Αφηρημένο

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια από τις πιο διαδεδομένες καρκίνους παγκοσμίως και είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο λόγω της αντίστασης θεραπεία και μετάσταση. Η κατανόηση του μηχανισμού υποκείμενων παχέος καρκινογένεση είναι απαραίτητη για τη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC. microRNAs (miRNAs) μπορεί να δράσει είτε ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων σε πολλούς καρκίνους. Ένας ρόλος για ογκοκατασταλτικό miR-27b έχει πρόσφατα αναφερθεί σε νευροβλάστωμα, ενώ καμία πληροφορία σχετικά με miR-27b σε CRC είναι διαθέσιμη. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση miR-27b μειώνεται σε πιο CRC ιστούς και προσδιορίστηκε ότι η υπερέκφραση του miR-27b καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC, σχηματισμός αποικίας και της ανάπτυξης των όγκων

in vitro

και

in vivo

. Ταυτοποιήσαμε αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα C (VEGFC) ως νέο γονίδιο-στόχο του miR-27b και προσδιορίστηκε ότι miR-27b λειτούργησε ως αναστολέας της εξέλιξης του όγκου και την αγγειογένεση μέσω της στόχευσης VEGFC σε CRC. Έχουμε καθορίζεται επίσης ότι το DNA υπερμεθυλίωση του miR-27b νησίδες CpG μειώνει την έκφραση του miR-27b. Εν ολίγοις, μια ρόλος κατά του όγκου για miR-27β και τα νέα στόχο της VEGFC

in vivo

μπορούσε να οδηγήσει σε νέκρωση των όγκων και να προσφέρει μια λογική για την ανάπτυξη miR-27b ως θεραπευτικού παράγοντα.

Παράθεση: Ye J, Γου Χ, Wu D, Wu P, Ni C, Zhang Ζ, et al. (2013) Στόχοι miRNA-27b αυξητικός παράγοντας αγγειακού ενδοθηλίου C έως Αναστέλλουν την εξέλιξη του όγκου και την αγγειογένεση σε ορθοκολικού καρκίνου. PLoS ONE 8 (4): e60687. doi: 10.1371 /journal.pone.0060687

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 του Νοεμβρίου, 2012? Δεκτές: 1, Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 12η Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Ye et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 91019005), Ίδρυμα Zhejiang Provincial Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ Y2110034), το 151 Talent Έργο της επαρχίας Zhejiang (HJ) και το Γραφείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Zhejiang (Αρ 2011C37004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) κατατάσσεται ως η τρίτη πιο διαδεδομένη καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Παρά την κλινική εφαρμογή πολλών θεραπευτικών στρατηγικών, παραμένει ένα κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο λόγω της αντίστασης θεραπεία και μετάσταση [1] – [3]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση του μηχανισμού υποκείμενου παχέος καρκινογένεση είναι απαραίτητη για τη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των όγκων και του στρώματος που αναγνωρίζονται ως κρίσιμες συνιστώσες της εξέλιξης του όγκου σε CRC [4]. Πιο πρόσφατα, τα στοιχεία δείχνουν ότι οι χημειοκίνες που παράγονται εντός της μικροπεριβάλλον του όγκου όπως αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), παράγοντα ανάπτυξης ινοβλάστης (FGF), και παράγοντα ανάπτυξης που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην παθογένεση του CRC αυξάνει [5], [6].

microRNAs (miRNAs) είναι μία κατηγορία μικρών, ενδογενούς, μη-κωδικοποίησης RNA, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων στόχων με συμπληρωματική σύζευξη στο mRNA 3 ‘αμετάφραστες περιοχή (3’UTR) η οποία οδηγεί σε μεταγραφική καταστολή ή mRNA αποικοδόμηση [7]. miRNAs είναι γνωστό ότι λειτουργούν σε διαφορετικές βιολογικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, και την έναρξη του καρκίνου ή την πρόοδο [8], [9]. Στον καρκίνο, miRNAs μπορούν να δρουν είτε ως ενός ογκογονιδίου ή ενός καταστολέα όγκου, όπως αποδεικνύεται από miR-130β προώθηση του καρκίνου του ήπατος βλαστοκύτταρα ανάπτυξης (ΚΕΠ) και αυτο-ανανέωση μέσω στόχευσης TP53INP1 [10], miR-34a αναστολής του προστάτη μετάστασης του καρκίνου με απευθείας καταστολή CD44 [11], και miR-7 αναστολή της ανάπτυξης όγκου και μετάστασης με επηρεασμό της η phosphoinositoide-3 κινάση (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ οδού σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [12]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι είναι καίριας σημασίας να διευκρινιστούν λειτουργίες miRNA και κανονιστικών κυκλώματα να διατυπώσει θεραπευτικές στρατηγικές.

Υποθέτουμε ότι μοριακές διαφορές μεταξύ ΚΕΠ και διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εντοπίσει ένα βασικό μόριο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, και σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκαν οι διαφορές στην έκφραση των miRNAs μεταξύ ΚΕΠ και διαφοροποιημένα κύτταρα CRC χρησιμοποιώντας miRNA μικροσυστοιχίες. Βρήκαμε ότι η έκφραση miR-27b είναι ουσιαστικά μειώνεται σε CSC-όπως κύτταρα και σε ιστούς CRC. miR-27b βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9 και έχει δειχθεί ότι λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε νευροβλάστωμα μέσω στόχευση των υπεροξυσωμάτων γ που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή υποδοχέας (ΡΡΑΚγ) [13]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι miR-27b μπορεί να δράσει ως ένα αγγειογόνο διακόπτη με την προώθηση των ενδοθηλιακών κυττάρων μοίρα άκρο και βλάστησης [14], [15]. Ωστόσο, οι συγκεκριμένες λειτουργίες και τις δυνατότητες τους στόχους του miR-27b σε κύτταρα CRC είναι ανεξερεύνητα. Επιβεβαιώσαμε ότι αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα C (VEGFC), η οποία παίζει ένα ρόλο στην εξέλιξη του όγκου, είναι ένας νέος στόχος του miR-27b. Ένας μεγάλος αριθμός κλινικών μελετών έχουν δείξει ότι η αύξηση της έκφρασης VEGFC σε πρωτογενείς όγκους συσχετίζεται με αυξημένη διάδοση των καρκινικών κυττάρων σε περιφερειακούς λεμφαδένες σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκινωμάτων [16] – [18]. Πρόσφατα, ο ρυθμιστικός ρόλος του VEGFC στην έναρξη και την ενδυνάμωση νεο-αγγειογένεση είχε αποκαλυφθεί [19]. Ανακαλύψαμε ότι miR-27b θα μπορούσε να μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC, σχηματισμός αποικίας και την ανάπτυξη του όγκου και ότι λειτουργεί ως αναστολέας της αγγειογένεσης μέσω στόχευσης VEGFC και κάτω ρύθμιση DNA υπερμεθυλίωση. Η κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους miR-27b αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση δημιουργεί έναν ισχυρό λόγο για την ανάπτυξή της ως θεραπευτικό μέσο κατά των όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

η έρευνα αυτή έχει εγκριθεί από τις Institutional Review Boards του δευτέρου συνδεδεμένες νοσοκομείο της Zhejiang University School of Medicine. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση των πληροφοριών τους να αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων του νοσοκομείου και να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα.

Όλα τα έργα των ζώων είχε διεξαχθεί σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες. Η έρευνα αυτή έχει εγκριθεί από τις Institutional Review Boards του δευτέρου συνδεδεμένες νοσοκομείο της Zhejiang University School of Medicine.

τηλέφωνα Γραμμές

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, SW620, SW480, RKO, ΗΤ29 και 293Τ αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων στην Κίνα Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Κίνα). SW620 και SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Leibovitz L15 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco). RKO, ΗΤ29 και κύτταρα 293Τ καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

miRNA έκφραση Ανάλυση μικροσυστοιχιών

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από CD133

+ και CD133

– κύτταρα CRC χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ποσότητα και η ποιότητα του RNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο Nanodrop (Thermo επιστημονικές, Worcester, ΜΑ, USA). Το προφίλ έκφρασης miRNA εκάστου δείγματος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία συστοιχία Affymetrix miRNA (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).

Ποσοτική Ανάλυση PCR

Ολικό RNA από κυτταρικές γραμμές, νωπά ιστούς CRC ή ξενομοσχεύματος ιστοί απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol® (Invitrogen). Ολικό RNA από ιστούς παραφίνης απομονώθηκε με κιτ απομόνωσης RecoverAll ™ Total Nucleic Acid (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNase Ι (Qiagen, Valencia, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Η ποσότητα και η ποιότητα του RNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Nanodrop. δοκιμασίες έκφρασης TaqMan miRNA (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης miRNA χρησιμοποιώντας το σύστημα StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν, και τα επίπεδα miR-27b σε κάθε δείγμα κανονικοποιούνται με εκείνη της U6.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων που περιέχουν 0.2-ml μέσο Leibovitz L15 με 10% FBS. MTS (3- [4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -5- [3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ] -2- [4-σουλφοφαινυλο] άλας -2Η-τετραζολίου) αντιδραστήριο (Promega, Madison, WI, USA) (20 μl ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Οι τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 490 nm σε αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και αξιολογούνται συνεχώς για 7 ημέρες.

Soft-άγαρ Δοκιμασία Αποικίας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 300 ανά φρέαρ στο κορυφαίο στρώμα του 0,3% αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) σε πλάκες 12 φρεατίων με ένα κάτω στρώμα από 0.5% αγαρόζη σε Leibovitz μέσο L15 που περιείχε 10% FBS. Μετά από επώαση στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα επώασης για 2 εβδομάδες, αποικίες που περιέχουν 20 κύτταρα έγιναν ορατά κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο και μετρήθηκαν.

Ογκογένεση Δοκιμασία

Cells αιωρήθηκε σε 100 μΙ μέσου Leibovitz L15 εμφυτεύθηκαν στην πίσω πλευρά του 4 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών για να αξιολογηθεί η ικανότητα τους να κινήσουν ξενομοσχεύματα όγκου. Οι όγκοι μετρήθηκαν εβδομαδιαία και ο όγκος τους υπολογίζεται ως μήκος Χ πλάτος Χ πλάτος /2.

miR-27b Therapy

κύτταρα SW620 (5 × 10

6) εγχύθηκαν μέσα στην πίσω πλευρά του 4-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια NOD /SCID, τα οποία ανέπτυξαν όγκους σε 1 εβδομάδα με έναν όγκο -200 mm

3. Πέντε ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε κάθε του αρνητικού ελέγχου (NC) και ομάδες miR-27b. Όλοι οι ποντικοί ενδο-ογκικά ένεση με χοληστερίνη-συζευγμένο μιμείται (1 OD μιμείται /ώρα /ποντικό) (GenePharma Tech, Σαγκάη, Κίνα) δύο φορές την εβδομάδα και οι όγκοι μετρώνται κάθε 4 ημέρες. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική εξάρθρωση 5 εβδομάδες μετά τη δέκατη ένεση, και μεταμοσχεύσιμους όγκους απομονώθηκαν και αξιολογήθηκαν.

ανοσοφθορισμού Δοκιμασία

Όλα ξενομοσχεύματος ιστοί σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη για τεμαχισμό σε ένα microtome Leica. τομές τεσσάρων μικρομέτρων παρασκευάστηκαν και ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιείται με βρασμό των δειγμάτων για 15 λεπτά στους 100 ° C σε 10 mmol /l κιτρικού νατρίου. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξειδάση υδρογόνου 0.3% για 20 λεπτά, και τα δείγματα αποκλείστηκαν με PBS που περιέχει 1% FBS. Πολυκλωνικά αντι-ποντικού κουνελιού CD31 IgG (Abcam, Cambridge, MA, USA) αραιώθηκε 1:200 και προστίθεται ως το πρωτογενές αντίσωμα? δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάζονται με το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) (Multisciences Biotech, Hangzhou, Κίνα).

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

Ο φορέας έκφρασης pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target (Promega ) περιείχε το VEGFC mRNA 3’UTR της θέσης στόχου miR-27b ή μια μεταλλαγμένη θέση-στόχο miR-27b (βλ S1 File). Τα πλασμίδια ρΡΙ_-ΤΚ (Promega) συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα 293Τ με είτε ο αρνητικός μιμούνται ελέγχου (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘), μιμούνται miR-27b (5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3′), ή αντι-ΜΙΚ 27β μιμούνται (5’-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3 ‘) (GenePharma Tech, Σαγκάη, Κίνα) με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Η αναλογία πυγολαμπίδας στο

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού διπλής Reporter (Promega) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε ένα λουμινόμετρο.

Western Blotting

Συνολική πρωτεΐνη ήταν εξάγεται από κύτταρα λύονται με την M-PER θηλαστικών Protein Extraction Reagent (Thermo) συμπληρωμένο με το κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Sigma). Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween-20 (TBST) για 60 λεπτά, η μεμβράνη επωάστηκε με τα πρωτεύοντα αντισώματα αντι-ανθρώπινης-VEGFC (τεχνολογία Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA) ( 1:2000) ή αντι-ανθρώπινο GAPDH (KangChen, Σαγκάη, Κίνα) διαλύθηκε σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού σε TBST όλη τη νύκτα στους 4 ° C.

Κλινική CRC δείγμα ανάλυσης

Δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 2.008,1 και 2.010,12 στο δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο, Zhejiang University School of Medicine και επιβεβαιώθηκε παθολογικά. Οι όγκοι οργανώθηκαν με τη χρήση του συστήματος σταδιοποίησης των όγκων Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (UICC) (Πίνακας S1).

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Τα αποτελέσματα qPCR από ζεύγη κλινικά δείγματα αναλύθηκαν με δύο-ουρά ζεύγη Φοιτητών

t-test

και τα άλλα αποτελέσματα από δύο-ουρά unpaired Student του

t-test

.

P

τιμές & lt?. 0.05 αναφέρεται στατιστική σημαντικότητα

Άλλες μέθοδοι

, συμπεριλαμβανομένης της διαλογής κυττάρων, πλασμίδιο κατασκευή, την εγκατάσταση του miR-27b, αντι-miR-27b, ή VEGFC knockdown (VEGFC-shRNA αντι-miR-27b σταθερά κύτταρα SW620), ELISA, αιματοξυλίνη και εοσίνη (ΗΕ) χρώση, και αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης μεθυλίωσης-ειδική (MSP), περιγράφονται στο S1 File.

Αποτελέσματα

Επίπεδα miR-27b μειώνεται τόσο στην παχέος ΚΕΠ και πιο καρκινικούς ιστούς

ΚΕΠ διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην καρκινογένεση και συνδέονται με υποτροπή, μετάσταση και η αντίσταση θεραπεία [20] – [22]. Ένας αριθμός δεικτών επιφανείας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαλογή ΚΕΠ, συμπεριλαμβανομένων των CD24, CD44, CD166 και CD133 [22]. Από αυτές, CD133 είναι ένας δείκτης καλή ΚΕΠ του CRC, [5], [22] – [25]. Παρατηρήσαμε ιδιότητες ΚΕΠ στο CD133

+ SW620 κύτταρα (Σχήμα S1) και θα αξιολογηθούν προφίλ έκφρασης των miRNAs στο CD133

+ και CD133

– κυττάρων για τον εντοπισμό miRNAs που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου. ανάλυσης μικροσυστοιχιών εντοπιστεί τέσσερις up-ρυθμίζεται (miR-1308, miR-720, miR-132-αστέρων και miR-181-αστέρων) και 14 κάτω-ρυθμιζόμενη (miR-27b, miR-193b, miR-595, miR-27a- αστέρι, miR-1307, miR-502-3p, miR-652, miR-200b, miR-31, miR-1247, miR-200A, miR-200b-αστέρων, miR-362-5p, miR-210) miRNAs σε CD133

+ κύτταρα (Εικόνα 1Α). Όταν αυτά τα αποτελέσματα συνδυάστηκαν με τα προηγούμενα δεδομένα miRNA μικροσυστοιχιών (τα δεδομένα δεν φαίνονται), μόνο η έκφραση miR-27b διέφεραν. Αυτό επιβεβαιώθηκε από qPCR, η οποία κατέδειξε μια 2.77-πλάσια αλλαγή στην έκφραση του miR-27b στο CD133

+

έναντι

CD133

-. Κύτταρα (Εικόνα 1Β)

(Α ) διαφορικά εκφράζονται miRNA στην CD133

+ και CD133

– κύτταρα. Κόκκινο σημαίνει υψηλή και πράσινο υποδηλώνει χαμηλά επίπεδα έκφρασης. (Β) έκφραση του miR-27b στο CD133

+ και CD133

– κυττάρων εκτιμήθηκε με qPCR. Ο άξονας y δείχνει φορές αλλαγή. (C) έκφραση miR-27b αξιολογείται με qPCR νωπών ιστών CRC σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς από έξι ασθενείς. Ο άξονας y δείχνει φορές αλλαγή. (D) έκφραση miR-27b αξιολογείται με qPCR σε 80 ζεύγη εγκλεισμένα σε παραφίνη CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. επίπεδα miR-27b κανονικοποιήθηκαν προς U6 και εκφράζεται σε όρους κύκλου κατωφλίου αναλογία (C

t). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Επίσης, μετρήθηκε η έκφραση του miR-27b σε δείγματα ιστού CRC. Στον περιορισμένο αριθμό διαθέσιμων δειγμάτων φρέσκου ιστού (n = 6), η έκφραση του miR-27b ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω 1/5 έως 5/5 φορές σε ιστούς CRC σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1 C). Σε μεγαλύτερο αριθμό ζευγών ιστούς παραφίνης, το miR-27b σε κύκλο όριο U6 (C

t) αναλογίες τιμή ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς όγκων, υποδηλώνοντας χαμηλότερη έκφραση του miR-27b στο CRC (Σχήμα 1D). Στην πραγματικότητα, τα δεδομένα qPCR 80 ζεύγη εγκλεισμένα σε παραφίνη CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών έδειξε ότι η έκφραση miR-27b μειώθηκε σε 60% σε σύγκριση με το CRC 15% αυξημένα. miR-27b έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι είναι ένας καταστολέας όγκων σε νευροβλάστωμα? έτσι εστιάσαμε το υπόλοιπο των μελετών μας για τον προσδιορισμό των βιολογικών λειτουργιών και των ρυθμιστικών μηχανισμών του miR-27b σε CRC.

miR-27b αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση σε CRC

Εμείς ιδρύθηκε τόσο ΜΙΚ 27β και SW620 σταθερές κυτταρικές σειρές αντι-miR-27b (βλ S1 αρχείων) για τη μελέτη των βιολογικών λειτουργιών του miR-27b (Σχήμα 2Α) με τον προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας πολλαπλασιασμό και

in vitro

και ογκογένεση

in vivo

. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-27b καταπιεσμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ αναστέλλοντας miR-27b μέσω σταθερή έκφραση ενός αντι-miR-27b σφουγγάρι προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικόνα 2Β). Μια δοκιμασία μαλακό άγαρ αποικίας έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του miR-27b απαγορεύεται σημαντικά το σχηματισμό αποικιών, γνωστή και ως αυτο-ανανέωση, ενώ τα κύτταρα αντι-miR-27b σχηματίζεται μεγαλύτερο και μεγαλύτερο αριθμό σφαιρών από τον αρνητικό μάρτυρα (Εικόνα 2C και D). Το πιο σημαντικό, σε μια δοκιμασία ογκογένεση ξεκίνησε με υποδόρια ένεση 1 × 10

6 κύτταρα CRC, βρήκαμε ότι το miR-27b θα μπορούσε ισχυρή ανάπτυξη καταστολή του όγκου, ενώ η αντι-miR-27b προωθείται ανάπτυξης (Σχήμα 2Ε και F).

(Α) έκφραση του miR-27b σε αρνητικό έλεγχο (NC), αντι-miR-27b κυτταρικές σειρές SW620 miR-27b και αξιολογήθηκαν από qPCR. Ο άξονας y δείχνει φορές αλλαγή. ρυθμό πολλαπλασιασμού (Β) Cell ανιχνεύεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm σε μια δοκιμασία MTS. (Γ και Δ) Τα αποτελέσματα μίας δοκιμασίας μαλακό άγαρ αποικία. Οι αποικίες έγιναν ορατές με μικροσκοπία μετά από 2 εβδομάδες επώασης. Αποικίες που περιέχουν & gt? 20 κύτταρα μετρήθηκαν. Ράβδοι κλίμακας = 200 μm. (Ε) Τα αποτελέσματα από μια δοκιμασία ογκογένεσης. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των όγκων ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

6 κύτταρα CRC. (F) Σύγκριση του σχηματισμού ξενομοσχεύματος

in vivo

. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν κάθε εβδομάδα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM, *

P

& lt?. 0.05

Η

Ερευνήσαμε περαιτέρω την αντικαρκινική δράση του miR-27b

in vivo

στην ένα ανθρώπινο μοντέλο ποντικού CRC-ρουλεμάν. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τον αρνητικό έλεγχο (NC) ή ομάδες miR-27b, με πέντε ποντικούς ανά ομάδα. Οι χοληστερίνη-συζευγμένο NC ή miR-27b μιμείται εγχύθηκαν εντός των όγκων. Δύο ποντίκια στην ομάδα NC πέθαναν μετά από θεραπεία 4 εβδομάδων? Ωστόσο, η αιτία του θανάτου δεν προσδιορίστηκε. Στην ομάδα miR-27b, ένα ξενομόσχευμα εξαφανίστηκε μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας (Σχήμα 3Α και Β), ενώ οι άλλες τέσσερις ξενομοσχεύματα ήταν μαλακά στην αφή και σοβαρή νέκρωση όγκου παρατηρήθηκε μετά παθολογική εξέταση (Σχήμα 3C). δοκιμασίες ανοσοφθορισμού αποκάλυψαν ότι ξενομοσχεύματα στην ομάδα miR-27b είχαν λιγότερη τριχοειδή αιμοφόρα αγγεία από εκείνες στην ομάδα NC (Σχήμα 3D), και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι qPCR επίπεδα miR-27b ήταν σημαντικά αυξημένα σε ξενομοσχεύματα miR-27b (Σχήμα 3Ε). Όλα αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ένα ρόλο κατασταλτικό όγκου για miR-27β στο CRC και δείχνουν τις δυνατότητές της ως φάρμακο κατά του CRC.

(Α και Β) Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) που φέρει NOD /SCID ποντίκια έγιναν εντός του όγκου ένεση με τη χοληστερόλη συζευγμένο αρνητικό έλεγχο (NC) ή μιμείται miR-27b. Εφελκίδες παρατηρήθηκαν σε τέσσερις όγκους από την ομάδα miR-27b (λεπτή βέλος). Ένας όγκος από την ομάδα miR-27b εξαφανίστηκε εντελώς με μόνο ένα φουζικλάδιο που απομένει (παχύ βέλος). (C) με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) χρώση ξενομοσχεύματος ιστοί που παρουσιάζουν νεκρωτικές περιοχές στην ομάδα του miR-27b. (D) Μια αντιπροσωπευτική δοκιμασία ανοσοφθορισμού δείχνει CD31 πρωτεΐνη σε ξενομόσχευμα ιστούς από NC και miR-27b (n = 3). Ράβδοι κλίμακας = 200 μm. (Ε) την έκφραση του miR-27b σε ξενομοσχεύματα από το NC και μιμείται miR-27b εκτιμήθηκε με qPCR. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM, *

P

& lt?. 0.05

Η

VEGFC είναι ένα μυθιστόρημα στόχος του miR-27b σε CRC

miRNAs λειτουργία κυρίως ως μεσολαβητές της γονιδιακής αποσιώπησης. Στόχοι του miR-27b σε CRC στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη χρήση δεδομένων που προβλέπονται από τη βάση δεδομένων TargetScan (www.targetscan.org). Εκατοντάδες προβλέψει στόχων miR-27b υποβλήθηκαν σε περαιτέρω ανάλυση εμπλουτισμό της κυτταρικής σηματοδότησης οδών χρησιμοποιώντας την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) βάση δεδομένων οδός (www.genome.jp/kegg/). Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, miR-27b είχε προβλεφθεί να στοχεύσει μονοπάτια σηματοδότησης σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων VEGF, Wnt και το ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ). Τελικά, εστιάσαμε στην VEGF σηματοδότησης Wnt αφού και ΜΑΡΚ δεν επηρεάστηκαν προφανώς σε CRC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έχουμε ακόμη προσδιοριστεί VEGFC ως λειτουργικό κατάντη στόχου της miR-27b. Η VEGFC 3’UTR περιέχει εντόνως διατηρημένες θέσεις σύνδεσης (Σχήμα 4Α) miR-27b, που είναι αποκριτικά σε miR-27b σε μια δοκιμασία διπλής αναφοράς λουσιφεράσης. Βρήκαμε ότι η δραστικότητα ενός ανταποκριτού λουσιφεράσης που περιέχει την VEGFC 3’UTR μειώθηκε κατά -70% με την συν-επιμόλυνση με το μιμητικό miR-27b, αλλά αυξήθηκε κατά -100% με συν-επιμόλυνση με το μιμητικό αντι-miR-27b. Επιπλέον, καμία αλλαγή ταυτοποιήθηκε κατόπιν συν-επιμόλυνση του μεταλλαγμένου πλασμιδίου αναφοράς είτε με miR-27b ή μιμείται αντι-miR-27b (Σχήμα 4Β). επίπεδα πρωτεΐνης VEGFC ήταν επίσης μειωμένη σε κύτταρα και μέσο καλλιέργειας μετά από διαμόλυνση με ένα μιμητικό miR-27b, ενώ τα επίπεδα VEGFC αυξήθηκαν κατά τη μορφομετατροπή ενός αντι-miR-27b μιμούνται (Σχήμα 4C και D).

In vivo

, τα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGFC ήταν χαμηλότερα σε ξενομοσχεύματα miR-27b σε σύγκριση με την ομάδα NC (Σχήμα 4Ε).

(Α) VEGFC προβλέπεται ως νέο στόχο του miR-27b . (Β) κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με άδειο πλασμίδια pmirGLO Dual-Luciferase ρεπόρτερ ή VEGFC 3’UTR πλασμίδια ανταποκριτές λουσιφεράσης πυγολαμπίδας και ρΡΙ_-ΤΚ-λουσιφεράσης πλασμίδια, μαζί με μιμείται miR-27b ή αντι-miR-27b. Μετά από 48 ώρες, πυγολαμπίδας μετρήθηκε δραστικότητα λουσιφεράσης και εξομαλύνθηκαν με εκείνη της λουσιφεράσης της Renilla. κύτταρα (C) CRC επιμολύνθηκαν με NC, miR-27b ή αντι-miR-27b μιμείται και έκφραση VEGFC ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. κύτταρα (D) CRC επιμολύνθηκαν με NC, miR-27b ή αντι-miR-27b μιμείται και VEGFC σε μέσο καλλιέργειας ανιχνεύθηκε με ELISA. (Ε) VEGFC πρωτεΐνης σε ξενομοσχεύματα από αρνητικό έλεγχο (NC) και μιμείται miR-27b ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM, *

P

& lt?. 0.05

Η

VEGFC Αναπαράγει το Όγκων-προώθηση Ρόλος στο CRC

Πολλές μελέτες έχουν αναφέρει ότι VEGFC συσχετίζεται με την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε μια ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων CRC [16] – [18]. Ιδρύσαμε VEGFC-knockdown κυττάρων SW620 αντι-miR-27b μέσω της έκφρασης ενός ανασταλτικού shRNA (βλέπε S1 File) (Σχήμα 5Α). VEGFC-knockdown καταστέλλεται τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα NC (Σχήμα 5Β), αναστέλλει σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας (Σχήμα 5C και D) και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 5Ε και F). Συλλογικά, οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν έντονα ότι VEGFC παίζει ρόλο στη διέγερση πολλαπλασιασμού και την προώθηση της ογκογένεσης σε CRC. Αν και υπάρχουν μια σειρά από προβλέψει στόχους miR-27b, VEGFC ως λειτουργικό κατάντη στόχου της miR-27b μπορεί να επιβεβαιωθεί πλήρως στα πειράματά μας.

(Α) VEGFC νοκ ντάουν σε αντι-miR-27b σταθερό κυττάρων ήταν επιβεβαιώνεται από western αποτύπωση. (Β) ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm σε μια δοκιμασία MTS. (Γ και Δ) Τα αποτελέσματα μίας δοκιμασίας μαλακό άγαρ αποικία. Οι αποικίες έγιναν ορατές με μικροσκοπία μετά από 2 εβδομάδες επώασης. Αποικίες που περιέχουν & gt? 20 κύτταρα μετρήθηκαν. Ράβδοι κλίμακας = 200 μm. (Ε) τα αποτελέσματα μιας δοκιμασίας ογκογένεσης. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των όγκων ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια υποδόρια ένεση με 1 × 10

6 κύτταρα CRC. (F) Σύγκριση του σχηματισμού ξενομοσχεύματος

in vivo

. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν κάθε εβδομάδα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM, *

P

& lt?. 0.05

Η

DNA υπερμεθυλίωση μειώνει την έκφραση του miR-27b

Και οι δύο μεταγραφικά και επιγενετικές μονοπάτια ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης . Επιγενετική περιλαμβάνουν μεθυλίωση του DNA, ακετυλίωση ιστονών και μη-κωδικοποίησης RNAs [26]? αποσιώπηση ορισμένων miRNAs συνδέεται με CpG νησιού υπερμεθυλίωση σε μία ποικιλία καρκίνων [27] – [29]. Για να καθοριστεί εάν επιγενετικών μηχανισμών μεσολάβηση λειτουργία miR-27b, καλλιεργήσαμε κύτταρα παρουσία της ιστόνης αποακετυλάσης αναστολέα τριχοστατίνη Α (TSA) (Sangon Biotech, Σαγκάη, Κίνα) ή τον αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης 5-αζα-dC (5AZA) (Calbiochem, San Diego, CA, USA). επίπεδα miR-27b παρέμειναν αμετάβλητες σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με 1 nmol /ml TSA για 3 ημέρες. Ωστόσο, η θεραπεία με 5 nmol /ml 5AZA αξιόλογα αυξημένα έκφραση miR-27b (Σχήμα 6Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DNA υπερμεθυλίωση παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του miR-27b. Η προβλεπόμενη θέση υποκινητή του miR-27b σε χρωμόσωμα 9 κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα λουσιφεράσης (βλέπε S1 File) και επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας λουσιφεράση δοκιμασίες (Σχήμα 6Β). Αποτελέσματα MSP υποδεικνύεται miR-27b CpG νησί υπερμεθυλίωση σε αρκετές κυτταρικές σειρές CRC (Σχήμα 6C).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης miR-27b σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκαν με qPCR μετά τη θεραπεία με 5AZA ή TSA για 3 ημέρες. (Β) Τα αποτελέσματα των αναλύσεων λουσιφεράσης δραστικότητας μετά από επιμόλυνση με το προβλεπόμενο προωθητή miR-27b ομαλοποιήθηκε να ρΡΙ_-ΤΚ λουσιφεράση της Renilla. ανάλυση (C) MSP του miR-27b CpG νησί σε μια σειρά από κυτταρικές σειρές CRC. Συγκροτήματα σε λωρίδες του «Μ» Τα προϊόντα PCR που λαμβάνονται με τη χρήση μεθυλίωσης-ειδικών εκκινητών και εκείνων στις λωρίδες του «U» είναι τα προϊόντα που παράγονται με τη χρήση μη μεθυλιωμένα-ειδικούς εκκινητές.

Η

Συζήτηση

Η ΚΕΠ υπόθεση έχει αποδειχθεί σε μια ευρεία ποικιλία στερεών όγκων [20], [21], και η τρέχουσα βιβλιογραφία εστιάζεται στον ρόλο των miRNAs στον ανθρώπινο καρκίνο. Τα miRNAs θεωρείται ότι έχουν ευρεία ρυθμιστική δραστηριότητα σε ένα ευρύ φάσμα των αναπτυξιακών διαδικασιών και εμπλέκονται σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [8].

Επιδιώξαμε να διερευνήσουν τη λειτουργία miRNAs σε CRC. Υποθέσαμε ότι οι μοριακές διαφορές μεταξύ των ΚΕΠ και διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εντοπίσει το κλειδί μόριο υπεύθυνο για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Τόσο

in vitro

και

in vivo

έρευνες προσδιορίστηκε ότι CD133

+ κύτταρα CRC θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως ΚΕΠ κύτταρα που μοιάζουν με βάση τα βλαστικά κύτταρα ιδιότητές τους. Αυτό το μοντέλο ΚΕΠ χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή και τον εντοπισμό 18 διαφορετικά νομοθετικά miRNAs. miR-27b ήταν το μόνο miRNA εντοπίζονται κατ ‘επανάληψη σε αυτά τα πειράματα? δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο αυτού του miRNA σε CRC έχει αναφερθεί. Βρήκαμε ότι miR-27b δεν επηρέασε CRC διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων τροποποιώντας την έκφραση του στελέχους-κυττάρων που συνδέεται γονίδια

Nanog, Oct4, Sox2, Bmi1

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περαιτέρω μελέτη έδειξε μειωμένη έκφραση του miR-27b στις περισσότερες CRC ιστούς.

Στη συνέχεια ερευνήσαμε τη λειτουργία των miR-27b σε CRC και απέδειξε ότι θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά αυτο-ανανέωση

in vitro

και ογκογενετικότητας

in vivo

. Επιπλέον, προσδιορίσαμε VEGFC ως λειτουργικό κατάντη στόχος του miR-27b χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να αναφέρετε την συγκεκριμένη λειτουργία και ένα νέο λειτουργικό στόχο του miR-27b σε CRC. VEGFC ανήκει στην οικογένεια παράγοντα ανάπτυξης που προέρχεται από αιμοπετάλια και η έκφρασή του συσχετίζεται σημαντικά με φτωχότερες ιστολογική βαθμολογία, λεμφικό εισβολή και φλεβική εισβολή [16] – [18], [30], και οι πρόσφατες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι έχει ένα σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση. [19], [31] Αρκετές πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι αυτοκρινής ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων μέσω της μετανάστευσης VEGFC /VEGFRs είναι ένας σημαντικός επαγωγέας του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όγκου, εισβολή και μετάσταση. [30] Υπάρχει επίσης τις αναδυόμενες ενδείξεις που υποστηρίζουν ένα υποθετικό ρόλο για miRNAs ως καταστολείς των όγκων ή ογκογονίδια που θα μπορούσε να οδηγήσει σε στοχοθετημένες στρατηγικές θεραπείας του καρκίνου [32], [33]. miR-34a έχει ισχυρή κατά του όγκου αποτελέσματα σε όγκους του προστάτη και μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα θεραπευτικό παράγοντα για τον καρκίνο του προστάτη [11]. Ένεση εντός του όγκου της χοληστερόλης-συζευγμένο μιμείται miR-199α /b-3ρ ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και τα επίπεδα AFP ορού σε μειωμένη ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [34]. Κακοήθη κύτταρα εξαρτώνται από την ανώμαλη έκφραση των miRNAs? αυτά τα μικρά RNAs παρέχουν σημαντικές ευκαιρίες για την ανάπτυξη των μελλοντικών θεραπειών miRNA με βάση [30], [35], [36]. Λόγω των σοβαρών παρενεργειών των παραδοσιακών χημειοθεραπεία, η έρευνα σχετικά με άλλες μεθόδους για τη θεραπεία CRC, όπως η γονιδιακή θεραπεία, είναι ελκυστική.

Tumor αγγειογένεση είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου και τη συντήρηση, και πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η αγγειογένεση αναστολείς μπορεί να παρέχει ένα σημαντικό θεραπευτικό πλεονέκτημα [37], [38]. Εδώ αναφέρουμε ότι σοβαρή νέκρωση παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα της μιμείται miR-27b, η οποία ανέπτυξε επίσης λιγότερες τριχοειδή αιμοφόρα αγγεία από την ομάδα NC, και σε ένα ξενομόσχευμα εξαφανιστεί εντελώς με τα υπόλοιπα μόνο μια κρούστα. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν την αντικαρκινική δράση του miR-27b

in vitro

και

in vivo

, υποδηλώνοντας miR-27b να είναι ένα υποσχόμενο στόχο για θεραπεία CRC μετά την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της γονιδιακής θεραπείας έχουν προσδιοριστεί.

Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής είναι ποικίλες, και ενώ αυτά υποκείμενες miRNA δυσρύθμιση στον καρκίνο δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί, miRNA μεσολάβηση υπερμεθυλίωση προαγωγού έχει εντοπιστεί στην πλειονότητα των όγκων. Βρήκαμε ότι το miR-27b μεσολαβεί γονιδιακή σίγηση σε CRC οφειλόταν σε αναστρέψιμη υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων και όχι ακετυλίωση των ιστονών.

Η ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και την επισκευή του καρκίνου. Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι η αγγειογένεση του όγκου θα μπορούσε να προκληθεί από ΚΕΠ λόγω έκφραση αγγειογόνο παράγοντα στο μικροπεριβάλλον του όγκου [37], [39]. Αντι-αγγειογένεσης θεραπεία στοχεύει VEGF μπορεί να καταστρέφουν την αγγείωση του όγκου και την εκτομή αυτο-ανανέωση των ΚΕΠ [37], [40]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-27b προέρχεται ΚΕΠ από CRC και ενεργεί ως ένα σημαντικό ογκοκατασταλτικό και αγγειογόνου παράγοντα με στόχευση VEGFC. Η περαιτέρω μελέτη των ΚΕΠ ή αγγειογένεσης θα διευκολύνει την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών θεραπευτικών στρατηγικών. miRNA με βάση θεραπευτικές στρατηγικές μπορεί επίσης να οδηγήσει σε βελτίωση της διαχείρισης των όγκων στο όχι πολύ μακρινό μέλλον [41], [42]. Αυτά τα αποτελέσματα δεν επιτρέπουν μόνο για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν κύτταρα CRC, αλλά και να διευκολύνει τη σταδιακή ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

CD133 + SW620 κύτταρα εμφανίζουν χαρακτηριστικά ΚΕΠ

in vitro

και

in vivo

. (Α) Η κυτταρομετρία ροής διάγραμμα σημείων που δείχνει την κατανομή του CD133

+ κυττάρων στην κυτταρική σειρά CRC, SW620. (Β και Γ) Τα αποτελέσματα μίας δοκιμασίας μαλακό άγαρ αποικία. Οι αποικίες έγιναν ορατές με μικροσκοπία μετά από 2 εβδομάδες επώασης και εκείνα που περιέχουν & gt? 20 κύτταρα μετρήθηκαν. Ράβδοι κλίμακας = 200 μm. (Δ) προκύπτει από μια δοκιμασία ογκογένεσης. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των όγκων ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια που έλαβαν υποδόρια ένεση με 5 × 10

4 CD133

– ή CD133

+ SW620 κυττάρων. (Ε) Σύγκριση του σχηματισμού ξενομοσχεύματος

in vivo

. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν εβδομαδιαίως. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM, *

P

& lt? 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0060687.s001

(ΔΕΘ)

αρχείου S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0060687.s002

(DOC)

Πίνακα S1.

κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών CRC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0060687.s003

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Zhong Shi για επεξεργασία γλώσσας .