώς και ανοσοϊστοχημικά με χρώση δραστική κασπάση 3 και το δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67. Nemorosone επεξεργασμένου ΜΙΑ-ΡΑΟΑ-2 όγκοι εμφάνισαν περισσότερο νεκρωτικά και /ή αποπτωτική περιοχές, οι οποίες συνδέονται με την αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης 3 και χαμηλότερο αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που εκφράζουν το Ki-67, σε συνέπεια με αποτελέσματα που λαμβάνονται σε κύτταρα MIA-PaCa-2

in vitro

[12].

Η μέτρηση της κινητικής του πλάσματος μετά από ip ένεση 50 mg /kg nemorosone επιβεβαίωσε βιοδιαθεσιμότητα και απορρόφηση της ένωσης στην κυκλοφορία του αίματος (Εικόνα 5). Πέντε λεπτά μετά την ένεση, η συγκέντρωση στο πλάσμα nemorosone βρέθηκε να είναι 40 μg /ml (80 μΜ) με λογαριθμική εξάλειψη κυριαρχεί 20 λεπτά μετά την ένεση και nemorosone επιδεικνύοντας μια ημιζωής στο πλάσμα περίπου 30 λεπτά. Οι μετρούμενες τιμές για την κινητική στο πλάσμα καλύτερα εξοπλισμένο υποθέτοντας μια πρότυπο δύο διαμερισμάτων διάθεση όπως παρατηρείται επίσης σε φαρμακοκινητικές μελέτες της συγκέντρωσης στο πλάσμα υπερφορίνη κατά την στοματική χορήγηση [21,22]. Υπολογίζεται μέγιστη συγκέντρωση της nemorosone πλάσμα ήταν ~ 100 μΜ. Έτσι, λαμβάνοντας υπόψη την υψηλή δόση κατά τη διάρκεια του πρώτου 5-10 λεπτά μετά την εφαρμογή, η παρατηρούμενη οξεία υπεραερισμό μπορεί να εξηγηθεί από nemorosone αναστρέψιμα παρεμβαίνοντας με υγιή κύτταρα μεταξύ μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα και την έναρξη της φάσης απομάκρυνσης περίπου 10 λεπτά αργότερα.

Συνολικά, 9 δυνατόν μεταβολίτες ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα του ποντικιού, οι περισσότεροι από αυτούς ήταν ήδη παρούσα σε 5 λεπτά μετά την ip ένεση (σχήματα 5 και S2). Αυτό δείχνει προς ένα ταχύς μεταβολισμός του nemorosone, σύμφωνα με την υπολογισμένη ημιζωή του μόνο 30 λεπτά. Δυστυχώς, η δομή των μεταβολιτών δεν μπορούσε να ληφθεί λόγω του χαμηλής ανάλυσης του ανιχνευτή ESI-MS. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι χρόνοι κατακράτησης στο χρωματογράφημα RP-HPLC είναι χαμηλότερες για όλους τους μεταβολίτες σε σύγκριση με nemorosone, μπορεί να υποτεθεί διαδικασίες οξείδωσης ή υδροξυλίωση. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται περαιτέρω από το γεγονός ότι, σε σύγκριση με nemorosone, η μάζα των επιλεγμένων μεταβολιτών είναι αυξημένη κατά 16 u, το μοριακό βάρος του οξυγόνου (Εικόνα S4). Για να αποκτήσετε λεπτομερείς δομικές πληροφορίες σχετικά με τους μεταβολίτες, ένα σύστημα LC /ESI-MS με υψηλότερη ανάλυση ή μια προπαρασκευαστική προσέγγιση για την ανάλυση NMR, θα πρέπει να καθοριστούν. Και οι δύο μέθοδοι έχουν εφαρμοστεί σε υπερφορίνη μεταβολίζεται στο ήπαρ αρουραίου συστήματα μικροσωμάτων και είχε ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση των τεσσάρων μεταβολιτών υπερφορίνη, κάθε υδροξυλιωμένο στο τερματικό ομάδα μεθυλενίου μιας από τις πλευρικές αλυσίδες τεσσάρων πρενυλ [23]. Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι δύο αρουραίων ισομορφών του κυτοχρώματος Ρ450 ορθόλογο για την ανθρώπινη CYP3A4 ήταν ασχολείται κυρίως στο μεταβολισμό της υπερφορίνη. Αυτό είναι συνεπές με το γεγονός ότι υπερφορίνη επάγει την έκφραση του

CYP3A4 μέσω

σύνδεση με τον υποδοχέα πρεγνανίου X (PXR) [9,24].

CYP3A4

έκφραση βρέθηκε επίσης ότι επάγεται ισχυρά από την υπερφορίνη και ριφαμπικίνη, μια ουσία που είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν PXR, κατά την κατεργασία των ανθρώπινων πρωτευόντων ηπατοκυττάρων σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 2). Είναι ενδιαφέρον, nemorosone ήταν μόνο μετρίως αποτελεσματική στην επαγωγή

έκφραση CYP3A4

: Η επώαση των ηπατοκυττάρων με 1 μΜ nemorosone οδήγησε μόνο σε μια 3-πλάσια αύξηση του

CYP3A4

mRNA σε σύγκριση με ένα 15-πλάσια αύξηση μετά από επώαση με 1 μΜ υπερφορίνη. Αυτό το αποτέλεσμα είναι εκπληκτικό λαμβάνοντας υπόψη το εξαιρετικά ευέλικτο κοιλότητα σύνδεσης συνδετήρα του PXR οποία έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύουν τέλεια υπερφορίνη [24,25]. Έτσι, με δεδομένη την στενή δομική σχέση με υπερφορίνη, η PXR θα πρέπει να αναμένεται, επίσης, να δεσμεύσει και να προκαλέσουν

CYP3A4

έκφραση σε ισομοριακές συγκεντρώσεις nemorosone. Αυτό δεν φαίνεται να είναι η περίπτωση, καθιστώντας έτσι υψηλότερες συγκεντρώσεις nemorosone για τη θεραπεία του καρκίνου προτιμότερη έναντι εκείνων του υπερφορίνη για τα οποία έχουν αναφερθεί πολλαπλές αλληλεπιδράσεις φαρμάκων που σχετίζονται με την επαγωγή του CYP3A4 [9,18]. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι μια αυξημένη έκφραση PXR έχει επίσης παρατηρηθεί σε διάφορες παγκρεατικά κύτταρα [26], θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος με μία προσέγγιση θεραπείας συνδυασμού είναι πιο πιθανό να είναι επιτυχής με nemorosone παρά υπερφορίνη.

Εν κατακλείδι, μελέτη μας δείχνει μια σημαντική αύξηση-ανασταλτική δράση της nemorosone επί του παγκρέατος ξενομοσχεύματα καρκίνου ενώ είναι καλά ανεκτές. Βασικές φαρμακοκινητική ανάλυση δείχνει, ότι nemorosone απορροφάται ταχέως και μεταβολίζεται μέσω οξείδωσης σε ένα CYP3A4-ανεξάρτητο τρόπο. Αυτό κάνει nemorosone μια πολλά υποσχόμενη ένωση μολύβδου για συνδυασμό θεραπειών. Έτσι, θα πρέπει να διεξάγεται πιο λεπτομερείς μελέτες για ορθοτοπική μοντέλα ξένου μοσχεύματος και φαρμακοκινητικές αναλύσεις υψηλότερη ανάλυση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Σωματικό βάρος των επεξεργασμένων και ελέγχου ποντίκια. Το σωματικό βάρος των επεξεργασμένων και ελέγχου ποντικών ρουτίνας προσδιορίστηκε σε καθημερινή βάση πριν από ενδοπεριτοναϊκώς ένεση. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από 8 ζώα ανά ομάδα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

HPLC χρωματογραφήματα του nemorosone και των μεταβολιτών της ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα. Επικάλυψη των επιλεγμένων χρωματογραφήματα HPLC (ανίχνευση στα 303 nm) του ποντικού (πράσινο) και ανθρώπου (μπλε) δείγματα πλάσματος καθώς και ανθρώπινο πλάσμα εμπλουτίστηκαν με 100 ng /ml nemorosone (κόκκινο) και πλάσμα ποντικού 5 λεπτά μετά i.p. εφαρμογή του nemorosone (μαύρο) παρουσιάζεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Πρότυπο σειρά του ανθρώπινου πλάσματος εμπλουτίστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις nemorosone. Μια γραμμή βαθμονόμησης για nemorosone εμπλουτισμένου σε δείγματα ανθρώπινου πλάσματος ήταν υπολογίζονται και να τρέξει παράλληλα με τα δείγματα που προέρχονται από το πλάσμα του ποντικιού για να επιτρέπουν την ποσοτικοποίηση των nemorosone

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

ESI-MS φάσματα nemorosone και επιλεγμένα μεταβολιτών. ESI-MS φάσματα καταγράφηκαν για κάθε κορυφή, και τα φάσματα για nemorosone καθώς επίσης και για τους μεταβολίτες M01, M06 και M08 εμφανίζονται. Οι κορυφές ιόν μορίου του πρωτονιωμένων nemorosone (m /z = 503,2), καθώς και νάτριο του (m /z = 525,2) και κάλιο (m /z = 541,1) άλατα σημειώνονται με μαύρα βέλη. Δυνητικά οξειδωμένη nemorosone νατρίου (m /z = 541.1) και καλίου (m /z = 557,2) άλατα σημειώνονται με γκρι βέλη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s004

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες για τη διευκόλυνση DKFZ Εργαστήριο ζώων και Sven Rüffer για τεχνική βοήθεια κατά τη διάρκεια της κυτταρικής καλλιέργειας και το έργο των ζώων, καθώς και ο Δρ Shereen Keleg, Ευρωπαϊκό Πάγκρεας Κέντρο, Χαϊδελβέργη, για τη βοήθειά της με ανοσοϊστοχημική χρώση.