Αφηρημένο

Ιστορικό

Στη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, μια καλή συμφωνία των μελετών έχει παράσχει τη δυνατότητα των κυκλοφορούντων microRNAs (miRNAs) ως μη επεμβατική βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να ανιχνεύσει τα επίπεδα των κυκλοφορούντων miRNAs σε ιστούς και πλάσμα του γαστρικού καρκίνου (GC) των ασθενών και να αξιολογούν διαγνωστική αξία τους.

Μέθοδοι

Δείγματα ιστών συλλέχθηκαν από 85 GC ασθενείς. Δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν από 285 ασθενείς GC και 285 μάρτυρες. Διαφορικά εκφραζόμενο miRNAs διηθούνται με από Agilent Human miRNA Microarray και TaqMan συστοιχία χαμηλής πυκνότητας (TLDA) με συνδυασμένα δείγματα, που ακολουθείται από την επικύρωση ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR). λειτουργούν χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη δέκτη δομήθηκαν για να αξιολογηθεί η διαγνωστική ακρίβεια των miRNAs. Το επίπεδο του miR-26a σε ασθενείς GC διαφορετικών κλινικά στάδια πλάσμα σε σύγκριση.

Αποτελέσματα

Τέσσερις miRNAs (miR-26a, miR-142-3p, miR-148a, και ΜΙΚ 195) αποκάλυψε συμπτωματικά μειωμένα επίπεδα σε ιστό και το πλάσμα των ασθενών GC σύγκριση με τους μάρτυρες, και τις καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν για να αποδείξει ότι miR-26a είχαν μια υψηλότερη περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC) του 0.882. Επιπλέον, miR-26a ήταν σταθερά ανιχνεύθηκε στο πλάσμα ασθενών GC με διαφορετικά κλινικά χαρακτηριστικά.

Συμπέρασμα

Plasma miR-26α μπορεί να παράσχει μία νέα και σταθερή δείκτης του καρκίνου του στομάχου.

Παράθεση: Qiu Χ, Zhang J, Shi W, Liu S, Kang Μ, Chu Η, et al. (2016) Κυκλοφορούν microRNA-26α στο πλάσμα και ενδεχόμενη Διαγνωστική αξία του σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 11 (3): e0151345. doi: 10.1371 /journal.pone.0151345

Επιμέλεια: Zheng Li, Ένωση Medical College Hospital του Πεκίνου, Κίνα

Ελήφθη: 29η Οκτωβρίου, 2015? Αποδεκτές: 8 Φεβρουαρίου του 2016? Δημοσιεύθηκε: 24 Μαρτίου του 2016

Copyright: © 2016 Qiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή υποστηρίζεται μερικώς από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81230068, 81373091, 81302502, 81302490 και 81473049), Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2012842 και BK20130641), το Πρόγραμμα Κλειδί για την Βασική Έρευνα της Jiangsu επαρχιακή Παιδαγωγικό Τμήμα Δημοτικής εκπαίδευσης (12KJA330002), Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της τριτοβάθμιας εκπαίδευσης της Κίνας (20130092120063), Jiangsu Εκπαιδευτικά Προγράμματα Επαρχιακό Καινοτομίας και Επιχειρηματικότητας για Προπτυχιακά (201412682004Y ), Jiangsu Provincial Επιστήμης και Τεχνολογίας Team καινοτομία, και την προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης (Δημόσιας Υγείας και προληπτικής Ιατρικής)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο (GC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες του κόσμου. Παρά το γεγονός ότι η συνολική συχνότητα έχει μειωθεί τα τελευταία χρόνια, είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθεια (989.000 περιπτώσεις) και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται (738.000 θάνατοι) σε όλο τον κόσμο [1]. Πάνω από το 70% των περιπτώσεων συμβαίνουν σε αναπτυσσόμενες χώρες [2]. Ειδικότερα, οι ασθενείς σε προχωρημένο στάδιο εξακολουθούν να επιδεικνύουν εξαιρετικά χαμηλά ποσοστά επιβίωσης [3] ημερομηνία .Για, η διάγνωση της GC βασίζεται στα κλινικά συμπτώματα, και υπάρχουν κάποιες τεχνικές ελέγχου που εφαρμόζονται, όπως η ενδοσκόπηση και η εξέταση βάριο γεύμα. Ωστόσο, όλες αυτές οι προσεγγίσεις έχουν δείξει κάποια ελαττώματα στην ανίχνευση του GC. Επιπλέον, υπάρχουν ορισμένοι δείκτες όγκου ορό για παράδειγμα καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA), το αντιγόνο υδατάνθρακα 19-9 (CA19-9) και το αντιγόνο υδατάνθρακα 72-4 (CA72-4), και υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί της ευαισθησία και ειδικότητα για διαλογής GC [4]. Ως εκ τούτου, έχουμε δώσει μεγαλύτερη προσοχή στην ανακάλυψη νέων, αξιόπιστη και μη επεμβατική βιοδείκτες του GC.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία σύντομη (20 ~ 25 νουκλεοτίδια), μη-κωδικοποίησης RNAs μονόκλωνο [5]. Πιστεύεται ευρέως ότι miRNAs μπορούν να συμμετέχουν στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, με αποτέλεσμα να mRNA φίμωση, όπως η διάσπαση στόχου, μεταφραστική αναστολή, και mRNA φθορά [6]. Συσσωρευμένα στοιχεία που έχει δηλώσει ότι miRNAs συμμετείχαν σε διάφορες παθοφυσιολογικές διεργασίες και να οδηγήσει σε θεμελιώδεις αλλαγές σε πολλές ασθένειες. Zhang

et al

. Βρέθηκε ότι miR-26a επαγόμενη απόπτωση των ενδοθηλιακών και έδειξε θεραπευτικό δυναμικό του miR-26a για αθηροσκλήρωση που σχετίζεται με αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [7]. Leonov

et al

. περιγράφεται η αναστολή της miR-132 είχε ως αποτέλεσμα υψηλή

ago2

έκφρασης, ο οποίος συμμετείχε στην αγγειογένεση και φλεγμονή κατά τη διάρκεια της πρωτογενούς ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων [8]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι τα miRNAs παίζουν απαραίτητη ρόλους στην ογκογένεση, ενεργώντας είτε ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων [9]. Αρκετές miRNAs έχουν αναφερθεί να σχετίζεται με τον καρκίνο από τα προφίλ έκφρασης των miRNAs [10-12]. Δυστυχώς, τα δείγματα ιστού είναι δύσκολο να αποκτηθούν. Ανίχνευση miRNAs στους ιστούς, δεν είναι ρεαλιστικό σε κλινική εφαρμογή.

Επιπλέον, ολοένα και περισσότερες ενδείξεις απέδειξε ότι κυκλοφορούν miRNAs είναι ανθεκτικά στην πέψη RNase και σταθερά ανιχνεύσιμη στο πλάσμα και στον ορό με ευκολία μετρήσεων [13-14]. Προηγούμενες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η ύπαρξη miRNAs στο αίμα και η έκφραση σχετίζεται με καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των μεγάλων Β-κυτταρικό λέμφωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου, του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και του καρκίνου του μαστού [15-18]. Αυτές οι μελέτες παρέχουν συλλογικά μια βάση για την κυκλοφορία miRNAs που ενεργεί ως νέων βιοδεικτών για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου.

Πολλές μελέτες αποδεικνύουν το επίπεδο έκφρασης των miRNA στο πλάσμα δεν είναι απολύτως συνεπής με εκείνη στον όγκο. miR-378 μειώθηκε σημαντικά σε GC ιστών και αρκετές κυτταρικές σειρές [19], αλλά miR-378 ήταν ουσιαστικά πάνω ρυθμισμένα σε ορό ασθενών GC »[20]. Δεδομένου ότι το ίδιο όπως miR-486, miR-486 μπορεί να λειτουργήσει ως ογκοκατασταλτικού miRNA σε γαστρικού όγκου [21], τα οποία υπερεκφράζεται στον ορό των ασθενών GC »[22]. Επί του παρόντος, αρκετές miRNAs ορού /πλάσματος μπορούν να διακρίνουν από τους ασθενείς GC με τους ελέγχους, ωστόσο αυτό δεν μπορεί να εκπροσωπεί την έκφραση miRNA σε ιστό. Αν μπορούμε να βρούμε τα miRNAs δύο διαφορικά εκφρασμένο σε γαστρικό καρκινικό ιστό και το πλάσμα, θα πρέπει να έχουν περισσότερες κλινική σημασία.

Για να εξακριβωθεί αν τα miRNAs που εκφράζονται διαφορικά τόσο στον ιστό και το πλάσμα, χρησιμοποιήσαμε δύο μικροσυστοιχίες για να miRNAs οθόνη . Στα δύο στάδια επικύρωσης, τέσσερα υποψήφιος miRNAs ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω στους ιστούς όγκου και δείγματα πλάσματος από qRT-PCR. Η μελέτη μας έδειξε ότι miR-26a μειώθηκε σημαντικά σταθερά στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο του στομάχου και θα μπορούσε να διακρίνει ασθενείς με γαστρικό καρκίνο από τους ελέγχους, με καλή ευαισθησία και εξειδίκευση. Είχε προβλεφθεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη κυκλοφορούν βιοδεικτών του καρκίνου του στομάχου σε καθημερινή κλινική διάγνωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Σχεδιασμός μελέτης και θέματα

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την θεσμική αναθεώρηση διοικητικού συμβουλίου της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και κάθε συμμετέχων υπό την προϋπόθεση ότι υπέγραψε γραπτή συγκατάθεση. Όλα τα άτομα προσλήφθηκαν στο Yixin Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, Όγκων Νοσοκομείο Nantong, Χουάι-Μια Πρώτη Λαϊκό Νοσοκομείο και το δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing από Μάρτιος 2006-Μάιος 2013 στην επαρχία Jiangsu, Κίνα.

Ο όγκος ιστούς και τα φυσιολογικούς ιστούς (που βρίσκεται & gt? 5 cm μακριά από τον όγκο) ελήφθησαν από 55 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε επέμβαση GC και συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν από 285 ασθενείς GC, και 285 sex- και ίδιας ηλικίας πλάσματος από τα υγιή άτομα συλλέχθηκαν ως τους ελέγχους. Όλοι οι ασθενείς είχαν αποδείξει την ιστολογικά διάγνωση του GC κατά την αρχική διάγνωση, και κανένας από αυτούς είχαν λάβει θεραπευτικές διαδικασίες, για παράδειγμα χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Εμείς κατατάσσονται το στάδιο του όγκου, σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης των όγκων-node-μετάσταση (ΤΝΜ) της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC). Τα κλινικά χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων στην μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Μια μελέτη πολλαπλών σταδίων σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει τα miRNAs πλάσμα ως βιοδείκτες για τους ασθενείς GC (Σχήμα 1). Στο στάδιο ανακάλυψη, εκφράζονται διαφορικά miRNAs εκτιμήθηκαν στα ζευγαρωμένα δείγματα ιστών από 5 ασθενείς GC (S1 πίνακα) Agilent Human miRNA Microarray (V12.0, Agilent Technology, CA, USA). Δείγματα πλάσματος από 5 ασθενείς GC (S2 Πίνακας) των οποίων το φύλο, την ηλικία κλινικές καταστάσεις συσχετίζονται με τα δείγματα ιστού και 5 υγιείς ελέγχους υποβλήθηκαν σε TLDA (V2.0? Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) για τον εντοπισμό των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs . Στη φάση της κατάρτισης, οι σημαντικές μετατροπές miRNAs αξιολογήθηκαν για πρώτη φορά από qRT-PCR σε 50 ζεύγη δειγμάτων ιστών και 80 δείγματα ορού GC και 80 μάρτυρες. Στη συνέχεια, τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ του ιστού και του ορού εξετάστηκαν περαιτέρω σε επιπλέον 400 συμμετέχοντες, η οποία περιελάμβανε 200 ασθενείς GC και 200 ​​μάρτυρες.

Η

απομόνωση RNA από το πλάσμα και τους ιστούς

Αίμα δείγματα στις ξεχωριστές κύβους κενού φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Συλλέξαμε το υπερκείμενο και αποθηκεύεται τους στους -80 ° C. Πριν από την έναρξη της διαδικασίας απομόνωσης, προσθέσαμε μια τελική συγκέντρωση 10

-4 pmol /μl συνθετικών

C

.

elegans

miR-39 (CEL-miR-39) (Takara, Japan) σε κάθε δείγμα, έτσι ώστε να ελέγχουν τη βιολογική μεταβλητότητα. Το RNA εκχυλίστηκε από 100 μΙ πλάσματος χρησιμοποιώντας QIAGEN miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Το συνολικό RNA από ιστούς απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

μικροσυστοιχίες και qRT-PCR

χαρακτηρισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας Agilent Ανθρώπινα miRNA Microarray (V12.0 , Agilent Technology, CA, USA) και TaqMan συστοιχία χαμηλής πυκνότητας (V2.0? Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Για το ολικό RNA απομόνωση από ιστούς, qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ SYBR (R) PrimeScript ™ RT-PCR (Takara Bio). Μια λεπτομερής περιγραφή των πειραματικών πρωτοκόλλων έχει κατατεθεί στο Data S1.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα ζεύγη δειγμάτων ιστού συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon. Μη παραμετρική Mann-Whitney U πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των επιπέδων miRNA πλάσμα μεταξύ της ομάδας του καρκίνου και υγιή ομάδα. Δέκτης-χειριστή χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη και οι περιοχές κάτω από τις καμπύλες ROC (AUCs) ελήφθησαν για να αξιολογηθεί η δυνατότητα ανίχνευσης GC των miRNAs. Στατιστικές αναλύσεις ήταν δοκιμή διπλής όψης, και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS έκδοση λογισμικού 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

Ανακάλυψη των υποψηφίων βιοδεικτών από μικροσυστοιχίες

Χρησιμοποιήσαμε δύο πλατφόρμες μικροσυστοιχιών για τα miRNAs να αναλύσει και να συγκρίνει τα πρότυπα έκφρασης των miRNAs από δύο διαφορετικές συνθήκες. ανάλυση TLDA ολοκληρώθηκε για επιβεβαίωση υποψήφιο miRNAs επίπεδα έκφρασης. Ένα σύνολο 142 miRNAs ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα. 65 των συνολικών miRNAs αυξήθηκαν και 77 μειώθηκαν σε ασθενείς GC σύγκριση με τους μάρτυρες

Για να ταυτοποιηθούν υποψήφιες miRNAs, η έκφραση των miRNAs μεταξύ ασθενών και μαρτύρων ήταν αναγκαίες για να αντιστοιχεί με δύο κριτήρια: (1). Η έκφραση απορρύθμιση στον ιστό του όγκου ήταν σύμφωνη με TLDA αποτέλεσμα [23]? και (2) τα επίπεδα στο πλάσμα miRNA αποδεικνύοντας ≥ 2-πλάσια διαφορά μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Τελικά, τέσσερις κάτω-ρυθμίζονται miRNAs πλάσματος (δηλαδή, miR-26a, miR-142-3p, miR-148a και miR-195) επιλέχθηκαν ως οι υποψήφιοι για την επικύρωση γροθιά σταδίου (Πίνακας 2).

επιβεβαίωση των miRNAs από qRT-PCR

Κατ ‘αρχάς, τα αποτελέσματα των αναλύσεων μικροσυστοιχίες επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας τα ζεύγη ιστούς, το πλάσμα GC και τους μάρτυρες για αυτές τις τέσσερις miRNAs από qRT-PCR. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η τάση των αποτελεσμάτων των qRT-PCR ήταν παρόμοια με τις μικροσυστοιχίες αναλύσεις, είτε σε ιστούς ή στο πλάσμα. Το οικόπεδο έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων miRNAs ήταν στατιστικά σημαντική στους ιστούς GC (

P

= 0.001,

P

= 0,002,

P

& lt? 0.001 και

P

= 0,003 για το miR-26a, miR-142-3p, miR-148a και miR-195, αντίστοιχα, σχήματα 2A-2D). Εν τω μεταξύ, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR για την επαλήθευση των εκφράσεων των miRNAs ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε άλλο ανεξάρτητο σύνολο των 80 δειγμάτων πλάσματος GC και 80 υγιείς μάρτυρες. Οι εκφράσεις των τεσσάρων miRNAs στο πλάσμα GC ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνα των ελέγχων (όλα

P

& lt? 0.001, Σχήματα 2Ε-2Η). Τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων miRNAs στο πλάσμα ήταν σταθερά μειωμένη, σε σύγκριση με τα δείγματα ιστού.

(AD) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-26a, miR-142-3p, miR-148a, miR-195, στο 50 ζεύγη γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τα αντίστοιχα noncancerous ιστούς (log

10 κλίμακας στο άξονα y). (Ε-Η) επίπεδα έκφρασης πλάσμα του miR-26a, miR-142-3p, miR-148a, miR-195, σε 80 ασθενείς GC και 80 υγιείς μάρτυρες. Οι γραμμές στο εσωτερικό των κουτιών δηλώνουν οι διάμεσοι (log

10 κλίμακας στο άξονα y). Τα μουστάκια των οικοπέδων κουτί:. Ελάχιστη στον Max

Η

Η μεγάλης κλίμακας επικύρωση των microRNAs πλάσματος σε ασθενείς GC

Για να είναι έγκυρη η σταθερότητα των εκφράσεων των miRNAs πλάσμα, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR σε μεγάλη κλίμακα από 200 δείγματα πλάσματος GC και 200 ​​συμφωνημένα χωρίς καρκίνο ελέγχους. Σύμφωνος με τα αποτελέσματα της φάσης εκπαίδευσης, τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων miRNAs έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω στο πλάσμα των ασθενών GC (όλα

P

& lt? 0.001, Εικόνα 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα τέσσερα miRNAs στο πλάσμα μπορούν χρησιμεύσει ως υποψηφίων βιοδεικτών για τη διάγνωση του GC.

οικόπεδα ασφαλείας έδειξαν τα επίπεδα του miR-26a (Α), miR-142-3p (Β), miR-148a (C) και miR-195 στο πλάσμα ( Δ) σε 200 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και 200 ​​την ηλικία και το φύλο υγιείς μάρτυρες. Ο άξονας y αντιπροσωπεύει σχετική έκφραση των miRNAs ομαλοποιήθηκε με cel-miR-39 (Σύνδεση

10 σχετικό επίπεδο).

Η

Αξιολόγηση της διαγνωστικής δυναμικό των miRNAs για GC

Για να αξιολογεί την αποτελεσματικότητα των παραπάνω τεσσάρων miRNAs ως διαγνωστικοί δείκτες για την ανίχνευση GC, πραγματοποιήθηκε ανάλυση καμπύλης ROC για κάθε miRNA. Σχήμα 4 αποκάλυψε ότι οι καμπύλες ROC των τεσσάρων υποψήφιων miRNAs κατέδειξε τα miRNAs στο πλάσμα ήταν αξία για τη διάκριση των ασθενών GC από φυσιολογικούς μάρτυρες. Η τιμή αποκοπής του 0.651 ήταν ίση με ευαισθησία + ειδικότητα-1, η οποία ήταν μέγιστη για miR-26a (σχετική έκφραση ομαλοποιήθηκε με κύτταρο-39). Για miR-26a, η ευαισθησία ήταν 83,6% και η ειδικότητα ήταν 81,5% με την AUC του 0,882 (95% CI = 0,847 – 0,916) (Εικόνα 4Α). Στο cut-off τιμή 0,585 για miR-142-3p, η ευαισθησία ήταν 74.4% και η ειδικότητα ήταν 84,1% με την AUC των 0.839 (95% CI = 0,800 – 0,879) (Εικόνα 4Β). Οι τιμές AUC ήταν 0.842 (95% CI = 0,803 – 0,882) και 0.765 (95% CI = 0,717 – 0,812) για miR-148a και miR-195, αντίστοιχα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν 75.4% και 83.1% για miR-148a, 69,2% και 75,4% για miR-195, αντίστοιχα (Σχήμα 4C και 4D). Ο συνδυασμός ROC ανάλυση καμπύλης απέδωσε την τιμή της AUC 0,872 (95% CI = 0,836 – 0,908) (Εικόνα 4Ε).

καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν για να δείξει καμπύλη AUC του miR-26a (Α), miR-142- 3P (Β), miR-148a (C), miR-195 (D) και ο συνδυασμός των τεσσάρων miRNAs (Ε).

η

για να επαληθεύσετε την αξία διάγνωση του ξενιστή miRNA για GC, εμείς σε συνδυασμό οποιοδήποτε από τα miRNAs πλάσματος και εκτέλεσε τις καμπύλες ROC, όπως φαίνεται στο S1 και S2 Εικ. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το miR-26a η οποία έδειξε τη μεγαλύτερη δυνατότητα για διαφοροποίηση των ασθενών GC από τους ελέγχους, θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα κατάλληλο βιοδείκτη για την ανίχνευση GC.

Συζήτηση

Παρά τη σημαντική πτώση στη θνησιμότητα GC κατά την τελευταία δεκαετία, το ποσοστό θνησιμότητας είναι ακόμη υψηλότερο από ό, τι πολλές άλλες κοινές κακοήθειες [24]. Τα τελευταία χρόνια, οι βιοδείκτες του όγκου για παράδειγμα CEA, CA19-9, CA74-2 με την περιορισμένη ευαισθησία και την εξειδίκευση έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη διάγνωση, την παρακολούθηση και την πρόγνωση των GC [4]. Συνολικά, υπάρχει μεγάλη σημασία για τη διάγνωση της GC για να ψάξουν για πιο ειδικές και ευαίσθητες βιοδείκτες.

miRNAs ιστών ως βιοδείκτες της διάγνωση και πρόγνωση για πρώτη φορά προτείνεται. Bandres

et al

. αποκάλυψε ότι miR-451 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε πρωτογενείς γαστρικών και ορθοκολικών όγκων, και η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-451 συνδέθηκε με χαμηλό DFS και χαμηλή συνολική επιβίωση [25]. Xiao

et al

. προσδιορίζονται miR-106a ως δραματικά up-ρυθμίζονται miRNA σε GC [26]. Διαπίστωσαν επίσης ότι η έκφραση του miR-106a ήταν σημαντικά σχετίζονται με το στάδιο του όγκου, λεμφικό, μακρινή μετάσταση και εισβολή. Παρ ‘όλα αυτά, πολλοί τύποι των ασθενών με καρκίνο δεν μπόρεσαν να υποβληθούν σε χειρουργική επέμβαση στην κλινική πρακτική όταν διαγνωστεί. Η εξάρτηση από την χειρουργική τομή και επεμβατική διαδικασία για τη συλλογή δειγμάτων ιστού περιορίζεται έντονα την εφαρμογή των miRNAs στον ιστό της διάγνωσης του καρκίνου [27]. Η διαγνωστική ποιότητα των μεθόδων αυτών δεν είναι ικανοποιητική.

Αναδυόμενες αποδείξεις, επίσης, σημαίνει ότι κυκλοφορούν miRNAs που σχετίζονται με τον καρκίνο [28-30]. Η πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι τα miRNAs ήταν ανιχνεύσιμα στο πλάσμα και σταθερή σε θερμοκρασία δωματίου ή /και πολλαπλές διεργασίες ψύξης-απόψυξης [31]. Πολυάριθμες εκθέσεις είχε φωτίζεται ότι η χρησιμότητα των κυκλοφορούντων miRNAs ως νέα μη επεμβατική βιοδείκτες για καρκίνους, όπως καρκίνο του παχέος εντέρου [32], ο καρκίνος του μαστού [33-34] και το καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [35].

Στη μελέτη μας, εμείς μεθοδικά προβληθεί το προφίλ miRNA στα ζεύγη ιστούς και στο πλάσμα ασθενών GC και υγιείς μάρτυρες. Πλάσμα λαμβάνεται από 5 περιπτώσεις και 5 έλεγχοι αναμίχθηκαν μαζί για να σχηματίσουν δύο ομαδοποιημένα δείγματα και χρησιμοποιήθηκαν για TLDA. Αυτή η μέθοδος συγκέντρωσης δειγμάτων είναι μία ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική που έχει αποδειχθεί ότι είναι αξιόπιστα για τη σκιαγράφηση [36-38]. Συγκρίνοντας την ανάλυση TLDA και το αποτέλεσμα των μικροσυστοιχιών ιστού, επιλέχθηκαν τέσσερις miRNAs (miR-26a, miR-142-3p, miR-148a και miR-195) μείωσε στο GC.

Στη συνέχεια, εντοπίσαμε τέσσερα υποψήφια miRNAs από qRT-PCR σε δύο στάδια, και βρήκε τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων miRNAs κατρακύλησε στο πλάσμα των ασθενών GC που βρίσκονται σε συμφωνία με τις εκφράσεις στους ιστούς. καμπύλη ROC, επίσης γνωστή ως καμπύλη ευαισθησίας, αναγνωρίζεται ευρέως ως μια μέθοδος αξιολόγησης του διαγνωστικού τεστ. Είναι επίσης ένα ενσωματωμένο δείκτη που αντικατοπτρίζει την ευαισθησία και την εξειδίκευση των συνεχών μεταβλητών. Στην παρούσα μελέτη, η ανάλυση ROC έδειξε ότι ο συνδυασμός των τεσσάρων miRNAs δεν ήταν περισσότερο αποτελεσματική από miR-26a μεμονωμένα. MiR-26α και μόνο θα μπορούσε να επιτύχει μια καλή διαγνωστική αποτελεσματικότητα σε ασθενείς διακριτικό GC από υγιείς μάρτυρες με την AUC του 0,882 (ευαισθησία = 83,6% και ειδικότητα = 81,5%). Μια προηγούμενη μελέτη από τη Schneider

et al

. εμφανίζονται τα επίπεδα του CEA, CA19-9 και CA72-4 σε GC ορό διευκρινίσθηκε ευαισθησία 45,5% για CA19-9, 23,8% για το CEA και 60,7% για CA72-4 [39]. Αυτά ήταν πολύ λιγότερο από ό, τι την ευαισθησία του miR-26a. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης του miR-26a στο πλάσμα ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς GC, και δεν έδειξαν καμία σημασία με την εξέλιξη του GC (S3 Εικ). Ως εκ τούτου, miR-26a είχαν μεγάλες δυνατότητες ως διαγνωστικό βιοδείκτη πλάσματος για GC.

Στη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, οι προηγούμενες μελέτες δεν βεβαιωθείτε ότι αν η έκφραση των miRNAs πλάσματος ή ορού μπορεί να αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα των ιστών. Σε σύγκριση με αυτές τις μελέτες, η μελέτη μας είχε το δικό του χαρακτηριστικό λόγω λόγους ως εξής. Πρώτον, επιλέγονται τα miRNAs που εκφράζονται διαφορικά τόσο σε ιστό και το πλάσμα, με σύγκριση των αποτελεσμάτων των δύο μικροσυστοιχίες. Αυτό οδήγησε σε μια καλύτερη ευκαιρία για τον εντοπισμό εφικτό διαγνωστικοί δείκτες. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-26a μειωθεί σημαντικά σε ασθενείς με GC και διατηρούνται σταθερές στο πλάσμα (S3 σχήμα).

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του miR-26a πλάσμα ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς GC σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (

P

& lt? 0.05), η οποία έδειξε σταθερότητα σε ασθενείς GC με διαφορετική κλινική κατάσταση. Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης πλάσματος miR-26a μπορεί να υποδεικνύει την πιθανότητα της διάγνωσης GC. Ως εκ τούτου, miR-26a μπορεί να είναι μια καλύτερη επιλογή για να χρησιμεύσει ως πιθανές βιοδείκτη για GC. Ντενγκ

et al

. έδειξε ότι τα επίπεδα miR-26a σε ιστούς GC ήταν πιο σημαντικά μειωμένα από εκείνα σε ιστούς μη-όγκου από qRT-PCR [40]. Απέδειξαν επίσης ότι miR-26a ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση εν μέρει με τη στόχευση

FGF9

in vivo. Αυτά αποτελούνταν με τα αποτελέσματά μας. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν ότι miRNA-26α στο πλάσμα θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός διαγνωστικός δείκτης για GC.

Ωστόσο, οι περιορισμοί της μελέτης μας είναι ότι τα δείγματα για την μικροσυστοιχιών ιστού και για την TLDA δεν ήταν από τους ίδιους τους ασθενείς, και τα μεγέθη του δείγματος μας για τις μικροσυστοιχίες ήταν σχετικά μικρές. Περαιτέρω ανάλυση των μικροσυστοιχιών για τους ίδιους ασθενείς και την επιβεβαίωση διευρυμένης-δείγμα απαιτείται να εφαρμοστεί ως ένα νέο εργαλείο διαλογής για GC στην καθημερινή κλινική χρησιμοποίηση. Επιπλέον, δεν επιλέγουν τα επάνω ρυθμισμένη miRNAs, λόγω του γεγονότος ότι δεν υπήρχαν τα πάνω ρυθμισμένα miRNAs των οποίων φορές οι αλλαγές ήταν ≥ 2. Έχουμε επιλέξει υποψήφιο miRNAs που αφειδώς εκφράζονται σε πλάσμα για να βεβαιωθείτε ότι της πιθανότητας της εξέτασης στην κλινική πράξη.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας αποκάλυψε τέσσερα κάτω-ρυθμίζονται miRNAs, miR-148a, miR-142-3p, miR-26a, και miR-195, στο GC ασθενείς. Το πιο σημαντικό, η έκφραση του miR-26a πλάσμα ήταν σημαντικά μειωμένη και σταθερή σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Ως αποτέλεσμα, miR-26a μπορεί να παρέχει μια μη επεμβατική και σταθερή βιοδείκτη του γαστρικού διάγνωση του καρκίνου και τον έλεγχο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 δεδομένων. Πειραματικά Πρωτόκολλα των μικροσυστοιχιών και qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s001

(DOC)

S1 Εικ. ROC ανάλυση καμπύλης του συνδυασμού των δύο miRNAs μεταξύ των τεσσάρων υποψήφιων miRNAs.

Ο συνδυασμός του miR-26a και miR-142-3p (Α), ο συνδυασμός του miR-26a και miR-148a (Β), ο συνδυασμός του miR-26a και miR-195 (C), και ο συνδυασμός του miR-142-3p και miR-148a (D), ο συνδυασμός του miR-142-3p και miR-195 (Ε) και ο συνδυασμός του ΜΙΚ 148a και miR-195 (F) έδωσε τις μεγαλύτερες AUCs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s002

(DOC)

S2 Εικ. ROC ανάλυση καμπύλης του συνδυασμού των τριών miRNAs μεταξύ των τεσσάρων υποψήφιων miRNAs.

Ο συνδυασμός του miR-26a, miR-142-3p και miR-148a (Α), ο συνδυασμός του miR-26a, miR-142-3p και miR-195 (Β), ο συνδυασμός του miR-26a, miR-148a και miR-195 (C) και ο συνδυασμός του miR-142-3p, miR-148a και miR-195 (D) έδωσε τις μεγαλύτερες AUCs.

doi: 10.1371 /journal.pone.0151345.s003

(DOCX)

S3 Εικ. . Επίπεδο στο πλάσμα του miR-26a σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου στρωματοποιημένη από την κλινική κατάσταση

οικόπεδα ασφαλείας έδειξαν τα επίπεδα του miR-26a πλάσματος σε 200 υγιείς μάρτυρες και 200 ​​ασθενείς με καρκίνο του στομάχου σε διαφορετικές κλινική κατάσταση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s004

(DOCX)

S1 πίνακα. Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών ιστού ελέγχου της Agilent Ανθρωπίνων miRNA μικροσυστοιχιών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s005

(DOC)

S2 πίνακα. Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών πλάσματος ελέγχου από TLDA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s006

(DOC)

Ευχαριστίες

Είμαστε εξαιρετικά ευγνώμονες για τη συμμετοχή της όλα τα θέματα που συμβάλλουν σε αυτή την έρευνα.