Αφηρημένο

Ιστορικό

Η απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ (ApoA- II) ρυθμίζεται προς τα κάτω στους ορούς παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) ασθενείς, που μπορεί να οφείλεται στην αύξηση της χρησιμοποίησης υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (HDL) λιπιδίων με παγκρεατικό καρκινικό ιστό. Αυτή η μελέτη εξέτασε την επίδραση εξωγενών ΑροΑ-II για την πρόσληψη λιπιδίων και την ανάπτυξη των κυττάρων στον καρκίνο του παγκρέατος (PC) και

in vitro

και

in vivo

.

Μέθοδοι

Η Cryo μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM) εξέτασαν την επιρροή ΑροΑ-II για τη μορφολογία του γαλακτώματος Smoflipid. Η επίδραση της ΑροΑ-ΙΙ στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προσδιορίστηκε με επώαση αυτών με λιπίδιο +/- ΑροΑ-ΙΙ και αντι-SR-Β1. Lipid σημάνθηκε με το φθοροφόρο, έκανε, για την ανίχνευση της πρόσληψης λιπιδίων με καρκινικά κύτταρα

in vitro

με συνεστιακή μικροσκοπία και

in vivo

σε PDAC ασθενή που προέρχεται ξενομοσχεύματος όγκοι (PDXT) με απεικόνιση φθορισμού. κλάση υποδοχέων Scavenger Β τύπου 1 (SR-Β1) έκφραση σε κυτταρικές σειρές PDAC και PDAC PDXT μετρήθηκε με κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

ΑροΑ-ΙΙ μετατρέπεται αυθόρμητα λιπιδίων γαλάκτωμα σε πολύ μικρά μονοελασματοειδή rHDL σαν κυστίδια (rHDL /Α-ΙΙ) και αυξημένη πρόσληψη λιπιδίων σε PANC-1, CFPAC-1 και πρωτογενή καρκινικά κύτταρα όπως φαίνεται με ομοεστιακό μικροσκόπιο. έκφραση SR-B1 ήταν 13,2, 10,6, 3,1 και 2,3 φορές υψηλότερη σε κυτταρικές γραμμές από την κανονική κυτταρική γραμμή του παγκρέατος (HPDE6) και 3,7 φορές μεγαλύτερη σε PDAC ιστό σε σχέση με το κανονικό πάγκρεας PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 και BxPC3 . ΑροΑ-ΙΙ συν λιπιδίων αύξησε σημαντικά την πρόσληψη του επισημασμένου λιπιδίων και προωθούνται κυτταρικής ανάπτυξης σε PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 και κύτταρα BxPC3 που ανεστάλη από αντίσωμα αντι SR-Β1. Περαιτέρω, ΑροΑ-ΙΙ αύξησε την πρόσληψη των λιπιδίων σε ξενομοσχεύματα κατά 3,4 φορές.

Συμπέρασμα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι ΑροΑ-ΙΙ ενισχύσει το δυναμικό της στόχευσης των λιπιδίων στον καρκίνο του παγκρέατος, που μπορεί να έχουν απεικόνισης και τα ναρκωτικά δυνατότητες παράδοσης

Παράθεση:. Julovi SM, Xue Α, Thanh LE TN, Gill AJ, Bulanadi JC, Patel M, et al. (2016) Η απολιποπρωτεΐνη Α-II Plus λιπιδικό γαλάκτωμα ενισχύσουν την αύξηση κυττάρων μέσω SR-Β1 και Target καρκίνο του παγκρέατος

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151475. doi: 10.1371 /journal.pone.0151475

Επιμέλεια: Yingmei Feng, Πεκίνο Βασικά Εργαστήριο Πρόληψης Διαβήτη και Έρευνας, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 3, Σεπτεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 29, Φεβ του 2016? Δημοσιεύθηκε: 22 του Μάρτη του 2016

Copyright: © 2016 Julovi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και Υποστήριξη Πληροφορίες αρχείου

της

Χρηματοδότηση: Μέρος αυτής της μελέτης παρουσιάστηκε και βραβεύτηκε ως καλύτερη αφίσα στο New Horizons το 2014 και Επιστημονικής Έρευνας Συνέλευσης, Νοέμβριος 17 – 19, 2014. η μελέτη αυτή δεν έχει έχουν δημοσιευθεί αλλού ή δεν είναι υπό εξέταση για δημοσίευση. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το ίδρυμα CanSur και εν μέρει από το Ramsay Ταμείο Έρευνας διδασκαλίας αλλά δεν έχουν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Εμπορική υπαγωγή των συντακτών της κατά CSIRO δεν παίζουν κανένα ρόλο στη μελέτη και δεν έχει κανένα ανταγωνιστικά συμφέροντα που σχετίζονται με την απασχόληση, την παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη και εμπορία προϊόντων

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δεν έχουν σύγκρουσης συμφερόντων. Εμπορική υπαγωγή των συντακτών της κατά CSIRO δεν παίζουν κανένα ρόλο στη μελέτη και δεν έχει κανένα ανταγωνιστικά συμφέροντα που σχετίζονται με την απασχόληση, την παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη και την εμπορία των προϊόντων.

Εισαγωγή

Ορός απολιποπρωτεΐνη α-ΙΙ (ΑροΑ-ΙΙ) βρέθηκε να είναι καταθλιπτικοί σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος και ήταν ένας δυνητικός διαγνωστικός βιοδείκτης [1]. Το έργο αυτό έχει επιβεβαιωθεί από την Honda και οι συνεργάτες του [2] και άλλοι [3]. ΑροΑ-ΙΙ είναι ένα συστατικό της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL), όπου έχει ένα σημαντικό ρόλο στην κατεύθυνση της τύχης του μεταβολισμού του λιπιδίου στην HDL. Το πιο σημαντικό ρόλο για την HDL είναι η παράδοση της χοληστερόλης από τους περιφερειακούς ιστούς στο ήπαρ όπου μεταβολίζεται σε χολικά άλατα ή απεκκρίνεται στη χολή. Ο τύπος-1 υποδοχέα καθαριστή κατηγορίας Β (SR-Β1) είναι διαδεδομένη σε ηπατοκύτταρα και προσελκύει HDL, όπου το λιπίδιο ενδοκυτταρώνεται [4, 5], ή διαχέεται [6, 7] στα ηπατοκύτταρα.

SR-Β1 είναι ένας υποδοχέας πολλαπλών συνδετήρα και εντόνως εκφρασμένο σε μία ποικιλία κυττάρων όγκου συμπεριλαμβανομένων του προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [8]. Η λιποπρωτεΐνη στην επιφάνεια των HDL συνδέεται προς SR-Β1 παραδίδει λιπιδίων του μέσα στο κύτταρο μέσω ενός πόρου που σχηματίζεται από SR-B1 αυξάνοντας την πρόσληψη της HDL-χοληστερυλεστέρα (CE) [9], ένα απαραίτητο θρεπτικό συστατικό για κακοήθη πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετάσταση [10, 11]. Τριάντα τοις εκατό των HDL συνδέεται με ΑροΑ-ΙΙ η οποία πιστεύεται ότι κάνει την HDL μικρότερη από εκείνη με ΑροΑ-Ι μόνη και καθιστά την HDL /ΑροΑ-ΙΙ λιγότερο έλκονται από την ηπατική SR-B1 [12]. Επιπλέον, ΑροΑ-ΙΙ διατηρεί τα επίπεδα της HDL εν μέρει από την αναστολή της ηπατικής λιπάσης [13]. Αυτά τα αποτελέσματα σε ένα σχετικά μεγαλύτερο χρονικό διάστημα κυκλοφορίας για HDL /ΑροΑ-ΙΙ. ΑροΑ-ΙΙ μεταβάλλει πρόσδεση της HDL σε SR-B1 σε διαφορετικούς ιστούς και είναι ιδιαίτερα έλκονται στερεοειδογόνο ιστό [14], όπου η χοληστερίνη χρησιμοποιείται για τη σύνθεση ορμονών αλλά ταχέως αναπτυσσόμενων καρκινικών κυττάρων απαιτούν επίσης τη χοληστερόλη για κυτταρικές μεμβράνες [15]. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν αυξημένη έκφραση του SR-B1in σχέση με την έκφραση σε μη-κακοήθη κύτταρα προέλευσής τους [16, 17] και είναι πιθανό ότι αυτό έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη πρόσληψη της HDL από τον καρκινικό ιστό η οποία είναι μια εξήγηση για τη μείωση στον ορό ΑροΑ-ΙΙ σε PDAC περιπτώσεων [1-3]. Είναι ενδιαφέρον ότι ο καρκίνος του παγκρέατος δεν συσσωρεύεται φθοριοδεοξυγλυκόζη (FDG) είναι αρκετά ισχυρά για να είναι αξιόπιστη ως παράγοντας αντίθεσης για την Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίων (PET) [18], η οποία πιθανώς υποδεικνύει ότι ο καρκίνος του παγκρέατος έχει μια προτίμηση για λιπιδίων ως κύρια πηγή θερμίδων της [19]. Αν λιπίδιο είναι η κύρια πηγή ενέργειας για παγκρεατικό καρκινικό ιστό είναι πιθανό ότι HDL αποτελεί σημαντική πηγή αυτού του λιπιδίου. μεταβολισμός ενέργειας των κυττάρων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση συγκρότημα [20, 21]. Ο ρόλος του μεταβολισμού της χοληστερόλης στη διαδικασία της καρκινογένεσης Αναφέρεται επίσης [22-24] .Cancer και άλλα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα απαιτούν χοληστερίνη και τα άλλα συστατικά της μεμβράνης για τη βελτιστοποίηση της ανάπτυξης [25]. Οι HDLs ενοχοποιηθεί για την παράδοση της χοληστερόλης σε ορισμένες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [26], τον καρκίνο των ωοθηκών [8], του φλοιού των επινεφριδίων όγκους [27] και του καρκίνου του προστάτη. [28] Είναι πιθανό ότι ο καρκίνος του παγκρέατος είναι επίσης αχόρταγα utilsing HDL.

Η υπόθεση εξετάστηκε σε αυτό το έγγραφο είναι ότι οι ΑροΑ-ΙΙ θα επισπεύσει την πρόσληψη λιπιδίων σε παγκρεατικό καρκινικό ιστό και έτσι θα αυξήσει την ανάπτυξη των κυττάρων. Περαιτέρω, υποθέτουμε ότι το επίπεδο της έκφρασης του SR-B1 θα συσχετίζεται με την πρόσληψη λιπιδίων από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και θα είναι μεγαλύτερη από εκείνη του φυσιολογικού ιστού.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρων πολιτισμό

PANC-1, MIAPaCa-2, BxPC3 και CFPAC-1 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ήταν δώρα από τον καθηγητή Barry Allen (Αγίου Γεωργίου Νοσοκομείο, NSW, Australia), και φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά παγκρεατικού πόρου (HPDE6) κύτταρα [29] ήταν από τον Δρ Κρις Scarlett (Σχολή Περιβάλλοντος & amp? Επιστημών ζωής, Πανεπιστήμιο του Newcastle, NSW, Αυστραλία). Α549 πνεύμονα καρκίνου κυτταρική γραμμή, κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού T47D και MCF7 ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή Ross Davey (Kölling Ινστιτούτο Ιατρικών Ερευνών, το Royal North Shore Νοσοκομείο, NSW, Αυστραλία). PC3 καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή παρασχέθηκε ευγενώς από τον Καθ Qihan Dong (Κεντρική Κλινική Σχολή, Ινστιτούτο Bosch, το Πανεπιστήμιο του Sydney, NSW, Αυστραλία). Εκτός κυτταρική γραμμή HPDE6, όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC. Οι κυτταρικές σειρές ήταν δακτυλογραφημένες με μικρή διαδοχική επανάληψη προφίλ και σύμφωνη με τα πρότυπα αναφοράς ATCC (CellBank, Westmead, NSW, Αυστραλία). BxPC3, CFPAC-1, Α549, κυτταρικές σειρές T47D και MCF7 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640, PANC-1 και MIAPaCa-2 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) και τα κύτταρα PC3 προστάτη καλλιεργήθηκαν σε F-12K (Gibco, BRL) με 10% FBS, που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? ICN, Aurora, ΟΗ) σε 75 cm

2 φιάλες στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. κύτταρα HPDE6 καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων (KSF) μέσο ελεύθερο ορού συμπληρώνεται από επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδών (Life Technologies, Inc., Grand Island, Νέα Υόρκη).

Πρωτοβάθμια πολιτισμό

Ανθρώπινο δείγματα του παγκρέατος όγκου ελήφθησαν στο Royal North Shore Νοσοκομείο (Σύδνεϋ, Αυστραλία), με ενημέρωσε τη γραπτή συγκατάθεσή τους, ακολουθώντας τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την Τοπική υγειονομική περιφέρεια της Βορείου Σίδνεϊ Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής (NSLHD HREC) (αριθμός πρωτοκόλλου: 0909-227M, Σίδνεϊ , Αυστραλία). καλλιέργειες πρωτογενών κυττάρων όγκου καθορίστηκαν με ανάπτυξη εκφυτεύματος μικρών θραυσμάτων (≈1 mm) αποκόπηκαν από τους ιστούς όγκων PDAC, τοποθετήθηκαν σε ϋΜΕΜ (ρΗ 7,4) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS με 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Οι καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν μετά τη διέλευση 3 για να αποφευχθεί η μόλυνση από υπολειπόμενα από τα μακροφάγα [30]. Όλες οι καλλιέργειες συνελέγησαν υπό ταυτόσημες συνθήκες ανάπτυξης και ορό. Χρησιμοποιήσαμε 24 ώρες τα κύτταρα στερούνται ορού για πειράματα για να αποφύγετε την έκφραση του πρώιμου γονιδίου που προκαλείται από τον ορό.

Επισήμανση των SMOF λιπιδίων με το φθοροφόρο DiD

Το λιπιδικό γαλάκτωμα SMOF που περιέχει έλαιο σόγιας, μέσης αλύσου τριγλυκεριδίων, ελαιόλαδο και ιχθυέλαιο {www.tga.gov.au/pdf/auspar/auspar-smoflipid.pdf}, και χρησιμοποιείται για την ενδοφλέβια διατροφή, χρησιμοποιήθηκε στα πειράματά μας μετά από σήμανση με ένα 0,05% λιπόφιλο ιχνηθέτη φθοροφόρο, έκανε , (DiD307, Invitrogen, Carlsbad, CA). Το λιπίδιο γαλάκτωμα SMOF ξηράνθηκε υπό περιστροφικό εξατμιστή, λυοφιλιωμένο πριν από την ανάμειξη καλά με DiD λιπίδιο σε ένα αιθανολικό διάλυμα. Η αιθανόλη τελικά εξατμίζεται και το απομένον λιπιδικό υμένιο ενυδατώθηκε με προσθήκη στείρου ύδατος Baxter να προβεί στην τελική συγκέντρωση στο 20% Smoflipid, ακολουθούμενη από σκληρές στροβιλισμό και 30 λεπτά υπερήχων ομογενοποίηση λουτρό.

Συλλογή και καθαρισμός της ΑροΑ -II

ΑροΑ-ΙΙ καθαρίστηκε όπως περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες [31-33]. HDLs είχαν ultracentrifugally απομονώνονται από ομαδοποιημένα δείγματα φυσιολογικού ανθρώπινου πλάσματος (1.063 & lt? Ά & lt? 1,21 g /ml) και απολιπιδωμένο. Το προκύπτον apoHDL υποβλήθηκε σε χρωματογραφία επί στήλης ταχείας ροής Q-Speharose συνδεδεμένη σε ένα σύστημα FPLC Akta (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buck, UK). Κλάσματα που περιέχουν ΑροΑ-ΙΙ συνενώθηκαν και καθαρότητα ελέγχθηκε με SDS-PAGE και χρώση Coommassie, η οποία αποκάλυψε μια μοναδική ζώνη. Τα συγκεντρωμένα δείγματα ήταν λυοφιλιωμένο, ανασυσταθεί με 3 Μ γουανιδίνη υδροχλωρική /10 mM Tris /0.01% (β /ο) ΕϋΤΑ-Ν &

2, και υποβάλλεται σε διαπίδυση σε PBS άνευ ενδοτοξίνης πριν την χρήση.

Κυττάρων πολλαπλασιασμός δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτελέστηκε σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και ποσοτικά με τον ποσοτικό προσδιορισμό ιώδες κρύσταλλο, όπως περιγράφεται στην προηγουμένως [34], όπου ο ποσοτικός προσδιορισμός ΜΤΤ δεν είναι κατάλληλο σε κύτταρα κατεργασμένα λιπιδίων [35]. 4 × 10

4 κύτταρα /ml κύτταρα σπάρθηκαν σε ενενήντα έξι φρεατίων μικροπλάκες, για όλες τις κυτταρικές σειρές εκτός από PANC-1 και MIAPaCa-2 όπου 2×10

4 κύτταρα /ml σπάρθηκαν σε έναν τελικό όγκο 200 μΙ. Χωρίς ορό κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς Smoflipid (λιπίδιο) μόνο, ΑροΑ-ΙΙ μόνο και ή σε συνδυασμό σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και επωάστηκαν για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. Για να δοκιμαστεί η επίδραση του SR-B1, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αντι SR-B1 (2,5μg /ml) για 2 ώρες και πλύθηκε με media 3 φορές για 5 λεπτά η κάθε μία. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς λιπίδιο συν ΑροΑ-ΙΙ για 48 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκαν και βάφονται με 1 μg /ml κρυσταλλικό ιώδες (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σε διάλυση σε 25% μεθανόλη (ν /ν) και 75% απεσταγμένο νερό (ν /ν). Bound κρυσταλλικό ιώδες διαλυτοποιήθηκε με 0,1% νάτριο-δωδεκυλο-θειικό (SDS) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Η οπτική πυκνότητα εκάστου φρεατίου προσδιορίστηκε σε μήκος κύματος 550 nm. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχέση με το μάρτυρα. Βρήκαμε ότι 1:30 αραίωση του λιπιδίου και 50 μg /ml της ΑροΑ-ΙΙ ήταν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις στις 48 ώρες και αυτός ο όρος χρησιμοποιείται στην επακόλουθη μελέτη.

ανοσοαποτύπωσης

ανάλυση ανοσοστυπώματος διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1]. Εν συντομία, 4 x10

5 κύτταρα της κάθε κυτταρικής γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Το πρωτεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν κουνελιού αντι- SR-B1 (Novus Biologicals, Littleton, USA). Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε με το σύστημα ανίχνευσης ηλεκτροχημικοφωτεινότητα (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Αντι-ανθρώπινης β-ακτίνης αντίσωμα που περιλαμβάνονται στην ομαλοποίηση έναντι άνισης φόρτωσης.

Ομοεστιακή μικροσκόπιο

Η πρόσληψη του Smoflipid επισημαίνονται με έκανε ερευνήθηκε από ομοεστιακό μικροσκόπιο. Εν συντομία, 1×10

5 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν στις 8 διαφάνειες φρεάτιο καλλιέργειας (BD Falcon, Βϋ Bioscience) για όλη τη νύχτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με επισημασμένο με λιπίδιο DiD βαφή στις 1:30 αραίωση με ή χωρίς ΑροΑ-ΙΙ για 48 ώρες. Σε μερικά πειράματα τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με το1Η: 40, 1:30 και 1:10 αραιώσεις του μη επισημασμένου Smoflipid και αντι SR-Β1 σε (2,5 μg /ml) για 2 ώρες, πλύθηκαν με μέσο ελεύθερο ορού και επωάστηκαν με το λιπίδιο συν ΑροΑ-ΙΙ για 48 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη (Univar, Redmond, WA, USA), περατά με 0,3% Tween 20 (Sigma Aldrich, Castle Hills, NSW, Australia) και επωάστηκαν με ή χωρίς πρωτογενές αντίσωμα, γίδινο αντι-ανθρώπινης ΑροΑ-ΙΙ ( Abcam, Abcam Inc., ΜΑ, USA) για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με πράσινο flurophore συζευγμένο ισότυπου δευτερεύον αντίσωμα (AlexaFlour

Α488 γαϊδάρου αντι κατσίκας IgG (h + L) (Invitrogen, Carlsbad, CA) για άλλη 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. τα κύτταρα τοποθετήθηκαν με μέσα γλυκερίνης με DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) και την κυτταρική πρόσληψη εξετάστηκε κάτω από την Leica Ομοεστιακή Μικροσκοπίας (Leica, Tokyo, Japan).

Για την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, 1×10

5 κύτταρα /και σπάρθηκαν σε μ- Slide 4 και IBI Αντιμετωπίστε Μικροσκοπίας Επιμελητηρίου (ibidi GmbH, Martinsried, Γερμανία) για τη διάρκεια της νύχτας και να αντιμετωπίζονται με λιπίδια επισημαίνονται με DiD χρωστική στο 1:20 και 1:10 αραίωση με ή χωρίς ApoA- II για 24 ώρες. Cellular πρόσληψη εξετάστηκε κάτω από την Leica Ομοεστιακή Μικροσκοπίας (Leica, Tokyo, Japan). Lipid ένταση πρόσληψη ποσοτικοποιήθηκε από την Leica Microsystem LAS AF (GmbH, Mannheim, Germany) και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχετική ένταση.

Cryo μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (ΤΕΜ)

Ένα σύστημα υαλοποίηση υγρασία ελεγχόμενες εργαστηριακές κατασκευής χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των δειγμάτων για Cryo-ΤΕΜ. Υγρασία κρατήθηκε κοντά στο 80% για όλα τα πειράματα και η θερμοκρασία περιβάλλοντος ήταν ~ 22 ° C. Ένα κλάσμα 4 μΐ του δείγματος μεταφέρθηκε με πιπέττα σε ένα πλέγμα χαλκού 300 mesh επικαλυμμένα με υμένιο δαντελωτές Formvar-άνθρακα (Pro-SciTech, Thuringowa, Queensland). Μετά από 30 s χρόνος προσρόφησης, το πλέγμα στυπώθηκε χειροκίνητα χρησιμοποιώντας Whatman 541 διηθητικό χαρτί, για μεταξύ 2 και 10 s. Το πλέγμα στη συνέχεια βυθίστηκε σε υγρό αιθάνιο ψύχονται με υγρό άζωτο. Κατεψυγμένα πλέγματα αποθηκεύθηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι να εξεταστούν. Τα δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Gatan 626 cryoholder (Gatan, Pleasanton, CA, USA) και ένα Tecnai 12 μικροσκόπιο εκπομπής ηλεκτρονίων (FEI, Eindhoven, Ολλανδία) σε τάση λειτουργίας των 120 kV, εξοπλισμένο με CCD FEI Eagle 4k × 4k (FEI, Αϊντχόβεν, Κάτω Χώρες). Τα δείγματα παρατηρήθηκαν σε 100 000-150 000 φορές μεγέθυνση.

Gel ηλεκτροφόρηση

Ένα υδατικό 0,5% m /m γέλη αγαρόζης παρασκευάστηκε και βυθίστηκε σε 1 χ ΤΒΕ (ρυθμιστικό Tris-βορικό-ΕϋΤΑ , που παρασκευάζεται με αραίωση 10χ στοκ διαλυμάτων, ρΗ 9) ρυθμιστικό διάλυμα [36, 37], τρέχει σε ένα οριζόντιο σύστημα ηλεκτροφορήσεως (Mini-Sub κυττάρων GT, Biorad, απόσταση ηλεκτροδίων 15 cm) για 45 λεπτά σε 90 εικόνες V. Gel ελήφθησαν με ένα Carestream μΙ σε μήκος κύματος 650 nm διέγερση και 700 nm εκπομπή.

ΑροΑ-ΙΙ συν ανασυστάθηκε με την επώαση 2 μΙ ΑροΑ-II (2mg /ml) και 2 μΙ επισημασμένου Smoflipid λιπιδίων (10 mg /ml) στους 37 ° C για 24 ώρες. Πριν από τη φόρτωση της γέλης με το δείγμα, το κάθε δείγμα αραιώθηκε στο 1: 5 σε PBS (ρΗ 7.4) και προστίθενται 2 μΙ διαλύματος βαφής φόρτωσης 6Χ (# R0611, Fermentas, Science Ζωής) περιέχουν 10mM Tris-HCl (ρΗ 7.6), 0,03% μπλε βρωμοφαινόλης, 0.03% ξυλόλιο κυανόλη FF, το 60% ρυθμιστικό EDTA 60mM γλυκερόλη. 12 μΐ δείγματος φορτώθηκαν σε κάθε φρεάτιο της γέλης. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου.

Δημιουργία PDAC ξενομοσχεύματος ασθενής προέρχεται όγκου (PDTX) σε μη-παχύσαρκους διαβητικούς /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID)

Όλα τα πειράματα σε ζώα ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Βόρειας Σίδνεϊ Τοπικό Διαμέρισμα Υγείας (NSLHD) Επιτροπή Δεοντολογίας των ζώων σε αυτή τη μελέτη και στεγάζεται στο Kearns εγκατάσταση, Kölling Ινστιτούτο Ιατρικών Ερευνών, το Πανεπιστήμιο του Σίδνεϊ. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή NSLHD ζώων δεοντολογίας (αριθμός πρωτοκόλλου 1011-015A). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο με NO

2 και οξυγόνου (2: 1) και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Έχουμε αναπτύξει το μοντέλο PDTX όπως περιγράφεται από τους Wong MH και Xue Α et al. [38, 39] στο πλαίσιο του πρωτοκόλλου NSLHD HREC- 0909-227M. Εν συντομία, αρσενικοί NOD /SCID ποντίκια, ηλικίας 6 έως 8 εβδομάδων, αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο με ΝΟ

2 και οξυγόνου (2: 1). Μικρά κομμάτια από φρέσκα ιστούς όγκων ασθενούς ήταν ξενο-μεταμόσχευσις υπό τη νεφρική κάψα (SRC) σε ένα ποντικό. Στις οκτώ εβδομάδες μετά ξενομοσχεύματος, οι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η

in vivo

πρόσληψης λιπιδίων.

Τα ζώα που φέρουν τις πρώτες ξενομοσχεύματα γενεάς (F1) τυχαιοποιήθηκαν και διανεμήθηκαν σε τρεις ομάδες (α) όχημα (αλατούχο διάλυμα)? (Β) λιπίδιο (γ) λιπίδιο συν ΑροΑ-ΙΙ και εγχύθηκαν μέσω της φλέβας της ουράς. Στην ομογενοποίηση των όγκων του όγκου κάποιοι από τους όγκους F1 ήταν πέρασμα σε άλλη ομάδα ποντικών (F2) και εν συνεχεία πέρασμα σε F3. Η γενιά F3 φέρει ζώο ξενομοσχεύματος όγκων χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη επικύρωσης. Λιπιδίων πρόσληψη μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία από Carestream Μοριακής Απεικόνισης (ΜΙ) (Carestream Μοριακής Απεικόνισης, USA). Στο τέλος κάθε πειράματος οργάνων και οι όγκοι συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν περαιτέρω.

In vivo εικόνας ανάλυση

Για in vivo οπτική απεικόνιση, τα ποντίκια που φέρουν όγκο δέχτηκαν ένεση με DiD307 σημασμένο λιπίδιο με ή χωρίς apo-ΑΙΙ με ένεση στην φλέβα της ουράς. Απεικόνιση διεξήχθη αμέσως μετά την ένεση, στις 4 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 96 ώρες με in-vivo Carestream ΜΙ Σύστημα Απεικόνισης. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν στις 48 ώρες μετά την ένεση, τα νεφρά με όγκο, ήπαρ, σπλήνα, πάγκρεας, τους πνεύμονες, τον εγκέφαλο και τους μύες συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με Carestream ΜΙ σε μήκος κύματος 650 nm διέγερση και 700 nm εκπομπή.

Ιστολογίας και ανοσοϊστοχημεία

τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη ρυθμισμένη με φωσφορικό και εμπεδώθηκαν σε παραφίνη. Φορμαλίνη σταθερό, εμβαπτισμένες σε παραφίνη τομές κόπηκαν 4-μm πάχους τομές και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Mayer και ηωσίνη (Η &? Ε). Για ανοσοϊστοχημεία, οι τομές επωάστηκαν με αντι-ΑροΑ-ΙΙ (# 54796 ab, Abcam, Abcam Inc., ΜΑ, USA) (1 σε 4,000), αντι-SR-B1 (#NB 400-104, Novus Biologicals, Littleton, USA) (1 σε 4,000) και αντισώματα IgG ισότυπο. Ανοσοανίχνευση έγινε χρησιμοποιώντας το Dako Envision + System-HRP επισημασμένο κιτ ανίχνευσης πολυμερές (Dako, Carpinteria, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών και αντίθετα με αιματοξυλίνη Mayer και διάλυμα λουλάκι Scott. Μετά την τοποθέτηση, οι τομές παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (ECLIPSE 80i? Nikon, Tokyo, Japan).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (S.D.). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών ομάδα αναλύθηκαν με ζεύγη

t-test

και ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni (κατά περίπτωση). Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή στο

σ

& lt? 0.05 επίπεδο.

Αποτελέσματα

αποτέλεσμα ΑροΑ-ΙΙ για SMOF λιπιδικό γαλάκτωμα

Όταν ΑροΑ-ΙΙ προστέθηκε στο αδιαφανές γαλάκτωμα λιπιδίων, μια μετάβαση φάσης συνέβη και το γαλακτωματοποιημένο αδιαφανής διάλυμα μετασχηματίζεται σε ένα διαφανές διαυγές υγρό σε λιγότερο από μία ώρα (S1 Εικ). Cryo ΤΕΜ εικόνες SMOF λιπιδίων συν ΑροΑ-ΙΙ έδειξαν ότι τα γαλακτωματοποιημένα σωματίδια μετασχηματίζεται σε μονομεμβρανικά κυστίδια (Σχήμα 1Β). Πιο ενδιαφέρον είναι το μικρό μέγεθος αυτών των δομών, πολλά από τα οποία ήταν 10-50 nm σε διάμετρο, πολύ μικρότερη από τις αρχικές σωματίδια στο γαλάκτωμα. Αυτό μορφολογική αλλαγή στη δομή και το μέγεθος είναι πιο πιθανό να οφείλεται στην αλληλεπίδραση και την ολοκλήρωση της ΑροΑ-ΑΙΙ εντός των λιπιδικών αυτο-συγκροτήματα και τον μετασχηματισμό σε ένα διαφανές διάλυμα που περιέχει κυρίως μικρά μονοστρωματικά κυστίδια, όπως αποδεικνύεται από Cryo-ΤΕΜ (Σχ 1Α και 1Β).

Cryo-μικρογραφία ΤΕΜ εικόνα του γαλακτώματος Smoflipid χωρίς ΑροΑ-ΙΙ (Α) και μετά την προσθήκη της ΑροΑ-ΙΙ (Β). Σημειώστε τη δομή δι-στιβάδα της επιφάνειας του λιπιδίου του νανοσωματιδίων όπως δομές σε παρουσία της ΑροΑ-ΙΙ (μαύρα βέλη). (C) φασματική χρώμα φθορισμού φωτογραφία μιας γέλης τρέξιμο 0.5% αγαρόζη για 45 λεπτά στους 90 V σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ. Smoflipid επισημαίνονται με δεν είχε μεταναστεύουν μέσω της αλλά ανασυσταθεί επισημανθεί Smoflipid με ΑροΑ-ΙΙ μετανάστευσαν ως μπάντα.

Η

ηλεκτροφόρηση τζελ αποδειχθεί ότι ανασυσταθεί ΑροΑ-ΙΙ συν συμπλέγματα λιπιδίων μετανάστευσαν μέσω της γέλης ως μπάντα ενώ μόνο λιπίδιο ακόμη έμειναν στο φρεάτιο (Σχήμα 1 C), υποδηλώνοντας ότι ΑροΑ-ΙΙ μετέβαλε το γαλάκτωμα λιπιδίων και μείωσε το μέγεθος σωματιδίου που επιτρέπει μετανάστευση στην γέλη. Αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα Cryo ΤΕΜ (Σχήμα 1Α και 1Β).

συνεστιακή μικροσκοπία των καρκινικών κυττάρων που αναπτύσσονται σε λιπιδικά διαλύματα με και χωρίς ΑροΑ-ΙΙ

Η πρόσληψη λιπιδίων από CFPAC-1 κύτταρα (Σχ 2Α3), PANC-1 (Εικ S2A) και κυτταρικές γραμμές πρωτογενούς όγκου (S2B Εικ) ενισχύθηκε όταν ανασυσταθεί λιπίδιο συν ΑροΑ-ΙΙ προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε καρκίνο του πνεύμονα Α549 κύτταρα (S2C σχήμα). Σε αυτά τα πειράματα ΑροΑ-ΙΙ οπτικοποιήθηκε από αντισώματα ΑροΑ-ΙΙ, τα οποία κατέδειξαν ότι ήταν εντοπισμένη σε καρκίνο κυτταρικές μεμβράνες (Σχήμα 2Α και S2 Εικ). Ενώ μειωμένη ένταση φθορισμού παρατηρήθηκε στα κύτταρα CFPAC-1 όταν τα κύτταρα προ επωάστηκαν με το αντίσωμα αντι μπλοκαρίσματος SR-B1 (Σχήμα 2Α4). Όταν τα κύτταρα CFPAC-1 προ επωάστηκαν με το μη σημασμένο μεγάλη περίσσεια μόνος Smoflipid (Σχ 2Β1) και στη συνέχεια επωάστηκαν με το ανασυσταθέν Smoflipid /ΑροΑ-ΙΙ /είχε (Σχήμα 2Β2) περαιτέρω πρόσληψη DID συνέβη και το αντίσωμα ΑροΑ-ΙΙ βάφονται περιφερειακά εξαρτήματα των κυττάρων. Έτσι, αν και προ-επώαση μείωσε την πρόσληψη πρόσληψη Smoflipid /ΑροΑ-ΙΙ εξακολουθεί να συμβεί μέσω του μηχανισμού της επιφάνειας έλξης για ΑροΑ-II [4, 5]. Με την παρουσία της πρόσληψης λιπιδίων ΑροΑ-ΙΙ είναι σημαντικά μεγαλύτερη σε διάφορες συγκεντρώσεις σε σύγκριση με το λιπίδιο μόνο (Σχ 2C και 2D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΑροΑ-ΙΙ έλκεται από την κυτταρική μεμβράνη, ενώ λιπιδίου ήταν μεταφορά στα κύτταρα PC. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με το Fan Υ

et al

. [4] και Silver

et al

. [5]. Στο σύνολό τους αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την άποψη ότι λιπιδίων νανοσωματιδίων μπορεί να ενδοκυτταρώνεται.

Smoflipid σημάνθηκε με DiD (κόκκινο), ΑροΑ-ΙΙ σημασμένα πράσινο με ένα δευτερογενές αντίσωμα και DAPI χρώση των πυρήνων μπλε. κύτταρα (Α1) που έλαβαν μόνο ΑροΑ-ΙΙ, (Α2) κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με λιπίδια και μόνο, κύτταρα (Α3) που έλαβαν θεραπεία με ανασυσταθεί λιποπρωτεΐνες μετά την προσθήκη ΑροΑ-ΙΙ έκανε την ένδειξη Smoflipid (SMOF /Α-ΙΙ) επιδεικνύοντας αυξημένη πρόσληψη και (Α4 ) κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με (SMOF /Α-ΙΙ) μετά από προεπεξεργασία με αντι-SR-B1antibodies η οποία μείωσε την πρόσληψη λιπιδίων (κλίμακα bar, 20 μm). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με μη επισημασμένο λιπιδίων στις 1:10 αραίωση και (Β2) μετά προστέθηκε 2 ώρες SMOF /Α-ΙΙ, φαίνεται να ενδοκυτταρώνεται στην κυτταροπλασματική κυστίδια όπως φαίνεται στο (Β3) και (Β4). ΑροΑ-ΙΙ (πράσινο) είναι συνδεδεμένο με την κυτταρική μεμβράνη (κίτρινο κεφάλι βέλος) και επίσης στο κυτταρόπλασμα σε μέρος που συνδέεται με το λιπίδιο (κόκκινο κεφαλή βέλους) σε διαφορικής παρεμβολής αντίθεσης (DIC) επικάλυψη εικόνας (γραμμή κλίμακας 25 μm). (Γ) πείραμα απεικόνισης ζωντανών κυττάρων αποδεικνύεται μεγαλύτερη εξάπλωση των λιπιδίων στα κύτταρα όταν ανασυσταθεί λιποπρωτεΐνες μετά την προσθήκη ΑροΑ-ΙΙ κατάφερε να επισημανθεί Smoflipid προστέθηκε στα μέσα ενημέρωσης για τις συγκεντρώσεις λιπιδίων 1:20 και 1:10 (γραμμή κλίμακας 100 μm). (Δ) Η ένταση της χρώσης έκανε ήταν μεγαλύτερη όταν 4 δείγματα εξετάστηκαν με οκτώ έως δώδεκα τομείς ενδιαφέροντος για κάθε μελέτη όπου ΑροΑ2 αύξησε την πρόσληψη των λιπιδίων 25.6 ± 2.2,

P

= 0,02 και 54,8 ± 2,2 ,

P

= 0.004 για αραιώσεις 1:20 και 1:10 αντίστοιχα.

η

Smoflipid ΑροΑ-II στοχεύει PDAC PDTX in vivo

για την εκτίμηση του όγκου με στόχο την ικανότητα των λιπιδίων καθώς και ΑροΑ-ΙΙ χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο PDAC PDTX στο ποντίκι. Λιπιδίων /DiD ή λιπίδιο /DID /ΑροΑ-ΙΙ ενέθηκε στην φλέβα της ουράς ποντικών που έφεραν όγκους πρώτης γενιάς. Ολόκληρο απεικόνισης ζώο μετά από 48 ώρες έδειξε πρόσληψη λιπιδίων στα ξενομοσχεύματα όγκων PDAC περιορίζεται στη λιπιδική συν ΑροΑ-ΙΙ με ένεση ποντικούς σε σύγκριση με λιπίδιο μόνο (σχήμα 3Α και S3A Σχήμα), αλλά και στο ήπαρ, στομάχι και τη σπλήνα. Αυτό επιβεβαιώθηκε στις εκφυτευμένη οργάνων από

ex vivo

απεικόνισης, αλλά λίγο λιπιδίων παρατηρήθηκε σε πνεύμονες και εγκέφαλο, αλλά δεν έχουμε δει στην κανονική του παγκρέατος (Σχήμα 3Β και S3b σχήμα). Η σχετική ένταση φθορισμού αυξήθηκε κατά 3,4 φορές σε στοχευμένες ιστούς του καρκίνου, πότε-λιπιδίων /ΑροΑ-II εγχύθηκε (Σχήμα 3C) σε σύγκριση με Did-λιπιδίων, σύμφωνα με το σχήμα 2. Στο σύνολό τους τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΑροΑ-II στοχεύει ανθρώπινο PDAC.

(Α) φασματική ανάκλαση εικόνες φθορισμού από 8 εβδομάδων ξενομοσχεύματα ελήφθησαν 48 ώρες μετά την ένεση στη φλέβα της ουράς του PBS, έκανε την ένδειξη Smoflipid χωρίς ή με ΑροΑ-ΙΙ χρησιμοποιώντας μοριακή απεικόνιση Carestream. Σημειώστε την ευρεία διανομή των έκανα είναι εντοπισμένη καλύτερα στις όγκους όταν ΑροΑ-ΙΙ περιλαμβάνεται με λιπίδιο. Τα βέλη δείχνουν την τοποθεσία των όγκων. (Β) Φασματική εικόνες φθορισμού των εκφυτευμένων όγκοι και τα όργανα που λαμβάνονται 48 ώρες μετά την ένεση από ποντικούς μετά από ένεση στην φλέβα της ουράς είτε PBS, λιπιδίων /είχε (n = 2) ή λιπιδίων /DiD συν ΑροΑ-ΙΙ (n = 2) (δεξί πάνελ ) μαζί με το η &? Ε φωτογραφία μικρογραφία του όγκου από δύο ποντίκια (αριστερό πάνελ), διατήρησε τα μορφολογικά χαρακτηριστικά με όγκους PC του αρχικού ασθενούς λιπιδίων και λιπιδίων συν ΑροΑ-ΙΙ αγωγή ποντικούς. Σημειώστε την πρόσληψη του φθορισμού από τους όγκους, το ήπαρ και τη σπλήνα. (C) Διάγραμμα αντιπροσωπεύει την πρόσληψη από τον όγκο σε σχέση με την πρόσληψη του ήπατος ως κλάσμα της περιοχής. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν τότε κανονικοποιούνται με την τιμή για ποντικούς που λαμβάνουν μόνο λιπίδιο (ορίζεται ως 1), όταν η πρόσληψη του όγκου για τους ποντικούς που έλαβαν λιπιδίων και ΑροΑ-ΙΙ είχε 3,4 φορές αυξημένη πρόσληψη. Οι τιμές είναι μέση ± SD?

n

= 3.

Η

υποδοχέα οδοκαθαριστή τύπου Β κατηγορίας 1 (SR-Β1) έκφραση είναι υψηλότερη ανθρώπινη PDAC

Με την κηλίδωση Western, για πρώτη φορά, αποδείξαμε ότι η έκφραση SR-B1 ήταν 13,2, 10,6, 3,1 και 2,3 φορές υψηλότερη σε PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 και κυτταρικές σειρές BxPC3 αντίστοιχα σε σύγκριση με την κανονική κυτταρική σειρά παγκρέατος (HPDE6) (Εικ 4Α). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) έδειξαν ότι η έκφραση SR-B1 ήταν 3,7 φορές μεγαλύτερη σε PDAC ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικά πάγκρεας (Εικόνα 4Β). Συνεπής με το Σχ 2, βρήκαμε ότι η έκφραση ΑροΑ-ΙΙ ήταν υψηλότερη σε όγκους όταν τα ποντίκια ενέθηκαν με συνδυασμό των λιπιδίων και γαλάκτωμα ΑροΑ-ΙΙ (σχήμα 4C), ενώ δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση SR-B1 σε όγκους σε καμία ομάδα ( Σχήμα 4C).

(Α) HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 και τα κύτταρα BxPC3 καλλιεργήθηκαν και SR-B1 έκφραση μετρήθηκε με κηλίδωση Western. Η ένταση της ζώνης των πρωτεϊνών ομαλοποιήθηκε με β-ακτίνη και HPDE6 ορίστηκε ως 1. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος των δύο ξεχωριστά πειράματα. (Β) Έκφραση SR-B1 με IHC επί κανονικών παγκρέατος (ΝΡ) και την ανθρώπινη PDAC ιστούς. Ένθετο, IgG αντιπροσωπεύει την ισοτυπία συμφωνημένα πρωτογενές αντίσωμα σε αντι SR-Β1. Η γραφική παράσταση δείχνει την ποσοτικοποίηση της έκφρασης SR-B1 από το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται Χ ένταση από 3 ξεχωριστές ασθενείς και ΝΡ ορίστηκε ως 1. (γ) έκφραση του SR-B1 και ΑροΑ-ΙΙ με IHC σε αντίστοιχες ξενομόσχευμα PDAC όγκους στις 48 ώρες μετά την ένεση στην ουραία φλέβα των λιπιδίων με ή χωρίς ΑροΑ-ΙΙ. Ένθετο, IgG αντιπροσωπεύει την ισοτυπία συμφωνημένα πρωτογενές αντίσωμα σε αντι-ΑροΑ-ΙΙ. (D) Επιδράσεις των αντι SR-Β1 μόνη της σε HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 και την ανάπτυξη των κυττάρων BxPC3. (Ε) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς το αντίσωμα SR-Β1 (2.5 μg /mL) για 2 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑροΑ-ΙΙ, λιπιδίων και λιπιδίων συν ΑροΑ-ΙΙ για 48 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με δοκιμασία κρυσταλλικό ιώδες. Οι τιμές είναι μέση ± SD?

n

= 4. *

, ‡, # και ± p & lt? 0.05 ελέγχου έναντι, ΑροΑ-ΙΙ, λιπιδίων και λιπιδίων + ΑροΑ-ΙΙ, αντίστοιχα, με τη χρήση της ανάλυσης της διακύμανσης.

Η

ΑροΑ-ΙΙ ενισχύεται πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Τέσσερις κυτταρικές PC γραμμές PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 και BxPC3 αυξήθηκαν ταχύτερα (Σχήμα 4Ε), όταν είχαν λιπιδίων και ΑροΑ-ΙΙ προστίθενται στο μέσο καλλιέργειας τους σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ΑροΑ-II μόνο ή μόνο με λιπίδιο (εκτός CFPAC-1 κύτταρα). Εναλλακτικά ΑροΑ-ΙΙ μειωτικά φυσιολογικά κύτταρα HPDE6 (Εικ 4Ε). Αυτό ήταν περισσότερο εμφανής στις 48 ώρες και υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός λιπιδίων και ΑροΑ-ΙΙ αύξησε την πρόσληψη του λιπιδίου και έτσι ενέργεια επιτρέποντας στα κύτταρα PC αναπτύσσονται πιο γρήγορα. Υπήρχε μία παρόμοια επίδραση επί ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών από πνεύμονα, μαστού και του προστάτη στις 48 ώρες (Εικ S4). Ωστόσο, η ΑροΑ-ΙΙ δεν προωθούν την ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή MCF7, η οποία διατήρησε τα χαρακτηριστικά της διαφοροποίησης και αναπτύσσεται αργά [40]. Επιπλέον, προεπώαση με αντίσωμα αντι SR-B1 αναστρέψει πλήρως λιπίδιο συν ΑροΑ-ΙΙ διεγείρεται κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε PANC-1, CFPAC-1 και τα κύτταρα BxPC3 και μερικώς αλλά σημαντικά MIAPaCa-2 κύτταρα (Σχ 4Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της SR-B1 ενισχυμένη ΑροΑ-ΙΙ συν λιπίδιο επαγόμενη μειορύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης σε HPDE6 (Σχήμα 4Ε). Αντι SR-B1 μόνη της σε 2.5 μ§ /ml δεν είχε σημαντική επίδραση επί HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2 και BxPC3 κυτταρικές σειρές, ενώ σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων ρυθμίζεται προς τα κάτω CFPAC-1 (Σχ 4D). Αυτό μπορεί να οφείλεται στο επίπεδο πυκνότητας διαφορά του SR-B1 σε CFPAC-1 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α) PANC-1, MIAPaCa-2, BxPC3 και.

Συζήτηση

ΑροΑ-ΙΙ άλλαξε τη φυσική δομή του SMOF λιπιδίων με τη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων των λιπιδίων και την επαγωγή του σχηματισμού ενός nanoparticle- μεμβράνης διπλοστιβάδας όπως δομή. Αυτό είναι σύμφωνο με τη γνωστή δομή και τη λειτουργία της ΑροΑ-ΙΙ σε HDL [41]. Ο συνδυασμός της ΑροΑ-ΙΙ και λιπιδίων προώθησε σημαντικά την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών PC και κυτταρικές σειρές από καρκίνο του πνεύμονα, του μαστού και του προστάτη. Επιπλέον, ΑροΑ-ΙΙ αυξηθεί η πρόσληψή λιπιδίων σε PANC-1, CFPAC-1, πρωτογενή κύτταρα όγκου και PDXT. Η πρόσληψη εξωγενούς γαλάκτωμα λιπιδίων με ΑροΑ-ΙΙ σε όγκους PC μπορεί να χρησιμοποιεί τον υποδοχέα SR-B1 (Σχήμα 2Α4), επειδή σχηματίζει ένα HDL σαν δομή η οποία έχει μια υψηλής συγγένειας προς SR-B1 [26].