Αφηρημένο

στόχευση φθορισμού-αντισώματος του μεταστατικού καρκίνου έχει αποδειχθεί από το εργαστήριο μας για να ενεργοποιήσετε οπτικοποίηση των όγκων και αποτελεσματική επέμβαση φθορίζουσα καθοδήγηση. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί αν αυξητικού παράγοντα-1 υποδοχέα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF-1 R) αντισώματα, συζευγμένα με φωτεινά φθοροφόρα, θα μπορούσε να επιτρέψει την απεικόνιση του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου σε ορθοτοπική γυμνά μοντέλα ποντικού. IGF-1 R αντίσωμα (κλώνος 24-31) συζεύχθηκε με 550 nm, 650 nm ή ΡΕΟυλιωμένο 650 φθοροφόρα nm. Υποδόρια, ορθοτοπική, και μετάσταση ήπατος πρότυπα καρκίνου κόλου σε γυμνά ποντίκια στοχευμένη με τα φθορίζοντα αντισώματα IGF-1R. Western κηλίδωση επιβεβαίωσε την έκφραση του IGF-1 R σε ΗΤ-29 και HCT 116 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, και οι δύο εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Σήμανση με συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1 R αντίσωμα επέδειξε φθορισμού εστίες επί της μεμβράνης των κυττάρων καρκίνου του κόλου. Subcutaneously- και ορθοτοπικά-μεταμοσχευμένων όγκων 116-GFP ΗΤ-29-GFP και HCT λαμπρά φθορισμό στα μακρύτερα μήκη κύματος μετά από ενδοφλέβια χορήγηση του φθορίζοντα αντισώματα IGF-1R. Ορθοτοπικά-μεταμοσχευμένων όγκων HCT 116-GFP είχαν έντονα επισημασμένα με φθορίζοντα αντισώματα IGF-1 R τέτοια ώστε να μπορούν να απεικονιστούν μη επεμβατικά στα μεγαλύτερα μήκη κύματος. Σε ένα πειραματικό μοντέλο μετάστασης ήπατος, IGF-1 R αντισώματα συζευγμένα με πεγκυλιωμένη 650 nm φθοροφόρα επιλεκτικά υπογράμμισε τις μεταστάσεις ήπατος, η οποία θα μπορούσε στη συνέχεια να είναι μη-επεμβατικά απεικονισθεί. Τα IGF-1 R φθορίζον-σημασμένο αντίσωμα ηπατικές μεταστάσεις ήταν πολύ φωτεινό σε σχέση με το φυσιολογικό ήπαρ και το φθορίζον-αντισώματος ετικέτας συντοπισμένου με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) έκφραση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει έτσι ότι η συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1R αντισώματα απεικονίσει επιλεκτικά μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου και έχουν κλινικές δυνατότητες για βελτιωμένη διάγνωση και τη χειρουργική με φθορίζουσα καθοδήγηση

Παράθεση:. Πάρκο JY, Murakami Τ, Lee JY, Zhang Υ , Hoffman RM, Μπουβέ Μ (2016) Fluorescent-αντίσωμα στόχευση των ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα-1 υποδοχέα οπτικοποιεί Μεταστατικό Καρκίνο του Ανθρώπου του παχέος εντέρου σε μοντέλα ορθοτοπική ποντίκι. PLoS ONE 11 (1): e0146504. doi: 10.1371 /journal.pone.0146504

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: May 26, 2015? Αποδεκτές: 17 Δεκεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 5 Γενάρη 2016

Copyright: © 2016 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το National Cancer Institute CA142669 και CA132971, σε MB και αντικαρκινικά, Inc., και μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Κορέα έρευνα σύμφωνα με το βασικό ταμείο προώθησης της έρευνας του Υπουργείου Παιδείας και πόροι Υγεία Ανάπτυξης της Κορέας 2010-0022990 να JYP. Το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για συγγραφέα MB, αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι του συγγραφέα αρθρώνεται στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. JYP, TM, και RMH είναι nonsalaried θυγατρικές των αντικαρκινικών, Inc. YZ είναι υπάλληλος των αντικαρκινικών, Inc. AntiCancer, Inc., εμπορεύεται ζωικά μοντέλα καρκίνου. Δεν υπάρχουν άλλα ανταγωνιστικά συμφέροντα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις δυτικές χώρες [1 ]. Ανάπτυξη κολονοσκόπηση επιτρέπει την έγκαιρη ανίχνευση και την αφαίρεση των προκαρκινικών αδενωματώδεις πολύποδες [2,3]. Πλήρη χειρουργική εκτομή μπορεί να θεραπεύσει καλά επιλεγμένους ασθενείς με ηπατική μετάσταση [4,5]. Βελτιωμένη απεικόνιση του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου θα πρέπει να αυξήσουν την επιβίωση κάνοντας κολονοσκόπηση και η χειρουργική επέμβαση πιο αποτελεσματική. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η στόχευση ορθοτοπική μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένων ορθοτοπικό ξενομοσχεύματα που λαμβάνονται από ασθενή (PDOX) μοντέλα, με φθορίζουσες αντι-carcinoembyronic αντιγόνο (CEA) αντισωμάτων επέτρεψε βελτιωμένη οπτικοποίηση των όγκων και αποτελεσματική χειρουργική φθορίζουσα καθοδήγηση (FGS) [6]. Στόχευση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα με φθορίζοντα αντισώματα βελτιωμένη κολονοσκόπηση [7].

Τύπος Ι υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF-1 R) είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας κινάσης τυροσίνης που περιλαμβάνει δύο α και δύο β αλυσίδες και είναι ο κύριος υποδοχέας για IGF-I και IGF-II. IGF-1 R εκφράζεται σε 51 ~ 100% των καρκίνων του παχέος εντέρου ανάλογα με τη μελέτη [8-10]. Η υψηλή συχνότητα της έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου και μεμβράνη υποκυτταρική τοποθεσία κάνουν IGF-1 R ένας δυνητικός στόχος για φθορίζοντα αντισώματα να επιτρέψει την απεικόνιση του καρκίνου, τη διάγνωση, και FGS [11]. Χρησιμοποιώντας IGF-1R έχει επίσης πρόσθετες κλινικές δυναμικό δεδομένου ότι η υπερέκφραση του IGF-1R συσχετίζεται με μικρότερη διάμεση επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση και επικουρική χημειοθεραπεία [10].

Η παρούσα έκθεση αποδεικνύει τη σκοπιμότητα της IGF- 1R στοχευμένη φθορισμοφόρο-συζευγμένα αντισώματα για να απεικονίσει μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου σε κατάλληλα μοντέλα ποντικιών.

Υλικά και Μέθοδοι

καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 [12] και HCT 116 [13] διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), πυροσταφυλικό νάτριο (Gibco-BRL) , διττανθρακικό νάτριο (Cellgro, Manassas, VA), L-γλουταμίνη (Gibco-BRL), και ελάχιστο βασικό μέσο μη απαραίτητα αμινοξέα (Gibco-BRL). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

Κατασκευή του GFP που εκφράζουν κόλου κυτταρική σειρά καρκίνου

Η κατασκευή της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) που εκφράζουν HCT 116 προηγουμένως περιγράφεται [14-16]. Για μεταγωγή γονίδιο GFP, 20% συρρέοντα HCT 116 κύτταρα [17] επωάστηκαν με ένα μίγμα 1: 1 των ρετροϊικών υπερκειμένων των κυττάρων συσκευασίας ΡΤ67 και RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) για 72 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψίνη /ΕϋΤΑ 72 ώρες μετά την επώαση με GFP ρετροϊικά υπερκείμενα και υποκαλλιεργήθηκαν με αναλογία 1:15 σε επιλεκτικό μέσο που περιείχε 200 μg /ml G418. Το επίπεδο G418 αυξήθηκε στα 800 μg /ml κατά βήματα. Οι κλώνοι που εκφράζουν GFP απομονώθηκαν με κυλίνδρους κλωνοποίησης (Bel-Art Products, Pequannock, NJ) με θρυψίνη /EDTA και ενισχύθηκαν και μεταφέρθηκαν με συμβατικές μεθόδους καλλιέργειας. κλώνοι έκφραση υψηλού GFP μετά απομονώθηκαν με την απουσία του G418 για & gt? 10 περάσματα για να επιλέξετε για σταθερή έκφραση της GFP [14-16].

Ποντίκια

Αθυμικοί nu /nu γυμνά ποντίκια (AntiCancer Inc., San Diego, CA), ηλικίας 4-6 εβδομάδων , χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Οι ποντικοί κρατήθηκαν σε μία εγκατάσταση φράγματος υπό διήθηση HEPA. Οι ποντικοί τράφηκαν με δίαιτα έχει αποστειρωθεί σε κλίβανο εργαστηρίου τρωκτικών. Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες και απεικόνισης ποντικού διεξήχθησαν με τα ζώα αναισθητοποιούνται με ενδομυϊκή ένεση 50% κεταμίνης, ξυλαζίνης 38%, και 12% μηλεϊνική ακεπρομαζίνη (0,02 ml). Τα ζώα έλαβαν βουπρενορφίνη (0,10 mg /kg ΙΡ) αμέσως πριν από το χειρουργείο και μία φορά την ημέρα κατά τη διάρκεια των επόμενων 3 ημερών για τη βελτίωση του πόνου. Η κατάσταση των ζώων παρακολουθήθηκε κάθε μέρα. Οι όγκοι μετρήθηκαν με παχύμετρο κάθε δεύτερη μέρα. Όταν οι όγκοι έγιναν μεγαλύτερα από 2 cm ή σχηματίστηκε ένα βαθύ έλκος, ευθανασία πραγματοποιήθηκε. Τα ζώα θυσιάστηκαν όλα 2-3 εβδομάδες μετά την επέμβαση. CO

2 εισπνοή χρησιμοποιήθηκε για την ευθανασία. Για να εξασφαλιστεί θάνατο μετά από CO

2 ασφυξία, αυχενική εξάρθρωση έγινε. Όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από αντικαρκινικούς, θεσμικές Φροντίδα Ζώων Inc. και Επιτροπή Χρήσης (IACUC), σύμφωνα με τις αρχές και τις διαδικασίες που περιγράφονται στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων υπό Διασφάλισης Αριθμός A3873-1.

Antibody-dye σύζευξη

Ποντίκια μονοκλωνικά αντισώματα προς IGF-1 R (κλώνος 24-31? Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) συζεύχθηκαν με DyLight 650, Dylight 550, ή πεγκυλιωμένη Dylight 650 χρώματα (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή, διασφαλίζοντας ένα ελάχιστο τουλάχιστον 4: 1 βαφής: αναλογία πρωτεΐνης [18]. Πρωτεΐνη: Οι συγκεντρώσεις χρωστικής επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [18]

κηλίδωση Western

κυτταρολύματα εκχυλίσθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 70 mM β-γλυκεροφωσφορικό. , 0,6 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 2 mM MgCl

2, 1 mM αιθυλενογλυκόλη τετραοξικό οξύ, 1 mM DTT (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA), 0.5% Triton-Χ100, 0,2 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 1% πρωτεάση κοκτέιλ αναστολέα (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Τα προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα νάτριο δωδεκυλθειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% (w /v) μη λιπαρό ξηρό γάλα και ανιχνεύτηκαν με αντι-IGF-1Rα (SC-712, Santa Cruz, Dallas, ΤΧ, USA). Οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Επισήμανση των ζωντανών κυττάρων in vitro με χρήση φθοριζόντων αντισωμάτων IGF-1 R

ΗΤ-29 και HCT 116 κύτταρα (2 χ 10

5) καλλιεργήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας. IGF-1 R αντίσωμα (κλώνος 24-31) συζευγμένο με DyLight 550 βαφή αραιώθηκε στα 4 μg /ml σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS, Corning Cellgro, Manassas, VA). Το μέσο καλλιέργειας αναρροφήθηκε από τα κύτταρα και το αραιωμένο αντίσωμα προστέθηκε στα ζωντανά κύτταρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν απαλά 2 φορές με PBS μετά αναρροφήθηκε το αντίσωμα. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) με λευκό φως και 559 nm laser [19].

Η ανοσοϊστοχημεία

Anti-IGF-1R (κλώνος 24-31 ) συζευγμένο με DyLight 650 χρησιμοποιήθηκε για χρώση τομές όγκων σε πλακίδια. Τα πλακίδια επωάστηκαν με 10% φυσιολογικό ορό γαϊδάρου για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και επωάστηκαν με το συζευγμένο αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα σε αραίωση 1: 100. Οι ιστοί ξηραίνονται και παρατηρήθηκαν με IV-100 μικροσκόπιο λέιζερ σάρωσης (Olympus, Tokyo, Japan) με ένα λέιζερ 633 nm [20]. Εναλλακτική διαφάνειες από την ίδια κατεψυγμένου ιστού του όγκου χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φωτός.

υποδόρια και ορθοτοπική μοντέλα όγκου ποντικού

ΗΤ-29-GFP και HCT 116-GFP ανθρώπινου κόλου καρκινικά κύτταρα (2 χ 10

6) ενέθηκαν υποδορίως στα πλευρά γυμνών ποντικών. Όταν οι όγκοι αναπτύχθηκαν υποδόρια μεταξύ 10 και 20 mm σε διάμετρο, αυτά συλλέχθηκαν και κατακερματισμένο σε μικρά θραύσματα. Τα θραύσματα του όγκου εμφυτεύθηκαν ορθοτοπικά σε κόλον γυμνών ποντικών, όπως περιγράφεται προηγουμένως [6,21,22]. Εν συντομία, ένα μόνο 3 mm

3 θραύσμα του όγκου, το οποίο ήταν κατάλληλο για συρραφή και επίσης ως αποτέλεσμα αναπαραγώγιμη ανάπτυξη όγκου, συνδέθηκε με το μεσεντερικά σύνορα του τυφλού εντέρου τοίχου χρησιμοποιώντας 8-0 νάιλον χειρουργικών ραμμάτων (Ethilon ™? Ethicon Inc ., Somerville, NJ). Με την ολοκλήρωση, το τυφλό έντερο επέστρεψε στην κοιλιακή χώρα, και η τομή έκλεισε σε μία στρώση, χρησιμοποιώντας 6-0 νάιλον χειρουργικών ραμμάτων (Ethilon).

μοντέλο μετάστασης ήπατος

HCT116-GFP καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα (2 χ 10

6), με Matrigel, εγχύθηκαν εντός του σπλήνα γυμνών ποντικών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Ηπατικές μεταστάσεις εμφανίστηκε σε μια περίοδο 2-3 εβδομάδων.

Imaging

Και στα δύο μοντέλα υποδόρια και ορθοτοπική όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν με το αντίσωμα IGF-1 R, συζευγμένο με φθορισμοφόρο στην ουρά φλέβα, και στη συνέχεια ολόκληρο το σώμα μη επεμβατική απεικόνιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το μικρό σύστημα OV100 ζώων Imaging (Olympus, Tokyo, Japan) όπως περιγράφεται παραπάνω [23]. Η βέλτιστη δόση της συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1 R αντίσωμα προσδιορίστηκε με τη δόση που παράγονται εικόνες με την καλύτερη αναλογία όγκου-προς-υπόβαθρο στο μοντέλο υποδόριου όγκου απεικονιστεί ως απευθείας με το OV100. Μετά ολόκληρο το σώμα μη επεμβατική απεικόνιση στη ορθοτοπικό πρότυπο όγκου, ex vivo απεικόνιση του όγκου με το OV-100 διεξήχθη στο τέλος του πειράματος. Στο μοντέλο ορθοτοπική μεταμόσχευση ήπατος, μετά την εξασφάλιση της παρουσίας ηπατικών μεταστάσεων με μη επεμβατική απεικόνιση όλου του σώματος με την OV100, τα ποντίκια ενέθηκαν με αντι-IGF-1 R (κλώνος 24-31) συζευγμένο με πεγκυλιωμένα DyLight 650. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 24 ώρες μετά την ένεση και μια κοιλιακή κάθετη τομή από το στέρνο προς το κάτω μέρος της κοιλιάς έγινε και στη συνέχεια το ήπαρ απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας το OV-100. Το σύνολο του ήπατος με μετάσταση λήφθηκε έξω και ex vivo απεικόνιση με το OV-100 επαναλήφθηκε. Το σήμα υποβάθρου στη μητρική του ήπατος μειώθηκε κατά την επιλογή των φίλτρων διεγέρσεως. GFP ήταν ενθουσιασμένος από ένα φίλτρο 460-490 nm και το φθορίζον αντίσωμα ήταν ενθουσιασμένος με ένα φίλτρο 595-635 nm.

Ανάλυση εικόνας

Επεξεργασία εικόνας έγινε με το Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc ., San Jose, California).

Αποτελέσματα

Η έκφραση του IGF-1 R σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου in vitro

Τόσο ΗΤ-29-GFP και HCT 116 του κόλου-GFP κυτταρικές σειρές καρκίνου εκφράζονται προ-IGF-1 R και IGF-1 R, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western. ΗΤ-29-GFP που εκφράζεται IGF-1 R εντονότερα από HCT-116-GFP (Σχήμα 1Α). Η κηλίδωση Western επαναλήφθηκε τρεις φορές, και παρατηρήσαμε τα ίδια αποτελέσματα κάθε φορά. Μετά την επώαση με το φθορίζον συζευγμένο αντίσωμα IGF-1 R, χωρίς διαπέραση, πολλαπλές φθορίζουσες εστίες έγιναν ορατές επί των κυττάρων ΗΤ-29 και HCT 116 σε μονοστρωματική καλλιέργεια, όπως παρατηρείται υπό μικροσκόπιο φθορισμού (Σχήμα 1Β). Διαφορική μικροσκοπία αντίθεσης παρεμβολή επιβεβαίωσε ότι το συζευγμένο αντίσωμα αντέδρασε με IGF-1 R επί της επιφανείας των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1Β).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western δείχνει έκφραση pro-IGF-1 R και IGF-1Rα στο 200 και 130 kDa σε κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα (ΗΤ-29 και HCT 116). (Β) Σήμανση των ζώντων HCT 116 και ΗΤ-29 κυττάρων με φθορισμοφόρο-συζευγμένα αντισώματα 550 nm δείχνει πολλαπλές φθορίζουσες εστίες στην επιφάνεια. Εκπρόσωπος εικόνες φθορισμού συγχωνεύθηκε με την αντίστοιχη DIC (αντίθεση παρέμβαση διαφορικό) εικόνες (x60 στόχος βύθιση σε νερό με το FV1000, με τη χρήση του λέιζερ 559 nm).

Η

Στόχευση υποδόριων όγκων του παχέος εντέρου σε γυμνά ποντίκια με φθορίζουσες IGF-1R αντισώματα

Όταν ΗΤ-29-GFP ή HCT 116-GFP υποδόριοι όγκοι έφθασαν περίπου 10 mm σε διάμετρο, τα ζώα κάθε δίνεται ένα ενιαίο 10, 30, και 50 μα δόση DyLight 650-συζευγμένο αντι-IGF -1R (κλώνος 24-31) σε 150 μΙ PBS μέσω της φλέβας της ουράς. Η υποδόρια απεικόνιση όγκου έγινε όταν η διάμετρος του όγκου ήταν περίπου 10 mm. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν τόσο φωτεινού πεδίου και ο φθορισμός φωτισμό χρησιμοποιώντας το OV100 μετά από 48 ώρες. Με 30 μg δόση του συζευγμένου αντι-IGF-1 R, που παρήγαγε τα καλύτερα αντιπαραβάλλεται εικόνες, και οι δύο ΗΤ-29 και HCT 116 υποδόριων όγκων είχε ισχυρότερη φθορισμό σε σύγκριση με το φόντο (Σχήμα 2Α). Ο φθορισμός ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε σε δείγματα κατεψυγμένου όγκου από HCT 116 όγκους και επιβεβαίωσε την παρουσία του IGF-1 R επί των καρκινικών κυτταρικών μεμβρανών (Σχήμα 2Β).

(α) το ποντίκι που απεικονίζεται στο πλαίσιο τόσο λευκό φως και το φθορισμό φωτισμός. Η ένταση του φθορισμού από τα HCT 116 και ΗΤ-29 υποδόριοι όγκοι είναι πολύ μεγαλύτερη από το υπόβαθρο. (Β) αιματοξυλίνη & amp? χρώση ηωσίνης (χ200, αριστερά). Ο φθορισμός ανοσοχρώση για IGF-1 R (x20 τακτική στόχος, IV-100 μικροσκόπιο λέιζερ σαρώσεως (Olympus) με ένα λέιζερ 633 nm, δεξιά) κατεψυγμένων δειγμάτων όγκου HCT 116 δείχνει φθορισμού επί της μεμβράνης των καρκινικών κυττάρων.

Η

Στόχευση ορθοτοπική όγκων του παχέος εντέρου σε γυμνά ποντίκια με φθορίζοντα αντισώματα IGF-1R

ποντίκια με όγκους ορθοτοπικά-εμφυτεύεται στο τυφλό έντερο ποντικού εγχύθηκαν με DyLight 650-συζευγμένο αντι-IGF-1 R (κλώνος 24-31) αντίσωμα με μία μόνο δόση 30 μg μέσω της φλέβας της ουράς 14 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου. Απεικόνιση διεξήχθη πριν και μετά το άνοιγμα του κοιλιά των ποντικών. Το μέγεθος του όγκου ήταν περίπου 10 mm. Η OV100 ανιχνεύεται φθορισμός όγκου με μη επεμβατικό τρόπο, με ενδοζωικής ανοιχτό απεικόνισης, καθώς και ex-vivo (Σχήμα 3). Ο φθορισμός παρατηρήθηκε στο δέρμα, της ουροδόχου κύστης, και εντερικά περιεχόμενα, αλλά σε χαμηλή ένταση.

φθορισμού από μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά όγκων του παχέος εντέρου στο τυφλό έντερο εντοπίστηκε πριν και μετά κοιλιακό λαπαροτομία. Επίσης, ανιχνεύθηκε φθορισμός από την εκτομή του όγκου. Ασθενής φθορισμός ανιχνεύθηκε επίσης από το δέρμα και, της ουροδόχου κύστης και εντερικά περιεχόμενα, αλλά σε πολύ μικρότερη ένταση από ό, τι στον όγκο. Λευκά βέλη δείχνουν όγκου του παχέος εντέρου.

Η

Στόχευση του παχέος εντέρου-καρκίνο του ήπατος μετάσταση σε άτριχα ποντίκια με φθορίζοντα αντισώματα IGF-1R

Τρεις εβδομάδες μετά την έγχυση HCT κύτταρα 116-GFP εγχέεται στο ποντίκι σπλήνα, η παρουσία ηπατικών μεταστάσεων παρατηρήθηκε με μη επεμβατική ολόκληρο το σώμα απεικόνισης. Οι ποντικοί κατόπιν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πεγκυλιωμένη DyLight 650-συζευγμένο αντι-IGF-1 R (κλώνος 24-31) με μια απλή δόση 90 μg μέσω της φλέβας της ουράς και θυσιάστηκαν 24 ώρες μετά την ένεση αντισώματος. Κάναμε απεικόνισης εντός 24 ωρών στο μοντέλο μετάστασης ήπατος επειδή η προηγούμενη εμπειρία μας έδειξε ότι το αντίσωμα συζευγμένο αποσπαστούν από τον όγκο ταχύτερα στο μοντέλο μετάστασης ήπατος σε σύγκριση με τα μοντέλα υποδόρια και ορθοτοπικό όγκο [24]. Κοιλιακό κοιλιακό λαπαροτομία των ποντικών κατέδειξε πολλαπλές μεταστατικών όγκων στο ήπαρ. GFP και 650 nm φθορισμού προέρχεται από μεταστατικούς όγκους, με φυσιολογική ηπατική δείχνει μόνο ένα πολύ ασθενές σήμα (Σχήμα 4Α). Αν και δεν ήταν δυνατόν να μετρήσει όλα τα πολύ μικροί όγκοι, ex vivo απεικόνιση έδειξε επίσης ότι το σήμα 650 nm συν-εντοπισμένη με GFP και οριοθετημένες την έκταση του όγκου με μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με έντονο φως απεικόνισης. Αιματοξυλίνη & amp? χρώση ηωσίνης δειγμάτων ιστού που εκφράζουν φθορισμού επιβεβαίωσε την παρουσία μεταστατικών όγκων στο ήπαρ ποντικού (Σχήμα 4Β).

Anti-IGF-1 R συζευγμένο με πεγκυλιωμένα 650 nm βαφή επιλεκτική σήμανση ο HCT 116-GFP μεταστατικών όγκων. Τόσο in vivo (Α) και ex vivo (Β) απεικόνισης δείχνουν ότι οι συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1 R αντισώματα 650 nm συν-εντοπισμένη με φθορισμό HCT 116-GFP και με μεγαλύτερη ακρίβεια διαχωρισμένες του όγκου σε σύγκριση με το έντονο φως απεικόνισης (λευκό βέλη). H & amp? Ε χρώση του δείγματος ιστού (x200) εκφράζει φθορισμού επιβεβαιώνει την παρουσία των μεταστατικών όγκων στο ήπαρ ποντικού.

Η

Συζήτηση

Στόχευση IGF-1R στο σάρκωμα με ραδιοεπισημασμένο αντίσωμα και τον καρκίνο του μαστού με φθορισμοφόρο-συζευγμένο αντίσωμα έχει αναφερθεί [11,25]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα που στοχεύει την άλφα υπομονάδα του IGF-1R. In vitro απεικόνιση επιβεβαίωσε ότι το συζευγμένο αντίσωμα δεσμεύεται σε IGF-1 R επί της εξωτερικής μεμβράνης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Με φθορισμό αντισώματα συζευγμένα αντι-IGF-1 R γίνει ο όγκος περισσότερο από φθορίζον φόντο, διαχωρίζοντας εύκολα όγκου από περιβάλλοντα κανονικά όργανα. Η παρούσα έκθεση υποδηλώνει ότι η απεικόνιση φθορισμού με συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1 R αντίσωμα θα μπορούσε να συνδυαστεί με ενδοσκόπηση και FGS για καλύτερη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

IGF-1 R στοχευμένη απεικόνισης μπορεί να είναι σε θέση να ανιχνεύσει υψηλού κινδύνου πολύποδες όπως προτείνεται από τα αποτελέσματα μας και από προηγούμενες αναφορές ότι η έκφραση του IGF-1R ανιχνεύθηκε στα αδενώματα του παχέος εντέρου και έγινε ισχυρότερη ως ο βαθμός της καρκινογένεσης προχωρούσε. Μη νεοπλασματικές υπερπλαστικούς πολύποδες δεν εκφράζουν IGF-1 R [26]. Την πρόβλεψη του κινδύνου καρκινογένεσης των προκαρκινικών πολυπόδων με φθορίζοντα αντισώματα IGF-1R μπορεί να επιτρέψει την εξατομικευμένη θεραπεία για πολύποδες του παχέος εντέρου, ακόμη και χωρίς τη δειγματοληψία ιστού και μπορεί να βοηθήσει στην αποφυγή περιττών επεμβατικές διαδικασίες ή επαναλαμβανόμενη θεραπεία.

IGF-1R στοχευμένη θεραπεία αναπτύσσεται και δοκιμάζεται σε κλινικές δοκιμές [27]. Τον προσδιορισμό της έκφρασης του IGF-1R σε όγκους με απεικόνιση φθορισμού πριν ή κατά τη διάρκεια της θεραπείας μπορεί να είναι σε θέση να καθοδηγήσει τη θεραπεία ή την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στη θεραπεία. απεικόνισης φθορισμού έχει πλεονεκτήματα δεδομένου ότι δεν απαιτεί επεμβατική δειγματοληψία του όγκου και μπορεί να επαναληφθεί εύκολα [28].

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως αποτελεσματική FGS του καρκίνου του παχέος εντέρου σε μοντέλα ποντικού χρησιμοποιώντας φθορίζοντα αντισώματα αντι-ΟΕΑ [6,29, 30]. απεικόνισης φθορισμού έχει αποδειχθεί για να ανιχνεύσει μικροσκοπικά ηπατικές μεταστάσεις και να τους αφαιρέσει αργότερα με χειρουργική επέμβαση σε ασθενείς [31]. Ειδικά με καρκίνο του παχέος εντέρου, του ήπατος ανίχνευση μετάστασης με απεικόνιση φθορισμού είναι σημαντική, δεδομένου ότι μπορεί να ενισχύσει την πλήρη εκτομή. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι με IGF-1 R αντίσωμα συζευγμένο με ένα φθοροφόρο ΡΕΟυλιωμένο, οι μεταστάσεις έγινε πολύ πιο φθορισμού σε σύγκριση με το φυσιολογικό ήπαρ φόντο, και έγινε με μεγαλύτερη ακρίβεια να ανιχνεύεται [24]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι ΡΕΟυλιωμένο βαφές συζευχθεί με αντισώματα όγκου-ειδικά μειωμένη μη-ειδική πρόσληψη από φυσιολογικό ήπαρ [24]. Ο στόχος της παρούσας χειρόγραφο ήταν να αποδείξει ότι μια φθορίζοντος αντισώματος σε IGF-1R θα μπορούσε να προσδιορίσει την έκταση της ηπατικής μετάστασης σε ορθοτοπική μοντέλα του καρκίνου του παχέος εντέρου καλύτερα από ό, τι πρότυπο φωτεινό οπτικοποίηση φως, και πετύχαμε αυτό το στόχο. Ο φθορισμός απεικόνιση χρησιμοποιώντας συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1 R αντίσωμα ηπατικής μετάστασης θα πρέπει να είναι αποτελεσματική για FGS.

Συμπερασματικά, έχουμε δείξει ότι συζευγμένο με φθορισμοφόρο IGF-1 R αντίσωμα είναι πολύ αποτελεσματική στην επισήμανση καρκίνο του παχέος εντέρου σε μοντέλα ποντικού. Τυπική ανάλυση βιο-διανομή και περαιτέρω μελέτες με μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου PDOX χρειάζονται για να επιβεβαιώσει ότι IGF-1 R στοχευμένη απεικόνισης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην κλινική πράξη. προηγούμενες μελέτες μας, χρησιμοποιώντας φθοροφόρου συζευγμένα αντισώματα έναντι CEA, CA 19-9, Kit, και MUC-1 έχουν αποδείξει την ικανότητά τους λαμπρά όγκων του γαστρεντερικού επισήμανση in vivo [6,24,30,32-40]. Απεικονίσιμη βιοδείκτες θα έχει σημαντικές κλινικές δυνατότητες για διάγνωση και θεραπείες, όπως FGS.