Αφηρημένο

Εμείς περιγράφουμε μία νέα βιοπληροφορικής και την προσέγγιση της παθολογίας της μετάφρασης, το γονίδιο Υπογραφή Finder Αλγόριθμος (gSFA) για την ταυτοποίηση βιοδεικτών που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) επιβίωση. Εδώ ένα ισχυρό σύνολο των δεικτών CRC επιλέγεται από ένα σύνολο μέθοδο. Με τη χρήση ενός συνόλου δεδομένων από 232 προφίλ γονιδιακής έκφρασης, gSFA ανακαλύπτει 16 πολύ σημαντική μικρές υπογραφές γονίδιο. Ανάλυση των διχοτομήσεις που δημιουργούνται από τις υπογραφές οδηγεί σε ένα σύνολο 133 δειγμάτων σταθερά κατατάσσεται σε καλή ομάδα πρόγνωση και 56 δείγματα σε κακή ομάδα πρόγνωση, ενώ 43 παραμένουν μη αξιόπιστα ταξινομούνται.

AKAP12

,

DCBLD2

,

NT5E

και

SPON1

είναι ιδιαίτερα εκπροσωπούνται στις υπογραφές και έχουν επιλεγεί για επικύρωση

in vivo

για δύο ανεξάρτητες ομάδες ασθενών που περιλαμβάνει 140 καρκινικούς ιστούς και 60 συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. έκφρασή τους και ρυθμιστικών προγραμμάτων διερευνώνται

in vitro

. Θα δείξουμε ότι το συνδυασμό έκφραση του

NT5E

και

DCBLD2

στρωματοποιεί σθεναρά τους ασθενείς μας σε δύο ομάδες (μία εκ των οποίων με 100% επιβίωση σε πέντε έτη). Θα δείξουμε ότι

NT5E

είναι ο στόχος του TNF-α σηματοδότησης

in vitro

? το ογκοκατασταλτικό PPARγ ενεργεί ως νέου

NT5E

ανταγωνιστή που θετικά και ταυτόχρονα ρυθμίζει

DCBLD2

σε ένα καρκινικό κύτταρο πλαίσιο-εξαρτώμενο τρόπο

Παράθεση:. Pagnotta SM, Laudanna C , Pancione M, L Sabatino, Votino C, Remo A, et al. (2013) Ensemble of Gene Υπογραφές Αναγνωρίζει νέων βιολογικών δεικτών στον καρκίνο του παχέος ενεργοποιείται μέσω PPARγ και TNFα Σηματοδοσίας. PLoS ONE 8 (8): e72638. doi: 10.1371 /journal.pone.0072638

Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 18 Απρ, 2013? Αποδεκτές: 11 Ιουλ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Αυγούστου, 2013

Copyright: © 2013 Pagnotta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Ministero dell’Università e della Ricerca σύμφωνα με επιχορήγηση (PRIN2008-20085CH22F) και από Associazione Italiana per la Lotta ai linfomi e leucemie. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ορθοκολικό καρκίνο (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες σε όλο τον κόσμο και μια διαδεδομένη αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας. CRC επιβίωση είναι στενά συνδεδεμένη με την κλινική και παθολογική στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση? πάνω από το ένα τρίτο των ασθενών CRC πεθαίνουν μέσα σε πέντε χρόνια από την αρχική διάγνωση και οι περισσότεροι από θανατηφόρα αποτελέσματα προκύπτουν από μεταστάσεις στο ήπαρ [1].

Παρά την πρόσφατη εισαγωγή πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών παραγόντων, υπάρχουν μόνο λίγες επικυρωμένες προγνωστικούς βιοδείκτες να εκτιμήσει την επιθετικότητα της νόσου και την πιθανότητα υποτροπής ή θανάτου μετά την επέμβαση. Πρόσφατες μελέτες προτείνουν μικρές υπογραφές γονιδίου ως χαρακτηριστικά του σταδίου του όγκου [1,2]. Μέχρι σήμερα ενοποιητική μελέτες ανακάλυψαν ενισχύσεις του

ΕΚΒΒ2

και

IGF2

και γονίδια σημαντικά μεταλλάσσεται σε CRC όπως

APC, TP53, Smad4, PIK3CA

και

KRAS

ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους [3]. Έτσι, ο προσδιορισμός της ακριβούς πρόβλεψης και προγνωστικοί δείκτες σε συνδυασμό με την αυξανόμενη οπλοστάσιο των θεραπευτικών παραγόντων θα παρέχει πιο αποτελεσματικές θεραπείες που σχετίζονται με το μοριακό προφίλ ελαχιστοποίηση απειλητική για τη ζωή τοξικότητα του ασθενούς [4].

Έχουμε αναπτύξει μια νέα υπολογιστική προσέγγιση , γονίδιο Υπογραφή Finder Αλγόριθμος (gSFA) να δημιουργήσετε πολλά μικρά σύνολα γονιδίων που διαστρωμάτωση των ασθενών από την άποψη της επιβίωσης. Η στρατηγική μας κάνει χρήση της διαθεσιμότητας των μεγάλων συνόλων δεδομένων γονιδιακής έκφρασης για την επιλογή υποψηφίων που μπορούν στη συνέχεια να επικυρωθεί σε ανεξάρτητες βιβλιοθήκες των ιστών. Προσεγγίσαμε το πρόβλημα της εξαγωγής κατάλληλων χαρακτηριστικών από την παγκόσμια έκφραση των γονιδίων που συσχετίζονται καλύτερα με την κλινική πληροφορία για τη δημιουργία προγνωστικών υπογραφές. Οι περισσότερες από τις τρέχουσες διαδικασίες βασίζονται στην εξειδικευμένη γνώση για την επιλογή, μεταξύ των χιλιάδων γονιδίων, μοριακούς δείκτες που μπορούν να συσχετιστούν με την πρόγνωση [5]. Πρόσφατα, νέες μέθοδοι, που θεμελιώνεται στην εξόρυξη δεδομένων, μηχανική μάθηση [6] και των στατιστικών παλινδρόμηση [7] για «μάθηση Υπογραφή » έχουν προταθεί. Αυτό είναι ένα ενδιαφέρον θέμα στην Υπολογιστική Βιολογία και μπορεί να μοντελοποιηθεί ως ένα πρόβλημα της βέλτιστης επιλογής χαρακτηριστικών [8]. Εδώ, υιοθετήσαμε ως κριτήριο βέλτιστου τη σημασία του τεστ log-rank μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης των ομάδων που προκαλείται από τα επιλεγμένα χαρακτηριστικά και χρησιμοποιείται μια νέα διαδικασία που ενσωματώνει αρκετές υπογραφές δημιουργούνται από μια βασική άπληστο αλγόριθμο. Τα γονίδια Υπογραφή στη συνέχεια κατατάσσονται με βάση ορισμένες μετρήσεις βαθμολογίας που μετρούν τη συμβολή του γονιδίου στις υπογραφές ανήκει.

Ξεκινώντας από μια δημόσια σύνολο δεδομένων από διακόσια τριάντα δύο προφίλ γονιδιακής έκφρασης CRC, ο αλγόριθμος μας επιλέγεται, μεταξύ άλλων, βιοδείκτες επιβίωση σχετίζονται όπως

AKAP12, DCBLD2, NT5E

και νέα CRC-ειδικούς δείκτες όπως

SPON1

. Θα προβληθεί τα υποψήφια γονίδια σε δύο ανεξάρτητες ομάδες των 140 ασθενών με πρωτοπαθή σποραδικές CRC χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία σε ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs). Οι μεταβολές στην έκφραση γονιδίων στη συνέχεια δοκιμάστηκε σε ένα

in vitro

σύστημα κυττάρων που επιβεβαίωσε τις

in vivo

δεδομένων. Συλλογικά, τα δεδομένα μας παρέχει μια νέα μέθοδο για την ταυτοποίηση νέων και ισχυρή βιοδεικτών ως πολύτιμο βήμα προς την καλύτερη προγνωστική διαστρωμάτωση και τη διαχείριση των ασθενών.

Υλικό και Μέθοδοι

μικροσυστοιχιών Σύνολα

Εφαρμόζουμε

gSFA

(περιγράφεται παρακάτω) για τη δημόσια σύνολα δεδομένων για να εντοπίσει μια σειρά βιοδεικτών. Τα στοιχεία που λαμβάνονται υπόψη είναι εκείνες από τις συλλογές που αναφέρονται στο [9] και είναι διαθέσιμο ως GSE17536 και GSE17537 σύνολο δεδομένων στο Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Και τα δύο σύνολα δεδομένων είναι γονίδιο προφίλ έκφρασης που λαμβάνονται με τη χρήση του Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array. GSE17536 μετράει 177 δείγματα σε 54.613 γονιδίων-ανιχνευτές, ενώ GSE17537 έχει 55 δείγματα στα ίδια ανιχνευτές. Τα 232 αρχεία πρώτων κυττάρων είχαν κατεβάσει από τις δύο συλλογές, τότε η διόρθωση υποβάθρου, ποσοστημόριο κανονικοποίηση και περιλήψεων εφαρμόστηκαν.

δείγματα όγκων

ανέλυσαν δείγματα CRC από ομάδες δύο ανεξάρτητες ασθενών που περιλαμβάνει μια σειρά δοκιμών και μια σειρά επικύρωσης (Ι και ΙΙ), αντίστοιχα. Cohort Ι περιλαμβάνει ενενήντα οκτώ CRC περιπτώσεις και 60 σε συνδυασμό φαινομενικά φυσιολογικό βλεννογόνο αφαιρεθεί κατά τη διάρκεια της ίδιας χειρουργικής επέμβασης. Αυτό το σύνολο δεδομένων περιλαμβάνει τόσο το άζωτο κατεψυγμένα δείγματα παραφίνη και υγρά, όπως αναφέρθηκε [10,11]. Cohort II αποτελείται από 42 περιπτώσεις σποραδικής CRC συγκεντρώνονται στο Τμήμα Παθολογίας και Ογκολογίας, Legnago Νοσοκομείο Βερόνα, Ιταλία κατά την περίοδο 2005-2007. Όγκοι ταξινομούνται και βαθμολογούνται σύμφωνα με τα κριτήρια των TNM και όγκου στάδια Ι-IV συστήματα ταξινόμησης? η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 71,2 ± 18.21. Κανένας από τους ασθενείς είχαν οικογενειακό ιστορικό εντερικών δυσλειτουργίας ή CRC, είχαν λάβει χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία πριν από την εκτομή ούτε είχαν λάβει μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα σε τακτική βάση. Οι συμβατικές θεραπείες μετεγχειρητικές δόθηκαν σε όλους τους ασθενείς, ανάλογα με τη σοβαρότητα της νόσου. Συνολικό μήκος της επιβίωσης υπολογίσθηκε αρχίζοντας από την πρώτη χειρουργική επέμβαση. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν για ένα μέσο διάστημα 55 μηνών ή μέχρι το θάνατο.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση και αξιολόγηση της χρώσης

Για την ανοσοϊστοχημική ανάλυση, αποπαραφινοποιήθηκαν τμήματα ιστού, ενυδατωμένο σε διαβαθμισμένη αλκοόλη, και φούρνο μικροκυμάτων θεραπεία για 20 λεπτά στους 750 W. Heat επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου διεξήχθη με θέρμανση των διαφανειών ΤΜΑ βυθίζεται σε ανάκτηση κιτρικού ρυθμιστικού (ρΗ 6,0). Οι τομές επωάστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια με τα ειδικά αντισώματα: AKAP12 (αραίωση 1: 500? WH0009590M1, μονοκλωνικό ποντικού, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), Spondin1 (αραίωση 1: 250? AB40797? κουνελιού πολυκλωνικό, Abcam, Cambridge, UK))? NT5E (αραίωση 1:50? AB115289? Πολυκλωνικά κουνελιού, Abcam, Cambridge, UK)? και DCBLD2 (αραίωση 1: 100? AB115451? κουνελιού πολυκλωνικό, Abcam, Cambridge, UK) Όλα τα αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτερεύοντα αντισώματα, που ακολουθείται από το σύστημα στρεπταβιδίνης-ραφανιδικής επωάστηκαν για 30 λεπτά το καθένα, με τη χρήση στρεπταβιδίνης-βιοτίνης κιτ χρώσης υπεροξειδάσης (LSAB + System-HRP? Dako Cytomation, Glostrup, Δανία). Η ανοσοαντιδραστικότητα αποκαλύφθηκε με επώαση σε 3,3-διαμινοβενζιδίνης (DAB) υπόστρωμα για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, de-ενυδατωμένο, και κάλυμμα-γλίστρησε. Πρωτογενή αντισώματα είχαν παραλειφθεί σε αρνητικούς μάρτυρες.

Μια ημιποσοτική προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει ανοσοαντιδραστικότητα λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των θετικών κυττάρων και διανομή χρώση της χρώσης σε υποκυτταρικό διαμέρισμα (κυτοσολική και /ή μεμβράνης). Για κάθε δείγμα, ολόκληρο το κομμάτι των πολύ μικρών ιστός εξετάστηκε διαμέσου μικροσκοπία φωτός σε μεγέθυνση 20x. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων, τα οποία προσδιορίζονται από ανοσοαντιδραστικότητα για κάθε δείκτη, υπολογίστηκε για όλα τα δείγματα στο ΤΜΑ. Αντιπροσωπευτικά περιοχές (5 πεδίο υψηλής ισχύος) που περιέχει το υψηλότερο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για την καταμέτρηση των κυττάρων όγκου ανά τμήμα. Το κλάσμα (ποσοστό ανοσοαντιδραστικών κυττάρων όγκου, σε δείγματα εις τριπλούν) που εκφράζεται ως ο αριθμός των θετικών κυττάρων για Fields (PCFs), υπολογίζεται στη συνέχεια.

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα προς τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι και εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Institutional Review της «FatebeneFratelli» Νοσοκομείο στην Μπενεβέντο και Legnago Νοσοκομείο, Βερόνα, Ιταλία. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων και η επακόλουθη ανάλυση

Στατιστική ανάλυση:. Γονιδίου Υπογραφή Finder Αλγόριθμος (gSFA)

διαδικασία επιλογής γονιδίων μας απασχολεί μια αποτελεσματική μέθοδο περιτύλιγμα [8] με βάση σε ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση, με ένα σύστημα διαταραχή δημιουργώντας αρκετές γονίδιο-σετ με διαφορετικές αρχικές συνθήκες για να αρχίσει η επιλογή του γονιδίου. Οι αρχικές συνθήκες αντιστοιχούν σε σπόρους γονίδια που εμφανίζουν ορισμένες ιδιότητες, όπως είναι μια καλή αρχική υπόθεση. Η προκύπτουσα αλγόριθμος ορίζεται

geneSignatureFinder

(gSFA) υλοποιείται σε ένα R-πακέτο και είναι διαθέσιμη με CRAN (https://cran.r-project.org/web/packages/geneSignatureFinder/index.html) σε ένα ανοικτού κώδικα για λήψη. gSFA, ότι είναι μια γενίκευση του τροποποιημένου Απότομης Καθόδου προτείνει Boutros et al. [6], αποτελείται από τέσσερα κύρια βήματα (Σχήμα 1):

Το

γονίδιο Υπογραφή Finder Αλγόριθμος

αποτελείται από 4 ξεχωριστά στάδια: (1) βρείτε γονίδια υποψήφιος σπόρους? (2) να δημιουργήσει μια υπογραφή, αρχής γενομένης από κάθε γονίδιο σπόρο? (3) κλαδέψετε τις υπογραφές από στατιστική συμπερασματολογία? (4) την ενσωμάτωση υπογραφές με γονιδιακή κατάταξη

Η

Βήμα 1:.

Σπόροι Finder

Η Το πρώτο βήμα του αλγορίθμου μας στοχεύει στην επιλογή ενός σύνολο των γονιδίων που μπορεί να είναι ένα αξιόπιστη σπόρους εκκίνησης για να επεκτείνετε την υπογραφή. Χρησιμοποιήσαμε ένα σύνολο γονιδίων σύμφωνα με δύο βασικές προϋποθέσεις: (α) ένα διτροπική κατανομή των επιπέδων έκφρασης, (β) την ικανότητα να διαχωρίζει το σύνολο δεδομένων σε δύο ομάδες με βάση της δοκιμής ανάλυση επιβίωσης. Ειδικότερα, για κάθε γονίδιο

i

θεωρεί ότι η ακολουθία g

i

= {

x

ij

,

i

= 1 …,

Μ

}, όπου

x

ij

είναι το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου

i

στο δείγματος

ι

. Το κριτήριο Bayesian Πληροφοριών (BIC) [12] στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να ελέγξει την υπόθεση διφασικότητα για την ακολουθία g

i

. Η ακολουθία g

i

είναι συγκεντρωμένα σε δύο υποσύνολα S

1 και S

2 χρησιμοποιώντας ένα

k

-median αλγόριθμο (

k

= 2) και η απόσταση μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης των δειγμάτων σε S

1 και S

2 στη συνέχεια υπολογίζεται. γονίδια σπόρων είναι αυτές εκδηλώνονται διφασικότητα και ο διαχωρισμός μεταξύ των καμπυλών σύμφωνα με ένα επιλεγμένο όριο σημαντικότητας (σε όλα τα πειράματά μας 0.05)

Βήμα 2:.

διάδοσης Υπογραφή

Η Λαμβάνοντας υπόψη ένα σύνολο

K

γονίδια σπόρων επιλεγεί ως το προηγούμενο βήμα, επεκτείναμε αα μικρή γονιδιακή υπογραφή ξεκινώντας από κάθε γονίδιο σπόρου. Μια άπληστη στρατηγική υιοθετείται επιλέγοντας ως επόμενο γονίδιο υπογραφή το γονίδιο μεγιστοποιώντας την αύξηση της απόστασης μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης των δύο συνόλων S

1 και S

2 λαμβάνεται με ομαδοποίηση τη δισδιάστατη σύνολο δεδομένων (που περιέχει του γονίδιο σπόρου και το επόμενο γονίδιο υπογραφή υποψηφίου). Ο αλγόριθμος συνεχίσετε την προσθήκη γονιδίων σε κάθε υπογραφή με αυτόν τον τρόπο μέχρι να μην περαιτέρω βελτίωση της απόστασης μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης λαμβάνεται

Βήμα 3:.

ανάλυση Υπογραφή και κλάδεμα

Η Ένα

δείκτης σημασία

υπολογίζεται για κάθε γονίδιο του

K

υπογραφών, είναι ένα μέτρο του πόσο πολύ ένα μόνο γονίδιο συμβάλλει στη βελτίωση της απόστασης μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης σε σχέση με την απόσταση με βάση όλα τα γονίδια σε μια υπογραφή. Ορίζεται ως 1 μείον η αναλογία των αποστάσεων των καμπυλών επιβίωσης που λαμβάνεται όταν το επιλεγμένο γονίδιο απομακρύνεται από την υπογραφή (λεπτομέρειες στο συμπληρωματικό διαδικασία gSFA συνοδευτικό αρχείο). Στη συνέχεια, κάθε υπογραφή κλαδεύεται από τα γονίδια που δεν συμβάλλουν σημαντικά στο διαχωρισμό της διχοτομίας που παράγεται από την υπογραφή

Βήμα 4:.

Gene Κατάταξη

Η Από το σύνολο των γονιδίων σε οι

K

υπογραφές, μπορούμε να πάρουμε διάφορα αποτελέσματα για να επιλέξετε υποψήφια γονίδια που πιθανώς σχετίζονται με τις προγνωστικές ομάδες. Έχουμε σημειώσει τα γονίδια, με βάση τον αριθμό των υπογραφών στο οποίο εμφανίζονται και μέσο δείκτη σημασία τους

Η

Οι συνημμένες Υλικά & amp.? Μέθοδοι S1 (Συμπληρωματική διαδικασία gSFA) περιέχει όλες τις λεπτομέρειες του αλγορίθμου και τις εντολές για να αναπαράγουν το σύνολο της ανάλυσης με R χρησιμοποιώντας το πακέτο gSFA.

Αποτελέσματα

γονίδιο Υπογραφή Finder Αλγόριθμος (gSFA) αποκαλύπτει πολλές υπογραφές που συνδέονται με την κυτταρική προσκόλληση και εξωκυττάρια μήτρα οργάνωση

Εφαρμόσαμε την gSFA σε ένα σύνολο δεδομένων από διακόσια τριάντα δύο δείγματα CRC και εντοπίστηκαν 16 σπόρων γονίδια που δείχνουν σημαντική (

p

& lt? 0,05 μετά τη διόρθωση) μονοπαραγοντική διαχωρισμό των καμπυλών επιβίωσης μεταξύ καλής και κακής ομάδες πρόγνωση, και είναι διπλής μορφής στο ίδιο χρονικό διάστημα (περίπου το 1/3 των ανιχνευτών δείχνουν διφασικότητα). Από κάθε ένα από τα γονίδια-σπόρο λάβαμε τις υπογραφές που παρατίθενται στον Πίνακα 1? οι αντίστοιχες καμπύλες επιβίωσης απεικονίζονται στο Σχήμα S1. Στις περισσότερες περιπτώσεις, το

σ

-τιμή δεν είναι υπολογίσιμο, δεδομένου ότι η

t

-τιμή είναι πέρα ​​από την ακρίβεια της μηχανής. Παρά το γεγονός ότι οι επιλεγμένες υποομάδες γονίδιο μπορεί να είναι διαφορετικές, οι καμπύλες επιβίωσης εμφανίζονται συχνά παρόμοια (Σχήμα S1), έτσι ζητήσαμε από την διαφορά μεταξύ του διαχωρισμού που προκαλείται από κάθε υπογραφή. Εμείς υπολογίζεται η απόσταση μεταξύ ομαδοποίηση που λαμβάνεται από κάθε μία από τις 16 υπογραφές και να πάρει το δενδρόγραμμα που αναφέρεται στο Σχήμα 2α: παρατηρούμε ότι διαφορετικοί γονίδιο υπογραφή μπορεί να δημιουργήσει τελικά παρόμοια διχοτομήσεις. Αυτό δενδρόγραμμα επιτρέπει να ληφθεί μια ισχυρή ταξινόμηση των δειγμάτων σε δύο ομάδες ανάλογα με τον αριθμό των φορών που ένα δεδομένο δείγμα εμπίπτει σε μία από τις ομάδες. Ειδικότερα, η

σταθερή καλή ομάδα πρόγνωση

περιλαμβάνει δείγματα που τουλάχιστον το 80% των διχοτομήσεις πέφτουν στην καλή ομάδα πρόγνωση, αναλόγως για το

σταθερή κακή ομάδα πρόγνωση

. Έτσι, 133 και 56 δείγματα κατατάσσονται στην σταθερή καλή ή κακή ομάδα πρόγνωση, αντίστοιχα, ενώ το 43 παρέμειναν μη αξιόπιστα ταξινομούνται και ορίζονται αβέβαιο δείγματα. Οι αντίστοιχες καμπύλες επιβίωσης που αναφέρονται στο Σχήμα 2β, δοκιμασία log-rank μεταξύ των τριών καμπυλών δίνει μια

σ

-τιμή & lt? 10

-16. 1609 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (φορές μεταβολής 1,5 και διορθώνονται

ρ-τιμή

& lt? 0,05) μεταξύ των δύο σταθερών προγνωστικές ομάδες δημιουργούνται την ομαδοποίηση heatmap του Σχήματος 2γ. Τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο κύριες ομάδες: η πρώτη περιλάμβανε 113 από 133 (85%) της σταθερά κατατάσσεται ως καλή ομάδα πρόγνωση? η δεύτερη 55 από 56 (98%) των φτωχών ομάδας πρόγνωση. Οι αντίστοιχες καμπύλες επιβίωσης που αναφέρονται στο Σχήμα 2d, η δοκιμασία log-rank μεταξύ των δύο καμπυλών δίνει

σ

= 6,6 · 10

-6. Η σιλουέτα του διαχωρισμού συμπλέγματος αναφέρεται επίσης στη συμπληρωματική διαδικασία gSFA συνοδευτικό αρχείο.

Seed Gene

t

-τιμή

log (

σ

-τιμή)

Υπογραφή

PCSK5 (205560_at) 76,572 & lt? -16PCSK5, AKAP12, NPR3, AGPAT5, GMFB, C6orf141, 1569202_x_at, KCNH8FST (226847_at) 75,757 & lt? -16FST, AKAP12, ULBP2, SLC25A43, EI24, 1563467_at, CLDN8POSTN ( 214981_at) 74,023 & lt? -16POSTN, AKAP12, AGPAT5, ATL3, SLC44A2SUSD5 (214954_at) 71,842 & lt? -16AKAP12, 241867_at, ADAMTS5, APLP2, PITPNC1, 1556983_a_atKIAA1462 (231841_s_at) 67.624-15.654KIAA1462, DCBLD2, ADIPOQ, FAM217B, C17orf48DCBLD2 (230175_s_at ) 66.71-15.477DCBLD2, AKAP12, GUSBP11, CDR2L, MGC16703, METTL4NPR3 (219054_at) 66.457-15.477NPR3, DZIP1, 243820_at, 238109_at, 236795_at, DNAJC4, FOXA1, EMID2AKAP12 (227530_at) 65.522-15.256AKAP12, ISM1, C11orf9, 244026_at, ARHGAP9, NOL3, AP2A1PAPPA (201981_at) 65.024-15.109PAPPA, NT5E, DUSP7, 230711_at, CD96, ABI2ETV1 (221911_at) 61.631-14.386ETV1, LONRF3, NGEF, RAB2A, U2AF2, CPOKIAA1462 (213316_at) 60.733-14.184KIAA1462, AKAP12, UGGT2 , 231989_s_atSRGAP2P1 (1568955_at) 58.417-13.674SRGAP2P1, AKAP12, SNX16, NT5ELOC100132891 (228438_at) 58.037-13.589LOC100132891, DCBLD2, ADIPOQ, SLFN5DCBLD2 (224911_s_at) 50.106-11.837DCBLD2, ADCY7, EHD2CTGF (209101_at) 46.099-10.949CTGF, FERMT1, AKAP12 , CDK1EFHA2 (238458_at) 42.166-10.076EFHA2, ST18, ACACBTable 1. υπογραφές αναπτύχθηκε από 16 σπόρους-γονίδια.

CSV Λήψη CSV

α. Δενδρόγραμμα των διχοτομήσεις που δημιουργούνται από κάθε ένα από τα 16 gSFA υπογραφές (Πίνακας 1 και Σχήμα S1)? σι. Επιβίωση οικόπεδο των 133 δειγμάτων σταθερά κατατάσσεται στην καλή ομάδα πρόγνωση, 56 δείγματα στην κακή ομάδα πρόγνωση και 43 αβέβαιο δείγματα (log-rank test δίνει

σ

& lt? 10

– 16)? ντο. θερμικός χάρτης του βαθμούς με ανάμεσα στις δύο σταθερές ομάδες, Red δείχνει υπερεκφρασμένο γονίδια (τα επίπεδα έκφρασης πάνω από τη μέση) και το πράσινο υποδεικνύει υποεκφράζονται γονίδια (τα επίπεδα έκφρασης κάτω από τη διάμεση τιμή)? ρε. δείγματα καμπύλες επιβίωσης στις δύο συστάδες του heatmap όπως στο c. (

σ

= 6,6 · 10

-6).

Η

Για να φωτιστούν οι βιολογικές διαδικασίες και λειτουργίες που σχετίζονται με τις εν λόγω δύο συστάδες, εντοπίσαμε 1394 διαφορικά εκφρασμένων probesets που αντιστοιχεί σε 1024 διαφορετικά γονίδια (βαθμούς με), εκ των οποίων το 87% περιέχονται στον κατάλογο βαθμούς με μεταξύ των σταθερών προγνωστικές ομάδες. Ο κατάλογος βαθμούς με εμπλουτισμένο αρκετές Γονιδιακή Οντολογία (GO) κατηγορίες. Διαδικασία μας gSFA επιλεγεί, καθώς σχετίζονται με την κακή ομάδα πρόγνωση, ένα σύνολο δειγμάτων με χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά συνδέονται με από τα γονίδια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση των κυττάρων. Ειδικότερα, GO ανάλυση των γονιδίων up-ρυθμίζεται στην κακή ομάδα έδειξε ότι

κυτταρικής προσκόλλησης

εμπλουτίστηκε με 123 βαθμούς με (

σ

& lt? 10

-28),

εξωκυττάρια μήτρα οργάνωση

με 34 γονίδια (

σ

& lt? 10

-15),

Απάντηση σε Τραυματισμός

με 95 βαθμούς με (

σ

& lt? 10

-22),

Ανοσοποιητικό

απόκριση με 91 γονίδια (

σ

& lt? 10

-14). Επιπλέον, αυτές οι βαθμούς με εμπλούτισε τις KEGG Pathways

αλληλεπίδραση ECM-υποδοχέα

(

σ

& lt? 10

-10) και

Focal πρόσφυση

(

p

& lt? 10

-8). Όταν φορτωθεί στην οδό Ανάλυση εφευρετικότητα, η λίστα μας βαθμούς με παρήγαγε ένα σύνολο εμπλουτισμένου κατηγορίες των οποίων η

σ

-τιμή αναφέρεται στο σχήμα S2a. Συγκεκριμένα, άλλες κατηγορίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη του ιστού και του καρκίνου ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη? ειδικά εκείνων που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου εμπλουτίστηκαν σε

σ

& lt? 10

-14.

Για να κατανοήσουμε τις βασικές ρυθμιστικές αρχές που εμπλέκονται στο διαχωρισμό των δύο προγνωστικών ομάδες, έγινε μια ανάλυση εμπλουτισμό των ανάντη ρυθμιστικές αρχές. Είναι ενδιαφέρον, παράγοντας μετασχηματισμού ανάπτυξης βήτα 1 (TGFβ1) ήταν ρυθμισμένο στην κακή σύμπλεγμα πρόγνωση [13]. Επιπλέον, το δίκτυο των 20 ρυθμιστικών αρχών που απεικονίζονται στην Εικόνα S2B θα μπορούσε να εξηγήσει τη συμπεριφορά των 177 των επιλεγμένων γονιδίων. Οι κορυφαίοι ρυθμιστές του δικτύου περιελάμβανε επίσης και άλλα διαλυτά αυξητικούς παράγοντες όπως τα μέλη του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών (FGF) και ο παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF) οικογένειες. Τα επιλεγμένα γονίδια που εμπλέκονται κυρίως στην σηματοδότηση TGFβ1, όπως 109 μόρια (

σ

& lt? 10

-51) είναι σχολιασμένη στόχους της στη βάση γνώσης του ΜΠΒ. προκαλούμενη από υποδοχέα σηματοδότηση σε απόκριση σε αυτά τα προσδέματα προκαλεί την ενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών μορίων τελεστή, όπως, οι μικρές οικογενειακές ΟΤΡάσης RAS, τα μέλη των τυροσίνης-κινάσης οικογένειας ή μεταγραφή παραγόντων SRC συμπεριλαμβανομένων, SMAD, RUNX2, STAT3, ΝΡκΒ, ρ53 και β- κατενίνης. Αυτές οι δράστες έχουν κεντρικό ρόλο στην CRC εξέλιξη και μεταστατική εισβολή προώθηση του σχηματισμού ενός όγκου που σχετίζεται με μικροπεριβάλλον.

TMA επικύρωση των βιοδεικτών που προσδιορίζονται από τα σύνολο των υπογραφών

Για την αναγνώριση ισχυρή βιοδείκτες που σχετίζονται με CRC πρόγνωση που μπορεί να επικυρωθεί σε δύο βιβλιοθήκες μας ιστών, χρησιμοποιήσαμε την κατάταξη που αναφέρονται στο τρίτο στάδιο της gSFA και τα προκύπτοντα γονίδια φαίνεται στον πίνακα S1, όπου

AKAP12, DCBLD2, NT5E

ήταν η πιο κοινή γονίδια που επιλέγονται από τον αλγόριθμο σε διάφορες υπογραφές. Μπορούμε επίσης επικυρωθεί SPON1 ως, απροσδόκητα, ήταν μεταξύ των πιο διαφορικά εκφρασμένα γονίδια από τις δύο ομάδες? Ωστόσο, ο ρόλος του στην CRC δεν έχει αντιμετωπιστεί ακόμα. Εμείς διαλογή με ανοσοϊστοχημεία (IHC) ο TMAs της σειράς μας 140 CRCs και ένα υποσύνολο 60 κανονικής συμφωνημένα κολονική δειγμάτων για τον προσδιορισμό της προγνωστικής δυναμικό των επιλεγμένων γονιδίων. πρότυπο έκφρασης Markers »καταγράφηκε σαν ποσοστό των θετικών κυττάρων: θετική χρώση πάνω από το 25% των κυττάρων του όγκου ορίστηκε υψηλή έκφραση. Εικόνα 3α αναφέρει εκπρόσωπος διαφάνειες ιστό της TMA επισημαίνονται με αντισώματα έναντι AKAP12, DCBLD2, NTE5 και SPON1. Το Σχήμα 3b παρουσιάζει τα συνολικά ποσοστά ανίχνευσης μεταξύ όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων. Στο Σχήμα S3 περαιτέρω χρώση DCBLD2 και NT5E σε υψηλότερη ανάλυση απεικονίζεται.

α. «Στήλες από αριστερά προς τα δεξιά» δείχνουν ανοσοχρώση μοτίβο στην κανονική του παχέος δείγματα και CRC πυρήνες αρνητικά και θετικά για κάθε AKAP12 δείκτη, DCBLD2, NT5E, SPON1. Μαύρο βέλη δείχνουν ανοσοϊστοχημική τύπο χρώσης σε φυσιολογικά ή κακοήθη κύτταρα του κόλου. Λευκά βέλη δείχνουν την κατανομή ανοσοχρώση στο διαμέρισμα στρωματικών (ενδοθηλιακά, ρυθμιστικά Τ-κύτταρα και μακροφάγα) χαρακτηριστικό μοτίβο έκφρασης NT5E. Μεγέθυνση 10Χ? σι. Αριθμός θετικών κρουσμάτων που εντοπίζονται στην TMA σειρά επικύρωσης περιλαμβάνει δείγματα όγκου (ΤΟΜ) και μια υποομάδα συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου (NM). Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την πρότυπη απόκλιση από τη μέση τιμή (

ρ

& lt? 0,05)? ντο. Τέσσερις αντιπρόσωπος κατεψυγμένα δείγματα CRC (Τ) και συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου (Ν) ταυτοποιήθηκαν στο ίδιο πληθυσμό ασθενών και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα. Οι δείκτες μοριακού βάρους υποδεικνύονται σε kilodaltons. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για την κανονικοποίηση εντάσεις ζωνών.

Η

Στο κανονικό βλεννογόνο του κόλου, AKAP12 ανοσοχρώση ήταν πάντα θετική, εντοπίζεται στο κυτοσόλιο και κυρίως διανέμονται στο κορυφαίο διαμέρισμα της κρύπτης, δηλαδή στην πιο διαφοροποιημένα κύτταρα. Σε δείγματα CRC, AKAP12 ανοσοαντιδραστικότητα διατηρήθηκε στο 55% και απουσιάζουν σε περίπου 45% των περιπτώσεων.

DCBLD2 ήταν πάντα θετική σε φυσιολογικά κύτταρα του κόλου και ομοιόμορφα εντοπισμένη στο Baso-πλευρικές μεμβράνες πλάσματος. Σε δείγματα CRC, η ανοσοχρώση ανιχνεύτηκε σε περίπου 52% των περιπτώσεων. Σε μερικές τομές όγκων, DCBLD2 ανοσοθετικότητα επίσης εντοπίζεται στην κυτοσολικό διαμέρισμα.

NT5E ανοσοθετικότητα βρέθηκε κυρίως σε στρωματικά κύτταρα (ενδοθηλιακά ή ρυθμιστικών Τ-κύτταρα) της κανονικής βλεννογόνου του κόλου, ενώ ήταν ασθενώς θετική ή αρνητική στα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου. Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, NT5E ανοσοθετικότητα σηματοδότησε την σχετιζόμενο με τον όγκο στρώμα και ήταν απούσα σε κακοήθη κύτταρα σε περίπου 40% των δειγμάτων όγκου. Είναι ενδιαφέρον ότι, στο υπόλοιπο 60%, χρώση NT5E σηματοδότησε επίσης κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα, εκτός από τα στρωματικά αυτά.

SPON1 ανοσοαντιδραστικότητα ήταν θετική μόνο σε περίπου 20% της κανονικής κολονικής δειγμάτων. Αξιοσημείωτα, SPON1 ανιχνεύθηκε στο 70% περίπου των δειγμάτων CRC, με μια μεμβράνη ή κυτοσολικά εντοπισμού. Θετικότητα εντός όγκων συσχετίστηκε σημαντικά με το κολλαγόνο IV και η έκφραση βιμεντίνη, υποδηλώνοντας ένα ρόλο SPON1 στην αναδιοργάνωση και την αναδιαμόρφωση του όγκου επιπλέον κυτταρική μήτρα (ECM) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Western Blot ανάλυση, σε Δημοτικά CRC

για να επιβεβαιωθεί το προφίλ έκφρασης IHC και να έχουν περισσότερα ποσοτικά στοιχεία, είκοσι τυχαία επιλεγμένα δείγματα CRC και συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο από την ίδια ομάδα ασθενών αναλύθηκαν με κηλίδα western, χρησιμοποιώντας τα ίδια αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην IHC. Η ανάλυση αυτή επαλήθευσε επίσης την ειδικότητα των αντισωμάτων. Οι ζώνες που λαμβάνονται ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία μετά από κανονικοποίηση σε β-τουμπουλίνης για πρωτεΐνη φόρτωσης. AKAP12 και DCBLD2 είχαν συχνά εντοπιστεί σε χαμηλότερα επίπεδα σε όγκο (Τ) από το κανονικό συμφωνημένα ιστούς (Ν). Σε αντίθεση, NT5E και έκφραση SPON1 παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε όγκους από τους ελέγχους. Σχήμα 3c αναφέρει τις ζώνες που αντιστοιχούν σε τέσσερα αντιπροσωπευτικά δείγματα, ο κβαντισμός της οποίας αναφέρεται στο σχήμα S4A. Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα που αναφέρονται μόνο σε 20 περιπτώσεις, επιβεβαίωσαν την ιδιαιτερότητα των αποτελεσμάτων και ενίσχυσε τις διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων ανιχνεύθηκαν από την IHC για TMAs.

βιοδείκτες προφίλ έκφρασης και Κλινικο-παθολογικών παραμέτρων

Πραγματοποιήσαμε ένα τεστ πολλαπλής σύγκρισης αξιολόγηση της συχνότητας έκφραση IHC κάθε βιοδεικτών και τα κλινικο-παθολογικών παραμέτρων. Εμείς δεν βρήκε καμία συσχέτιση μεταξύ AKAP12 ή γονίδιο SPON1 προφίλ έκφρασης και την ηλικία των ασθενών, το φύλο, το στάδιο του όγκου, διαφοροποίηση ή ιστολογία, παρουσία των κομβικών και ηπατικές μεταστάσεις. Σε αντίθεση, η απώλεια του DCBLD2 συσχετίστηκε με προχωρημένα στάδια της νόσου (

σ

= 0,021). Στην πραγματικότητα, το 37,4% των δειγμάτων που ελέγχθηκαν χαμηλή για έκφραση DCBLD2 ήταν συχνότερα Stage IV-όγκους συγκριτικά με το 15% των DCBLD2 υψηλής έκφρασης αυτά. Κατά συνέπεια, ακόμη και περιπτώσεις που σχετίζονται με απομακρυσμένες μεταστάσεις είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης DCBLD2 από εκείνους που δεν έχουν μεταστάσεις στο ήπαρ (

σ

= 5.71 · 10

-5). Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι όγκοι επίσης εκφράζουν υψηλά επίπεδα NT5E έδειξε παρόμοια επιδεκτικότητα σε μεταστατικούς όγκους (

σ

= 6.62 · 10

-4). Η σχέση μεταξύ βιοδεικτών και των κλινικο-παθολογικών παραμέτρων σε CRC σύνολο δεδομένων μας παρουσιάζεται στον Πίνακα S2.

Για να διερευνήσουν ποια από τα επιλεγμένα γονίδια ήταν επίσης ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης των ασθενών σε σειρά επικύρωση CRC μας, που ταξινομούνται όγκους ως χαμηλή ή υψηλή έκφραση κάθε μία από τις υπό έρευνα βιοδεικτών. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι η απώλεια της AKAP12 ήταν οριακά σχετίζονται με την κακή συνολική επιβίωση (OS) (

σ

= 0,0758, Σχήμα 4α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, χαμηλή έκφραση μεμβράνη που σχετίζεται των DCBLD2 και υπερέκφραση του NT5E στα καρκινικά κύτταρα συνδέθηκε έντονα με μικρότερη επιβίωση (

σ

= 5.97 · 10

-7and

σ

= 1.01 · 10

-5 αντίστοιχα, Σχήμα 4γ και 4δ). Καμία σημαντική συσχέτιση με το OS βρέθηκε λαμβάνοντας υπόψη μόνο το ανοσοθετικότητα NT5E σε όγκο που σχετίζονται-στρώμα (Σχήμα S5). SPON1 υπερέκφραση δεν συσχετιζόταν με πρόγνωση των ασθενών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

α. Οι καμπύλες επιβίωσης για σειρά επικύρωση CRC μας, κατηγοριοποιούνται ως έχοντα υψηλή (κόκκινη καμπύλη) και χαμηλής (πράσινη καμπύλη) της έκφρασης AKAP12, DCBLD2 και NT5E.

σ

-τιμή για την μηδενική υπόθεση των καμπυλών επιβίωσης ίσο πληθυσμό παρέχεται από δοκιμασία log-rank σε κάθε γράφημα? σι. Οι καμπύλες επιβίωσης εκτιμάται συνδυάζοντας την έκφραση (

υψηλή

και

χαμηλή

) όλων των 3 δεικτών (AKAP12, DLBLC2, NTE5). Κόκκινη καμπύλη αντιπροσωπεύει το συνδυασμό

υψηλή /υψηλή

? η μπλε καμπύλη αντιπροσωπεύει το συνδυασμό

υψηλή /χαμηλή

? η μαύρη καμπύλη αντιπροσωπεύει το συνδυασμό

χαμηλή /υψηλή

? η πράσινη καμπύλη αντιπροσωπεύει το συνδυασμό

χαμηλή /χαμηλή

.

Η

Τέλος, θα αξιολογηθεί κατά πόσον τα τρία προγνωστικά δείκτες (AKAP12, DCBLD2, NT5E) θα μπορούσε να ασκήσει αμοιβαίες επιδράσεις και τη βελτίωση προγνωστική ακρίβεια. Οι περιπτώσεις ταξινομήθηκαν σε 4 ομάδες ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασής τους (Σχήμα 4δ, 4ε, 4στ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, το 100% των ασθενών που δείχνει το συνδυασμό DCBLD2

υψηλή /NT5E

χαμηλή ήταν ζωντανοί στα 5 χρόνια μετά τη διάγνωση. Αντίθετα μόνο το 30% των ασθενών των οποίων οι όγκοι εκφράζουν το συνδυασμό DCBLD2

χαμηλή /NT5E

υψηλή ήταν ζωντανοί. Αυτή η διαφορά επιβίωση ήταν ανεξάρτητη από επικουρική χημειοθεραπεία ή το στάδιο της νόσου.

έκφραση επιλεγμένων βιοδεικτών σε κυτταρικές γραμμές CRC

Για να αποκτήσει περαιτέρω γνώσεις σχετικά με τις υποψήφια γονίδια, αξιολογήσαμε προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης τους σε έξι εκπρόσωπο του τμήματος ανθρώπινου CRC προέρχονται κυτταρικές σειρές (Σχήμα S3b). AKAP12 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα HCT116 και DLD1 σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [14]. DCBLD2 εκφράστηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών, ενώ NT5E ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ΗΤ29 και HCT116 σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές. Τέλος SPON1 ανιχνεύθηκε στην πλειονότητα των κυτταρικών σειρών, με τα υψηλότερα επίπεδα σε DLD1.

Cross-talk μεταξύ TNF-α και σηματοδότησης PPARγ ρυθμίζει NT5E και DCBLD2

Το

στο vivo

αποτελέσματα έδειξαν ότι NT5E και DCBLD2 εμπλέκονται στην εισβολή και μετάσταση όγκου πιθανώς μέσω ενός όγκου που προκαλείται από ανοσοκατασταλτικές μηχανισμό. Έτσι, εστιάσαμε την προσοχή μας σε ΤΝΡ-α, μία κυτοκίνη που ρυθμίζει ένα δίκτυο σηματοδότησης εμπλέκονται σε φλεγμονώδεις νόσους και ογκογένεση [15]. Εφευρετικότητα Διαδρομή ανάλυση αυτή αμφισβητήθηκε να αναδείξει τις επιπτώσεις του TNF-α και την αλληλεπίδραση των κυτοκινών. ΝΡκΒ αναδειχθεί ως τον κύριο κόμβο του δικτύου των ανάντη ρυθμιστές των επιλεγμένων βαθμούς με και, στη συνέχεια, ως κρίσιμο ρυθμιστή των γονιδίων που εμπλέκονται στην φλεγμονώδη και ανοσολογική απόκριση (Σχήμα S6a) [16]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, ψάξαμε για cis-δρώντα στοιχεία ρυθμιστικές DNA σε

NT5E

και

DCBLD2

υποκινητές (Σχήμα S6b) και προσδιόρισε διάφορες υποθετικές NFκB στοιχεία χώρο-όπως. Για να επαληθευθεί αν

NT5E

, και, ενδεχομένως,

DCBLD2

, θα μπορούσε να ρυθμιστεί με την φλεγμονώδη καταρράκτη, θα αντιμετωπίζονται 293Τ κύτταρα ΗΕΚ με LPS, μια ισχυρή προ-φλεγμονώδη NFκB επαγωγέα, και απέκτησε ένα σημαντικό χρονικό διάστημα εξαρτώμενη επαγωγή

NT5E

? Ομοίως, έκτοπη έκφραση του p65 /ΚεΙΑ ΝΡκΒ υπομονάδα προκάλεσε σημαντική επαγωγή ενισχύεται περαιτέρω με την κατεργασία LPS. Σε αντίθεση, η επιμόλυνση του σούπερ καταστολέα ΙκΒα S32 /36 κατήργησε πλήρως τη διεγερτική επίδραση του LPS στο

NT5E

(Εικόνες S6c και S6d). ένα.