Αφηρημένο

τεχνολογία αλληλούχισης επόμενης γενιάς επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών γονιδίων ευαισθησίας για την κλινική γενετική του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, multiplex γενετικό έλεγχο διεξήχθη με μία κινεζική οικογένεια με πολλαπλές περιπτώσεις καρκίνου για τον προσδιορισμό των μεταβολών στα γονίδια του καρκίνου προδιάθεση. Η οικογένεια αποτελείται από μια μητέρα και πέντε κόρες της, εκ των οποίων η μητέρα και η μεγαλύτερη κόρη έχουν καρκίνο και τη δευτεροβάθμια κόρη του πέθανε από καρκίνο. Διενεργήσαμε multiplex γενετικό έλεγχο του 90 γονιδίων ευαισθησίας στον καρκίνο χρησιμοποιώντας το DNA περιφερικού αίματος της μητέρας και τα πέντε κόρες.

WRN

πλαισίου μετάλλαξη θεωρείται μια πιθανή παθογόνο παραλλαγή σύμφωνα με τις οδηγίες του Αμερικανικού Κολλεγίου Ιατρικής Γενετικής. Ένα μυθιστόρημα

WRN

μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου (p.N1370Tfs * 23) αναγνωρίστηκε στις τρεις ασθενείς με καρκίνο και στη νεότερη ανεπηρέαστη κόρη. Άλλες σπάνιες μη συνώνυμες μεταλλάξεις βλαστικής σειράς επίσης ανιχνεύθηκαν σε

Dicer

και

ELAC2

. Λειτουργικές μεταλλάξεις στο

WRN

να προκαλέσει το σύνδρομο Werner, έναν άνθρωπο αυτοσωματικό υπολειπόμενο ασθένεια που χαρακτηρίζεται από την πρόωρη γήρανση και σχετίζονται με γενετική αστάθεια και αυξημένο κίνδυνο καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η

WRN

μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου είναι σημαντική για την εποπτεία των άλλων μελών αυτής της οικογένειας, ιδιαίτερα την μικρότερη κόρη, αλλά η παθογένεια του μυθιστορήματος

πρέπει να διερευνηθεί WRN

πλαισίου μετάλλαξη περαιτέρω. Λαμβάνοντας υπόψη την εκτεταμένη χρήση της στην κλινική γενετική εξέταση, multiplex γενετικός έλεγχος είναι ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την κλινική παρακολούθηση του καρκίνου

Παράθεση:. Yang L, Wang G, Zhao Χ, Ye S, Shen P, Wang W, et al. (2015) A Novel

WRN

μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου που προσδιορίζονται από Multiplex Γενετικές εξετάσεις σε μια οικογένεια με πολλαπλές περιπτώσεις καρκίνου. PLoS ONE 10 (8): e0133020. doi: 10.1371 /journal.pone.0133020

Επιμέλεια: Peyman Björklund, Πανεπιστήμιο της Ουψάλα, Σουηδία

Ελήφθη: 18 Σεπτεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 23, Ιούν 2015? Δημοσιεύθηκε: 4 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα δεδομένα αλληλουχίας (fastq) κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων SRA του National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) με τους ακόλουθους αριθμούς πρόσβασης: SRR1563024, SRR1563027, SRR1563036, SRR1563037, SRR1563039 και SRR1563041. Ο Πίνακας 2 δείχνει μεμονωμένων ασθενών και των αντίστοιχων αριθμών πρόσβασης SRA τους

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από το Εθνικό Υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης του Προγράμματος της Κίνας (863 Προγράμματος, Νο 2012AA02A205), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Όχι . J20121214), την οικονομική υποστήριξη της Επιστήμης Τμήμα Τεχνολογίας της επαρχίας Zhejiang (Αρ 2011C23088), το Ιατρικό Ίδρυμα Επιστημονικής Έρευνας του Γραφείου Υγείας της επαρχίας Zhejiang (Αρ 2012KYB070), η Εθνική S & amp? T μεγάλο έργο (Αρ 2012ZX10002017), το σχέδιο που υποστηρίζεται από το Ίδρυμα για την καινοτόμο Ομάδες Ερευνών του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81121002), και το Ειδικό Ταμείο Έρευνας για Κοινής Ωφέλειας Βιομηχανίας Υγείας (Νο 201202007)

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

κατά τα τελευταία 30 χρόνια, ιδιαίτερα διεισδυτικό γονίδια τα οποία προσδίδουν προδιάθεση καρκίνου έχουν εντοπιστεί στον καρκίνο επιρρεπείς οικογένειες. Αυτά τα γονίδια ακολουθούν Μέντελ πρότυπα κληρονομικότητας. Μελέτες έχουν συνδέσει επιτυχώς μεταλλάξεις με διάφορες συνθήκες, για παράδειγμα,

BRCA1

και

BRCA2

στο σύνδρομο κληρονομικό καρκίνο μαστού-ωοθηκών, τα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA στο σύνδρομο Lynch,

P53

στο σύνδρομο Li-Fraumeni, και

APC

στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση [1-3]. Δοκιμές για μεταλλάξεις βλαστικής γραμμής υψηλής διεισδυτικών καρκινικών γονιδίων προδιάθεσης παρέχει πολύτιμες γενετικές πληροφορίες για τους ασθενείς και τις οικογένειές τους και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον τομέα της επιτήρησης του καρκίνου και παρακολούθηση των ασθενών.

Η τεχνολογία της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) επιτρέπει σε ολόκληρο το γονιδίωμα αλληλουχίας (ΠΓΣ), αλληλούχιση ολόκληρου exome (WES), καθώς και στοχευμένες αλληλουχίας συγκεκριμένων περιοχών ενδιαφέροντος, όπως η πολλαπλή γενετικό έλεγχο για τον εντοπισμό σπάνιων γονιδιωματικής παραλλαγές. Multiplex γενετικές εξετάσεις χρησιμοποιώντας NGS επιτρέπει την αποτελεσματική και αποδοτική προβολή μιας ομάδας γονιδίων ευαισθησίας του καρκίνου. Εν συντομία, τα θραύσματα DNA στόχος ήταν εμπλουτισμένα με ένα πάνελ γονίδιο του καρκίνου και η αλληλουχία του με NGS. NGS παράγει μια μεγάλη ποσότητα δεδομένων αλληλουχίας για χαρτογράφηση, την ευθυγράμμιση, και το φιλτράρισμα για την απόκτηση γενετικών παραλλαγών. Για να ορίσετε την παθογένεια των παραλλαγών, αξιολογήσαμε όλες τις προσδιοριζόμενες μεταλλάξεις σύμφωνα με τις οδηγίες του Αμερικανικού Κολεγίου Ιατρικής Γενετικής (ACMG) [4].

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε τρεις ασθενείς με καρκίνο από μια οικογένεια. Η μητέρα και η δεύτερη κόρη είχε αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, και η μεγαλύτερη κόρη έχει καρκίνο του ενδομητρίου. Multiplex γενετικό έλεγχο του 90 γονίδια του καρκίνου προδιάθεση αποκάλυψε

WRN

μετατόπισης πλαισίου μεταλλάξεις στα τρεις ασθενείς. Η δοκιμή διεξήχθη επίσης στις άλλες τρεις κόρες, αποκαλύπτοντας ότι η μικρότερη κόρη έχει επίσης το ίδιο

WRN

μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου. Τα πιο πάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι το

WRN

πλαισίου μετάλλαξη θα μπορούσε να έχει σημασία στην εποπτεία του καρκίνου για τη μικρότερη κόρη.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Ηθικά έγκριση για αυτή τη μελέτη χορηγήθηκε από τις επιτροπές Δεοντολογίας της First Affiliated Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang. Οι ασθενείς και οι οικογένειές τους έλαβαν γενετική συμβουλευτική. Έχουμε λάβει γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη αυτή

Θέματα και δείγματα

Αναλύσαμε μια οικογένεια, η οποία περιελάμβανε μια μητέρα με καρκίνο του πνεύμονα και πέντε κόρες της.? η μεγαλύτερη κόρη έχει καρκίνο του ενδομητρίου, και η δεύτερη κόρη του πέθανε από καρκίνο του πνεύμονα. Συγκρίναμε επίσης τα δεδομένα αλληλουχίας των 300 άσχετα υγιείς μάρτυρες να αποκλείσει κοινή ενιαία παραλλαγές νουκλεοτιδίου [5]. Πλήρες αίμα συλλέχθηκε από όλες τις έξι μέλη της οικογένειας. Γονιδιωματικό DNA, εκχυλίζεται με πρότυπες μεθόδους, χρησιμοποιήθηκε για multiplex γενετικό έλεγχο και επικύρωση με αλληλούχιση Sanger.

Η κλινική έρευνα

χειρουργικά ενδομήτριου ιστού καρκίνου και μια βιοψία δείγμα που λαμβάνεται με διαδερμική πνεύμονα centesis υποβλήθηκαν σε παθολογικές αξιολόγηση για τη δημιουργία ιστολογική διάγνωση. Οι ακόλουθες παράμετροι μελετήθηκαν: κλινικά και διαγνωστικά δεδομένα (ηλικία, φύλο, και κλινικά χαρακτηριστικά), τα αποτελέσματα Doppler υπερήχων, και αξονική τομογραφία (CT). Παρακολούθηση εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης.

προετοιμασία βιβλιοθήκη DNA

Κάθε δείγμα DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και φασματοφωτομετρία NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Οι βιβλιοθήκες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο Illumina. Εν συντομία, 3 μα ϋΝΑ γονιδιώματος κατακερματισμένη με εκνέφωση. Κατακερματισμένο DNA με ενιαίο πρόβολοι Α συνδέθηκαν στο τέλος 3’της Illumina προσαρμογείς, και επιλέχθηκαν 350-400bp προϊόντα. Τα προϊόντα επιλεγμένου μεγέθους ενισχύθηκαν με PCR, και κάθε δείγμα έχει επισημανθεί με ένα μοναδικό δείκτη κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Το τελικό προϊόν ελέγχθηκε με τη χρήση της Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

εμπλουτισμό πίνακα γονίδιο του καρκίνου και της αλληλουχίας

Το ενισχυμένο DNA συνελήφθη με ένα πάνελ αλληλουχίας βλαστικής σειράς περιέχουν 90 γονίδια ευαισθησίας στον καρκίνο (S1 πίνακα) με βάση την MyGenostics GenCap Εμπλουτισμός Technologies (MyGenostics, Βαλτιμόρη, MD, USA). Ο κατάλογος γονίδιο περιείχε 75 γονίδια κατεβάσει από το Cancer Gene Απογραφή (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/) και 15 επιπλέον γονίδια, όπως

AXIN2

και

BARD1

, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι γονίδια κίνδυνο καρκίνου [6-11]. Βιοτινυλιωμένα ανιχνευτές σχεδιάστηκαν να κεραμίδι κατά μήκος των περιοχών εξονίου και τα όρια εξονίου-ιντρονίου των γονιδίων-στόχων. Το πείραμα δέσμευσης διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg DNA βιβλιοθήκη αλληλούχισης αναμίχθηκε με Ρυθμιστικό BL και GenCap 90 όγκων πίνακα γονίδιο ανιχνευτή (MyGenostics) και θερμάνθηκε στους 95 ° C για 7 λεπτά και στη συνέχεια στους 65 ° C για 2 λεπτά σε έναν θερμικό κυκλοποιητή. Ρυθμιστικό ΗΥ (23 μί? MyGenostics) που έχει προθερμανθεί στους 65 ° C, προστέθηκε στο μίγμα και στη συνέχεια διατηρήθηκε στους 65 ° C με τη θερμότητα θερμικό κυκλοποιητή καπάκι του για 22 ώρες για υβριδισμό. σφαιρίδια MyOne (50 μι? Technology Life, Carlsbad, CA, USA) πλύθηκαν τρεις φορές σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης 1 × και επαναιωρήθηκαν σε 80 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης 1 ×. Κατά συνέπεια, 64 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης 2 χ προστέθηκε στο υβριδικό μίγμα, το οποίο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα σωληνάριο με 80 μι MyOne χάντρες. Το μίγμα περιστράφηκε για 1 ώρα σε περιστροφικό αναδευτήρα. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό WB1 σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά και τρεις φορές με WB3 ρυθμιστικό σε 65 ° C για 15 λεπτά. Το δεσμευμένο DNA εκλούσθηκε με Ρυθμιστικό Elute και ενισχύεται χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 98 ° C για 30 s (1 κύκλος)? 98 ° C για 25 s, 65 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s (15 κύκλοι)? και 72 ° C για 5 λεπτά (1 κύκλος). Το PCR προϊόν καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια SPRI (Beckman Coulter Genomics, Danvers, ΜΑ, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι βιβλιοθήκες εμπλουτισμού αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία σε ένα sequencer Illumina HiSeq 2000 για ζεύγη τέλος αλληλουχίας των 100-bp διαβάζει.

Η ανάλυση των δεδομένων και την παραλλαγή ερμηνεία

Μετά την αλληλούχιση του 2000, υψηλής ποιότητας HiSeq διαβάζει ανακτήθηκαν από τις πρώτες διαβάζει φιλτράροντας τις χαμηλής ποιότητας διαβάζει και αλληλουχιών προσαρμογέα χρησιμοποιώντας το πακέτο Solexa QA και το πρόγραμμα cutadapt (https://code.google.com/p/cutadapt/), αντίστοιχα. SOAPaligner (https://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html) χρησιμοποιήθηκε για να ευθυγραμμιστούν οι καθαρές σειρές ανάγνωσης στο hg19 γονιδίωμα αναφοράς του ανθρώπου. Τα αποτελέσματα αλληλούχισης συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Αφού οι PCR διπλότυπα απομακρύνθηκαν από το λογισμικό Picard (https://picard.sourceforge.net/), τα SNPs ταυτοποιήθηκαν αρχικά χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SOAPsnp. Η διαβάζει στη συνέχεια ευθυγραμμισμένο με το γονιδίωμα αναφοράς χρησιμοποιώντας BWA (https://bio-bwa.sourceforge.net/), και τα indels ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GATK (https://www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php /Home_Page). Οι προσδιορίζονται SNPs και indels σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα exome-βοηθός (https://122.228.158.106/exomeassistant). MagicViewer χρησιμοποιήθηκε για να δείτε τη σύντομη ανάγνωση ευθυγράμμιση και την επικύρωση των υποψήφιων SNPs και indels. Παραλλαγές αρχικά διηθούνται εάν εμφανίστηκε στη βάση δεδομένων γονιδιώματος Έργου 1000, στη βάση δεδομένων ESP6500 με μια μικρή κατώφλι συχνότητα αλληλόμορφου του & gt? 0,05, στη βάση δεδομένων dbSNP, και στην in-house βάση δεδομένων 300 ασιατική Genome [5]. Οι υπόλοιπες παραλλαγές υποβλήθηκαν σε περαιτέρω διαλογή χρησιμοποιώντας τον Κατάλογο Σωματικών Μεταλλάξεων Καρκίνου (COSMIC) της βάσης δεδομένων.

Για να ορίσετε την παθογένεια των παραλλαγών, αξιολογήσαμε όλες τις προσδιοριζόμενες παραλλαγές και indels σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ACMG [4]. Παραλλαγές ορίστηκαν ως δυνητικά παθογόνων εάν παρήγαγε ένα περικοπή κωδικόνιο, ένα κωδικόνιο έναρξης, ή ένα φαινόμενο δότη ματίσματος /αποδέκτη, ή αν η επίδραση επί της λειτουργίας των πρωτεϊνών που σχετίζονται με φαινότυπο ασθένειας που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Σε αντίθετη περίπτωση, η εσφαλμένου νοήματος, σιωπηλή, και ιντρονικές παραλλαγές ορίστηκαν ως παραλλαγές της αβέβαιης σημασίας (VU για). Η VU για αξιολογήθηκαν περαιτέρω από τρεις αλγόριθμους, δηλαδή, PROVEAN, κοσκινίστε και PolyPhen-2, να προβλεφθούν οι επιδράσεις στη λειτουργία της πρωτεΐνης [12-15].

Όλα τα δεδομένα αλληλουχίας (FASTQ) κατατέθηκαν στο SRA βάση δεδομένων του National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) με τους ακόλουθους αριθμούς πρόσβασης: SRR1563024, SRR1563027, SRR1563036, SRR1563037, SRR1563039 και SRR1563041. Ο Πίνακας 2 δείχνει μεμονωμένους ασθενείς και τους αντίστοιχους αριθμούς τους προσχώρηση SRA.

Η

Primer σχεδιασμός, ενίσχυση PCR, και Sanger αλληλούχισης

Τα κακώς καλύπτει περιοχές από NGS ενισχύθηκαν και επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger. Οι παραλλαγές που προσδιορίζονται από multiplex γενετικής αλληλουχίας επίσης επικυρωθεί με αλληλουχίας Sanger. Εν συντομία, οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Primer3 [16]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών για την επικύρωση παρατίθενται στον Πίνακα S2. Προσδιορίζονται παραλλαγές, συμπεριλαμβανομένων των

WRN

(c.4108DelA),

DICER1

(c.A3334G), και

ELAC2

(c.A248G), ενισχύθηκαν εις διπλούν από γονιδιακό DNA από τα έξι μέλη της οικογένειας με τη χρήση Hot DNA FirePol πολυμεράσης (Solis Βίοϋγηβ, Tartu, Εσθονία). αλληλουχίας Sanger έγινε με τη χρήση του Big Dye Terminator Kit Cycle Sequencing v1.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) και ΑΒΙ Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Αποτελέσματα

Κλινική χαρακτηριστικά

το πρόγονο που είναι ένα 55-year-old γυναίκα (Σχήμα 1, II: 1), ο οποίος είναι ο παλαιότερος από πέντε αδέλφια. Βίωσε κολπική αιμορραγία, και menorrhea της είχε σταματήσει σε ηλικία 48 ετών. Διακολπικό υπερηχογράφημα έδειξε μια παθολογική μάζα 8-mm στη δεξιά πλευρά της κοιλότητας της μήτρας. Απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) του πυελική κοιλότητα προτεινόμενες καρκίνο του ενδομητρίου, και ένα παγωμένο τμήμα της μάζας ήταν σύμφωνο με καρκίνο του ενδομητρίου. Υστερεκτομή έγινε, και το αποτέλεσμα της μετεγχειρητικής παθολογίας επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της μαγνητικής τομογραφίας. Ο ασθενής υποβλήθηκε σε θεραπεία με ακτινοβολία μετά από χειρουργική επέμβαση. Εκείνη δεν παρουσίασε σύμπτωμα υποτροπής ή μετάστασης όγκου 6 μήνες μετά την επέμβαση και συνεχίζει με την παρακολούθηση εξετάσεις κάθε 6 μήνες.

Η γενεαλογία των ατόμων με καρκίνο εκπροσωπείται από τους μαύρους κύκλους (αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα) και μια δικτυωμένη κύκλος (καρκίνος του ενδομητρίου). Μια γραμμή που διέρχεται από το σύμβολο υποδεικνύει ότι το πρόσωπο έχει αποβιώσει. Η κατάσταση μετάλλαξης του

WRN

,

DICER1

, και

ELAC2

παρουσιάζεται σε κάθε άτομο που υποβλήθηκε σε multiplex γενετικής αλληλουχίας. Ένα σύμβολο συν αντιπροσωπεύει ένα μεταλλαγμένο είδος, και ένα αρνητικό πρόσημο αντιπροσωπεύει ένα άγριου τύπου

Η

Η αδελφή του πρόγονο, ένα 50-year-old αγρότης και μη καπνιστή (Σχήμα 1, II: 2)., ήταν σε καλή υγεία μέχρι που γνώρισε τον βήχα wracking, πτύελα παραγωγής, και την αγωνία στο στήθος το 2012. αυτή υποβλήθηκε σε αξονική τομογραφία στην Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang. Η σάρωση αποκάλυψε πολλαπλές μάζες των διαφόρων μεγεθών που διανέμονται σε όλο το πνεύμονα και εντάθηκε διάχυτη λεμφικού διαπερατότητας. CT-καθοδηγούμενη διαδερμική βιοψία του πνεύμονα και ιστοπαθολογική εξέταση κατέδειξε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Ο βαθμός IV όγκος ήταν ακατάλληλο για χρήση? Έτσι, δέχτηκε συστηματική θεραπεία, η οποία περιελάμβανε τη χημειοθεραπεία και παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα. Ο ασθενής απεβίωσε τον Φεβρουάριο του 2014 στην ηλικία των 52 ετών

Η μητέρα του πρόγονο, μια 80-year-old αγρότης και μη καπνιστή (Σχήμα 1, Ι: 1)., Ήταν σε καλή κατάσταση υγείας. Στη φυσική εξέταση της, η οποία διεξήχθη το 2013, ακτινογραφία θώρακα αποκάλυψε ένα 5-cm phyma στο κάτω δεξιό πνεύμονα. Δεν άλλα συμπτώματα καταγράφηκαν. Για περαιτέρω διάγνωση και τη θεραπεία, υποβλήθηκε σε μια συνολική check-up, η οποία περιελάμβανε ένα στήθος και την κοιλιά αξονική τομογραφία, μαγνητική τομογραφία κεφάλι, και η εκπομπή των οστών αξονική τομογραφία στην Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο. Τα αποτελέσματα έδειξαν μετάσταση στα οστά στην τέταρτη και πέμπτη lumbalis σπόνδυλο. CT-καθοδηγούμενη διαδερμική βιοψία του πνεύμονα έγινε, και ιστοπαθολογική εξέταση κατέδειξε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Ο ασθενής δεν ήταν κατάλληλος υποψήφιος για χειρουργική θεραπεία. Σταμάτησε τη θεραπεία, λόγω της προχωρημένης ηλικίας και οικονομικών περιορισμών. Κατά την εξέταση παρακολούθησης διεξάγονται έξι μήνες μετά τη διάγνωση, παραμένει ζωντανός, αλλά ο βήχας της και τον πόνο των οστών έχουν επιδεινωθεί. τρεις νεότερες αδερφές του πρόγονο που εξακολουθούν να είναι υγιείς. Ο πατέρας τους είχε πεθάνει από ένα ατύχημα πριν από 30 χρόνια.

WRN

μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου

Το αναγνωρισμένο μυθιστόρημα

WRN

πλαισίου μετάλλαξη c.4108DelA (σελ. N1370Tfs * 23) μοιράστηκε μεταξύ της μητέρας (Ι: 1), πρόγονο (II: 1), δεύτερη αδελφή (II: 2), και νεότερος ανεπηρέαστη αδελφή (II: 5)? ωστόσο, είναι απούσα στις άλλες δύο αδελφές ανεπηρέαστες (II: 3 και ΙΙ: 4), όπως προσδιορίζεται με multiplex γενετικό έλεγχο (Πίνακας 2). Η

WRN

μετάλλαξη είχε ως αποτέλεσμα μια μετατόπιση πλαισίου που εισήγαγε ένα κωδικόνιο λήξης 23 αμινοξέων καθοδικά της μετάλλαξης στο εξόνιο 34, η οποία προβλέπεται για την παραγωγή ενός κόλουρου

WRN

πρωτεΐνη. Θα προβληθεί περαιτέρω το

WRN

μετάλλαξη σε μία ομάδα από 300 καταχωρήσεις σε σπίτι στη βάση δεδομένων της Ασίας Γονιδιώματος. Η c.4108DelA (N1370Tfs * 23) μετάλλαξη δεν βρέθηκε ποτέ σε υγιή άτομα. Η μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου του

WRN

ορίζεται ως δυνητικά παθογόνων, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ACMG. Όχι τυπική παρουσίαση του συνδρόμου Werner παρατηρήθηκε επειδή τα επιβλαβή

WRN

μεταλλάξεις είναι ετερόζυγη εντός της οριοθετημένης μέλη αυτής της οικογένειας.

Αναγνώριση των άλλων βλαστική μεταλλάξεις

Η παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη γ .A3334G (p.N1112D) του

DICER1

ταυτίστηκε τόσο τις ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, δηλαδή, το πληγέν μητέρα (Ι: 1) και η δεύτερη κόρη (II: 2)? Ωστόσο, ήταν απούσα στα άλλα μέλη της οικογένειας (Πίνακας 2). Η

ELAC2

μετάλλαξη c.A248G (p.Y83C) βρέθηκε σε όλα τα έξι μέλη της οικογένειας (Πίνακας 2).

DICER1

και

ELAC2

μεταλλάξεις ορίστηκαν ως τις VU, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ACMG. Για να διερευνήσουν περαιτέρω την επίδραση των προαναφερθέντων μεταλλάξεων βλαστικής σειράς στη λειτουργία της πρωτεΐνης, αναλύσαμε τέτοιες μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας την PROVEAN εργαλεία πρόβλεψης, κοσκινίστε και PolyPhen-2.

ELAC2

(p.Y83C) είχε προβλεφθεί να είναι επιβλαβής από PROVEAN, καταστρέφοντας από SIFT, και πιθανώς επιζήμια από PolyPhen-2.

DICER1

(N1112D) ορίστηκε ως ουδέτερη, ανεκτή, και καλοήθεις από PROVEAN, κοσκινίστε και PolyPhen-2, αντίστοιχα. Ο Πίνακας 3 παρουσιάζει τα αποτελέσματα πρόβλεψης.

Η

Εκκαθάριση των μεταλλάξεων βλαστικής σειράς του

WRN

,

DICER1

, και

ELAC2

Η

Πραγματοποιήσαμε αλληλουχίας Sanger στις εντοπίστηκαν μεταλλάξεις βλαστικής σειράς στο

WRN

,

DICER1

, και

ELAC2

. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης Sanger ήταν σύμφωνες με εκείνες των multiplex γενετικού ελέγχου (Σχήμα 2).

(Α) επικύρωση αλληλουχίας Sanger του

WRN

πλαισίου μετάλλαξη σε κάθε άτομο. Τα ευθυγραμμισμένα NGS δεδομένα του

WRN

μετάλλαξη από το μητρικό (Ι: 1). Η

WRN

πλαισίου μετάλλαξη παρουσίασε ένα 1-bp διαγραφή στο CHR8: 31.024.663. Οι βάσεις μετά από Α σε κόκκινο χρώμα, και το A → C σημειακή μετάλλαξη σε CHR8: 31024666 παρουσιάζεται στο μπλε. Η

WRN

πλαισίου μετάλλαξη c.4108DelA (p.N1370Tfs * 23) ελέγχθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger στη μητέρα (Ι: 1), η πρόγονο (II: 1), η δεύτερη κόρη (II: 2) , και η μικρότερη κόρη (II: 5)? Ωστόσο, ήταν απούσα στις άλλες δύο κόρες (II: 3 και ΙΙ: 4). (Β) Το

DICER1

παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη c.A3334G (p.N1112D) ελέγχθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger στη μητέρα (Ι: 1) και η δεύτερη κόρη (II: 2), αλλά ήταν απούσα στο άλλα μέλη αυτής της οικογένειας. (Γ) Η

ELAC2

μετάλλαξη c.A248G (p.Y83C) ελέγχθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger σε όλα τα μέλη αυτής της οικογένειας.

Η

Συζήτηση

Multiplex γενετικός έλεγχος συνδυάζει επιλεκτική γονίδια σύλληψη και μαζική παράλληλη αλληλουχίας. Διευκολύνει αποτελεσματικά ταυτόχρονη γενετική ανάλυση ενός μεγάλου αριθμού υποψηφίων γονιδίων. Σε σύγκριση με την παραδοσιακή βαθμηδόν γονίδιο-προς-γονίδιο ανίχνευσης με αλληλούχιση Sanger, qPCR, ή φασματομετρία μάζας νουκλεοτιδίου, η σημαντική μείωση του κόστους της αλληλουχίας του DNA καθιστά multiplex γενετικές αναλύσεις μια αποδοτική και οικονομικά συμφέρουσα προσέγγιση. Multiplex γενετικός έλεγχος έχει εφαρμοστεί στην κλινική γενετική του καρκίνου από το 2012 [17, 18]. Πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες έχουν αποδείξει σθεναρά την κλινική εφαρμογή των multiplex γενετικού ελέγχου στην κληρονομική αξιολόγηση του κινδύνου καρκίνου του [19-21]. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε ένα νέο

WRN

πλαισίου μετάλλαξη σε τρεις ασθενείς με καρκίνο και ανεπηρέαστο μέλος της οικογένειας χρησιμοποιώντας πολλαπλή δοκιμή.

WRN

, μέλος της ρεκομπινάσης Q οικογένεια των ελικασών, παίζει σημαντικό ρόλο στη λειτουργία επιδιόρθωσης του DNA, συμπεριλαμβανομένης της προστασίας του γονιδιώματος από ανώμαλη ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια του χρωμοσώματος του διαχωρισμού σε μίτωση και τη διατήρηση της σταθερότητας γονιδιωματική [22]. Ελλείψεις σε

WRN

να προκαλέσει το σύνδρομο Werner, το οποίο είναι ένα σπάνιο αυτοσωματικό υπολειπόμενο διαταραχή που χαρακτηρίζεται από την πρόωρη γήρανση και την ευαισθησία του καρκίνου [23-26]. Όλες οι μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν στο

WRN

προβλέπεται να περικόψει το

WRN

πρωτεΐνη, με την απώλεια του σήματος πυρηνικού εντοπισμού (NLS) στην C-τελική περιοχή (αα 1370-1375)? Επιπλέον, το μεταλλαγμένο

WRN

πρωτεΐνη δεν μπορεί να μεταφερθεί προς τον πυρήνα [27]. Μειωμένη πυρηνικής εισαγωγής είναι πιθανώς ένας σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει στη μοριακή παθολογία του συνδρόμου Werner. Σε αυτή τη μελέτη, αναγνωρίσαμε μια ετερόζυγη μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου (p.N1370Tfs * 23) στην NLS του

WRN

Ο-τερματικό πεδίο. In vitro ανάλυση επιβεβαίωσε ότι οι κυτταρικές σειρές από το

WRN

ετερόζυγα άτομα περιέχουν μειωμένα

WRN

πρωτεΐνη έκφρασης και μειωμένη δραστηριότητα ελικάσης [28].

WRN

δραστηριότητα ελικάσης απαιτείται για την επισκευή του DNA μεταξύ σκέλος διασυνδέσεις (ICLs) στα κύτταρα, και

WRN

συνεργάζεται με

BRCA1

452 έως 1079 στην κυτταρική απόκριση DNA ICLs [29]. Παρά το γεγονός ότι το

WRN

ετεροζυγώτες αποτέλεσμα που προκύπτει από απλοανεπάρκεια υποτίθεται ότι πρέπει να συνδέεται με

WRN

παθογένεια, αυτή η υπόθεση πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

DICER1

, ένα σημαντικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, είναι ένα ενδοριβονουκλεάσης που είναι σημαντικό για τη δημιουργία microRNAs και σύντομης παρεμβολής RNAs [30]. Οι φορείς του

DICER1

μετάλλαξη βλαστικής σειράς έχουν βρεθεί να είναι σε κίνδυνο για σύνδρομο πλειοτροπικές προδιάθεση όγκου [31-33]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τόσο η μητέρα και η δεύτερη κόρη είχε καρκίνο του πνεύμονα, το οποίο παρουσιάζει συνήθως με γενετικές παραλλαγές στο

DICER1

. Η τάση δείχνει ότι

DICER1

μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην πνευμονική καρκινογένεση. Περαιτέρω λειτουργικές μελέτες μπορεί να διευκρινίσει το μηχανισμό του

DICER1

στον καρκίνο του πνεύμονα. Η εντοπίστηκαν

ELAC2

παραλλαγή c.248A & gt? G συμβαίνει εντός τριών νουκλεοτιδίων ενός κόμβου σύνδεσης (Εσώνιο 1 /exon2) και μπορούν να επηρεάσουν το γονίδιο μάτισμα. Η περιοχή κωδικοποίησης του

ELAC2

αποτελείται από 826 αμινοξέα μιας υδρολάσης μέταλλο εξάρτηση, και αυτό το γονίδιο είναι το γονίδιο ευαισθησίας για οικογενή κληρονομικό καρκίνο του προστάτη [34]. Άλλες μελέτες επίσης διαπίστωσαν ότι ο γονότυπος του

ELAC2

συνδέεται με υψηλό κίνδυνο σποραδικό καρκίνο του προστάτη [35, 36].

Multiplex γενετικό έλεγχο των 90 γονιδίων καρκίνου προδιάθεση θα παράγει γενετικές παραλλαγές αβέβαιη κλινική σημασία, τα οποία αναφέρονται ως τυχαία ευρήματα (IF). Για

DICER1

και

ELAC2

, δεν μπορούμε να αξιολογήσει άμεσα εάν οι εντοπίστηκαν μεταλλάξεις απουσίας επηρεάσει τη λειτουργία της προκύπτουσας πρωτεΐνης. Παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιείται υπολογιστικά εργαλεία όπως PROVEAN, κοσκινίστε και PolyPhen-2 για να προβλεφθεί αν οι προσδιορίζονται αμινοξέα αλλαγές μπορεί να είναι λειτουργικά σημαντική, δεν χρησιμοποιήθηκε άμεση λειτουργική δοκιμασία. Η ACMG δημοσίευσε πρόσφατα τις συστάσεις για την αναφορά ΑΝ προέρχονται από WGS και WES σε κλινικές και ερευνητικές δοκιμές [37]. Χρησιμοποιήσαμε τις κατευθυντήριες γραμμές ACMG να καθορίσει τις μεταλλάξεις του

DICER1

και

ELAC2

σαν σε αυτή τη μελέτη. συστάσεις ACMG πρέπει να ακολουθούνται για multiplex γενετικό έλεγχο στην κλινική ογκολογία. Ενημέρωσε συναίνεση είναι πολύ σημαντική σε γενετικό έλεγχο NGS-based χρησιμοποιούνται στην κλινική ογκολογία. Η Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας (ASCO), περιέγραψε τα βασικά στοιχεία του εν επιγνώσει συναίνεση για γενετικές εξετάσεις χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση του κινδύνου του καρκίνου. Επιπλέον, πληροφορίες σχετικά με το απόρρητο των δεδομένων, η ασφάλεια των δεδομένων, εργαστηριακών δοκιμών licensure, τη διαθεσιμότητα των γενετικών συμβουλών ή καρκίνο αξιολόγηση γενετικού κινδύνου, και κάθε πιθανότητα μελλοντικής χρήσης των δειγμάτων DNA πρέπει να ενσωματωθεί εν επιγνώσει συναίνεση [38, 39].

Multiplex γενετικές εξετάσεις με επιτυχία καθορίζει τις σπάνιες παραλλαγές γονιδίων ευαισθησίας του καρκίνου σε αυτή τη μελέτη. Ωστόσο, διεισδυτικότητα εκτιμήσεις για τέτοιες παραλλαγές παραμένουν αβέβαιες. Η μελέτη μας έχει ορισμένους περιορισμούς. Τα 90 γονίδια του καρκίνου επιλέχθηκαν από τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία? Ωστόσο, η βέλτιστη πάνελ πολλαπλών γονιδίων για κλινική χρήση ογκολογία παραμένει να καθοριστεί. Χωρίς μια άμεση λειτουργική δοκιμασία, η κλινική επίπτωση του καθορίζει τις σπάνιες παραλλαγές δεν μπορεί να προβλεφθεί? Ως εκ τούτου, μπορεί να μην είναι κατάλληλη για να χρησιμοποιήσει τα αποτελέσματα για να καθοδηγήσει τη διαχείριση των ασθενών. Επιπλέον, το αποτέλεσμα της μικρότερης κόρης με το

WRN

μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου απαιτεί παρακολούθηση. Αν και περισσότερο σε βάθος μελέτες δικαιολογείται να καθοδηγήσουν κλινική πρακτική, η μελέτη μας δείχνει μια πρώιμη ένδειξη για την κλινική συσχέτιση των multiplex γενετικών δοκιμών και αναδεικνύει τα δύο πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της γονιδιωματικής ανάλυσης μεγάλης κλίμακας στην αξιολόγηση του καρκίνου του κινδύνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1. γονίδια κίνδυνο καρκίνου από το Cancer Gene Απογραφή

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133020.s001

(XLSX)

S2 πίνακα. Αλληλουχίες εκκινητή για την επικύρωση από αλληλουχίας Sanger

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133020.s002

(XLSX)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τους ασθενείς και τους οικογένειες για τη συνεργασία τους στη μελέτη. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Jian Wu για τη συμβολή του στην εκτέλεση της ανάλυσης πειράματα και τα δεδομένα.