Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι η κύρια αιτία θανάτου στους άνδρες, ωστόσο οι παράγοντες που ρυθμίζουν την εξέλιξή της και ενδεχόμενη μετάσταση στα οστά παραμένουν ασαφείς. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η έκφραση WISP1 /CCN4 σε προστάτη καρκινικούς ιστούς ήταν ρυθμισμένη σε πρώιμα στάδια της νόσου και, περαιτέρω, ότι συσχετίζεται με αυξημένα επίπεδα κυκλοφορούντων του WISP1 στους ορούς των ασθενών σε πρώιμα στάδια της νόσου. WISP1 επίσης αυξημένα στον προστάτη ποντικού TRAMP μοντέλο καρκίνου στον υποπλαστική άρρωστο ιστό που αναπτύσσεται πριν από το σχηματισμό προχωρημένο καρκίνωμα. Όταν η ικανότητα των αντισωμάτων αντι-WISP1 να μειωθεί η εξάπλωση των κυττάρων PC3-Luc σε απομακρυσμένες θέσεις ελέγχθηκε έδειξε ότι δύο φορές εβδομαδιαίως ενέσεις των αντισωμάτων αντι-WISP1 μείωσε τον αριθμό και το συνολικό μέγεθος των μακρινών όγκοι αναπτύχθηκαν μετά ενδοκαρδιακή ένεση (IC) του PC3 κύτταρα-Luc σε ποντικούς. Η ικανότητα των αντισωμάτων έναντι WISP1 να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων PC3-Luc σε ποντικούς εκτιμήθηκε επίσης και έδειξε ότι δύο φορές την εβδομάδα ενέσεις των αντισωμάτων αντι-WISP1 μειωμένη τοπική ανάπτυξη του όγκου όταν εξετάζεται σε ξενομοσχεύματα. Για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης, η μετανάστευση των κυττάρων PC3-Luc μέσω μεμβρανών με ή χωρίς φραγμό Matrigel ™ έδειξε τα κύτταρα έλκονται WISP1, και ότι αυτή η έλξη ανεστάλη με αγωγή με αντισώματα αντι-WISP1. Δείχνουμε επίσης την έκφραση της WISP1 στη διεπιφάνεια οστού-όγκου και στο στρώμα του πρώιμου καρκίνων βαθμού πρότεινε έκφραση WISP1 είναι σε θέση να παίξει ρόλο τόσο στην προώθηση της ανάπτυξης του καρκίνου και την εξάπλωση του στα οστά. Εν ολίγοις, η αυξητική ρύθμιση των WISP1 στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου σε συνδυασμό με την ικανότητά του να αναστέλλει εξάπλωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη είναι τόσο ένας πιθανός στόχος και ένα προσιτό διαγνωστικό δείκτη για καρκίνο του προστάτη κάνει.

Παράθεση: Ono Μ, Inkson CA, SØNN R, σκωτσέζικες φούστες TM, de Castro LF, Maeda A, et al. (2013) WISP1 /CCN4: ένας πιθανός στόχος για αναστολή του προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου και να εξαπλωθεί σε Οστών. PLoS ONE 8 (8): e71709. doi: 10.1371 /journal.pone.0071709

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Μαρ 2013? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγ, 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από το τμήμα της Τειχών Έρευνας, NIDCR του Προγράμματος Τειχών Έρευνας, ΝΙΗ, DHHS (MO, CAI, ΤΜΚ, LFCD, AM (Maeda), LWF, PGR, ADB, LL NM-F, ACB, NPSC, AM (Molinolo) και MFY), με επιχορήγηση από το Υπουργείο άμυνας των W81XWH-11-1-0239 (AJ και NSF) και με Υποτροφία Howard Hughes (RS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Όντας η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες όλων των φυλών, ο καρκίνος του προστάτη είναι μια σημαντική ανησυχία για την υγεία για τους άνδρες [1], [2]. Έχει προταθεί ότι οι περισσότεροι ηλικιωμένοι άνδρες τρέφουν τα ίχνη του καρκίνου του προστάτη, και όμως οι μοριακές βάσεις για το πώς και γιατί η πρόοδος του καρκίνου είναι ακόμα άπιαστο [3]. Όπως πολλές άλλες επικίνδυνες μορφές καρκίνου, κύτταρα καρκίνου του προστάτη έχουν μια πολύ υψηλή συχνότητα εμφάνισης μεταναστεύουν από τον πρωτογενή όγκο σε απομακρυσμένες θέσεις όπου είναι μια πιο άμεση αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας [4]. Μια συχνή τοποθεσία για την μετάσταση του καρκίνου του προστάτη είναι σε οστό, όμως, όταν ο καρκίνος εξελίσσεται σε αυτό το στάδιο, είναι συνήθως ανίατη [5], [6], [7]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια κρίσιμη ανάγκη για 1) να καταλάβει τι παράγοντες που συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου στον προστάτη, 2) να κατανοήσουν πώς και γιατί του προστάτη «σπίτι» στα οστά και, περαιτέρω, 3) επινοήσουν νέους τρόπους για να αποφευχθεί αυτό το σύνθετο και καταστροφικές διαδικασία. Η μετάσταση του καρκίνου του προστάτη μπορεί να είναι μια αναποτελεσματική διαδικασία και μόνο ένα κλάσμα του προστάτη ασθενών με καρκίνο αναπτύσσουν καρκίνο που μεθίσταται σε απομακρυσμένες θέσεις [3]. Με την ανάλυση τα πρώτα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη είναι εφικτό ότι θα μπορούσαν να αναπτυχθούν νέες διαγνωστικές διαδικασίες που προβλέπουν την εξέλιξη και το μέλλον της σοβαρότητας του καρκίνου και τη βελτιστοποίηση το χρονοδιάγραμμα και τη φύση των θεραπευτικών παρεμβάσεων. Νέες πληροφορίες σχετικά με τις υποψήφιες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαδικασία αυτή θα μπορούσε, επίσης, ενδεχομένως να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη νέων θεραπειών για να μειωθεί η εξάπλωση και καθιέρωση της νόσου σε μακρινά σημεία, όπως των οστών.

WISP1 (Wnt που προκαλείται από εκκριτική πρωτεΐνη-1 ) είναι ένα μέλος της οικογένειας CCN που ονομάζεται από τα ιδρυτικά μέλη της Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 και Νοέμβριο /CCN3. Υπάρχουν επί του παρόντος έξι μέλη της οικογένειας που περιλαμβάνουν επίσης WISP1 /CCN4, WISP2 /CCN5 και WISP3 /CCN6 [8]. WISP1 αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα γονίδιο που εκφράζεται στο μεταστατικό μελάνωμα γραμμή, Κ-1735, όπου ονομαζόταν Elm1 (αναφερόμενος έκφρασή του σε ταπεινούς μεταστατικά κύτταρα) [9]. Περίπου την ίδια στιγμή που Elm1 ανακαλύφθηκε, WISP1 ταυτοποιήθηκε σε ένα ξεχωριστό εργαστήριο όπου βρέθηκε να είναι up-ρυθμίζεται από wnt1 μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα μαστού, καθώς και σε διάφορες σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, καθώς και να εκφράζεται σε ιστό καρκίνου ανθρώπινου κόλον [10 ]. Ακολούθως, WISP1 δείχθηκε να προσδίδει ογκογόνο χαρακτηριστικά αρουραίου κύτταρα νεφρού (NRK-49F), συμπεριλαμβανομένων των επιταχυνόμενη ανάπτυξη, ενισχυμένη πυκνότητα κορεσμού και αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν όγκους σε ποντίκια [11]. Από την αρχική του αναγνώριση, WISP1 έχει βρεθεί σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου οισοφαγικού καρκινώματος των πλακωδών κυττάρων [12], χονδροσάρκωμα [13], καρκίνωμα του μαστού [14], [15], νευροϊνωμάτωση τύπου Ι [16], ορθοκολικό καρκίνωμα [17 ], καρκίνωμα Lewis του πνεύμονα [18], επεμβατική χολαγγειοκαρκίνωμα, σκιρώδης γαστρικό καρκίνωμα [19] και το αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου endometriod [20]. Είναι ενδιαφέρον ότι, WISP1 έκφραση σε πολλούς από αυτούς τους καρκίνους εντοπίζεται στους ιστούς που περιβάλλουν στρωματικά των καρκινικών κυττάρων [15], υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στο μικροπεριβάλλον που υποστηρίζει την ανάπτυξη ή /και την ενδεχόμενη εξάπλωση του πρωτοπαθούς όγκου.

σε μη παθολογικές καταστάσεις, WISP1 βρίσκεται σε διάφορα εμβρυϊκά και ενήλικους ιστούς που περιλαμβάνουν κυρίως νέες περιοχές του σχηματισμού των οστών [21], όπου φαίνεται να ελέγχει οστεογένεση [22]. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι καρκίνοι του προστάτη έχουν υψηλό τροπισμό προς το οστό και, περαιτέρω, ότι αυτή η διαδικασία μπορεί να ενισχυθεί με την αύξηση της οστικής ανακύκλωσης [23] υποθέσαμε ότι WISP1 μπορεί, ενδεχομένως, να εμπλέκεται στη ρύθμιση metatasis καρκίνο του προστάτη. Αυτή η μελέτη αναλήφθηκε για τον προσδιορισμό πρώτα εάν και εφόσον WISP1 εκφράζεται σε πρωτογενείς όγκους του προστάτη και στη συνέχεια, να προσδιοριστεί ο ρόλος του WISP1 στην ανάπτυξη και παλιννόστησης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να σκελετικού ιστού. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι WISP1 βρίσκεται σε πρώιμα στάδια του καρκίνου του προστάτη είτε σε ιστούς βιοψίες ή σε ορούς από πληγείσες ασθενείς καθώς επίσης και στην υποπλαστική ιστό προ-καρκινώματος από ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, δείξαμε ότι η αναστολή της λειτουργίας WISP1 χρησιμοποιώντας αντισώματα εξουδετέρωσης μείωσε την ανάπτυξη όγκου ξενομοσχεύματος μιας κυτταρικής γραμμής καρκίνου του προστάτη, καθώς και παλιννόστησης του στο οστό. Στο σύνολό τους, τα σημεία της μελέτης μας για να WISP1 ως νέου συμμετέχοντος στις διαδικασίες ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη και οστικές μεταστάσεις

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Ανθρώπινα Θέματα:. Πυρήνας βιοψίες που εκπροσωπούν διαφορετικά τάξεις του καρκίνου του προστάτη (από το I-IV), συμπεριλαμβανομένων των ιστών ελέγχου αγοράστηκαν από τις ΗΠΑ Biomax ™ (Cat # PR801) και εγκρίθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας Γραφείο Ανθρωπίνων Θέματα Έρευνας, Bethesda, MD (Απαλλαγή # 11583) η χρήση τους. Έγκριση για τη χρήση του ανθρώπινου ορού λήφθηκε από το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins Medicine (JHM) Institutional Review Board (IRB), Βαλτιμόρη, MD. Ο αριθμός του εγκεκριμένου IRB πρωτόκολλο για χρήση με τον ορό δοκιμασίας είναι JHM IRB-X No: 04-07-27-03e. Οι παθολογικές δείγματα /διαγνωστικά δείγματα από τους εμπορικούς προμηθευτές είναι από πηγές που είναι διαθέσιμες στο κοινό και οι πληροφορίες που καταγράφονται από τον ερευνητή με τέτοιο τρόπο που δεν μπορεί να προσδιοριστεί θέματα, άμεσα ή μέσω αναγνωριστικά που συνδέονται με τα θέματα και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους δότες ορού πριν από τη χρήση του

για να διευκρινιστεί:. η φύση των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται για ανθρώπινα υποκείμενα, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από δότες ως μέρος των πρωτοκόλλων για τη συλλογή δειγμάτων ορού (ProMedDx, Inc.) και βιοψία ιστού πυρήνες (ΗΠΑ. Biomax Inc.). Αυτά τα πρωτόκολλα και οι μορφές συγκατάθεσή τους έχουν εγκριθεί από τις εμπορικές πηγές δική Institutional Review Boards. Περισσότερες πληροφορίες για τις ακριβείς λεπτομέρειες σχετικά με το περιεχόμενο των γραπτών μορφών έγκριση μπορεί να βρεθεί σε www.promeddx.com για δείγματα ορού και σε www.biomax.us για συστοιχίες ιστών. Αυτά τα πρωτόκολλα και οι μορφές συγκατάθεσή τους έχουν εγκριθεί από τις εμπορικές πηγές δική Institutional Review Boards. Επειδή τα εμπορικά διαθέσιμα δείγματα αποχαρακτηριστούν και αποσυνδεθεί από το δότη τους, η χρήση τους δεν ταιριάζει ορισμό του NIH για τα Ανθρώπινα Θέματα Έρευνας, ως εκ τούτου, τα πρωτόκολλα που εξαιρούνται (Απαλλαγή # 1158 για το NIH και αριθ: 07/04/27 -03e για JHU).

Πειράματα που χρησιμοποιούν ζώα

Όλες οι διαδικασίες που χρησιμοποιούν ζώα διεξήχθησαν στο Εθνικό Ινστιτούτο υγείας και του φορέα που χορήγησε την έγκριση για τις διαδικασίες των ζώων που περιγράφονται στο έγγραφο είναι γνωστή η επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση (ACUC). Ο αριθμός έγκρισης για τα πειράματα που εκτελούνται στην παρούσα μελέτη είναι ΝΙΗ ACUC # 12-645.

Polyclonal παραγωγή αντισωμάτων

Ένα ανθρώπινο πεπτίδιο WISP1 με την RDTGAFDAVGEVEAWHRN ακολουθία (αμινοξέα 198-216, προσχώρηση αριθμός ΝΡ 003873, βλέπε σχήμα S1A) συντέθηκε και συζευγμένο μέσω της κυστεΐνης σε ενεργοποιημένα αιμοκυανίνη πεταλίδας και εγχέεται μέσα σε ένα κουνέλι (LF-185) για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων σε ένα AAALAC εγκεκριμένη εγκατάσταση (Covance Immunology Services, Denver, ΡΑ, USA) . Ο τίτλος του προκύπτοντος αντιορού ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας άμεση ELISA είτε με το πεπτίδιο LF-185 ή με καθαρισμένη ανθρώπινη WISP1 ως έλεγχος (PeproTec, Rocky Hill, NJ, USA) που συνδέονται προς την πλάκα μικροτιτλοδότησης. Η ειδικότητα της LF-185 ελέγχθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας τρία άλλα διαθέσιμα μέλη της οικογένειας CCN Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 και Νοε /CCN3 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, USA) και έδειξε ανοσοαντιδραστικότητα μόνο προς WISP1 (Σχήμα S1B ). Ένα δεύτερο αντίσωμα κουνελιού για WISP1 δημιουργήθηκε με μία αλληλουχία στο C-άκρο, το οποίο διατηρείται σε υψηλό βαθμό (& gt? 95%) μεταξύ ποντικού και ανθρώπου WISP1 (αμινοξέα 346 έως 367, ΝΡ 003873 βλέπε, Εικόνα S1A), χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο πεπτιδική αλληλουχία CRNPNDIFADLESYPDFSEIN συζευγμένο μέσω της κυστεΐνης σε ενεργοποιημένο KLH (LF-187). Αυτό το τελευταίο αντίσωμα έδειξε επίσης υψηλή αντιδραστικότητα προς WISP1 και όχι τα άλλα μέλη της οικογένειας CCN δοκιμαστεί (S1B).

Polyclonal Antibody Καθαρισμός

Τα πεπτίδια που χρησιμοποιείται για την παραγωγή LF-185 και LF-187 ήταν καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας αντίστοιχο πεπτίδιο τους και την SulfoLink Ακινητοποίηση Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), και τα αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια ως ακολούθως. Πρώτον, οι στήλες πεπτιδίου-συνδεδεμένη εξισορροπήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και στη συνέχεια 2,0 ml από κάθε ορό πέρασε μέσα από τη στήλη, πλύθηκαν με PBS, και εκλούστηκαν με διάλυμα 4 Μ γουανιδίνης σε PBS. Τα εκλουσθέντα αντισώματα αμέσως σε διαπίδυση με περίσσεια όγκου PBS όλη τη νύκτα στους 4 ° C και την ανάκτηση των ανοσοαντιδραστικότητα τους επαληθεύονται με ELISA. καθαρισμένα με συνάφεια αντισώματα φυλάχτηκαν στους -80 ° C πριν από τη χρήση. Για πειραματικούς ελέγχους, IgG καθαρίστηκε από ένα κουνέλι αμφισβητούνται μόνο με ανοσοενισχυτικό χρησιμοποιώντας την Πρωτεΐνη Α IgG Purification Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) με μια στήλη Πρωτεΐνης Α συγγένειας χρησιμοποιώντας την ίδια δεσμευτική, πλύση, έκπλυση και διαπίδυση συνθήκες που χρησιμοποιούνται για καθαρισμού LF-185 και LF-187.

Ανοσοϊστοχημεία και TRAP χρώση

τα πλακίδια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή με ένα τρόπο ταυτόσημο με εκείνο που χρησιμοποιείται για τα τμήματα ποντικού που περιγράφεται παρακάτω. Εν συντομία, τομές ιστών αποπαραφινοποιήθηκαν, η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης καταστράφηκε από μεθανολικό H

2O

2, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-WISP1 IgG (SC-25441, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) αραιωμένο σε συγκέντρωση 4 μg /mL (1:50) σε PBS συν 10% ορό κατσίκας επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μια κανονική ισότυπος IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως μη ανοσοδραστικό ελέγχου (ΑΒ-105-C, Ε & amp? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA). Για ορισμένες χρώσεις (S5) πρωτογενή αντισώματα για την ανθρώπινη WISP1 (LF-185) ή προάνοσο ορό χρησιμοποιήθηκαν και πρώτα αραιώνεται 1:500 και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα πριν από την ανίχνευση. Ακολούθησε χρώση με μεθυλ πράσινο και χώρους των θετικών ανοσοχρώση αξιολογούνται από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητους ερευνητές. Για χρώση TRAP, το κιτ TRAP /ALP λεκέ (# 294 έως 67.001, Wako, Osaka, Japan) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Ορός Ανάλυση

Ορός από ασθενείς με καθορισμένες ποιότητες καρκίνο του προστάτη ή από κανονικούς ελέγχους αναλύθηκε με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και ανιχνεύτηκαν με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του συντηρημένο καρβοξυ-άκρο της ανθρώπινης WISP1 (LF-187) με τυποποιημένες διαδικασίες κηλίδωση Western. Το πρωτογενές αντίσωμα, LF-187, προστέθηκε σε αραίωση 1: 2000 που ακολουθείται μετά από επώαση και πλύση με HRP-σημασμένο δευτερεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:10,000. Μετά την απομάκρυνση του δεύτερου διαλύματος αντισώματος, η μεμβράνη πλύθηκε και εκτίθενται στο χημιφωταύγειας ενζυμικό υπόστρωμα και τα σήματα συνελήφθησαν, ψηφιοποιήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Kodak GEL Logic 2200 Σύστημα Απεικόνισης (Carestream Health Inc., Rochester, ΝΥ, USA). Για κάθε κηλίδα, η καθαρή ένταση της ζώνης που αντιστοιχεί στο πλήρους μήκους WISP1 ομαλοποιήθηκε με το μέσο σήμα από διπλές λωρίδες που περιέχει 20 ng ανασυνδυασμένης WISP1 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, USA)

.

Ζώα

ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς (αθυμικά γυμνά-Foxn1nu) αγοράστηκαν από τη Harlan και ήταν ηλικίας 8 εβδομάδων κατά τη στιγμή της μελέτης. Ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του προστάτη (προστάτη διαγονιδιακό αδενοκαρκίνωμα ποντικού ή TRAMP) ότι η υπερ-εκφράζει ιού πιθήκου 40 (SV-40 /Tag) γονίδιο από το στέλεχος υποκινητή ειδικού προστατικού probasin (ΡΒ) είχε προηγουμένως δημιουργηθεί [24] και να χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει WISP1 έκφραση σε προσβεβλημένο ιστό του προστάτη. Το γενετικό υπόβαθρο των ποντικών TRAMP ήταν NOD και ελήφθη με τη διέλευση των θηλυκών TRAMP Β6 με NOD /αρσενικά LTJ να δημιουργήσει μια ημιζυγωτική στέλεχος F1 για το PB-Tag. Τα προκύπτοντα ποντίκια TRAMP-NOD υποβλήθηκαν σε ευθανασία με υπερβολική δόση πεντοβαρβιτάλης στα 8 και 16 εβδομάδων και του προστάτη και των σπερματοδόχων κύστεων συλλέχθηκαν για ιστολογική ανάλυση. Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης όλη τη νύκτα και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε 70% αλκοόλη. Σταθερή ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη και τεμαχίστηκαν σε πάχος 4 μm. Για τον προσδιορισμό της σχετικής οστική πυκνότητα των ποντικών θεραπεία μυρμήγκι-WISP1 χρησιμοποιήσαμε ένα σεληνιακό PIXImus Πυκνότητας (GE Medical Systems) που έχουν σχεδιαστεί ειδικά για τα τρωκτικά.

Ο αποικισμός του PC-3 Luc κύτταρα σε μακρινές τοποθεσίες με ενδοκαρδιακή έγχυση ( IC)

Οκτώ εβδομάδων αρσενικών Αθυμικοί nude- ποντικούς ΝΙΗ /Bg-ηυ /ηυ-XID αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο και ξυρισμένο στο σημείο της ένεσης, το οποίο στη συνέχεια σκουπίστηκε με ιώδιο και αλκοόλη 70%. Μία σύριγγα TB με μια βελόνα 27 gauge επισυνάπτεται στη συνέχεια φορτώθηκε με ένα εναιώρημα PC3-Luc (5 × 10

5 κύτταρα /150 ml PBS) και η βελόνα εισάγεται κάθετα στο τέταρτο μεσοπλεύριο χώρο. Όταν μια λάμψη του αίματος παρατηρήθηκε στην πλήμνη της βελόνας τα κύτταρα ενέθηκαν αργά μέχρις ότου το περιεχόμενο της βελόνας ήταν άδεια και η βελόνα τραβήχτηκε έξω αργά. Για να βεβαιωθούμε ότι τα κύτταρα ενεθεί σωστά στην αριστερή κοιλία και διαδίδονται σε όλο το ποντίκι και όχι, για παράδειγμα, παγιδεύεται στους πνεύμονες (όπως θα ήταν η περίπτωση για μια ένεση μέσα στην δεξιά κοιλία) μετά την ένεση IC οι ποντικοί αμέσως ενέθηκαν με 100 μΐ ενός διαλύματος 40 mg /ml ά-λουσιφερίνη πυγολαμπίδας (Biosynth) ενδοφλεβίως και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας ένα Lumina-XR (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ, USA). Οι ποντικοί που εμφάνισαν διανομή των κυττάρων PC3-Luc όπως κρίνεται από φωταύγεια σε ολόκληρο το σώμα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω επεξεργασίες. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες θεραπείας (η = 6 /ομάδα) και ενέθηκαν με κύτταρα την Ημέρα 0. Η χορήγηση των αντισωμάτων διεξήχθη με μία δόση των 100 μg μέσω ΙΡ ένεση δύο φορές την εβδομάδα, ξεκινώντας την Ημέρα 0 του τον εμβολιασμό του όγκου και συνεχίζοντας τη διάρκεια του πειράματος. Τρεις ομάδες αποτελούνταν από: 1) ποντικούς που έλαβαν ένεση με 100 μΙ συγγένεια καθαρισμένο αντίσωμα, LF-185, 2) εκείνους που έλαβαν IgG ελέγχου, και 3) αυτούς που 1Χ PBS μόνο.

In vivo

απεικόνισης εκτελέστηκε κάθε εβδομάδα για να παρακολουθείτε την ανάπτυξη και τη δημιουργία των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση ενός Lumina-XR (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Πριν από την απεικόνιση ποντίκια ενέθηκαν με 100 μΐ ενός διαλύματος 40 mg /ml ά-λουσιφερίνη πυγολαμπίδας (Biosynth) σε PBS ενδοφλεβίως. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή για ένα σύνολο 4 εβδομάδων και την περιοχή και οι μετρήσεις της έκθεσης στο φως ποσοστώθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Στην τέταρτη εβδομάδα, αφού αναλύει το τελικό λουσιφεράσης, τα οστά εμφανίζουν αποικισμό από τα κύτταρα του όγκου συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ακτινογραφία MX-20 Faxitron με έκθεση σε 30 Κν για 40 δευτερόλεπτα χρησιμοποιώντας PPL φιλμ από Kodak με επακόλουθη ενσωμάτωση και την επεξεργασία για ιστολογία και ανοσοχημεία.

Cell Culture και RT-PCR

κύτταρα PC3-Luc [25] είναι ένα ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη που εκφράζει συστατικά λουσιφεράσης (ένα δώρο από τον Δρ Ράσελ Taichman, του Πανεπιστημίου του Michigan School Οδοντιατρικής, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI Medium 1640 (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) που περιείχε 10% FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA) και 1% στρεπτομυκίνη διάλυμα πενικιλλίνης /(Gibco GlutaMAX-I, Grand Island, ΝΥ, USA ) σε ένα C ατμόσφαιρα 5% CO

2 /αέρα 37 °. Τα κύτταρα περάστηκαν κάθε 2 ημέρες σε 85% συρροή. RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε mRNA απομονωμένο από καλλιεργημένα κύτταρα PC3-Luc και ενισχύεται χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτιδικούς σύνολα που αντιστοιχούν σε ανθρώπινο WISP1 χρησιμοποιώντας αλληλουχίες και τις συνθήκες που περιγράφηκαν προηγουμένως [22].

Ξενομοσχεύματος

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη PC3-Luc παραδόθηκαν 8 εβδομάδων αθυμικά γυμνά-Fox1nu ποντικούς με υποδόριο εμβολιασμό ενός καρκινικού κυττάρου εναιώρημα (5 × 10

6 κύτταρα /200 μΙ PBS) την ημέρα 0. σε αυτό το πείραμα τα κύτταρα μετρήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ ψυχρού PBS και διατηρήθηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες σε υγρό πάγο κατά τη μεταφορά στην εγκατάσταση ζώων. Ο βέλτιστος αριθμός των κυττάρων για το πείραμα αυτό προσδιορίστηκε με την πρώτη μέτρηση συνολική ανάπτυξη PC3-Luc χρησιμοποιώντας 2 × 10

6, 5 × 10

6 1 × 10

7 κύτταρα /εμβολιασμό σε 4 διαφορετικές θέσεις /ποντικό . Για τον εμβολιασμό, τα κύτταρα αναρροφήθηκαν εντός μίας σύριγγας ΤΒ με μια βελόνα 25G συνδέονται και ένεση με κωνικούς πλευρά επάνω στον ραχιαία πλευρά προηγουμένως σκουπίζεται με αλκοόλη. Το μέγεθος του όγκου στη συνέχεια μετρήθηκε με παχύμετρο ή με δράση σε σχέση με τη χρήση της λουσιφεράσης Lumina XR όπως περιγράφεται παραπάνω. πιλοτική μελέτη μας έδειξε ότι το χαμηλότερο 2 × 10

6 δόση των PC3-Luc αυξήθηκε αργά, ενώ η υψηλότερη δόση 1 × 10

7 δόση αυξήθηκε ταχύτατα τα οποία κρίναμε ότι είναι υπο-βέλτιστη για το 4 -Εβδομάδα πορεία του χρόνου έχει προγραμματιστεί για τις θεραπείες αντισώματος μας. Η μεσαία δόση 5 × 10

6 ήταν η βέλτιστη και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τα επόμενα πειράματα. Τρεις ομάδες θεραπείας που αποτελούνται από 6 προκλήθηκαν γυμνών ποντικών ανά ομάδα ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς (ΙΡ) δύο φορές την εβδομάδα είτε με 1) 100 μα του πολυκλωνικού αντισώματος καθαρισμένου με συνάφεια που κατευθύνονται έναντι WISP1 (LF-185) 2) 100 μα παρομοίως καθαρισμένο IgG ελέγχου ή 3 ) PBS μόνο σε έναν όγκο 100 μΙ. Πρόσφατα παρασκευασμένη καθαρισμένα αντισώματα παρασκευάστηκαν πριν από την ένεση στα ποντίκια δοκιμής. Μέσα από την πορεία των όγκων πειραμάτων μετρήθηκαν με παχύμετρο για να εκτιμηθεί σχετικό ρυθμό ανάπτυξής τους και στην τέταρτη εβδομάδα, οι όγκοι συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν. Σε ένα πείραμα οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν για 6 εβδομάδες (S4) με παρόμοια αποτελέσματα. Όλα τα πειράματα χρησιμοποιώντας ποντίκια επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές. Στο τέλος του πειράματος ορισμένοι όγκοι αναλύθηκαν περαιτέρω με ιστολογία και αναλύθηκαν για έκφραση WISP1, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα «Ανοσοϊστοχημεία και TRAP χρώση».

In vitro μετανάστευση

Σε vitro

μετανάστευση των κυττάρων PC3-Luc ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας BD Falcon FluoroBlok Cell Culture Ενθέματα με τρύπες 8-micron (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). PC3 κύτταρα-Luc σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης αποκολλήθηκαν από τις πλάκες 100 mm με τη θρυψίνη-ΕϋΤΑ, και 2 χ 10

4 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 100 μg /ml του LF-187, το αντίσωμα IgG ή PBS για 1 ώρα στους 37 ° C σε ελεύθερο ορού RPMI 1640 και προστέθηκαν σε FluoroBlok Cell Culture Εισάγει. RPMI 1640 που περιέχει 5% FBS ή 200 ng /ml WISP1 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, USA) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο, και ολόκληρο το σύστημα επωάστηκε στους 37 ° C για 24 ώρες σε 5% CO

2 . Μετά την επώαση και τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (cat # P36935, Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ, USA). Τα κύτταρα που μετανάστευσαν εξετάστηκαν μικροσκοπικά σχετικά με την κάτω πλευρά της μεμβράνης με ανίχνευση μετανάστευσε ϋΑΡΙ-επισημασμένου πυρήνες. Ο αριθμός των κυττάρων σε 3 τυχαία ολόκληρο πεδία σε μεγέθυνση 100Χ μετρήθηκε με Image-Pro Plus (MediaCybernetics, Rockville, MD, USA) και ο μέσος όρος των τριών φρεάτια προσδιορίστηκε.

Στατιστική Ανάλυση

Ένα unpaired Student του

t-test

χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση ελέγχου έναντι πειραματικά δείγματα χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (Prism 5, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) για την κυτταρική μετανάστευση, την ανάπτυξη του όγκου και λουσιφεράση δοκιμασίες.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Η κατανομή των μετρούμενων παραμέτρων για τιμές WISP1 ορού αξιολογήθηκε από το D’Agostino & amp? Pearson test omnibus ομαλότητα. Συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων έγιναν με τη χρήση

t-test

, ενώ οι συγκρίσεις σε τρεις ή περισσότερες ομάδες χρησιμοποίησε μια μονόδρομη δοκιμή ANOVA ενός αταίριαστο του Student. Η ένωση των επιπέδων πρωτεΐνης WISP1 με PSA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία συσχέτιση Spearman.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

WISP1 Protein Expression στον καρκίνο του προστάτη ιστών και σε ορό από προσβεβλημένους ασθενείς

Antiserum ήταν. εγείρονται έναντι ενός ανεπαρκώς και εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή του WISP1 (LF-185 και LF-187 αντίστοιχα, βλέπε S1) σε κουνέλια και βρέθηκε να είναι πολύ δραστικές για WISP1 (S1) και δε μπορεί να αντιδρούν εγκάρσια με άλλα τρία μέλη της οικογένειας CCN συμπεριλαμβανομένων Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 ή Νοέμβριο /CCN3 (S1). Αν και δεν ελέγχονται άμεσα με στύπωμα Western, τα ανθρώπινα WISP2 /CCN5 και WISP3 /CCN6 δεν περιέχουν πρωτογενείς αλληλουχίες πρωτεΐνης που θα μπορούσε εύλογα να θεωρηθούν ομόλογο με την εξαιρετικά διατηρημένη ανθρώπινο πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για την παραγωγή LF-185. Η θέση και σχετικό επίπεδο έκφρασης των WISP1 σε φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη και του προστάτη των διαφόρων βαθμών σοβαρότητας εκτιμήθηκε με LF-185 χρησιμοποιώντας πυρήνα ιστό βιοψιών που λαμβάνονται από εμπορικώς Biomax ™. Σε αυτό το πείραμα πυρήνα βιοψίες από καρκίνους χαμηλής και υψηλής ποιότητας (Ι ήταν χαμηλότερη, IV ήταν υψηλότερο) και χρωματίστηκαν για ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το αντιορούς WISP1 και συγκρίθηκαν με τη χρώση χρησιμοποιώντας IgG σαν αρνητικό δείγμα αναφοράς. Η αξιολόγηση αυτής της χρώσης από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητους παρατηρητές αποκάλυψε ότι WISP1 εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στον καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες (Σχήμα 1Α) και ότι ήταν κατά κύριο λόγο βρίσκεται στο ιστό στρώμα που περιβάλλει τον όγκο και σε κάποιο βαθμό στην επιθηλιακός ιστός. Εκτός από αυτό, χρώση WISP1 ήταν υψηλότερη σε δείγματα που προέρχονταν από ασθενείς με χαμηλότερο βαθμό του καρκίνου (Ι) σε σύγκριση με εκείνους με τους υψηλότερους βαθμούς (IV) του καρκίνου.

A. Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση WISP1 σε βιοψίες από ασθενείς με διάφορους βαθμούς του καρκίνου του προστάτη. Ειδικά χρώση για WISP1 (LF-185) βρέθηκε στο στρώμα και στο επιθήλιο των όγκων από το χαμηλότερο Gleason Grade (Grade Ι) βαθμολογίες και διάχυτα σε ολόκληρη την πολύ μεταστατικός (Βαθμός IV) νεοπλασματική καρκίνωμα. B. Μία αντιπροσωπευτική εικόνα ενός ποσοτική δοκιμασία κηλίδος western για να μετρηθούν επίπεδα του WISP1 ορού σε ορό από φυσιολογικά άτομα (διαδρομές 1-6) και από άτομα με καρκίνο του προστάτη (διαδρομές 7-12). Γ Ποσοτική συγκροτήματα από 20 φυσιολογικά άτομα και 60 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με

t-test

. Δ δείγματα στρωματοποιημένη κατά το στάδιο της νόσου χρησιμοποιώντας το σύστημα TNM βαθμολόγησης και σε σύγκριση με ένα τεστ ANOVA. NL, Κανονική, ρΤ1, pT2, ρΤ3 χαμηλότερη στην υψηλότερη βαρύτητα, LN

+ /SV

+, λεμφαδένα θετικές, σπερματοδόχος κύστη θετική. E. Το επίπεδο των WISP1 ήταν στρωματοποιημένη κατά Gleason σκορ και σε σύγκριση με το τεστ ANOVA, 5 είναι χαμηλότερη σοβαρότητα, 9 είναι η μεγαλύτερη σοβαρότητα. F. Η σύνδεση των επιπέδων WISP1 ορού με PSA αναλύθηκε με Spearman συσχέτιση (PSA, X-άξονας, WISP1, Υ-άξονας). Κάθε μικρό κύκλο αντιπροσωπεύει αξίες από έναν μόνο ασθενή.

Η

δεδομένα ανοσοϊστοχημείας μας δείχνουν ότι η έκφραση WISP1 ήταν ισχυρότερη σε χαμηλότερη βιοψίες ποιότητας μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι WISP1 σε τέτοιου είδους καρκίνων θα μπορούσαν να διαφύγουν σε ορό και να ανιχνευθεί με τη χρήση ανοσοαποτύπωση τεχνικές. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, δείγματα ορού εξετάστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα προς WISP1 (Σχήμα 1Β). Η ανάλυσή μας έδειξε ότι όταν όλοι οι βαθμοί ομαδοποιήθηκαν μαζί WISP1 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ορό από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (PCA) σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες (NL) (Σχήμα 1 C). Αυτά τα δείγματα περαιτέρω υποδιαιρούνται με τη χρήση του όγκου, κόμβος, μετάσταση (TNM) σύστημα βαθμολόγησης και έδειξαν ότι τα σχετικά επίπεδα WISP1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με βαθμούς ρΤ2, ρΤ2 και ρΤ3 σε σύγκριση με είτε NL ή για τους ασθενείς που ήταν λεμφαδένα και σπερματικό κυστίδιο θετικά (LN + /SV +) (Σχήμα 1 C). Όπως είχε προβλεφθεί, όταν τα δείγματα επαναξιολογούνται χρησιμοποιώντας το σύστημα βαθμολόγησης Gleason τα σχετικά επίπεδα WISP1 ήταν σημαντικά υψηλότερα στους βαθμούς 5-7 σε σύγκριση με τις πιο προηγμένες βαθμούς 8-9 (Σχήμα 1Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε σύγκριση με τα επίπεδα του PSA υπήρξε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση με WISP1 είναι υψηλότερη στα δείγματα που είχαν τα χαμηλότερα επίπεδα PSA (Σχήμα 1 F).

WISP1 Έκφραση στο TRAMP μοντέλο του καρκίνου του προστάτη

για να επιβεβαιώσετε την αντίληψη μας ότι WISP1 ήταν ρυθμισμένη στον καρκίνο του προστάτη χρησιμοποιήσαμε ένα παρελθόν που δημιουργείται μοντέλο ποντικού γνωστό ως TRAMP (διαγονιδιακό αδενοκαρκίνωμα του προστάτη του ποντικιού). Αυτό το στέλεχος διαγονιδιακών ποντικών αρχίζει να αποκτά υποπλαστική ιστό προστάτη από 8 εβδομάδες της ηλικίας και με 16 εβδομάδες, οι ιστοί που επηρεάζονται να εξελιχθεί σε καρκινώματα με σημαντική επιβάρυνση του όγκου. Επηρεαζόμενα προστάτες απομονώθηκαν από ποντίκια TRAMP-NOD σε πρώιμα (ηλικίας 8 εβδομάδων) και αργά (16 εβδομάδων) τα στάδια της εξέλιξης του όγκου και αναλύθηκαν για έκφραση WISP1 με ανοσοϊστοχημεία. Στα πρώτα στάδια της νόσου WISP1 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται στον υποπλαστική ιστό που αναπτύσσεται αρχικά στο μοντέλο σε αυτή την ηλικία (κάτω πάνελ Σχήμα 2Α). Σε ιστούς που απομονώθηκαν από 16 εβδομάδων ποντίκια, WISP1 εκφράσεως είναι αυξημένο ακόμη περισσότερο με την περαιτέρω ανάπτυξη της υπερπλασίας (Σχήμα 2Β μεσαίο πλαίσιο) και, περαιτέρω, εκφράστηκε σε γενικές γραμμές σε περιοχές με προχωρημένο carinoma (Σχήμα 2Β κάτω πίνακας).

Α. WISP1 εντοπισμός σε ηλικία 8 εβδομάδων σε φυσιολογικό ιστό του προστάτη (άνω πάνελ) και υπερπλαστικών ιστών (κατώτερο πάνελ, μαύρο βέλος). B. εντοπισμός WISP1 στις 16 εβδομάδες της ηλικίας, σε φυσιολογικό ιστό του προστάτη (άνω πάνελ), υπερπλαστικό ιστός (μεσαίο πλαίσιο, μαύρο βέλος) και καρκίνωμα (κάτω πίνακας). Οι έλεγχοι IgG φαίνεται στα δεξιά του κάθε πίνακα.

Η

Anti-WISP1 Θεραπεία περιορίζει την εξάπλωση και την Ίδρυση του PC3-Luc απόσταση από το σημείο της ένεσης

κύτταρα PC3-Luc ήταν εγχέεται στην αριστερή κοιλία της ανοσοκατεσταλμένοι ποντικούς και αφήνεται να εξαπλωθεί και να αναπτυχθούν επί 4 εβδομάδες με δύο φορές την εβδομάδα ενέσεις του PBS, IgG ή αντι-WISP1. Ο αριθμός των όγκων και το συνολικό φορτίο του όγκου στη συνέχεια προσδιορίζεται από την ικανότητά τους να εκπέμπουν φως (φωταύγεια) και έδειξε ότι το αντι-WISP1 μείωσε σημαντικά τις δύο αυτές παραμέτρους σε σχέση με PBS ή IgG αγωγές (Σχήμα 3Α και 3Β αντίστοιχα). Στα χέρια μας η κυτταρική σειρά PC3-Luc που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη είχαν υψηλό triopism για τα οστά κάνει το δρόμο του μετά την έγχυση IC σε πολλά σημεία του σκελετού, συμπεριλαμβανομένης της γνάθου, ρύγχος, σπονδυλική στήλη, μηρού, κνήμης, τα πλευρά, στέρνο, ωμοπλάτης και ωλενών. Ωστόσο, άλλες περιοχές της παλιννόστησης των κυττάρων PC3-Luc βρέθηκαν επίσης έξω από το σκελετό και περιλαμβάνονται μαλακούς ιστούς, όπως την καρδιά, τους πνεύμονες και των όρχεων περιλαμβάνει περίπου 10% του συνόλου των μεταστάσεων. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των όγκων που σχηματίζονται μετά την έγχυση IC παρουσιάζεται στο (S2) που απεικονίζει αυτά τα ευρήματα. Όταν μετρήθηκαν οι αριθμοί των όγκων βρήκαμε ότι οι σκελετικές θέσεις είχαν προτίμηση μειώθηκε με την κατεργασία WISP1 αντίσωμα. Συγκεκριμένα, σε ελέγχους, το 90% των μεταστάσεων ήταν σε σκληρό ιστό και 10% σε μαλακό ιστό. Με WISP1 θεραπείες αντισώματος, ο αριθμός των σκελετικές θέσεις επηρεάζονται μειώθηκε στο 66% του συνόλου των μεταστάσεων με τις θέσεις των μαλακών ιστών που αποτελούν το 33% του συνόλου των μεταστάσεων. Εκτός από συνολικό αριθμό όγκων η συνολική επιβάρυνση του όγκου μειώθηκε από θεραπείες αντίσωμα WISP1 σε σύγκριση με τις θεραπείες IgG (Σχήμα 3Β). Αυτό έδειξε ότι όχι μόνο τη διάδοση αλλά και η ανάπτυξη του όγκου μειώθηκε κατά WISP1 εξουδετέρωση. Για να ελέγξετε την πιθανότητα ότι θα μπορούσε να επηρεάσει WISP1 όγκου καλλιεργούνται αξιολογήσαμε την επόμενη αύξηση των PC3-Luc χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματα.

Α. Συνολικός αριθμός των όγκων που αναπτύχθηκε ανά ποντίκι σε επεξεργασία με IgG ή αντι-WISP1 (LF-185). **

σ

& lt? 0,01 PBS εναντίον θεραπεία αντι-WISP1, Β συνολικής επιβάρυνσης του όγκου κρίνεται από σχετικές μετρήσεις luciferease ανά ποντίκι. ***

σ

& lt?. 0.001 IgG έναντι της θεραπείας αντι-WISP1

Η

WISP1 θεραπεία με αντίσωμα μειώνει το μέγεθος των PC3-Luc Ξενομοσχεύματα σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια

Αντισώματα έναντι WISP1 χρησιμοποιήθηκαν κατά μήκος της πλευράς IgG και PBS ελέγχου να δοκιμάσουν σχετική ικανότητα τους να μειώνουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη που αναπτύχθηκαν κάτω από το δέρμα του ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. Τα ζώα εγχύθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με αντι-WISP1 και την ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για 4 εβδομάδες. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η WISP1 γίνεται στο οστό εξετάσαμε επίσης τα ποντίκια χρησιμοποιώντας μια μηχανή σάρωσης DEXA και έδειξε ότι το αντι-WISP1 αγωγή ποντικοί δεν είχαν σημαντικές αλλαγές στο ποσοστό της οστικής πυκνότητας πριν και μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με είτε PBS ή IgG ελέγχου (S3 ). Ο ρυθμός ανάπτυξης του όγκου μετρήθηκε κατά τη διάρκεια του πειράματος χρησιμοποιώντας καλίμπρες και έδειξαν ότι οι όγκοι στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με αντι-WISP1 μειώθηκαν σε μέγεθος σε σύγκριση με είτε PBS ή IgG ελέγχου (S4). Όταν οι όγκοι αφαιρέθηκαν στο τέλος των θεραπειών και φωτογραφήθηκε, ήταν σαφές ότι οι όγκοι ήταν μικρότερα στην αντι-WISP1 αγωγή ποντικούς, (Σχήμα 4Α) και ότι είχαν στατιστικώς μικρότερο συνολικό βάρος σε σύγκριση με όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή είτε με PBS ή IgG (Εικόνα 4Β).

Α.