Αφηρημένο

Η Enhancer 2 πρωτεΐνης (ΕΖΗ2) Zeste έχει αναφερθεί ότι διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων σε ορισμένους καρκίνους και, επομένως, θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει μια ενδιαφέρουσα νέα στόχος για θεραπευτική παρέμβαση. Εδώ, ερευνήσαμε ένα πιθανό ρόλο του ΕΖΗ2 για τον έλεγχο της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Παρεμβολή RNA (RNAi) μεσολάβηση ενδοκυτταρική εξάντληση ΕΖΗ2 οδήγησε στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων του καρκινώματος του κόλου κατά την G1 /S μετάβαση. Αυτό συσχετίστηκε με μείωση του αριθμού των κυττάρων μετά από παροδική επιμόλυνση των συνθετικών

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs και με την αναστολή της ικανότητας σχηματισμού αποικιών τους κατά σταθερή έκφραση siRNAs που μεταδίδονται μέσω φορέων. Έχουμε επιπλέον δοκιμαστεί εάν ΕΖΗ2 μπορεί να καταστέλλουν την ανάπτυξη ανασταλτική

ρ27

γονίδιο, όπως αναφέρθηκε για τον καρκίνο του παγκρέατος. Ωστόσο, η έκφραση αναλύσεις κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου και του παχέος εντέρου βιοψίες καρκίνου του δεν αποκάλυψε μια συνεπή συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και τα επίπεδα ρ27. Επιπλέον, η εξάντληση ΕΖΗ2 δεν εκ νέου να προκαλέσει

p27

έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, υποδεικνύοντας ότι

p27

καταστολή από ΕΖΗ2 μπορεί να είναι σε κύτταρα ή ιστό-ειδικό. Ολόκληρο το γονιδίωμα μεταγραφικό αναλύσεις εντοπίστηκαν κυτταρικά γονίδια που επηρεάζονται από την εξάντληση ΕΖΗ2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Θα περιλαμβάνονται αρκετές σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια που συνδέονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή εισβολή, όπως

Dag1

,

MageD1

,

sdc1

,

Timp2

, και

Tob1

. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι εμποδίζει εξάντληση ΕΖΗ2 την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να παρέχουν οφέλη για την θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Fussbroich Β, Wagener Ν, Macher-Goeppinger S, Benner Α, Fälth Μ, Sültmann Η, et al. (2011) ΕΖΗ2 Μείωση Μπλοκάρει το πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (7): e21651. doi: 10.1371 /journal.pone.0021651

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Φεβρουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 4 του Ιουνίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουλίου 2011

Copyright: © 2011 Fussbroich et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η Enhancer της Zeste ομόλογο 2 πρωτεΐνη (ΕΖΗ2) είναι μια βασική συνιστώσα της Polycomb Κατασταλτικά Complex2 (PRC2) και τροποποιεί τη μεταγραφή σε επιγενετικές επίπεδο επηρεάζοντας ιστονών και της μεθυλίωσης του DNA [1]. ΕΖΗ2 υπερεκφράζεται σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων των μεγάλων ανθρώπινους καρκίνους, όπως ο καρκίνος του προστάτη, ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του παγκρέατος, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, ή ο καρκίνος του τραχήλου [2] – [6].

Υπάρχουν πειραματικές ενδείξεις που

ΕΖΗ2

μπορεί να συμβάλει άμεσα στην καρκινογένεση, ενεργώντας ως

καλόπιστους

ογκογονίδιο. Συγκεκριμένα, για ορισμένους φορείς του καρκίνου, έχει αναφερθεί ότι ΕΖΗ2 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση μπλοκ, προάγει κυτταρική εισβολή και μετάσταση, ενεργοποιεί αγγειογένεση όγκου, και επάγει όγκους σε μοντέλα ποντικού [2] – [11]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή ΕΖΗ2 μπορεί να αντιπροσωπεύει μια ελκυστική νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου επιγενετικές [1], [12].

Πιο πρόσφατα, ωστόσο, υπάρχει επίσης δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΕΖΗ2 μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκων σε πρωτεΐνη ορισμένους ιστούς [13]. Τα ομόζυγα απενεργοποίησης

ΕΖΗ2

μεταλλάξεις ανιχνεύτηκαν σε ένα τμήμα του μυελοειδούς κακοήθειες [14], [15], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι ΕΖΗ2 μπορεί είτε να ασκήσει προ- ή αντι-ογκογόνο δραστηριότητες, σε ένα κυτταρικό τύπο με τρόπο που εξαρτάται [ ,,,0],16]. Ένα άλλο επίπεδο πολυπλοκότητας προστίθεται με την ανίχνευση ετερόζυγο

ΕΖΗ2

μεταλλάξεις σε ένα τμήμα του λεμφώματα βλαστικού κέντρου προέλευσης [13]. Στην περίπτωση αυτή, η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη φαίνεται να αυξάνει το επίπεδο της H3K27 μεθυλίωσης, μια κρίσιμη κατάντη στόχος της ΕΖΗ2, δρώντας σε συνδυασμό με την πρωτεΐνη άγριου τύπου που εκφράζεται από το μη μεταλλαγμένο αλληλόμορφο [17].

καρκίνος του παχέος είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους ανθρώπους. Κάθε χρόνο, περισσότερα από 1.200.000 άτομα θα αναπτύξουν τη νόσο και πάνω από 600.000 θα πεθάνουν από αυτό [18]. Παρά την υψηλή βιοϊατρική σημασία αυτού του όγκου, οι έρευνες της κατάστασης ΕΖΗ2 και τη λειτουργία των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου είναι αραιά και εν μέρει αντιφατικές. Για παράδειγμα, ενώ ΕΖΗ2 αναφέρθηκε με συνέπεια να υπερεκφράζεται σε καρκίνους του παχέος εντέρου, τα επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 συσχετίζεται θετικά [19], αρνητικά [20], [21], ή και καθόλου [22], με την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, με τις γνώσεις μας, μόνο μια λειτουργική μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος της ΕΖΗ2 για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου, αλλά απέτυχε να δει ένα τέτοιο φαινόμενο μετά από

ΕΖΗ2

γονιδιακή σίγηση [22]. Αυτό το εύρημα είναι σε έντονη αντίθεση με το ρόλο που προάγουν την ανάπτυξη του ΕΖΗ2 αναφερθεί για διάφορες άλλες οντότητες του καρκίνου [2] – [6]. Στην παρούσα εργασία, θα αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα αναλύοντας την έκφραση ΕΖΗ2 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

in vitro

και

in vivo

, και με τη διερεύνηση της συμβολής της ΕΖΗ2 στην ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου .

Αποτελέσματα

Η έκφραση της ΕΖΗ2 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

in vitro

και RNA παρεμβολής μεσολάβηση

ΕΖΗ2

καταστολή

Για να διερευνηθεί η έκφραση του ΕΖΗ2 σε καρκινικά κύτταρα κόλου

in vitro

, αναλύσαμε ένα πάνελ δώδεκα προέρχονται από όγκους κόλου καρκινικές κυτταρικές σειρές με ανοσοκηλίδωση και qRT-PCR. Όλες οι δοκιμαζόμενες κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν εύκολα ανιχνεύσιμη ποσότητες πρωτεΐνης ΕΖΗ2 (Σχήμα 1Α) και

ΕΖΗ2

mRNA (Σχήμα 1Β). Για τις αναλύσεις μετέπειτα παρεμβολή RNA (RNAi), δημιουργήσαμε τρία συνθετικά siRNA που στοχεύει διαφορετικές περιοχές του

ΕΖΗ2

μεταγραφή. Και οι τρεις siRNAs μπλοκάρει αποτελεσματικά την έκφραση ΕΖΗ2 (Σχήμα 1 C). Από το δυναμικό off-στόχο επιπτώσεις των επιμέρους siRNAs μπορεί να μειωθεί με siRNA συγκέντρωση [23], [24], θα δοκιμαστεί επίσης μια πισίνα που αποτελείται από τα τρία

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs. Αυτή η δεξαμενή siRNA επίσης μπλοκάρει αποτελεσματικά την έκφραση ΕΖΗ2 (Σχήμα 1 C) και χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω λειτουργικές αναλύσεις.

Μια ανάλυση ανοσοκηλίδας της έκφρασης πρωτεΐνης ΕΖΗ2. Τουμπουλίνης, φόρτωση έλεγχο. Β qRT-PCR αναλύσεις

ΕΖΗ2

έκφραση του mRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως πλάσια διαφορές στην γονιδιακή έκφραση, κανονικοποιημένη με κάποιο δείκτη γονίδιο καθαριότητας. Οι τυπικές αποκλίσεις από δύο αντίστροφη επαναλήψεις μεταγραφής υποδεικνύεται. C Η ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης ΕΖΗ2 από RNAi. έκφραση ΕΖΗ2 προσδιορίστηκε με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs ή siRNAs ελέγχου, όπως υποδεικνύεται. siEZH2pool: συγκεντρωμένων

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs. Τουμπουλίνης, φόρτωση έλεγχο.

Η

ΕΖΗ2

καταστολή οδηγεί σε G1 σύλληψη και την αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων

Στη συνέχεια, ελέγξαμε την επίδραση της RNAi μεσολάβηση

ΕΖΗ2

καταστολή στην ανάπτυξη του HCT116, LoVo, και DLD1 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. siRNA-αγωγή κατέληξε σε μια ισχυρή μείωση των επιπέδων ΕΖΗ2 σε όλες τις κυτταρικές καρκινώματος κόλου δοκιμάστηκαν γραμμές και, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για άλλα κύτταρα [7], σε μια συνακόλουθη μείωση της έκφρασης κυκλίνης D1 (Σχήμα 2Α).

Α Ανοσοστύπωμα αναλύσεις HCT116, τα κύτταρα DLD1 και LoVo δείχνει αποτελεσματική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΕΖΗ2 με RNAi. Τα επίπεδα κυκλίνης D1 υποδεικνύεται. Τουμπουλίνης, φόρτωση έλεγχο. κύκλος Β κυττάρων αναλύσεις με FACS. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δύο siRNAs ελέγχου ή με

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs. Ποσοστά των κυττάρων στην G1, S, G2 ή /Οι M φάσεις του κυτταρικού κύκλου που υποδεικνύεται. Γ Σύνταξη κυτταρικού κύκλου αναλύσεων από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τυπικές αποκλίσεις που υποδεικνύεται. Οι αστερίσκοι ίση p ≤ 0,05, διπλό αστερίσκους ίση p≤0.01, N.S. δεν είναι σημαντική.

Η

κυτταρικού κύκλου αναλύσεις με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) διεξήχθησαν παράλληλα. Μπορούν αποκάλυψε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε πληθυσμούς G1 και μια συνακόλουθη μείωση των πληθυσμών φάση S, κατά την

ΕΖΗ2

καταστολή. Τυπικές καμπύλες FACS παρουσιάζεται στο Σχήμα 2Β, μια συλλογή των αποτελεσμάτων των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων απεικονίζεται στο Σχήμα 2C. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

ΕΖΗ2

καταστολή προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S όριο και ως εκ τούτου μπορούν να ενεργούν αντιπολλαπλασιαστικές σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Για την περαιτέρω αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, ο αριθμός των κυττάρων αναλύσεις καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές διεξήχθησαν. Μεσολάβηση RNAi αναστολή της

ΕΖΗ2

έκφραση οδήγησε σε σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων, η οποία ήταν σαφώς ορατή 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση των συνθετικών siRNAs (Σχήμα 3Α), υποδεικνύοντας ότι

ΕΖΗ2

σίγηση οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

Ένα κύτταρο μετράει μετά από παροδική επιμόλυνση με συνθετικά siRNA ελέγχου (sicontr-1) ή

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs (πισίνα siEZH2). Γραφήματα αντιπροσωπεύουν σχετικούς αριθμούς των κυττάρων, στις υποδεικνυόμενες χρονικές στιγμές μετά την επιμόλυνση siRNA. αριθμούς κυττάρων σε επιμόλυνση (χρονικό σημείο 0) ορίστηκαν ως 1.0. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, οι τυπικές αποκλίσεις που υποδεικνύεται. Οι αστερίσκοι ίση p ≤ 0,05, N.S. ασήμαντο. δοκιμασίες σχηματισμού Β αποικία. HCT116, LoVo, κύτταρα DLD1, και RKO ήταν σταθερά επιμολυσμένα με πλασμίδια που εκφράζουν δύο διαφορετικές Τα siRNAs ενάντια

ΕΖΗ2

(ρΟΕΡ-shEZH2-1, ρΟΕΡ-shEZH2-2) ή δύο Τα siRNAs ελέγχου (ρΟΕΡ-shluc ή pCEP- shcontr-1). Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές, με συνεπή αποτελέσματα.

Η

Για την επικύρωση της αντιπολλαπλασιαστικής επίδρασης του

ΕΖΗ2

αναστολή σε καρκινικά κύτταρα κόλου από ανεξάρτητο μέθοδο, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας. Δύο διαφορετικές

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs ήταν σταθερώς εκφράζονται από φορείς έκφρασης επιλέξιμου σε HCT116, τα κύτταρα LoVo, DLD1, και RKO, για 13 έως 15 ημέρες. Τόσο

ΕΖΗ2

-targeting siRNAs οδήγησε σε σαφή μείωση της ικανότητας σχηματισμού αποικιών όλων των ελεγχθέντων κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου σε σχέση με έλεγχο των κυττάρων siRNA-αγωγή (Σχήμα 3Β). Μορφολογικά πτυχές, προφίλ FACS, και τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης άκρο επισήμανση dUTP nick (TUNEL) αναλύσεις δεν παρέχουν αποδείξεις για αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου κατά μεσολάβηση RNAi

καταστολή ΕΖΗ2

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξάντληση ΕΖΗ2 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 και αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

Tissue Micro Array ανάλυση της έκφρασης ΕΖΗ2 στα αδενώματα του παχέος εντέρου και του καρκίνου

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι είναι σημαντικά ΕΖΗ2 υπερεκφράζεται σε καρκίνους του παχέος εντέρου, σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό κόλου [19] – [22]. Ωστόσο, τα δεδομένα συγκρίνοντας την έκφραση ΕΖΗ2 στην καλοήθη αδενώματα του παχέος εντέρου σε σχέση με τον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν είναι ακόμα διαθέσιμα. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ανοσοϊστοχημική χρησιμοποιεί μια μικροσυστοιχία ιστός περιλαμβάνει 24 αδενώματα, 25 καρκινώματα G1, G2 24 καρκινώματα, και 24 καρκινώματα G3. Σε σύγκριση με αδενώματα του κόλον, η έκφραση ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκινώματα του παχέος εντέρου (Σχ. 4Α και 4Β). Αναλύσεις καρκίνων του παχέος εντέρου που αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς βαθμούς ιστολογικών αποδιαφοροποίηση (αυξάνοντας από G1-G3) έδειξε μία τάση για περαιτέρω αύξηση της έκφρασης ΕΖΗ2 για λιγότερο διαφοροποιημένες μορφές καρκίνου, η οποία, ωστόσο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 4Β).

Μια Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των αδενωμάτων του παχέος εντέρου και βιοψίες καρκίνου του παχέος εντέρου αντιπροσωπεύει αυξανόμενους βαθμούς ιστολογική αποδιαφοροποίηση (G1-G3). Μαύρα βέλη: καρκίνωμα? λευκά βέλη: συνδετικού ιστού. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. Β Box οικόπεδο έκφραση της πρωτεΐνης ΕΖΗ2. Τα επίπεδα έκφρασης του ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά αυξημένα σε καρκινώματα σε σύγκριση με αδενώματα (ρ & lt? 0.001). Διαφορές ως προς την έκφραση ΕΖΗ2 μεταξύ G1, G2, G3 και καρκινώματα δεν ήταν σημαντικές (ρ = 0,185).

Η

ΕΖΗ2 και έκφραση ρ27 δεν συσχετίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Η εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα της κινάσης p27 (ονομάζεται επίσης Kip1) είναι μια πρωτεΐνη αναστολής της ανάπτυξης που την εξέλιξη μπλοκ του κυτταρικού κύκλου στη μετάβαση G1 /S [25]. Σε καρκίνους του παχέος εντέρου, τα επίπεδα ρ27 είναι συχνά χαμηλή [26], [27]. Είναι ενδιαφέρον, ότι ήταν πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η εξάντληση ΕΖΗ2 οδήγησε σε ρ27 επανέκφραση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, υποδεικνύοντας ότι ΕΖΗ2 μπορεί να συνεισφέρει στη πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου με την καταστολή

ρ27

[4]. Εν όψει των ευρημάτων μας ότι η ΕΖΗ2 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρει την G1 /S εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, που ασχολήθηκε με το ερώτημα κατά πόσον

p27

καταστέλλεται από ΕΖΗ2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και.

ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι οι καρκίνοι του παχέος εντέρου εμφάνισαν σημαντικά μειωμένη πυρηνική ρ27 και μια τάση για μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ27 κυτταροπλασματική (Σχήμα 5Α), σε σύγκριση με αδενώματα του παχέος εντέρου. Εντός της ομάδας καρκίνου, αυξανόμενους βαθμούς καρκινικών κυττάρων αποδιαφοροποίηση (G1-G3) έδειξε στατιστικά μη σημαντική τάση για περαιτέρω μείωση της έκφρασης p27 (Σχήμα 5Α). Σε γενικές γραμμές, τα αποτελέσματα αυτά είναι αντίθετα με τα ευρήματα που ελήφθησαν για έκφραση ΕΖΗ2 (Σχήμα 4Β), αυξάνοντας την πιθανότητα ότι τα επίπεδα ΕΖΗ2 μπορεί αρνητικώς συσχετίζονται με τα επίπεδα ρ27. Ωστόσο, ΕΖΗ2 και τα επίπεδα ρ27 δεν συσχετίζονται σημαντικά σε μεμονωμένες καρκίνους (n = 68) σε ανά ασθενή βάση, δηλαδή σε όγκους που προέρχονται από τον ίδιο ασθενή (Σχήμα 5Β). Αυτή η έλλειψη του συνεταιρίζεσθαι που εφαρμόζεται για την ανάλυση ΕΖΗ2 ανέρχεται σε σχέση τόσο με τα επίπεδα πυρηνική ή κυτταροπλασματική έκφραση p27 (rank συσχέτισης Spearman είναι συντελεστές r = 0,187, p = 0,572 και r = -0,0623, p = 0,613, αντίστοιχα).

Ένα κουτί οικόπεδα της έκφρασης πυρηνικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών p27 στα αδενώματα του παχέος εντέρου και των καρκινωμάτων (G1-G3). Τα επίπεδα έκφρασης των πυρηνικών p27 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε καρκινώματα σε σύγκριση με αδενώματα (p = 0,026), κυτταροπλασματικά επίπεδα ρ27 παρουσίασε μια παρόμοια τάση, η οποία, ωστόσο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,173). Διαφορές ως προς την έκφραση ρ27 μεταξύ G1, G2, G3 και καρκινώματα δεν ήταν σημαντικές. Β Ανοσοϊστοχημική χρώση των ζευγών δειγμάτων των καρκίνων του παχέος εντέρου δεν αποκάλυψε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και τα επίπεδα έκφρασης p27. Παραδείγματα 4 διαφορετικών καρκίνων (Ι-IV) βάφτηκαν για ΕΖΗ2 (άνω πάνελ) και ρ27 (κάτω πάνελ), αντίστοιχα. Κλίμακα μπαρ, 50 μm.

Η

Σύμφωνα με αυτά τα

in vivo

ευρήματα, τα βασικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ΕΖΗ2 δεν συσχετίζονται με συνέπεια με τα επίπεδα της πρωτεΐνης p27 ή mRNA για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων γραμμές

in vitro

(Σχήμα 6Α και 6Β). Ερευνήσαμε επίσης εάν τα επίπεδα έκφρασης p27 που πλήττονται από την εξάντληση ΕΖΗ2 σε HCT116, LoVo, και DLD1 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Εάν ΕΖΗ2 έκφραση μπλοκ ρ27, αποσιώπηση του

ΕΖΗ2

πρέπει να συνδέεται με μια εκ νέου αύξηση της έκφρασης ρ27, όπως έχει παρατηρηθεί σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [4]. Σε αντίθεση, ωστόσο, αποτελεσματική αναστολή της έκφρασης ΕΖΗ2 Δεν συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της έκφρασης ρ27, ούτε κατά την πρωτεΐνη (Σχήμα 6C), ούτε στο επίπεδο του mRNA (Σχήμα 6D), σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Cellular μελέτες αποκάλυψαν ότι κλασματοποίηση ρ27 είναι ουσιαστικά εντοπίζεται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα, σε HCT116, τα κύτταρα LoVo, και DLD1. Αυτό υποκυτταρική κατανομή επίσης δεν μεταβάλλεται από ανιχνεύσιμα εξάντληση ΕΖΗ2 (Σχήμα S1).

Α ΕΖΗ2 και η έκφραση πρωτεΐνης ρ27 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, η οποία αξιολογείται με αναλύσεις ανοσοστυπώματος. Τουμπουλίνης, φόρτωση έλεγχο. Β

έκφραση p27

mRNA, το οποίο μετράται από qRT-PCR αναλύσεις. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως οι φορές διαφορές στην γονιδιακή έκφραση, κανονικοποιημένη με κάποιο δείκτη γονίδιο καθαριότητας. Οι τυπικές αποκλίσεις από δύο αντίστροφη επαναλήψεις μεταγραφής υποδεικνύεται. C ανοσοκηλίδας αναλύσεις μετά την εξάντληση ΕΖΗ2 από RNAi. Τα επίπεδα ΕΖΗ2 και ρ27 υποδεικνύεται. Τουμπουλίνης, φόρτωση έλεγχο. αναλύσεις D qRT-PCR μετά την εξάντληση ΕΖΗ2 από RNAi.

p27

και

ΕΖΗ2

επίπεδα mRNA ενδείκνυνται σε σχέση με sicontr-1-επεξεργασμένα κύτταρα (αυθαίρετα ορίζεται σε 1,0). Οι τυπικές αποκλίσεις των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων υποδεικνύεται.

Η

μεταγραφικό Αναλύσεις καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα κατόπιν ΕΖΗ2 εξάντληση

Για τον εντοπισμό πιθανών γονιδίων-στόχων που πλήττονται από την εξάντληση ΕΖΗ2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, μεταγραφικό αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν. Για το σκοπό αυτό, LoVo και DLD1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με το siRNA πισίνα σίγηση

ΕΖΗ2

έκφραση ή με έλεγχο siRNA. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης κυτταρικών γονιδίων εκτιμήθηκαν με τη χρήση ενός γονιδιώματος σε επίπεδο μικροσυστοιχιών περίπου 25.000 γονίδια. Παρατηρήσαμε σημαντικές μεταβολές των 2.235 γονιδίων στο DLD1 (1.095 ρυθμίζεται προς τα πάνω, 1.140 μειωτικά) (Πίνακας S1) και των 379 γονιδίων σε LoVo (280 ρυθμίζεται προς τα πάνω, 99 μειωτικά) (Πίνακας S2). Η επικάλυψη αποτελούνταν από 139 γονίδια που επλήγησαν από εξάντληση ΕΖΗ2 στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (100 ρυθμίζεται προς τα πάνω, 39 ρυθμίζεται προς τα κάτω). Ένας θερμικός χάρτης οπτικοποίηση αυτών των 139 διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια παρέχεται στο Σχήμα 7Α, υποδεικνύοντας υψηλή αντιστοιχία μεταξύ των βιολογικών επαναλήψεις. Μια λεπτομερής κατάλογος αυτών των γονιδίων παρέχονται στον Πίνακα S3.

Μια Βεν-διάγραμμα και θερμικούς χάρτες των 139 γονιδίων που επηρεάστηκαν σημαντικά στο επίπεδο μεταγραφής από εξάντληση ΕΖΗ2 και στα δύο κύτταρα LoVo και DLD1. Θερμικούς χάρτες δημιουργήθηκαν με τη χρήση ιεραρχικής ομαδοποίησης. Τα κύτταρα είτε σε επεξεργασία με siEZH2pool ή sicontr-2. Τέσσερις βιολογικές επαναλήψεις αναλύθηκαν για κάθε δείγμα. Τα σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια που αναφέρονται στο κίτρινο, σημαντικά μειωτικά γονίδια σε μπλε χρώμα. Β qRT-PCR αναλύσεις για την εκτίμηση της έκφρασης των πέντε γονιδίων που επλήγησαν από εξάντληση ΕΖΗ2 στην ανάλυση μεταγραφικό (βλέπε παραπάνω). Ενδείκνυται είναι τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που διεξήχθησαν σε κύτταρα DLD1. Τα επίπεδα mRNA δείχνονται σε σχέση με sicontr-2-κατεργασμένα κύτταρα (αυθαίρετα ορίζεται σε 1,0). Οι τυπικές αποκλίσεις που υποδεικνύεται. Οι αστερίσκοι ίση p ≤ 0,05, διπλό αστερίσκους ίση p≤0.01.

Η

Λειτουργική σχολιασμό των 139 γονιδίων από Ingenuity Διαδρομή Η ανάλυση αποκάλυψε ότι 37 προϊόντα γονιδίων έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο (Πίνακας 1). Όσον αφορά τις μοριακές και κυτταρικές λειτουργίες, εξάντληση ΕΖΗ2 βρέθηκε να επηρεάζει αρκετά γονίδια που εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης, τον έλεγχο της ανάπτυξης, κυτταρική κίνηση, και τη σηματοδότηση (Πίνακας 1).

Η

Για να επικυρώσετε το δεδομένα συστοιχία, αναλύσαμε την έκφραση της 5 σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια, τα οποία επάγονται από εξάντληση ΕΖΗ2 στο μεταγραφικό αναλύσεις, με qRT-PCR: (i)

Dag1

(Dystroglycan 1) που κωδικοποιεί ένα μόριο προσκόλλησης, το οποίο συχνά υποεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [28], (ii)

MageD1

(μελάνωμα που σχετίζεται οικογένεια πρωτεϊνικό αντιγόνο-D1) που κωδικοποιεί ένα αναστολέα του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [29], (iii)

sdc1

(συνδεκάνιο 1), το οποίο κωδικοποιεί ένα πρωτεογλυκάνη επιφάνειας κυττάρου που αναστέλλει κυτταρική εισβολή [30], (iv)

Timp2

(ΤΙΜΡ μεταλλοπεπτιδάση αναστολέα 2), το οποίο κωδικοποιεί έναν αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας του οποίου η προς τα κάτω ρύθμιση συσχετίζεται με την επεμβατική δυναμικό του καρκίνου του παχέος εντέρου LoVo κυττάρων [31], και (v)

Tob1

(αισθητήριο του ErbB2), που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με αντιπολλαπλασιαστική κατασταλτική του όγκου δυναμικό [32]. Όπως παρατηρήθηκε για το μικροσυστοιχιών, όλα τα 5 γονίδια, επίσης, που προκαλείται σημαντικά από την εξάντληση ΕΖΗ2 στην ανάλυση qRT-PCR (Σχήμα 7Β), περαιτέρω επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μεταγραφικό.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη , δείχνουμε ότι η εξάντληση ΕΖΗ2 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (i) μειώνει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στο όριο G1 /S, (ii) μειώνει τους αριθμούς των κυττάρων σε σύντομο προσδιορισμούς μακροπρόθεσμη ανάπτυξη, και (iii) ανάπτυξη μπλοκ κυττάρων σε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικιών μακροπρόθεσμη . Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με ένα ρόλο προαγωγής ανάπτυξης για ΕΖΗ2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου και έρχονται σε αντίθεση με μια πρόσφατη έκθεση δείχνει ότι η ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα δεν επηρεάζεται από την εξάντληση ΕΖΗ2 siRNA μεσολάβηση [22].

Μια πιθανή εξήγηση γι ‘αυτή την ασυμφωνία μπορεί να σχετίζονται με τις δοκιμασίες χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Η προηγούμενη μελέτη βασίστηκε στην ΜΤΤ δοκιμασία που μετρά μια μεταβολική δραστικότητα (μείωση του ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο προς φορμαζάνη) [22]. Αυτή η δοκιμασία μπορεί να επηρεαστεί από πολλούς συνθήκες, π.χ. μεταβολικές αλλαγές, και μπορεί να οδηγήσει στην υποεκτίμηση των ανασταλτικών αποτελεσμάτων της ανάπτυξης [33] – [35]. σε αντίθεση, στην παρούσα μελέτη, αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις εξής

ΕΖΗ2

σίγηση παρατηρήθηκαν με συνέπεια σε τρεις . ανεξάρτητες δοκιμασίες ευρήματά μας δείχνουν έτσι ότι ΕΖΗ2 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, όπως έχει αναφερθεί για διάφορες άλλες οντότητες του καρκίνου [2] -. [9], [11]

Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί πώς ΕΖΗ2 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Ως κρίσιμο συστατικό του συμπλέγματος PRC2 μεταγραφικό καταστολέα, ΕΖΗ2 μπορεί να οδηγήσει στην καταστολή των αντι-πολλαπλασιαστική γονιδίων. μια ενδιαφέρουσα μελέτη έδειξε πρόσφατα ότι ΕΖΗ2 οδηγεί στην καταστολή της ανάπτυξης ανασταλτική

p27

γονίδιο ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [4]. Από το p27 δρα στο G1 /μετάβαση S – που βρήκαμε να επηρεαστούν από

ΕΖΗ2

φίμωση στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου – και από ρ27 επίπεδα είναι συχνά χαμηλή σε καρκίνους του παχέος εντέρου [26], [27], ελέγξαμε μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και τα επίπεδα p27

in vivo

και

in vitro

.

Ωστόσο, συγκριτικές αναλύσεις των ΕΖΗ2 και της έκφρασης p27 δεν παρουσιάζουν στατιστικά σχετική θετική ή αρνητική σύνδεση σε καρκίνους του παχέος εντέρου

in vivo

, ανά ασθενή βάση. Επιπλέον, η εξάντληση ΕΖΗ2 δεν οδήγησε σε μια εκ νέου έκφραση του ρ27 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου

in vitro

, σε χρονικά σημεία όπου οδήγησε σε εξαιρετικά αυξημένη έκφραση ρ27 σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές [4]. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι – σε αντίθεση με την κατάσταση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα – τα επίπεδα ρ27 δεν κριτικά ρυθμίζονται από ΕΖΗ2 σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Έτσι, το φάσμα των γονιδίων στόχων ΕΖΗ2 μπορεί να ποικίλλει σε ένα ιστό ή κύτταρο-ειδικό τρόπο.

Για να έχετε εικόνα για το φάσμα των γονιδίων, τα οποία επηρεάζονται από την εξάντληση ΕΖΗ2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων, εκτελέσαμε ολόκληρο το μεταγραφικό γονιδιώματος αναλύσεις στα κύτταρα DLD1 και LoVo. Μεταξύ των 139 γονιδίων, τα οποία επηρεάστηκαν σημαντικά σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, πάνω από το ένα τέταρτο είναι γνωστό ότι είναι καρκινο-συναφές. Το φάσμα των προσβεβλημένων γονιδίων είναι συνεπές με την υπόθεση ότι ΕΖΗ2 είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη, τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού, σηματοδότηση, και κίνηση /εισβολή [1], [36]. Πρόσθετες εργασίες που απαιτούνται για να αναλύσει τους ακριβείς μηχανισμούς με τους οποίους ΕΖΗ2 μπορεί να μεταβάλλει την έκφραση αυτών των γονιδίων και να μελετήσει λεπτομερώς πιθανή συμβολή τους στην ανάπτυξη απελευθέρωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Εμείς επιβεβαίωσε τα στοιχεία array με ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων 5 από qRT-PCR:

Dag1

,

MageD1

,

sdc1

,

Timp2

, και

Tob1

. Σύμφωνα με την ανάλυση μεταγραφικό,

ΕΖΗ2

αποσιώπηση αυξηθεί η έκφραση όλων των γονιδίων σε 5 qRT-PCR αναλύσεις, καθώς και. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ΕΖΗ2 μπορεί καταστέλλουν τα γονίδια αυτά, είτε άμεσα είτε έμμεσα, σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Όλα τα 5 γονίδια αναφερθεί ότι εμφανίζουν αντιπολλαπλασιαστική ή /και antiinvasive δυναμικό [28] – [32] και ως εκ τούτου προς τα κάτω ρύθμιση τους θα είναι σύμφωνη με μια πιθανή ογκογόνο δράση του ΕΖΗ2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Λόγω της προαγωγής της ανάπτυξης. ρόλος του ΕΖΗ2 σε διάφορους καρκίνους, η αναστολή της ΕΖΗ2 συζητείται επί του παρόντος ως μια ελκυστική νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου [1], [12]. Πράγματι,

ΕΖΗ2

αναστολή από siRNAs, ή εξάντληση των συστατικών PRC2 από το φάρμακο 3-deazaneplanocin Α (DZNep), που ασκείται antioncogenic επιδράσεις, αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και /ή επαγωγής απόπτωσης [2] – [7], [11], [37], [38], εξουδετερώνοντας την εισβολή και τη μετάσταση [9], [10], καθώς και από την αναστολή της αγγειογένεσης των όγκων [8].

το εύρημα στη μελέτη μας ότι ΕΖΗ2 συμβάλλει στην πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου επεκτείνει το φάσμα των οντοτήτων του όγκου που μπορεί θεραπευτικώς να επωφεληθούν από την αναστολή ΕΖΗ2 με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Θεωρώντας ΕΖΗ2 ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο, ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι ΕΖΗ2 εκφράζεται επίσης σε φυσιολογικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του στρώματος κρυπτών του παχέος εντέρου [22]. Σημαντικά, ΕΖΗ2 έχει βρεθεί ότι ασκούν σημαντικότερο ρυθμιστικό λειτουργίες σε διάφορους ιστούς, όπως ο έλεγχος του διαφοροποίηση ιστού-ειδικών προγονικών και αρχέγονων κυττάρων [39] – [42]. Επιπλέον, η πρόσφατη παρατήρηση ότι ΕΖΗ2 μπορεί να δρα ως καταστολέας όγκων σε ορισμένες αιματολογικές διαταραχές [14], [15], [16] δείχνει ότι η αναστολή ΕΖΗ2 μπορούσε ακόμη προωθήσει ογκογένεση, σε ορισμένους ιστούς. Έτσι, παρεμβαίνοντας με λειτουργία ΕΖΗ2 ως θεραπευτική στρατηγική φέρει τον κίνδυνο να προκαλέσουν ανεπιθύμητες παρενέργειες και είναι πιθανό να απαιτήσει πολύ ειδική παράδοση των αναστολέων ΕΖΗ2 στα κύτταρα-στόχους τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και επιμολύνσεις

HCT116, DLD1, LoVo, WiDr, SW620, HCT15, RKO, Τ84, Caco-2, και ΟοΙο205 κυτταρικές σειρές καρκινώματος του κόλου ήταν ένα είδος δώρου από τον Dr. Μ von Knebel Doeberitz (Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης ), SW480 από τον Dr. S. Wiemann (γερμανικά Cancer Research Center, Heidelberg), και ΗΤ29 από τον πυρήνα του πολιτισμού εγκατάσταση των κυττάρων και των ιστών του Ερευνητικού Κέντρου Καρκίνου της Γερμανίας, της Χαϊδελβέργης. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM είτε (ρΗ 7,2), RPMI ή μέσο McCoys, ενισχυμένο με 10% FCS, 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml θειική στρεπτομυκίνη.

Τα πλασμίδια διαμολύνθηκαν με συγκαταβύθιση φωσφορικού ασβεστίου [43] σε κύτταρα HCT116 ή με Fugene HD (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σε DLD1, LoVo, και RKO κύτταρα. Συνθετικά siRNAs επιμολύνθηκαν με Dharmafect (Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6-cm στο 15% έως 25% συρροή. Dharmafect 4 και siRNAs (τελική συγκέντρωση 100 ηΜ) και οι δύο αραιωμένα σε Ορίί-ΜΕΜ Ι μειώνεται από ορό μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και αναμίχθηκε σε έναν όγκο 400 μΙ διαλύματος διαμολύνσεως.

Πλασμίδια και συνθετικά siRNAs

siRNAs ήταν είτε συντίθενται χημικά (Dharmacon) ή εκφράζονται ως Τα siRNAs από pCEPsh, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [44]. Τα παρακάτω

χρησιμοποιήθηκαν ΕΖΗ2

-targeting siRNAs: siEZH2-1 5′-GAAUGGAAACAGCGAAGGA-3 ‘(προσχεδιασμένα siRNA από Dharmacon), siEZH2-2 5′-GACUCUGAAUGCAGUUGCU-3′ [7], και siEZH2-3 5’-GCUGAAGCCUCAAUGUUUA-3 ‘(προσχεδιασμένα siRNA από Dharmacon). Η siEZH2pool αποτελούνταν από τρεις siRNAs αναμίχθηκαν σε ισομοριακές συγκεντρώσεις. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα siRNAs ελέγχου: sicontr-1 5’-CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 ‘[45], sicontr-2 5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3′ (προσχεδιασμένα siRNA από Dharmacon, που περιέχουν τουλάχιστον τέσσερις αναντιστοιχίες σε όλα τα γνωστά ανθρώπινα γονίδια), και siluc 5’-CAUCACGUACGCGGAAUAC-3 ‘(στόχευση

Photinus pyralis

λουσιφεράσης [46]).

εκχύλιση RNA, ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qRT-PCR), και πρωτεΐνες Οι αναλύσεις

RNA απομονώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [47] και επαναιωρήθηκε σε RNAse ελεύθερο νερό. Οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν με NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE USA), στα 260 nm. Η αντίστροφη μεταγραφή 1 μα RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του εκκινητή ολιγο-άΤ και Kit ProtoScript Μ-MuLV Taq RT-PCR (New England Biolabs, Frankfurt, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου με έναν ανιχνευτή 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), χρησιμοποιώντας το SYBR πράσινο PCR Master Mix (Applied Biosystems), συμπληρωμένο σε 500 ηΜ εκάστου προς τα εμπρός και αντίστροφη αλφαβητάρι.

ΕΖΗ2

(NM_004456) έκφραση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον πρόσθιο εκκινητή 5′-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5′-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3’ [48]. Για την ανίχνευση του

ρ27

Kip1

(NM_004064) έκφραση 5′-GCCAGACGGGGTTAGCGGAG-3 ‘χρησιμοποιήθηκε ως προς τα εμπρός και 5′-GAGGCCAGGCTTCTTGGGCG-3’ ως αντίστροφος εκκινητής.

MageD1

(NM_001005333) έκφραση προσδιορίσθηκε με εκκινητές 5′-GGCTGTCCTCTGGGAGGCACT-3 ‘και 5′-GGGTTGCTGTTGGGCACTCGT-3’,

Timp2

(NM_003255) έκφραση με εκκινητές 5′-TCTACACGGCCCCCTCCTCG-3 ‘και 5′-TGGGGCAGCGCGTGATCTTG-3’,

sdc1

(NM_001006946) έκφραση με εκκινητές 5′-CGGCCCTGCCGCAAATTGTG-3 ‘και 5′-CCTCCAGGCCGGTGGGTTCT-3’,

Tob1

(NM_005749) έκφραση με εκκινητές 5′-TGCAGCCTATGGAGGCCTCAA-3 ‘και 5′-CCCCTTGGGCCCGTGCATTTT-3’, και

Dag1

(NM_001165928) έκφραση με εκκινητές 5′-GTCGTCGGGCGCTCATTTCGA-3 ‘και 5′-CCAGCCGTGTAGCGCTCACTG-3’. Οι αλληλουχίες εκκινητή GAPDH και HPRT1 και τις συνθήκες ποδηλασίας έχουν περιγραφεί προηγουμένως [49]. Τα μεγέθη των προϊόντων PCR αρχικά επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης και στη συνέχεια ελέγχεται με τήξη ανάλυση σημείο μετά από κάθε αντίδραση. Σχετική ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το συγκριτικό Ct (2

-ΔΔCt) μέθοδος [50]. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το πλάσια διαφορά σε έκφραση γονιδίου κανονικοποιήθηκε με ένα δείκτη γονίδιο καθαριότητα (ο γεωμετρικός μέσος των

GAPDH

και

HPRT1

επίπεδα έκφρασης), και σε σχέση με ένα δείγμα βαθμονομητή. Τα γονίδια καθαριότητας επιλέχθηκαν ανάμεσα σε αρκετές δοκιμαστεί γονίδια καθαριότητας για την ομαλοποίηση της γονιδιακής έκφρασης, αφού παρουσίασαν αποδόσεις ίσες ενίσχυση ως τα γονίδια μας ενδιαφέρουν. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών σε μετρημένες μεταβλητές μεταξύ των ελέγχων και αγωγή ομάδες προσδιορίσθηκε με διπλής όψεως paired t-test χρησιμοποιώντας το λογισμικό Plot Sigma (Systat Software Inc., San Jose, CA). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε p ≤ 0,05.

Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν 48 έως 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [51]. Για κυτοσολικό και την προετοιμασία πυρηνικό εκχύλισμα, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet® Ρ-40, ρΗ 7.4) και επωάστηκε επί πάγου. Ακέραια πυρήνες ιζηματοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση και το εκχύλισμα κυτταρολύματος στο υπερκείμενο μεταφέρθηκε. Οι πυρήνες πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 0,05% Nonidet® Ρ-40 και οι πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν όπως περιγράφεται για εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης. Για τις αναλύσεις στυπώματος Western, 20-30 μα εκχυλίσματος πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 12.5% ​​SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη Immobilon-Ρ (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA), και αναλύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (GE Healthcare, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο ). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα (AC22, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), αντι-ρ27 αντίσωμα (# 610242, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), αντι-κυκλίνης D1 αντίσωμα (DSC6 , Cell Signaling), και αντι-άλφα-τουμπουλίνης αντίσωμα (cp06, Calbiochem, Darmstadt, Germany).

πλήθος των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου αναλύσεις

Για αναλύσεις μέτρηση κυττάρων, συνολικοί αριθμοί κυττάρων προσδιορίστηκαν 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Σύνολο κύτταρα ανά χιλιοστόλιτρο μετρήθηκαν, χρησιμοποιώντας ένα μετρητή Countess κυττάρων (Invitrogen).

Για τις αναλύσεις του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, πλύθηκαν σε παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και σταθερή σε 80% για όλη τη νύχτα ψυχρή αιθανόλη στους -20 ° C.