Αφηρημένο

Canine καρκινικές κυτταρικές σειρές έχουν σταδιακά αναπτυχθεί, αλλά δεν χρησιμοποιούνται επαρκώς πόρων για την έρευνα της βιολογίας ακτινοβολία. Η μέτρηση της κυτταρικής εγγενή ακτινοευαισθησία είναι σημαντικό, διότι η κατανόηση της διαφοράς μπορεί να παρέχει ένα πλαίσιο για την περαιτέρω αποσαφήνιση προφίλ για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης ακτινοθεραπεία. Οι μελέτες μας έχουν επικεντρωθεί σε χαρακτηρίζουν ποικίλες κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές

in vitro

και την κατανόηση των παραμέτρων που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην εγγενή ακτινοευαισθησία. Πρώτον, την εγγενή ραδιοευαισθησία του 27 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από δέκα τύπους όγκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία. Οι 27 κυτταρικές σειρές είχε ποικίλες radiosensitivities ανεξάρτητα από τον τύπο του όγκου (κλάσμα επιβίωσης στα 2 Gy, SF2 = 0,19 – 0,93). Για να κατανοήσουμε τις παραμέτρους που μπορεί να συμβάλλουν στην ενδογενή ακτινοευαισθησία, αξιολογήσαμε τις σχέσεις των κυτταρικών ραδιοευαισθησία με βασικά κυτταρικά χαρακτηριστικά των κυτταρικών γραμμών. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση του SF2 με κλάσμα S-φάση, χρόνος διπλασιασμού, τον αριθμό των χρωμοσωμάτων, πλοειδία, ή τον αριθμό των χρωμοσωμάτων μετακεντρικό, ενώ υπήρξε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ SF2 και ικανότητα επίστρωσης. Στη συνέχεια, έχουμε επιλέξει τα πέντε πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία κυτταρικές σειρές όπως το ακτινοευαίσθητα ομίλου και τις πέντε πιο ακτινοανθεκτικά κυτταρικές σειρές όπως η ομάδα ακτινοανθεκτικά. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε γνωστές παραμέτρους για θανάτωση κυττάρου από ιονίζουσα ακτινοβολία, συμπεριλαμβανομένης της ακτινοβολίας που προκαλείται από DNA διπλής διάλειμμα κλώνου (DSB) επισκευή και την απόπτωση, στην ακτινοευαίσθητα ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα ραδιοανθεκτικά. Υψηλά επίπεδα υπολειμματικού γ-H2AX εστίες στις θέσεις DSBs ήταν παρόντες στα τέσσερα από τα πέντε ακτινοευαίσθητα κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές. Οι μελέτες μας πρότειναν ότι υπάρχουν ουσιαστικές διαφορές ως προς τα εγγενή ραδιοευαισθησία σε κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές, και προκαλούμενη από ακτινοβολία επισκευή DSB σχετιζόταν με ακτινοευαισθησία, η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες σε ανθρώπους. Τα δεδομένα αυτά μπορούν να βοηθήσουν περαιτέρω έρευνες με επίκεντρο την ανίχνευση των ΟΕΔ για την πρόβλεψη ατομική ανταπόκριση στη θεραπεία ακτινοβολίας για σκύλους, ανεξάρτητα από τον τύπο του όγκου

Παράθεση:. Maeda J, Froning CE, Brents CA, Rose BJ, Thamm DH, Κάτω TA (2016) Εγγενής ραδιοευαισθησία και Κυτταρικής Χαρακτηρισμός της 27ης Καρκίνου Canine Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 11 (6): e0156689. doi: 10.1371 /journal.pone.0156689

Επιμέλεια: Ying-Jan Wang, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Cheng Kung, Ταϊβάν

Ελήφθη: 14η Ιανουαρίου 2016? Αποδεκτές: 18η Μάη 2016? Δημοσιεύθηκε: 3, Ιουνίου 2016

Copyright: © 2016 Maeda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η χρηματοδότηση έγινε από τον Dr. Akiko Ueno Ταμείο Ραδιοβιολογία (ΤΑΚ). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μία κύρια αιτία θανάτου σε σκύλους καθώς επίσης και σε ανθρώπους. Ανθρώπινα και κυνικός καρκίνων έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά, όχι μόνο σε ανατομικές και ιστοπαθολογική εμφάνιση αλλά και βιολογική συμπεριφορά, τη γενετική όγκου και απόκριση στις συμβατικές θεραπείες [1, 2]. Canine μοντέλα καρκίνου έχουν αναδειχθεί ως πολύτιμοι πόροι στη μελέτη του ανθρώπινου καρκίνου [2]. Στην ανθρώπινη έρευνα για τον καρκίνο, πολυάριθμες καλά χαρακτηρισμένο ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών είναι διαθέσιμες για την έρευνα του καρκίνου. Καρκινικές κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως

in vitro

πειραματικά πρότυπα συστήματα και έχουν αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμα για την εξερεύνηση της υποκείμενη βιολογία του καρκίνου [3]. Canine καρκινικές κυτταρικές γραμμές έχουν προοδευτικά έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί, αλλά δεν είναι όπως πλήρως χαρακτηρίζονται ως ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Διερεύνηση της κυτταρικής βιολογίας μέσα από χαρακτηρισμούς του σκύλου καρκινικές κυτταρικές σειρές μπορεί να παρέχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τη βιολογία του καρκίνου, κάποια ειδικά για τα σκυλιά, και κάποια δυνητικά συμπληρώνουν εκείνα που αναφέρθηκαν για τον καρκίνο του ανθρώπου.

Οι όγκοι, ακόμη και με το ίδιο ιστοπαθολογικές προέλευσης μπορεί να δείξει μια ευρύ φάσμα ευαισθησίας στην ακτινοθεραπεία [4, 5]. Η μέτρηση της κυτταρικής εγγενή ακτινοευαισθησία είναι σημαντικό, διότι η κατανόηση της διαφοράς μπορεί να παρέχει ένα πλαίσιο για την περαιτέρω αποσαφήνιση προφίλ για την πρόβλεψη της ακτινοθεραπείας απόκρισης (RT). Εγγενής radiosensitivities μετράται με

in vitro Οι ανιχνεύσεις

σχηματισμού αποικίας που εκφράζεται ως SF2, το κλάσμα των κυττάρων που επιβίωσαν μία μόνο 2 Gy δόση ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR). Η δόση των 2 Gy είναι επίσης μια ευρέως χρησιμοποιούμενη δόση ανά κλάσμα σε κλινικές RT σε ανθρώπους. Η SF2 στους ανθρώπους έχει δειχθεί να προβλέψει απόκριση όγκου

in vivo

σε προηγούμενες μελέτες [6, 7]. Τέτοιες μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχουν διαφορές ως προς τα εγγενή ραδιοευαισθησία και την κατανόηση των μηχανισμών που θα μπορούσαν να επηρεάσουν σημαντικά την πρακτική για εξατομικευμένη RT [4, 5].

Οι μηχανισμοί που διέπουν τις διαφορές ως προς τα εγγενή ακτινοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων είναι πιθανόν πολυπαραγοντική [5] . Επισκευή θραύσεων διπλής έλικος DNA (DSBs) είναι γνωστή ως ένα από τα πιο σημαντικά στοιχεία που καθορίζει τις εγγενείς ραδιοευαισθησία επειδή οι βλάβες αυτές, αν της αποκατάστασης της, να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο [8]. Προηγουμένως, η κατανομή των κυττάρων στις φάσεις του περιεχομένου /χρωμόσωμα DNA του κυτταρικού κύκλου και έχουν προταθεί ως παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν τις εγγενείς ραδιοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων [9, 10]. Επιπλέον, μέρος των διαφορών μπορεί να οφείλονται στην τάση να υποστούν απόπτωση σε απόκριση ακτινοβολίας, όπως φαίνεται στο λεμφοειδείς όγκους [11]. Ωστόσο, σε αντίθεση συσχετίσεις με ακτινοευαισθησία των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων έχουν αναφερθεί στη μέτρηση των παραμέτρων αυτών, και η δημιουργία ενός χρήσιμου δοκιμασία που προβλέπει εγγενή ακτινοευαισθησία είναι ακόμα υπό έρευνα [4].

Οι μελέτες μας έχουν επικεντρωθεί στην χαρακτηρισμό ποικίλες κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές

in vitro

και την κατανόηση των παραμέτρων που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην εγγενή ακτινοευαισθησία. Αυτή η βασική χαρακτηρισμός μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με αυτές τις κυτταρικές σειρές για περαιτέρω έρευνα στην πρόβλεψη της απόκρισης ακτινοθεραπείας. Εξετάσαμε την εγγενή ραδιοευαισθησία 27 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από δέκα τύπους όγκων. Κάθε κυτταρική γραμμή χαρακτηρίζεται από έναν συνδυασμό των δεδομένων που αντιπροσωπεύουν κατανομή κυτταρικού κύκλου, κυτταρική χρόνος διπλασιασμού, τον αριθμό των χρωμοσωμάτων, πρότυπο πλοειδία του DNA και ικανότητα επίστρωσης. Οι γνωστές παραμέτρους συμπεριλαμβανομένης της αποτελεσματικότητας επιδιόρθωσης του DNA DSB και της απόπτωσης μετά από έκθεση ιονίζουσα ακτινοβολία αξιολογήθηκαν μεταξύ επιλεγμένων ακτινοευαίσθητα και ακτινοανθεκτικά κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το 27 κυνικός κυτταρικές σειρές όγκων ευγενικά παρέχεται από Flint Κέντρο ζώων Καρκίνου του Πολιτειακού Πανεπιστημίου του Κολοράντο (Fort Collins, CO, USA) (Πίνακας 1) [12]. κυτταρικές σειρές όγκων Κολλητική αναπτύχθηκαν σε Ελάχιστο Βασικό Μέσο (ΜΕΜ /EBSS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ), 1% βιταμίνες ΜΕΜ, μη απαραίτητα αμινοξέα, πυροσταφυλικό νάτριο, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και Fungizone. κύτταρα όγκου Αναστολή αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco Life Technologies) συμπληρωμένο με τον ίδιο με το ΜΕΜ. Οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 95% αέρα και 5% CO

2.

Η

κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Για να καθορίσει τους χρόνους διπλασιασμού της οι κυτταρικές γραμμές, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δίσκους καλλιέργειας 35 mm. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε κάθε 24 ώρες χρησιμοποιώντας Coulter μετρητή Ζ1 (Beckman Coulter, La Brea, CA). Cellular χρόνοι διπλασιασμού υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Prism 5 λογισμικού (Graph Pad Software, La Jolla, CA). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν.

αριθμό των χρωμοσωμάτων

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 0,1 μg /mL κολσεμίδη (Invitrogen, Carlsbad, CA) για 6 ώρες για να μαζέψουν μεταφάσεως χρωμοσώματα. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε υποτονικό διάλυμα 75 mM KCl για 20 λεπτά στους 37 ° C και σταθεροποιήθηκαν σε 3: 1 (μεθανόλη: οξικό οξύ) διάλυμα καθήλωσης τρεις φορές. Μεταφάσης επάλειψη βάφτηκαν με διάλυμα Giemsa και παρατηρήθηκε ο αριθμός των χρωμοσωμάτων υπό μικροσκόπιο Axioplan (Carl Zeiss, Jena, Germany). Ένα ελάχιστο των 100 κυττάρων μετάφασης αναλύθηκαν για να μετρήσει χρωμοσώματα ανά κύτταρο. Τουλάχιστον 50 κύτταρα μετάφασης αναλύθηκαν για να μετρήσει μετακεντρικό χρωμοσώματα ανά κύτταρο.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

κυτταρικές καλλιέργειες σε 60% έως 70% συρροή σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους -20 ° C επί μία νύκτα ή περισσότερο. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 rpm για 5 λεπτά και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα κύτταρα μετά επαναιωρήθηκαν σε 1 ml διαλύματος χρώσης (/mL ιωδιούχου προπιδίου 20 μα, 0,1% TritonX-100, 500 μg /mL RNase Α) και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur με Cell Quest Pro (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) και το λογισμικό ModFit LT (Verity, Topsham, ΜΕ). Τρία ανεξάρτητα πειράματα με κάθε κυτταρική γραμμή διεξήχθησαν. Πλοειδίας εκτιμήθηκε ως το περιεχόμενο DNA των κυττάρων G1 στα κύτταρα όγκου κανονικοποιήθηκαν σε κύτταρα διπλοειδή ωοθήκης κινέζικου χάμστερ.

Η ακτινοβόληση

καλλιέργειες λογαριθμικής φάσεως ακτινοβολήθηκαν με διαφορετικές δόσεις

137Cs γ- ακτίνες χρησιμοποιώντας ένα JL Shepherd μοντέλο Mark I-68 ονομαστικής 6000 Ci

137Cs ακτινοβολίας (JL Shepard, Carlsbad, CA), παραδίδονται σε περίπου 2,5 Gy /min σε θερμοκρασία δωματίου.

κλωνογονική δοκιμασία επιβίωσης

ραδιοευαισθησία μετρήθηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό για nonsuspension κυτταρικές γραμμές. Τυχαία διαίρεση των κυττάρων σε Τ-φιάλες 12,5 ακτινοβολήθηκαν, θρυψίνη και απλώθηκαν σε τριπλή επανάληψη επί 100 mm ή 60 mm δίσκους καλλιέργειας σε κατάλληλη πυκνότητα κυττάρου. Μετά από επώαση για 1-2 εβδομάδες για να επιτραπεί ο σχηματισμός αποικιών, πιάτα ξεπλύθηκαν με 0,9% NaCl, σταθεροποιήθηκαν με 100% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Κάθε αποικία αποτελείται από περισσότερα από 50 κύτταρα βαθμολογήθηκε ως επιζών. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν, τότε οι καμπύλες επιβίωσης αντλήθηκαν χρησιμοποιώντας γραμμική-τετραγωνική εξισώσεις παλινδρόμησης με Prism 5 λογισμικό. Το κλάσμα επιβίωσης στα 2 Gy ακτινοβολίας (SF2) και του κλάσματος επιβίωσης σε 5 Gy ακτινοβολίας (SF5) ελήφθησαν δια παρεμβολής της κυτταρικής επιβίωσης ως εκτιμήσεις της εγγενούς ραδιοευαισθησία από κάθε κυτταρική σειρά.

Για καλλιέργειες αιωρήματος, μια περιοριστική αραίωση δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε όπως χρησιμοποιείται προηγουμένως στην ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές [13, 14]. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων σε πυκνότητες 1-200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε δύο ή τρεις κυτταρικές πυκνότητες ανά σημείο δόση. Μετά την ακτινοβόληση, οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 2-3 εβδομάδες πριν σκοράρει ως αρνητικά ή θετικά για ανάπτυξη με βάση μικροσκοπική εξέταση (δηλ φρεάτια στα οποία είχε πραγματοποιηθεί ανάπτυξη των κυττάρων είναι θετικά). Με βάση την κατανομή Poisson, κλάσματα επιβίωση υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [15].

γ-Η2ΑΧ εστιών στους G1-ακτινοβολημένα κύτταρα

αξιολογήθηκαν επαγωγή, και υπολειμματικό DSBs DNA με IR χρησιμοποιώντας ο προσδιορισμός γ-H2AX. Πραγματοποιήσαμε τη δοκιμασία με κύτταρα συγχρονισμένα και διατηρήθηκαν σε G1 κατά την ακτινοβόληση με χρήση της μεθόδου ισολευκίνη στέρηση [16]. Αυτό έγινε επειδή μη-ακτινοβολημένα κύτταρα σε S-φάση έχουν πολύ υψηλότερα επίπεδα γ-H2AX εστίες, και επίσης επειδή ο αριθμός των εστιών ανά κύτταρο εξαρτάται από το περιεχόμενο του DNA [17]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε πλαστικά πλακίδια θαλάμου για περίπου 50% συρροή και πλύθηκαν με PBS μία φορά. Το κανονικό μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε δύο φορές σε 1,5 φορές διπλασιάζοντας με ισολευκίνη ανεπάρκεια ΜΕΜ που περιέχει 5% 3 × διαπίδυση FBS να συγχρονίσει τα κύτταρα στην G1 φάση. Μετά το συγχρονισμό G1 και της έκθεσης σε 0 Gy ή 1 Gy γάμμα-ακτίνων, τα κύτταρα επωάστηκαν με 5-αιθυνυλ-2′-δεοξυουριδίνης (edu) για 30 λεπτά (είτε αμέσως είτε μετά από 5,5 ώρες επώασης για επισκευή). EDU-επισήμανση χρησιμοποιήθηκε για να κρίνουμε το συγχρονισμό G1 [18]. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη ακολουθούμενη από διαπερατοποίηση με 0,5% Triton-X 100 και 0.1% SDS. Edu πρώτα χρωματίστηκαν ως τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και μπλοκαρίστηκαν σε PBS με 10% ορό κατσίκας επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα φωσφορυλιωμένο ιστόνης Η2ΑΧ αντίσωμα (Ser139) (γ-Η2ΑΧ) (Millipore, Billerica, ΜΑ) και ακολούθησε Alexa 594 Fluor-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (Molecular Probes, Eugene, OR) . Τα κύτταρα τοποθετημένα σε ένα διάλυμα με ϋΑΡΙ περιέχει αργή εναλλαγή (Invitrogen). Ψηφιακές εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Axioskop μηχανοκίνητα Z-στάδιο μικροσκόπιο (Carl Zeiss) με CoolSnapHQ2 (Photometrics, Tucson, AZ) και το λογισμικό Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Οι εικόνες χρησιμοποιήθηκαν για να μετρήσει εστίες γ-Η2ΑΧ ανά κύτταρο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν και οι αριθμοί αναγνώρισης του γ-Η2ΑΧ μετρήθηκαν για τουλάχιστον 50 edu χρώση αρνητικά κύτταρα για κάθε δείγμα σε κάθε πείραμα.

Ανάλυση της Απόπτωσης

επαγωγή απόπτωσης με IR εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την ενεργοποίηση της κασπάσης 3/7, χρώση αννεξίνης V, και δοκιμασία τερματικής δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης (TdT) μεσολάβηση δεοξυουριδίνη τριφωσφορική nick τέλος επισήμανσης (TUNEL). Σύνδεση αναπτυσσόμενα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν φάση με 0 Gy ή 5 Gy γάμμα-ακτίνων. Μετά από 16 ώρες επώασης, η πρώιμη απόπτωση μετρήθηκε με την ενεργοποίηση της κασπάσης 3/7 με κασπάση-Glo 3/7 kit (Promega, Madison, WI). Λάμψη Luminesce 10.000 κυττάρων μετρήθηκε με Lumat LB9507 (Berthold τεχνολογίες, Oak Ridge, ΤΝ). Μετά από 24 ώρες επώασης, η πρόωρη /αργά απόπτωση μετρήθηκε με χρώση αννεξίνης V με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης FITC Annexin V με 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA). Annnexin V θετική, αλλά 7-AAD αρνητικά (πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων) και Αννεξίνη V θετική και 7-AAD θετικά (όψιμο στάδιο απόπτωσης) προσδιορίστηκε από γκουάβα-PCA κυτταρόμετρο ροής. Μετά από 48 ώρες επώασης, η καθυστερημένη απόπτωση μετρήθηκε με TUNEL δοκιμασία και κατακερματισμένη πυρηνική μορφολογία. Τα cytogentrifuged κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και παγωμένο 70% αιθανόλη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στο μίγμα της αντίδρασης που περιέχει 1.5 mM CoCl

2, 12,5 U TdT, 1 mM 5-βρωμο-2′-δεοξυουριδίνη-5′-τριφωσφορική σε ρυθμιστικό TdT (Br-dUTP, Sigma-Aldrich: οι άλλοι , Roche, Indianapolis, ΙΝ) για 4 ώρες στους 37 ° C στο σκοτάδι. Οι πλάκες επωάστηκαν με ένα BrdU μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού και αντίσωμα αντι-ποντικού Alexa Fluor 488 αντίσωμα κατσίκας. Τέλος, τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. Περίπου 1000 πυρήνες από κάθε διαφάνεια μετρήθηκαν, και TUNEL θετικά συχνότητες υπολογίστηκαν. αναλογίες απόπτωση προσδιορίστηκαν επίσης με σκορ κύτταρα χρώση DAPI με κατακερματισμένο πυρηνική μορφολογία.

Δυτική Blotting

Τα κύτταρα λύθηκαν με αντιδραστήριο M-PER θηλαστικών Πρωτεΐνη Extraction (Thermo Fisher Scientific) και αναστολείς πρωτεάσης. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (20 μg ανά δείγμα) κλασματώθηκαν κατά μέγεθος επί 4-12% NuPage δις-Τρις γέλες (Invitrogen), ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad) σε ρυθμιστικό (25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη, 20% (ν /ν) μεθανόλη, και 0,01% SDS) σε μία πυκνότητα ρεύματος από 3,0 mA /cm

2 για 16 ώρες στους 4 ° C. Τα φίλτρα αποκλείστηκαν με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0,05% Tween 20 που περιείχε 2% (w /v) αποβουτυρωμένο γάλα, και αντιδρά με ένα πρωτεύον αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με ένα δευτερεύον αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα ανοσοαντιδραστικά σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal Western Blotting Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) και ένα ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). Η έκφραση πρωτεΐνης από τη δύναμη ζώνη αναλύθηκε με λογισμικό Lab εικόνας (Bio-Rad). Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν το αντι-DNA-PKcs μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Ab-4? NeoMarkers, Fremont, CA), το αντι-Rad51 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Η-92? Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), το αντι-FANCD2 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (NB100-182? Novus Biologicals, Littleton, CO) και το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού βήτα-ακτίνης (Άβραμ 8226? Abcam, Cambridge, ΜΑ). Τα δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας αντι-ποντικού IgG HRP συζευγμένο αντίσωμα (1: 10.000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) και IgG αίγας αντι-κουνελιού HRP συζευγμένο αντίσωμα (1: 10.000) (κυτταρική σηματοδότηση, Boston ΜΑ ). Κάθε ζώνη έκφραση εκτιμήθηκε από το μοριακό βάρος εκάστης πρωτεΐνης και της ταινίας ανιχνεύεται στο ανθρώπινο καρκινική κυτταρική σειρά Α549.

Στατιστική Ανάλυση

Για στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε GraphPad Prism λογισμικό 5

. Η δοκιμασία D’Agostino-Pearson χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν οι τιμές ήταν κανονικά κατανεμημένη. Διαφορές με τιμή Ρ μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι συσχετίσεις των SF2 και άλλες παράμετροι προσδιορίστηκαν με δοκιμή Pearson. Στατιστικές συγκρίσεις των μέσων τιμών στην δοκιμασία γ-Η2ΑΧ (έλεγχος vs 6 ώρες μετά 1 Gy) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Kruskal-Wallis ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Dunn. Η στατιστική σύγκριση των μέσων τιμών στην SF2 /SF5 (ραδιοανθεκτικά ομάδα vs ακτινοευαίσθητα ομάδα) και στην δοκιμασία απόπτωσης (0 Gy έναντι 5 Gy) διεξήχθη χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο δύο tailed t-test.

Αποτελέσματα

βασικός χαρακτηρισμός του Καρκίνου Canine κυτταρικών γραμμών

Κάθε κυτταρική γραμμή χαρακτηρίζεται από έναν συνδυασμό των δεδομένων που αντιπροσωπεύουν κυτταρικών χρόνο διπλασιασμού, διανομή του κυτταρικού κύκλου, πλοειδία μοτίβο, και τον αριθμό των χρωμοσωμάτων, με τα δεδομένα που συνοψίζονται στον πίνακα 1. Η χρόνους διπλασιασμού από κάθε κυτταρική σειρά κυμάνθηκε από 15 ώρες (CML-6M, CTAC) έως 40 ώρες (STSA-1), που δείχνει μεγάλη παραλλαγή. Μετρήσαμε την κατανομή κυτταρικού κύκλου του κάθε κυτταρική σειρά με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου κυμάνθηκε από 39,3% (CLBL1) έως 69,6% (BR) για τη φάση G1, από 17,3% (Parks) έως 50,1% (CLBL1) για τη φάση S, και από 1,52% (BR ) σε 29,9% (πάρκα και STSA-1) για την φάση G2 /M. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται μεταβλητό μέσο όρο του αριθμού των χρωμοσωμάτων, που κυμαίνονται από 57 (1771) σε 155 (17CM98). Οι κυνικός καρκινικές κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν αυξημένο αριθμό μετακεντρικό χρωμοσωμάτων (χρωμοσώματα Χ σχήμα) που προκύπτει από γεγονότα κατά Robertson μετάθεση [19], με την εξαίρεση των δύο κυτταρικών σειρών (Jones και OSW) (Πίνακας 1). Οι συχνότητες των μετακεντρικό χρωμοσώματα ποικίλλουν μεταξύ των κυτταρικών σειρών από λιγότερο από δύο, το φυσιολογικό καρυότυπο, σε 43,2 (D17) ανά κύτταρο. Όλες οι κυτταρικές σειρές εκτός BR είχαν μεγαλύτερη από την διπλοειδή ποσότητα DNA. Βρήκαμε συνολικά συμφωνίες μεταξύ μη φυσιολογική πλοειδίας και αύξηση του αριθμού των χρωμοσωμάτων, αλλά όχι πάντα. Nike, για παράδειγμα, είχε ένα μικρότερο αριθμό χρωμοσωμάτων ανά κύτταρο με 64,4, αλλά το μοντέλο πλοειδίας ήταν μεταξύ διπλοειδίας και της τριπλοειδία.

Κλωνογόνος Επιβίωση μετά από έκθεση σε ακτινοβολία γάμμα

ακτινοβοληθεί καθένα από οι 27 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές με 0, 1, 2, 3 ή 5 Gy γάμμα-ακτίνων και του σχηματισμού αποικιών μετρημένη. Οι καμπύλες επιβίωσης τους φαίνεται στην Εικόνα 1. SF2 και SF5 αξίες που υπολογίστηκαν από την γραμμική καμπύλη τετραγωνική επιβίωση παλινδρόμησης, καθώς και της αποτελεσματικότητας επιμετάλλωση, αναφέρονται στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα αυτά αντιπροσωπεύουν το εύρος του σκύλου radiosensitivities κυττάρου όγκου σε διάφορα είδη όγκων . Η SF2 κυμαίνονταν από 0,19 να 0,93, και το SF5 κυμαίνονταν από 0,01 να 0,60. Η επιμετάλλωση αποτελεσματικότητα αυτών των κυτταρικών γραμμών έδειξαν επίσης μια ευρεία διακύμανση και κυμαίνονταν από 4% έως 65%. Η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση της BR (4%) ήταν πολύ χαμηλή για να αποκτήσουν αξιόπιστες κλάσματα επιβίωσης? Ως εκ τούτου, ραδιοευαισθησία του δεν χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω αναλύσεις. Η ραδιοευαισθησία των τεσσάρων σκύλων OSA κυτταρικές σειρές (D17, Μορέσκο, Gracie και MacKinley) μετρήθηκε με κλωνογόνο δοκιμασία ήταν συνεπείς με αυτές που έχουν ήδη δημοσιευθεί [20]. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα από τα βασικά κυτταρικά χαρακτηριστικά (π.χ. διπλασιασμός του χρόνου, η ανάλυση των χρωμοσωμάτων) εμφανίζεται στην έκθεση χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την ανάλυση σε αυτή τη μελέτη. Αξιολογήσαμε συσχετίσεις ανάμεσα στις μεταβλητές κυτταρικά χαρακτηριστικά και την ραδιοευαισθησία. Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση του SF2 με κλάσμα S-φάση, διπλασιάζοντας το χρόνο, τον αριθμό των χρωμοσωμάτων, ή τον αριθμό των μετακεντρικό χρωμοσωμάτων, ενώ υπήρξε μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ SF2 και ικανότητα επίστρωσης (R

2 = 0.34, ρ = 0.002, Pearson test) (Σχήμα 2). Αξιολόγηση κατά SF5 έδειξαν τα ίδια αποτελέσματα με αυτά που λαμβάνονται από SF2 (R

2 = 0.24, ρ = 0.01, Pearson test).

Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές και οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα των μέσων. Έχουμε επιλέξει τα πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία κυτταρικές σειρές (κόκκινο καμπύλες) και τα πιο ανθεκτικά στην ακτινοβολία κυτταρικές γραμμές (μπλε καμπύλες) για την ανάλυση που ακολουθεί.

Η

Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει μια κυτταρική γραμμή. Οι συσχετίσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμή Pearson. Οι γραμμές είχαν τοποθετηθεί από ένα τουλάχιστον τετραγώνων μέθοδο.

Η

Επιλογή ακτινοευαίσθητα και ακτινοανθεκτικά Ομάδες

Οι 27 κυνικός καρκίνο κυτταρικές γραμμές ανάλογα με τις παραμέτρους ακτινοευαισθησία, SF2 και SF5, και οι πέντε πιο ευαίσθητες ή ανθεκτικές γραμμές για κάθε παράμετρο ορίσθηκαν ως οι ευαίσθητων και ανθεκτικών ομάδων (Εικ 3Α και 3Β). Η επιλεγμένη ακτινοανθεκτικά ομάδα εμφανιζόμενες τιμές SF2 0,19 – 0,44 (Nike, CML-C2, Bliley, MacKinley, STSA-1). Η ακτινοευαίσθητα ομάδα εμφάνισαν τιμές SF2 παραπάνω 0.86 (CMT-12, K9TCC, DEN-HSA, CMT-27, Abrams). Οι διαφορές στο κύτταρο όγκου ραδιοευαισθησία ήταν καλύτερες διακρίσεις όταν η ραδιοευαισθησία των κυττάρων του όγκου εκφράστηκε ως κλάσματα επιβίωσης στην υψηλότερη δόση (SF5). Οι κυτταρικές γραμμές και στις δύο ομάδες με βάση τη σύγκριση SF5 ήταν ελαφρώς διαφορετικά από εκείνα που βασίζονται στη σύγκριση SF2. Τα κλάσματα επιβίωσης μεταξύ των δύο ομάδων των κυτταρικών σειρών με βάση είτε τη σύγκριση SF2 ή SF5 ήταν στατιστικά διαφορετικές (p & lt? 0.001). (Σχήμα 3C και 3D)

27 κυτταρικές γραμμές κατατάσσονται με βάση SF2 (Α) και SF5 (Β). Κόκκινος κύκλος: ακτινοευαίσθητα ομάδα, μπλε κύκλο: ακτινοανθεκτικά ομάδα. (C, D) Σύγκριση μεταξύ των μέσων τιμών των δύο ομάδων με βάση το SF2 (C) ή SF5 (D). Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση. * P & lt?. 0.001 έναντι ευαίσθητων και ανθεκτικών ομάδα (ασύζευκτα t-test)

Η

Σχέση μεταξύ Εγγενής ραδιοευαισθησία και DNA DSBs στο G1-Irradiatied κύτταρα

Για να εξεταστεί κατά πόσον η ανταπόκριση των κυττάρων στο DNA DSBs συσχετίζεται με ραδιοευαισθησία στα κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία γ-Η2ΑΧ στο πέντε πιο ραδιοανθεκτικά και πέντε πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία κυτταρικές γραμμές επιλέγεται από SF2 κατάταξης. Πυρηνική εστίες φωσφορυλιωμένου Η2ΑΧ ιστόνης (γ-Η2ΑΧ) που προκύπτει από βλάβη του DNA είναι ευαίσθητοι δείκτες για DNA DSBs [21]. Μετρήσαμε τον αριθμό των γ-H2AX εστίες μετά από 1 Gy γάμμα ακτινοβολία σε κύτταρα G1 φάσης συγχρονισμένη ακόλουθες 30-min ή 6-ώρες χρόνος επισκευής (Σχήμα 4). Στα ισολευκίνη μέσα ανεπαρκή για να συγχρονίσετε τα κύτταρα στην G1, τα περισσότερα κύτταρα DEN-HSA πέθανε μετά από 24 ώρες επώασης, και η κυτταρική σειρά CMT-12 δεν ήταν συγχρονισμένα στα μέσα μαζικής ενημέρωσης. Ως εκ τούτου, αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές δεν χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση αυτή. Οι άλλες κυτταρικές γραμμές έδειξαν συγχρονισμός G1 με λιγότερο από 16% στην S-φάση στην ισολευκίνη μέσα ανεπαρκή για 1,5 φορές διπλασιασμού. Σε μερικά κύτταρα δεν είναι σε φάση S με 0 θεραπεία Gy, μεγάλοι αριθμοί των ενδογενών εστιών γ-Η2ΑΧ παρατηρήθηκαν σε όλα τα καρκινικά κύτταρα σκύλου. Αποκλείσαμε κύτταρα με υψηλά επίπεδα εστιών εκτός του IR-επαγόμενης διανομή από την ανάλυση για την ανίχνευση των επιπέδων των εστιών που προκαλείται από IR. Με βάση την ανάλυση χωρίς κύτταρα με υψηλά επίπεδα ενδογενούς αριθμούς εστιών γ-Η2ΑΧ, 1 Gy γάμμα-ακτίνων που επάγεται σημαντικά υψηλότερα επίπεδα γ-H2AX εστίες μετά από 30 λεπτά ακτινοβόλησης σε όλες τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτήν την ανάλυση (ρ & lt? 0,05 vs 0 Gy, που δεν φαίνεται στο σχήμα) (εικόνα 4Β). Στα 30 λεπτά μετά την ακτινοβόληση, ο διάμεσος αριθμός των γ-H2AX εστίες ήταν εξαρτάται από το περιεχόμενο του DNA από κάθε κυτταρική σειρά. Επιπλέον, η ακτινοευαίσθητα CML-10C2, Nike, STSA-1 και MacKinley είχαν υψηλότερους αριθμούς των γ-H2AX εστίες μετά από 6 ώρες μετά από 1 Gy ακτινοβολίας σε σύγκριση με τα επίπεδα ελέγχου (p & lt? 0,05 vs 0 Gy). Από την άλλη πλευρά, οι τρεις ραδιοανθεκτικά κυτταρικές σειρές και μία ακτινοευαίσθητα κυτταρική γραμμή, Bliley, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και κυττάρων με 6 ώρες μετά την ακτινοβόληση.

Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν σε G1 χρησιμοποιώντας ισολευκίνη μέσα ανεπαρκή και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 1 Gy γάμμα-ακτίνων. Μετά από 30 λεπτά ή 6 ώρες χρόνο επώασης, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με γ-Η2ΑΧ. (Α) Παραδείγματα γ-H2AX εστίες (πράσινο) στην πυρηνική DAPI (μπλε) χρώση σε έλεγχο, 1Gy που ακολουθείται από επώαση 30 λεπτών και 1 Gy ακολουθούμενη από 6 ώρες επώασης σε αρνητικά κύτταρα edu. (Β) Ποσοτική ανάλυση της γ-H2AX εστίες ανά κύτταρο. Τα συγκεντρωτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα σκοράροντας 50 κύτταρα σε κάθε πείραμα που παρουσιάζεται. Η γραμμή δείχνει μέση. Οι στατιστικές έννοιες εμφανίζονται μόνο για τον έλεγχο έναντι 6 ώρες μετά την 1 Gy (μη παραμετρική δοκιμασία Kruskal-Wallis).

Η

Σχέση μεταξύ Εγγενής ραδιοευαισθησία και την απόπτωση Συχνότητα σε ακτινοβολημένα κύτταρα

Οι πέντε ακτινοανθεκτικά κυττάρων γραμμές και τα πέντε ακτινοευαίσθητα κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν επίσης για απόπτωση στα 18, 24, και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση (0 Gy και 5 Gy) (Σχήμα 5). Caspase 3/7 ενεργοποίηση αναλύθηκε 18 ώρες μετά την ακτινοβόληση (Σχήμα 5Α). έκφραση αννεξίνης V αναλύθηκε στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση (Σχήμα 5Β). Η δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 αυξήθηκε το παρατηρήθηκαν περισσότερες από δύο φορές σε CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, MacKinly και STSA-1. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά με 5 Gy ακτινοβολίας στο CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, και MacKinley με ανάλυση Annexin V. Τα αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν με χρώση TUNEL (Σχήμα 5C) και DAPI δηλώνοντας (Σχήμα 5D) και αναφέρονται χωριστά. Παρά το γεγονός ότι η απόπτωση παρατηρήθηκε σε όλες τις καλλιέργειες ελέγχου που κυμαίνεται 0,1 έως 3,4% με χρώση TUNEL και 0,37 έως 3,3% κατά DAPI χρώση των κυττάρων, ανάλογα με την κυτταρική γραμμή, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά με 5 Gy ακτινοβολίας σε Abrams, Nike, και CML-10C2 με DAPI χρώση σε σχέση με μηδέν δείγματα Gy (ρ & lt? 0,05, unpaired t-tests) (Εικ 5C). Χρησιμοποιώντας τη μέτρηση των αποπτωτικών κυττάρων με τη δοκιμασία TUNEL, παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα με αυτά με χρώση ϋΑΡΙ. Μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα απόπτωσης με IR παρατηρήθηκαν σε ένα (Abrams) από τα πέντε ραδιοανθεκτικά κυτταρικές σειρές και σε τρία (Nike, CML-10C2 και MacKinley) από τα πέντε ακτινοευαίσθητα κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5D).

3/7 δραστικότητα (Α) Caspase μετρήθηκε με luminomator στις 16 ώρες μετά την ακτινοβόληση. (Β) αννεξίνης V και χρώση 7ΑΑΌ μετρήθηκε με κυτταρόμετρο ροής στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. (Γ) TUNEL χρώση και (Δ) DAPI χρώση μετρήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού. Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 0 Gy και 5 Gy γάμμα-ακτίνων. *, Ρ & lt? 0,05 έναντι 0 Gy και 5 Gy για κάθε κυτταρική σειρά (μη ζευγαρωμένο t-test)

Η

Protein Expression της οδού επιδιόρθωσης DNA σε ακτινοευαίσθητα και ραδιοανθεκτικά Ομάδες

Από DNA. οδούς επιδιόρθωσης DSB είναι στενά συνδεδεμένα με θανάτωση κυττάρων με IR, μελετήσαμε την κατάσταση πρωτεΐνη από τα σημαντικότερα μονοπάτια στα καρκινικά κύτταρα σκύλου. Εστιάσαμε σε δύο μεγάλες μη ομόλογο τέλος ενώνει (NHEJ) και ο ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) για την επισκευή DSB και Fanconi αναιμία (FA) μονοπάτι, το οποίο ενδεχομένως να συμβάλλει στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA για την ακτινοβόληση. Πρωτεΐνη έκφραση των μεγάλων παικτών σε κάθε μονοπάτι, DNA-PKcs στο ΝΗΕΙ, RAD51 στην ΥΕ και FANCD2 στο FA μονοπάτι ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western στο ακτινοανθεκτικά και ακτινοευαίσθητα ομάδες (Σχήμα 6). Η έκφραση του DNA-PKcs, FANCD2 και RAD51 δεν ήταν ομοιόμορφες μεταξύ των κυτταρικών σειρών, και δεν υπήρχε σαφής τάση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης και στις δύο ομάδες, όπως φαίνεται στο σχήμα 6Β. Η έκφραση των τριών πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα σκύλου ήταν συνολικά υψηλότερες από εκείνες σε κανονικούς ινοβλάστες σκύλο. Παρατηρήσαμε λιγότερο έκφραση πρωτεϊνών DNA-PKcs σε Nike (1,4 φορές του φυσιολογικού) και την υψηλότερη έκφραση σε STSA-1 (5,4 φορές του φυσιολογικού). Για την πρωτεΐνη FANCD2, η χαμηλότερη έκφραση ήταν σε DEN-HSA (0,8 φορές του φυσιολογικού) και η υψηλότερη έκφραση ήταν το CMT-27 (7,2 φορές του φυσιολογικού). Για την πρωτεΐνη RAD51, η χαμηλότερη έκφραση σε DEN-HSA (0,4 φορές του φυσιολογικού) και η υψηλότερη έκφραση ήταν σε MacKinley (3,0 φορές του φυσιολογικού). Σε σύγκριση μεταξύ της κυνόδοντα και του ανθρώπινου καρκίνου κυτταρική γραμμή (Α549), τα επίπεδα έκφρασης του DNA-PKcs σε STSA-1, η οποία έδειξε την υψηλότερη έκφραση των σκύλων κυτταρικές σειρές, ήταν 10 φορές μικρότερη από εκείνη του Α549.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των DNA-PKcs (460 kDa), FANCD2 (165 kDa) και RAD51 (37 kDa). β-ακτίνης (42 kDa) έκφραση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Κάθε ζώνη έκφραση εκτιμήθηκε από το μοριακό βάρος. (Β) Ένταση Band of Western Blot. (C, D) Εκπρόσωπος εικόνες για RAD51 εστίες (C) και εστίες FANCD2 (Δ) συν-εντοπίζεται με γ-H2AX στα κύτταρα Moresco.

Η

Παρατηρήσαμε επίσης τη εστίες RAD51 και FANCD2 ως λειτουργικά συν-εντοπίζεται με γ-H2AX για το άγχος αντιγραφή χωρίς ακτινοβολία σε όλες τις 27 γραμμές κυττάρων (Σχήμα 6C και 6D). Ένα άλλο πλεονέκτημα για τον έλεγχο RAD51 και FANCD2 ήταν ότι αυτοί οι σχηματισμοί πρωτεΐνη εστίες απαιτούν άλλες ανάντη πρωτεΐνες, όπως πέντε πρωτεΐνες RAD51 παραλόγου και οκτώ πρωτεΐνες αναιμίας Fanconi [22-24]. Ως εκ τούτου, ανίχνευση του σχηματισμού εστιών μας επέτρεψε τη διαλογή για την παρουσία αυτών των ανάντη πρωτεϊνών σε όλες τις 27 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές. Παρατηρήσαμε λειτουργικές εστίες RAD51 και FANCD2 σε όλες τις κυτταρικές σειρές.

Συζήτηση

Οι 27 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από δέκα διαφορετικούς τύπους όγκων που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη είχαν ποικίλες radiosensitivities ανεξαρτήτως του όγκου Τύπος με τις τιμές SF2 του 0,17 να 0.94 (Εικόνα 1 και Πίνακας 1). Από τα προηγούμενα δεδομένα ραδιοευαισθησία χρησιμοποιώντας μία ευρεία ποικιλία ανθρώπινων όγκων, SF2 κυμαίνονταν από 0.038-0.95 [13]. Το χαμηλότερο εύρος των SF2 αναφέρθηκαν στην ανθρώπινη μελέτη ήταν ως επί το πλείστον οφείλεται σε λεμφοειδείς όγκους, οι οποίοι δεν ήταν εξαιρετικά ευαίσθητα στην ακτινοβολία σε κυνικός αποτέλεσμα μας όπου SF2 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια δοκιμασία. Λεμφοειδής όγκοι είναι γνωστό ότι είναι ευαίσθητα σε θεραπεία με ακτινοβολία στην ιατρική και στην κτηνιατρική ογκολογία [2]. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να προκληθεί από τη διακύμανση μεταξύ λεμφοειδείς νεοπλασματικές κυτταρικές σειρές όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25], δεδομένου ότι μόνο τέσσερις κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν στη μελέτη μας.

Για να κατανοήσουμε τις παραμέτρους που μπορεί να συμβάλλουν στην ενδογενή ακτινοευαισθησία, αξιολογήσαμε οι σχέσεις των κυτταρικών ραδιοευαισθησία με βασικά κυτταρικά χαρακτηριστικά στα 27 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές. Μια ευρεία διακύμανση παρατηρήθηκε επίσης σε κυτταρικά χαρακτηριστικά ως προς τον αριθμό των χρωμοσωμάτων, κλάσμα S-φάση, διπλασιάζοντας το χρόνο και επιμετάλλωση αποδοτικότητα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1). Στη μελέτη μας, δεν βρήκαμε μια συσχέτιση μεταξύ της ραδιοευαισθησία και τα κυτταρικά χαρακτηριστικά συμπεριλαμβανομένου του αριθμού των χρωμοσωμάτων, κλάσμα S-φάσης, και ο χρόνος διπλασιασμού (Σχήμα 2). Προηγουμένως, ο μεγαλύτερος αριθμός των χρωμοσωμάτων έχει βρεθεί σε μερικές από ραδιοανθεκτικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [9].