Αφηρημένο

Η ανώμαλη ενεργοποίηση του σκαντζόχοιρου (Hh) μονοπατιού σηματοδότησης έχει εμπλέκεται στην επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και του καρκίνου βλαστικών κυττάρων, όπως (CSC) συντήρηση? Και οι δύο διαδικασίες μπορούν να οδηγήσουν στην πρόοδο του όγκου και την αντίσταση σε θεραπεία διάφορους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο. Hh συνεργάζεται με τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μονοπατιού σηματοδότησης στην εμβρυογένεση. Βρήκαμε ότι το μονοπάτι σηματοδότησης Hh σίγησε σε κύτταρα EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο καρκίνο μη-μικρών κυττάρων του πνεύμονα (NSCLC), ενώ είχε ανάρμοστα ενεργοποιείται σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC, που συνοδεύεται από επαγωγή EMT και ABCG2 υπερέκφραση. Προς τα πάνω ρύθμιση Hh σηματοδότησης μέσω εξωγενών έκθεση ΕΛΕΡΠΕ μειωτικά E-cadherin έκφρασης και αυξημένα σαλιγκάρι και έκφραση ABCG2, με αποτέλεσμα την ανοχή gefitinib (

P & lt?. 0

001

) σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα. Ο αποκλεισμός του μονοπατιού σηματοδότησης Hh χρησιμοποιώντας το SMO ανταγωνιστή SANT-1 αποκατέστησε την έκφραση Ε-καδερίνης και ρυθμίζουν προς τα κάτω σαλιγκάρι και ABCG2 σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα. Ένας συνδυασμός του Sant-1 και gefitinib σημαντικά ανέστειλε την ογκογένεση και τον πολλαπλασιασμό σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα (

P & lt?. 0

001

). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η υπερδραστηριότητα του σηματοδότηση Hh οδήγησε στην αντίσταση EGFR-ΤΚΙ, από την εισαγωγή EMT και ABCG2 ρύθμιση προς τα άνω, και τον αποκλεισμό της ομάδας HH σηματοδότησης συνεργικά αυξημένη ευαισθησία σε EGFR-TKIs στην πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια ανθεκτικά κύτταρα NSCLC. έκφραση Ε-καντερίνης μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης της καταλληλότητας της συνδυασμένης εφαρμογής ενός αναστολέα HH και EGFR-TKIs σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική NSCLCs

Παράθεση:. Bai XY, Zhang XC, Yang SQ, Ένα SJ, Chen ZH, Su J, et al. (2016) Ο αποκλεισμός του Hedgehog Σηματοδοσίας Αυξάνει Συνεργιστικά Ευαισθησία σε αναστολείς υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα κινάσης τυροσίνης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Κυτταρικές Γραμμές. PLoS ONE 11 (3): e0149370. doi: 10.1371 /journal.pone.0149370

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 28η Δεκεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 31 του Γενάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: τέταρτης Μαρτίου του 2016

Copyright: © 2016 Bai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι autors έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία. Διάμεση επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του μη μικροκυτταρικού του πνεύμονα (NSCLC), οι οποίοι λαμβάνουν χημειοθεραπεία πρότυπο είναι μόνο 9-12 μήνες [1]. Η έλευση των μοριακά στοχευμένες θεραπείες έχει ρίξει περισσότερο φως στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. αναστολείς της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR-TKIs) έχουν γίνει η καθιερωμένη θεραπεία πρώτης γραμμής για το προχωρημένο NSCLC με ευαίσθητες μεταλλάξεις του EGFR [2, 3]. Ωστόσο, σχεδόν όλοι οι ασθενείς αναπτύσσουν αντίσταση αναπόφευκτα εντός 6-12 μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας με EGFR ΤΚΙ [4]. Παρά το γεγονός ότι διάφοροι μηχανισμοί, μεταξύ των οποίων το δευτερεύον μετάλλαξη Τ790Μ [5, 6], η ενίσχυση ΜΕΤ [7, 8], ο αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) υπερέκφραση [9], και η μετάλλαξη KRAS [10, 11], έχουν αναφερθεί, ξεπερνώντας EGFR -TKI αντίσταση εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση στην κλινική πράξη.

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η επαγωγή της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) στα αποτελέσματα κακοήθεια στην πρόοδο του όγκου και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [12, 13]. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) είναι ένας άλλος λόγος για την αντοχή στη συμβατική θεραπεία όγκου [14]. Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι οι διαδικασίες EMT θα μπορούσε να δημιουργήσει ΚΕΠ [15]. Η hedgehog (Hh) μονοπατιού σηματοδότησης, ένας κύριος ρυθμιστής πολλών θεμελιωδών διεργασιών, ρυθμίζει στενά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, ΕΜΤ, και το στέλεχος συντήρηση κυττάρων σπονδυλωτών εμβρυϊκή ανάπτυξη, και ανώμαλη ενεργοποίηση Hh σε ιστούς ενηλίκων έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση, αυτο-ανανέωση , και αντοχή φαρμάκου σε διάφορους τύπους ανθρώπινου καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [16-18]. Τρεις Hh ομόλογα έχουν εντοπιστεί σε ανθρώπους: Sonic hedgehog (ΕΛΕΡΠΕ), ινδική σκαντζόχοιρος (ΙΗΗ), και Desert hedgehog (DHH) [19, 20]. Το μονοπάτι σηματοδότησης Hh εκκινείται από την δέσμευση σε μια 12-διαμεμβρανική πρωτεΐνη, «patched» (PTCH) συνδέτη Hh. Σε περίπτωση απουσίας του συμπλοκοποιητού Hh, PTCH καταστέλλει τη δραστηριότητα της smoothened (SMO), έναν υποδοχέα G-σαν συζευγνύονται με πρωτεΐνη, εμποδίζοντας τον εντοπισμό του στο πρωτογενές cilium. Μόλις Hh δεσμεύεται με PTCH, η αναστολή της ΠΕΑ ανακουφίζεται, επιτρέποντας ΠΕΑ να μετατοπιστεί προς τον πρωτογενή cilium και για την μεταγωγή του σήματος Hh στην οικογένεια GLI παραγόντων μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου (GLI1, GLI2, GLI3) [20, 21]. Οι GLIS τότε μετατοπίζεται εντός του πυρήνα για τη ρύθμιση της ενεργοποίησης του Hh γονιδίων στόχων που εμπλέκονται σε διάφορες διαδικασίες, όπως είναι η ρύθμιση ανάδρασης, πολλαπλασιασμό, ΕΜΤ, και αυτο-ανανέωση [22, 23].

Κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, το Hh μονοπάτι σηματοδότησης συνεργάζεται με το σηματοδοτικό μονοπάτι EGFR στη διαδικασία νεοφλοιού πολλαπλασιασμού των αρχέγονων κυττάρων [23]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι συνεργατική αλληλεπιδράσεις μεταξύ του Hh και οδούς EGFR έχει ως αποτέλεσμα συνεργική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου GLI και συμβάλλουν στην κακοήθη εξαλλαγή των καρκινικών κυττάρων,

in vitro

και

in vivo

[24 , 25]. Στο σύνολό τους, εμείς υποτίθεται ότι η διέγερση της οδού σηματοδότησης Hh μπορεί να παρακάμψει ή να μετριάσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του EGFR-ΤΚΙδ σε NSCLC. Έτσι, χρησιμοποιείται EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών μοντέλων NSCLC κύτταρο πρώτα να αποδείξει ότι προς τα πάνω ρύθμιση του σηματοδότηση Hh συνέβαλαν στην EGFR-ΤΚΙ-αντίσταση. Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός ενός αναστολέα σηματοδότησης Hh και EGRF-ΤΚΙδ είχε μια έντονη συνεργική επίδραση στα κύτταρα NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Gefitinib παρεσχέθη από την AstraZeneca (Cheshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Ο αναστολέας Hh SANT-1 αγοράστηκε από TOCRIS Bioscience. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Shh Ν-άκρο αγοράστηκε από την R & amp? D Systems. Αντισώματα έναντι Σαλιγκάρι (# 9585), Ε-καδερίνης (# 3195), και ABCG2 (# 4477) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Αντισώματα έναντι GLI1 (ab92611) αγοράστηκαν από Abcam.

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά (HBE) ελήφθη από την Sciencell Εταιρείας και καλλιεργούνται σε βρογχικό μέσο επιθηλιακών κυττάρων (Sciencell, 3211) . Ανθρώπινα κύτταρα Α549 αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και διατηρήθηκε στο εργαστήριο μας. Ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα H1975 και PC9 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Είχαν ευγενώς από το Δρ Tony Mork (Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ). κύτταρα Α549 είναι ένα πρωτογενές ανθεκτική κυτταρική γραμμή EGFR-ΤΚΙ λόγω υπόθαλψη K-ras G12S μετάλλαξη τους. κύτταρα H1975 είναι ένα δευτερεύον ανθεκτική κυτταρική γραμμή EGFR-TKIs λόγω του EGFR L858R και μεταλλάξεις Τ790Μ. κύτταρα PC9 λιμάνι του EGFR εξόνιο 19 διαγραφή καρέ και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε EGFR-TKIs. κυτταρικές γραμμές NSCLC διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 UI /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

Ασθενείς

δειγμάτων όγκου NSCLC που περιέχει το EGFR εξόνιο 19 διαγραφή ή ευαίσθητο μετάλλαξης L858R, EGFR Τ790Μ δευτερογενή μετάλλαξη, και μετάλλαξη KRAS ελήφθησαν από Guangdong Γενικό Νοσοκομείο (Guangzhou, Κίνα) υπό την έγκριση αναθεώρηση της επιτροπής θεσμικών. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Guangdong Γενικό Νοσοκομείο (ιατρική δεοντολογία YUE αρ. 2013185 (R2)). Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Η παρουσία του EGFR και KRAS μεταλλάξεις σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με απευθείας προσδιορισμού σειράς PCR-based

Η ανοσοκυτταροχημεία και ανοσοϊστοχημεία

κύτταρα NSCLC σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με ψυχρή ακετόνη.? κατεψυγμένες τομές (5 μm) σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή μεθανόλη για 10 λεπτά και ξηραίνεται στον αέρα. Αυτά τα πλακίδια βυθίστηκαν σε 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά για να εμποδίσει ενδογενών υπεροξειδασών, κατόπιν επωάστηκαν με 10% λευκωματίνη ορού κατσίκας για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να εμποδίσει την μη ειδική σύνδεση αντισώματος. Ακολούθως, τα κύτταρα βάφτηκαν με GLI1, Ε-καδερίνης, σαλιγκάρι, και ABCG2 πρωτογενή αντισώματα (1: 100) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με Envision

+ /HRP έναντι κουνελιού (ϋΑΚΟ GK400305, Glostrup, Denmark) για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) ανίχνευσης. Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη και μετά την αφυδάτωση ήταν τοποθετημένα μόνιμα. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις, παραλείποντας τα πρωτογενή αντισώματα.

Όλα τα πλακίδια αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παθολόγους που αγνοούσαν τις πληροφορίες κρούσματος. Περιπτώσεις με χρώση σε & gt? 10% των κυττάρων θεωρήθηκαν θετικά. Η ανοσοϊστοχημική αντιδραστικότητα βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα από το 0 έως 3 σύμφωνα με την χρώση ένταση και το ποσοστό των ανοσοθετικών κυττάρων, ως ακολούθως: 0, καμία χρώση, & lt? 10% θετικά κύτταρα, 1, ασθενής χρώση σε & gt? 10% των κυττάρων του όγκου ή μέτρια χρώση σε 10-40% των κυττάρων του όγκου, 2, μέτρια χρώση σε & gt? Το 40% των κυττάρων του όγκου ή ισχυρή χρώση σε 10-40% των κυττάρων του όγκου, ή 3, ισχυρή χρώση στα & gt? Το 40% των κυττάρων του όγκου [26].

απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) από τις κυτταρικές γραμμές σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το υπεριώδες φασματοφωτόμετρο (Nanodrop ND-1000). ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας 1% μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Η σύνθεση του cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης μεταγραφής κιτ (ΑΒΙ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντιδράσεις Q-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση γονιδιακής TaqMan κύριο έκφραση μείγμα (ΑΒΙ, USA), β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Όλες οι αντιδράσεις qPCR διεξήχθησαν εις τριπλούν. Primer αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν οι εξής: 5′-AGCGTGAGCCTGAATCTGTG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CAGCATGTACTGGGCTTTGAA-3′ (αντίστροφο) για GLI1, 5’-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5’-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT- 3 ‘(αντίστροφο) forβ-ακτίνης. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης RNA των GLI1 υπολογίστηκε με 2 μεθόδους

-Δct.

ανάλυση Western blot

κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε 25 εκατοστά

φιάλες καλλιέργειας 2 και συγκομίζονται στην ημερολόγιο φάση ανάπτυξης για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Κυττάρων Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται από κύτταρα σε αγωγή χρησιμοποιώντας δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό, συμπληρωμένου με αναστολείς πρωτεάσης PMSF. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία δικινχονινικού οξέος. Πρωτεΐνες (30 ug /φρεάτιο) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι πρωτεΐνες μπλοκαριστεί από 5% Πρωτεΐνες γάλακτος χωρίς λίπος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με επώαση των μεμβρανών με την παρουσία των ακόλουθων πρωτογενή αντισώματα: GAPDH (1: 1000), ABCG2 (1: 500), σαλιγκάρι (1: 500), Ε-καδερίνης (1: 500) και Gli1 (1 : 500) και στη συνέχεια επωάστηκαν με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Η πρόσδεση του αντισώματος ανιχνεύτηκε με ένα ενισχυμένο κιτ χημειοφωταύγειας (Thermo, Rockford, IL, USA).

Films σαρώθηκαν και αναλύθηκαν με λογισμικό εικόνας J για πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση. Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια σύγκριση προς μη κατεργασμένο έλεγχο.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2000 /φρεάτιο για PC9, 3000 /φρεάτιο για H1975, και 1500 /φρεάτιο για Α549. Μετά από ολονύκτια προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, με πέντε αντίγραφα, με SHH-N 1 μg /mL (R &? D Systems) για 24 ώρες, ακολουθούμενη από διάφορες συγκεντρώσεις του gefitinib για 72 ώρες, ή σε επεξεργασία άμεσα με διάφορες συγκεντρώσεις αναστολέων για 72 h. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε σε πέντε πανομοιότυπα φρεάτια ανά συνθήκη δοκιμασίας χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ (Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

2 /φρεάτιο. Μετά από ολονύκτια προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, εις τριπλούν, με το φάρμακο τις ημέρες 0, 3, και 6. Μετά από επώαση για 10 ημέρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και οξικό οξύ (3: 1, ν /ν). Στη συνέχεια, οι αποικίες βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και ποσοτικοποιείται με απευθείας μέτρηση των αποικιών. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS. (Ver 13.0?. SPSS Inc., Chicago, IL). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SE τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Πρώτον, τα δεδομένα ελέγχθηκαν για μια κανονική κατανομή και ομοσκεδαστικότητα. Διαφορές στην Q-PCR, στύπωμα Western τιμές της κλίμακας του γκρι, και το σχηματισμό κυτταρικού κλώνου, μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν με μονόδρομη ANOVA, οι διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό εξετάσθηκαν με παραγοντική ανάλυση, και οι διαφορές εντός του ομίλου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμή LSD εάν τα δεδομένα κανονικά κατανεμημένη και έδειξε ομοσκεδαστικότητα. Διαφορετικά, μια δοκιμή Welch χρησιμοποιήθηκε, και οι διαφορές εντός του ομίλου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ Τ3 Dunnett. Οι διαφορές στην κατάταξη των δεδομένων μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Kruskal-Wallis H-test. Οι συσχετίσεις των κατετάγη δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ συσχέτισης τάξης Spearman του.

P

τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν δείχνουν στατιστική σημασία σε όλες τις περιπτώσεις.

Αποτελέσματα

Διαφορές στη δραστηριότητα σηματοδοτικό μονοπάτι Hh μεταξύ EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC

Για την εκτίμηση Hh σηματοδότησης διαφορές μονοπάτι μεταξύ EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC, τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC, PC9, H1975, και Α549, που φέρουν διαφορετικές μεταλλάξεις και διαφέρουν ως προς την ευαισθησία στην TKIs, χρησιμοποιήθηκαν. Πρώτον, η έκφραση GLI1, ενός δείκτη ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης Hh, προσδιορίστηκε με ανοσοκυτταροχημεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, GLI1 εκφράστηκε στους πυρήνες του EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές Α549 και H1975, αλλά η έκφραση GLI1 ήταν αρνητική στο EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητη PC9 κυτταρική γραμμή. Επιβεβαιώσαμε αυτό το αποτέλεσμα με Q-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β και 1Γ, GLI1 εκφράστηκε σε πολύ χαμηλό επίπεδο σε σύγκριση με PC9 H1975 και Α549 κύτταρα

(Ρ & gt?. 0

001

και

P = 0

.

005

αντίστοιχα). Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι σηματοδότηση Hh ρυθμίζει ΕΜΤ μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του σαλιγκαριού παράγοντα μεταγραφής και προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης [27, 28]. Η ABCG2 δείκτης βλαστικών κυττάρων είναι επίσης άμεσος στόχος του μονοπατιού σηματοδότησης Hh [29]. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω οι διαφορές Hh μονοπάτι μεταξύ EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων, αυτά τα τρία σημαντικά καθοδικά γονίδια στόχοι εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. Βρήκαμε ότι η έκφραση σαλιγκάρι ήταν σημαντικά ασθενέστερη σε EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητη PC9 κυτταρική γραμμή σε σύγκριση με τα EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική κυτταρικές σειρές H1975 και Α549 (

P

= 0,001). έκφραση Ε-καδερίνης σε κύτταρα PC9 ήταν αρκετά υψηλή, ενώ η έκφραση της ήταν πολύ ασθενής στα EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές H1975 και Α549 (

P

& lt? 0,001? Σχήμα 1D). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές που σαλιγκάρι έκφραση αντιστρόφως ανάλογη με εκείνη του Ε-καδερίνης [30, 31]. έκφραση ABCG2 ήταν επίσης αρκετά υψηλή στα EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική κυτταρικές σειρές H1975 και Α549 σύγκριση με την έκφραση της στην EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητη PC9 κυτταρική γραμμή (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1D). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μία σημαντική διαφορά στην δραστικότητα του μονοπατιού σηματοδότησης Hh μεταξύ EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων. Το μονοπάτι σηματοδότησης Hh ήταν παρεκκλίνοντα ενεργοποιείται σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα, ενώ είχε σιγήσει σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα.

(Α). Οι διαφορές στην έκφραση GLI1 σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC προσδιορίζεται με ανοσοκυτταροχημεία. GLI1 εκφράστηκε στους πυρήνες του EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική κυτταρικές σειρές Α549 και H1975, αλλά η έκφραση GLI1 ήταν αρνητική στο EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητη κυτταρική γραμμή PC9. (ΣΙ). έκφραση του mRNA σχετική GLI1 σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC καθορίζεται από την Q-PCR? Η έκφραση του PC9 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των H1975 και Α549? ** (

P

& lt? 0,01). (ΝΤΟ). Οι διαφορές στην έκφραση GLI1 σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC προσδιορίζεται με κηλίδα western. (Δ) διαφορές στο E-cadherin, σαλιγκάρι, και την έκφραση ABCG2 σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC προσδιορίζεται με κηλίδα western.

Η

Η αναβάθμιση της δραστηριότητας μονοπατιού σηματοδότησης Hh από την έκθεση σε μόλυβδο ΕΛΕΡΠΕ για την ανοχή gefitinib συνοδεύεται από επαγωγή EMT και ABCG2 αυξητική ρύθμιση σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα NSCLC

με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, υποθέσαμε ότι ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh μπορεί να συνεισφέρει στην αντίσταση EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC επηρεάζοντας EMT και συντήρηση CSC. Για να εξεταστεί αυτή η πιθανότητα, εξετάσαμε το ρόλο της Shh σηματοδότηση σε κύτταρα NSCLC. Πρώτον, τα κύτταρα PC9 EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ν-Shh (0,5 μg /mL). αποτέλεσμα ανοσοκυτταροχημεία έδειξαν ότι η έκφραση σε κύτταρα GLI1 PC9 ήταν αρνητική χωρίς έκθεση σε Ν-Shh, αλλά εκφράστηκε στους πυρήνες μετά την κατεργασία Ν-Shh για 24 και 48 ώρες (Σχήμα 2Α). Western κηλίδωση και τα αποτελέσματα Q-PCR έδειξε ότι η έκφραση GLI1 προφανώς αυξημένα μετά από έκθεση σε Ν-Shh για 24 ώρες και 48 ώρες (

P

= 0.008 και

P

& lt? 0.001 αντίστοιχα? Εικ 2Β και 2C). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι σηματοδότηση Hh ενεργοποιήθηκε με εξωγενή Ν-Shh σε κύτταρα PC9.

(Α) Ανοσοκυτταροχημική ανάλυση των GLI1 σε κύτταρα PC9 μετά Ν-Shh (/mL 0,5 μg) θεραπεία για 0, 24, και 48h. έκφραση GLI1 στα κύτταρα PC9 ήταν αρνητική χωρίς έκθεση σε Ν-Shh. GLI1 εκφράστηκε στους πυρήνες μετά την κατεργασία Ν-Shh για 24 και 48 ώρες. (Β) Ανάλυση Western blot των GLI1 σε κύτταρα PC9 μετά Ν-Shh θεραπεία (/mL 0,5 μg) για 0, 24, και 48 ώρες. (C) Ανάλυση Q-PCR του mRNA GLI1 σχετική έκφραση σε κύτταρα PC9 μετά Ν-Shh (/mL 0,5 μg) θεραπεία για 0, 24, και 48 ώρες? έκφραση GLI1 προφανώς αυξημένα μετά από έκθεση σε Ν-Shh για 24 ώρες και 48 ώρες? ** (

P

& lt? 0,01). (Δ) πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC9 εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ μετά από θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις gefitinib με ή χωρίς προ-έκθεση σε εξωγενή Ν-Shh (0,5 μg /mL) για 24 ώρες? σε σύγκριση με την ομάδα gefitinib μονοθεραπεία, η έκθεση σε εξωγενή Ν-Shh σημαντικά αυξημένη ανοχή gefitinib στο PC9 κύτταρα ** (

P

& lt? 0,01). (Ε) Ανάλυση Western blot της Ε-καδερίνης, σαλιγκάρι και ABCG2 σε κύτταρα PC9 μετά Ν-Shh (/mL 0,5 μg) θεραπεία για 0, 24, και 48 ώρες.

Η

Στη συνέχεια, EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητου κύτταρα PC9 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib με ή χωρίς έκθεση σε εξωγενή Ν-Shh (0,5 μg /mL), στη συνέχεια αξιολογήθηκε η βιωσιμότητα τους. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, σε σύγκριση με την ομάδα gefitinib μονού παράγοντα, η έκθεση σε εξωγενή Ν-Shh σημαντικά αυξημένη ανοχή gefitinib σε κύτταρα PC9 (

P

= 0.001? Σχ 2D και S1 και S2 Πίνακες). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Shh οδηγεί σε αντίσταση EGFR-ΤΚΙ σε κύτταρα NSCLC.

Για την εξέταση των μοριακών μηχανισμών στους οποίους η συμβολή της Shh σηματοδοσίας για αντίσταση EGFR-ΤΚΙ σε κύτταρα NSCLC, εξετάσαμε σαλιγκάρι , Ε-καδερίνη και η έκφραση ABCG2 σε 0, 24, και 48 ώρες μετά την επεξεργασία των κυττάρων με PC9 Ν-Shh (0,5 μg /mL) με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχ 2Ε, μετά από έκθεση σε Ν-Shh για 24 ώρες, η έκφραση του σαλιγκαριού ανυψώθηκε (

P

& lt? 0.001), η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν προφανώς εξασθενημένος (

P

= 0,003), και η έκφραση ABCG2 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα PC9 (

P

= 0,008). Αυτά τα αποτελέσματα διατηρήθηκαν για 48 ώρες μετά την Ν-Shh διέγερση. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι υπερενεργοποίηση σηματοδότησης Hh συνέβαλαν στην αντίσταση EGFR-ΤΚΙ σε κύτταρα NSCLC μέσω της ενεργοποίησης της μεταβατικής ΕΜΤ και την προς τα πάνω ρύθμιση ABCG2.

Hh αναστολή αντιστράφηκε επαγωγή ΕΜΤ και μειωμένη έκφραση ABCG2 σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική NSCLC κύτταρα

στη συνέχεια, για να αξιολογήσει περαιτέρω των μοριακών μηχανισμών σηματοδότησης Hh σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC, εξετάσαμε GLI1, σαλιγκάρι, Ε-καδερίνης, και ABCG2 έκφραση σε 0, 24, και 48 ώρες μετά την αγωγή του EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές H1975 και Α549 με SANT-1 (40 μΜ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά από θεραπεία με SANT-1 για 24 ώρες, η έκφραση GLI1 ήταν μειωτικά (

P

& lt? 0.001) και η έκφραση Σαλιγκάρι ήταν σημαντικά εξασθενημένο σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (

P

& lt? 0.001 και

P

= 0,003 αντίστοιχα)? μετά την αγωγή με SANT-1 για 48 ώρες, η έκφραση σαλιγκάρι ήταν σχεδόν απούσα σε H1975 κύτταρα (σχήμα 3Α και 3Β). Αντιστρόφως, η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά αυξημένα μετά από αγωγή του EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές με SANT-1 για 48 ώρες (

P

& lt? 0.001). έκφραση ABCG2 ήταν αμελητέα μετά SANT-1 θεραπεία για 24 h (σχήμα 3Α και 3Β). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η αναστολή Hh αντιστραφεί ΕΜΤ και μείωσε την έκφραση ABCG2 σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC.

(Α) και (Β), ανάλυση στυπώματος Western της δραστηριότητας μονοπατιού σηματοδότησης Hh και γονιδίων-στόχων του E -Cadherin, σαλιγκάρι και ABCG2 σε EGFR-ανθεκτικά κύτταρα Α549 και H1975 μετά SANT-1 θεραπεία για 0, 24, και 48 ώρες. (Γ) και (Δ), σχηματισμό αποικίας ποσοτική ανάλυση σε Α549 και H1975 κύτταρα? gefitinib μόνος ή Sant1 μόνο δεν αναστέλλει κλωνογόνο αύξηση αποτελεσματικά. Ωστόσο, οι αποικίες πολύ ελάχιστα που σχηματίζεται στην ομάδα που υποβλήθηκε σε συνδυασμό SANT-1 και gefitinib θεραπεία σε Α549 και H1975 κύτταρα? * (

P

& lt? 0.05), ** (

P

& lt? 0,01). (Ε) και (F), πολλαπλασιασμό των Α549 και H1975 κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ μετά από θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις gefitinib μόνο, SANT-1 μόνη, ή ο συνδυασμός του gefitinib και Sant-1? * (

P & lt? 0

05).

, ** (

P & lt?. 0

01

).

Η

ο συνδυασμός του gefitinib και Sant-1 συνεργιστικά ανέστειλε την ογκογένεση και τον πολλαπλασιασμό σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές NSCLC

Για να καταδειχθεί περαιτέρω ο ρόλος του μονοπατιού σηματοδότησης Hh σε κύτταρα NSCLC, έχουμε μπλοκάρει σηματοδότηση Hh χρησιμοποιώντας το αναστολέας ΠΕΑ SANT-1. Το IC

50 του Sant-1 στις περισσότερες κυτταρικές σειρές NSCLC είναι ~ 40 μΜ [18], και το IC

50 του gefitinib σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα είναι ~ 20 ηΜ [32]. Έτσι, ο EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές Α549 και H1975were επεξεργασία με 40 μΜ SANT-1 μόνη, μόνη 20 ηΜ gefitinib, ή ένα συνδυασμό του Sant-1 και gefitinib. Όπως φαίνεται στο Σχ 3C και 3D, το Sant-1 και gefitinib μόνος δεν αναστέλλει κλωνογόνο αύξηση (

P

= 0.252 και

P

= 0.187 αντίστοιχα). Ωστόσο, οι αποικίες πολύ ελάχιστα που σχηματίζεται στην ομάδα που υποβλήθηκε σε συνδυασμό SANT-1 και gefitinib θεραπείας (

P

& lt? 0.001). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι SANT-1 και gefitinib μπορεί να έχει μια συνεργική επίδραση στο EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC. Για να επιβεβαιωθεί αυτό, αντιμετωπίζεται το EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και H1975 με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του Sant-1 και μόνο, gefitinib μόνο, και συνδυασμούς του Sant-1 και gefitinib, και στη συνέχεια αξιολογούνται πολλαπλασιασμό τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα Α549 ήταν ανθεκτικά όχι μόνο να gefitinib, αλλά και να SANT-1 (

P

= 0.503? Σχ 3Ε και S3 και S4 Πίνακες). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με μία προηγούμενη έκθεση ότι τα κύτταρα Α549 έδειξε υπερενεργοποίηση σηματοδότησης Hh, αλλά ήταν ανθεκτικά σε αναστολείς Hh σηματοδότησης [18]. Ωστόσο, ο συνδυασμός του gefitinib και Sant-1 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 (

P & lt?

0.001? Σχ 3Ε και S3 και S4 Πίνακες). Παρά το γεγονός ότι, σε σύγκριση με το gefitinib, SANT-1 ήταν πιο αποτελεσματική στην H1975 κύτταρα (

P

= 0,002), κύτταρα H1975 έδειξε το «καλύτερο» απάντηση στο συνδυασμό gefitinib + Sant1 (

P & lt?

0.001? Σχήμα 3F και S5 και S6 πίνακες). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι ο συνδυασμός ενός αναστολέα σηματοδότησης Hh και EGFR-TKIs είχε επισημανθεί συνεργιστικά αποτελέσματα επί του EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC.

Δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης Hh σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών ιστούς NSCLC

Για να κατανοήσουμε περισσότερο τη διαφορά σε ΗΗ σηματοδότησης δραστηριότητα μονοπάτι μεταξύ του EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητη και ανθεκτικών NSCLCs, έκφραση GLI1, ABCG2, σαλιγκάρι, και E-cadherin εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε τέσσερις NSCLC ιστοί που περιείχε το εξόνιο EGFR 19 διαγραφή ή την ευαίσθητη μετάλλαξη L858R, τέσσερις ιστούς που περιείχε το δευτερεύον μετάλλαξη EGFR Τ790Μ, και τέσσερις ιστούς που περιείχε την μετάλλαξη KRAS (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GLI1 εκφράστηκε σε δύο EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών ιστούς. Λόγω του μικρού μεγέθους των δειγμάτων, η έκφραση GLI1 δεν έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων (

P

= 0,108). Ωστόσο, η μέση τάξη του EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητους ιστούς ήταν 5,25, δηλαδή της δευτεροβάθμιας ανθεκτικά ιστών μετάλλαξη ήταν 4,88 και η μέση κατάταξη των ιστών μετάλλαξη KRAS ήταν 9.38. Έτσι, μια τάση προς υψηλότερη έκφραση GLI1 βρέθηκε σε ιστούς που περιείχε την μετάλλαξη KRAS (Πίνακες 1 και 2). KRAS NSCLCs μετάλλαξη που φιλοξενούν μπορεί να έχουν υψηλότερη δραστικότητα μονοπατιού σηματοδότησης Hh σε σύγκριση με εκείνους με EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητη μεταλλάξεις και δευτερογενή ανθεκτικών μεταλλάξεων.

(Α) και (Β), αρνητικό έλεγχο και θετικό έκφραση GLI1 σε NSCLC ιστούς . (Γ) και (Δ), αρνητικό έλεγχο και θετικό έκφρασης Ε-καδερίνης σε ιστούς NSCLC. (Ε) και (ΣΤ), αρνητικού ελέγχου και θετική έκφραση Σαλιγκάρι σε ιστούς NSCLC. (G) και (Η), αρνητική και θετική έκφραση ABCG2 στους ιστούς NSCLC.

Η

Η

έκφραση ABCG2 δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα, δευτεροβάθμια ανθεκτικά, και τα πρωτογενή ανθεκτική ιστούς ΜΜΚΠ (

P

= 0,340). E-cadherin ήταν μέτρια ή έντονα εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς NSCLC (9/12,

P

= 0,555). Αντιστρόφως, σαλιγκάρι ήταν αρνητική ή ασθενώς εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς (11/12,

P

= 0,658) (Πίνακες 1 και 2).

ανάλυση συσχέτισης έδειξε ότι η έκφραση Ε-καδερίνης σημαντικά ήταν αρνητικά συσχετίζεται με την έκφραση σαλιγκάρι (

r

= 0.582,

P

= 0,047). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν σύμφωνο με τα πειράματα των κυττάρων. Επιπλέον, η έκφραση GLI1 ήταν αρνητική συσχέτιση με την έκφραση Ε-καδερίνης (

r

= 0.408,

P

= 0.188), και συσχετίζεται θετικά με Σαλιγκάρι (

r

= 0,372,

P

= 0.300) και ABCG2 (

r

= 0.386,

P

= 0,215) έκφρασης. Αν και οι συσχετίσεις δεν είχαν στατιστική σημασία λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος, η τάση ήταν σύμφωνο με τα πειράματα κύτταρο.

Συζήτηση

Το μονοπάτι σηματοδότησης Hh είναι ένας αποτελεσματικός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία και την πρόληψη της πολλούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο. Ακατάλληλη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh έχει αναφερθεί σε NSCLC [17, 18, 33, 34]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η επαγωγή EMT σχετίζεται με ευαισθησία σε EGFR-ΤΚΙ στον καρκίνο του πνεύμονα [35-37]. Το μονοπάτι σηματοδότησης hedgehog ρυθμίζει σφικτά επαγωγή ΕΜΤ μέσω κατάντη γονίδια στόχους της, όπως σαλιγκάρι, ZEB1, και TWIST2 [22]. Προς τα κάτω ρύθμιση ή η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του ΕΜΤ σε εμβρυϊκή ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Σαλιγκάρι έκφραση συσχετίζεται αντίστροφα με Ε-καδερίνης σε επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές όγκου [30, 31]. ABCG2 είναι ένα από τα μείζονα αντοχής πολυφαρμάκου (MDR) αντλίες? είναι επίσης ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων και είναι στενά συνδεδεμένο με ανθεκτικότητα σε αρκετά φάρμακα [38, 39]. Το μονοπάτι σηματοδότησης Hh ρυθμίζει άμεσα την δραστηριότητα του ABCG2 [29]. Hh ανταγωνιστές μπορούν να αναστείλουν τη δραστικότητα του ABCG2 και επαναευαισθητοποιήσουν κύτταρα NSCLC να μιτοξαντρόνη και τοποτεκάνη

in vitro

[40]. Hh και EGFR σηματοδότηση συνεργατικά ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των βλαστικών κυττάρων μετά τη γέννηση και ενήλικο εγκέφαλο [23, 41]. Ταυτόχρονη δέσμευση Hh και EGFR σηματοδότησης ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και απόπτωση, και να βελτιωθούν τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του docetaxel στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα προστάτη [42]. Με δεδομένο αυτό το φόντο, υποθέσαμε ότι το μονοπάτι σηματοδότησης Hh μπορεί να συμβάλει στην αντίσταση EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC από απορυθμισμένη δραστηριότητα EMT και ABCG2.

Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ Hh σηματοδότηση και την αντίσταση του EGFR ΤΚΙ, αξιολογήσαμε την πρώτη διαφορές σε ΗΗ σηματοδότηση μεταξύ EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μονοπάτι σηματοδότησης Hh ήταν ανωμάλως ενεργοποιούνται, συνοδεύεται από επαγωγή ενός φαινοτύπου ΕΜΤ και ABCG2 υπερέκφραση, σε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα, ενώ η οδός Hh σίγησε σε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα. Η διαφορά στην δραστικότητα σηματοδότησης Hh μεταξύ EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων πρότεινε ότι ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh μπορεί να συμβάλλει αντίσταση EGFR-ΤΚΙ με επαγωγή ενός φαινοτύπου ΕΜΤ και ABCG2 αυξορρύθμιση. Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα, σηματοδότηση Hh ρυθμίζεται αυξητικά χρησιμοποιώντας εξωγενείς ΕΛΕΡΠΕ στο EGFR-ΤΚΙ ευαίσθητη PC9 κυτταρική γραμμή. Προς τα πάνω ρύθμιση της δραστηριότητας Hh οδήγησε σε επαγωγή της EMT και την ανύψωση της έκφρασης ABCG2. Hh υπερκινητικότητα σηματοδότησης οδήγησε επίσης σε EGFR-ΤΚΙ ανοχής σε διαφορετικά EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας του EGFR ΤΚΙ σε κύτταρα NSCLC μέσω επαγωγής ΕΜΤ και ABCG2 υπερέκφραση. Η αναστολή της σηματοδότησης Hh από την ενισχυμένη έκφραση Ε-καδερίνης αναστολέα Hh SANT-1 και μειωτικά σαλιγκάρι και έκφραση ABCG2. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι ο αποκλεισμός της σηματοδότησης Hh μπορεί να αντιστρέψει το φαινότυπο EMT και ίσως μειώσει CSC αφθονία. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η αποκατάσταση της έκφρασης Ε-καδερίνης αυξημένη ευαισθησία σε EGFR-TKIs

in vitro

και

in vivo

[38]. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, είχε λόγο να πιστεύει ότι η στόχευση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh θα μπορούσαν να επηρεάσουν EGFR-ΤΚΙ αντίσταση σε κύτταρα NSCLC. Έτσι, την επόμενη θεραπεία EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα με gefitinib ή SANT-1 μόνο του ή gefitinib συν SANT-1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με είτε gefitinib ή SANT-1 μόνη, ο συνδυασμός του gefitinib συν SANT-1 ανέστειλε σημαντικά την ογκογένεση και κυτταρική βιωσιμότητα. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας προτείνουν ενώσεις μεταξύ σηματοδότηση Hh, EMT, ABCG2 υπερέκφραση, και αντίσταση EGFR-ΤΚΙ σε κύτταρα NSCLC για πρώτη φορά.

Απορρύθμιση σηματοδότησης Hh συμβάλλει στην ογκογένεση ή επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα συνδέτη Hh ανεξάρτητη από ή εξαρτώμενο τρόπο [43]. Στις περισσότερες καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων (BCCs) και μυελοβλαστώματα, απώλειας λειτουργίας μεταλλάξεων σε PTCH και να αποκτήσουν-of-λειτουργία μεταλλάξεων σε ΠΕΑ οι δύο οδηγούν στην ανεξάρτητη από συνδεσμικό, η μετάλλαξη με γνώμονα ενεργοποίηση του μονοπατιού Hh [44-46]. Αυτό το είδος της όγκου μπορούν να επωφεληθούν από τη θεραπεία με ένα μόνο αναστολέα Hh.