Abstract

Το μεγαλύτερο μέρος του ανθρώπινου γονιδιώματος μεταγράφεται και παράγει μη-κωδικοποίησης RNAs (ncRNAs) που αποτυγχάνουν να κωδικοποιούν πληροφορίες πρωτεΐνη. Τα μακρά μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) αναδύεται ως μια νέα κατηγορία ncRNAs, αλλά η γνώση μας γι ‘αυτά τα ncRNAs είναι περιορισμένη. Προηγουμένως, το εργαστήριο μας έχει προσδιορίσει ότι ένα lncRNA, ουροθηλιακά καρκίνου που σχετίζονται 1 (UCA1), έπαιξε σημαντικό ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Παρά το πρόσφατο ενδιαφέρον σε UCA1 ως διαγνωστικός δείκτης για καρκίνο της ουροδόχου κύστης, λίγα είναι γνωστά για ρύθμιση της μεταγραφής του. Για να αποσαφηνιστεί η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης UCA1, έχουμε χαρακτηριζόμενη το ανθρώπινο γονίδιο υποκινητής UCA1. Ένα 2.0-kb θραύσμα του 5 ‘πλευρική περιοχή του κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα λουσιφεράσης ανταποκριτή. Διαγραφή και την ανάλυση μετάλλαξης πρότεινε ότι μια θέση πρόσδεσης Ets-2 ήταν κρίσιμη για τη δράση υποκινητή του γονιδίου UCA1. Περαιτέρω ανάλυση αυτού του τόπου με τη μετατόπιση γέλης, χρωματίνη άνοση καθίζηση (μάρκας), και τα πειράματα συν-επιμόλυνσης έδειξαν ότι ο παράγοντας μεταγραφής Ets-2 δεσμεύονται άμεσα με την περιοχή UCA1 υποκινητή και διεγείρεται δραστικότητα προαγωγού UCA1 σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Λαμβάνοντας υπόψη την λειτουργία αντι-απόπτωση των Ets-2, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι Ets-2 ρυθμίζει διαδικασία απόπτωσης με ρύθμιση της έκφρασης του UCA1, εξάλλου UCA1 μπορεί να εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της Akt μονοπατιού σηματοδότησης με Ets-2 σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης .

Παράθεση: Wu W, Zhang S, Li X, Xue Μ, Cao S, Chen W (2013) Ets-2 Ρυθμίζει την απόπτωση των κυττάρων μέσω της AKT οδό, μέσω του κανονισμού του Καρκίνου ουροθηλιακά Associated 1, ένα Long μη-κωδικοποίησης του RNA, σε κύτταρα καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (9): e73920. doi: 10.1371 /journal.pone.0073920

Επιμέλεια: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 24 Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81072104). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ευκαρυωτικά γονιδιώματα δεν είναι οι απλές, καλά ώστε υποστρώματα της μεταγραφής γονιδίων που ήταν κάποτε πίστευαν. Γνωρίζουμε τώρα να μεταγράψει ένα ευρύ φάσμα των μορίων RNA, που κυμαίνονται από μακρά mRNAs που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη της μικρής μη-κωδικοποίησης μεταγραφές, οι οποίες συχνά επικαλύπτονται ή παρεμβάλλονται σε κάθε κλώνο [1]. Οι Long μη κωδικοποιητικού RNAs (lncRNAs) αναδύεται ως μια νέα κατηγορία μη-κωδικοποίησης RNAs που περιέχουν περισσότερα από 200 νουκλεοτίδια, αλλά η γνώση μας από αυτές τις lncRNAs είναι περιορισμένη. LncRNAs είναι οι μεταγραφές που μοιάζουν mRNAs που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη από το ότι είναι καλυμμένο, συγκολλημένα και οι μεταγραφές πολυαδενυλιωμένο RNA πολυμεράση II. Διαφέρουν από mRNAs μόνο σε έλλειψη ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη (ORF) [2].

Σε αντίθεση με την ποικιλότητα των ειδών RNA, μόνο ένας μικρός αριθμός lncRNAs εντοπίστηκαν να έχουν πειραματικά προερχόμενο λειτουργίες. Επιπλέον, η απορύθμιση της lncRNA έχει δειχθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου [3], [4], όπως MALAT-1 σε καρκίνο του πνεύμονα [5], HULC σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [6], και Hotair στον καρκίνο του μαστού [7] , υποδεικνύοντας ότι lncRNAs μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση ή την πρόοδον όγκου.

Προηγουμένως, ιδρύσαμε BLZ-211 και BLS-211 κύτταρα τα οποία είναι ένα ζεύγος καρκινώματος της ουροδόχου κύστης από μεταβατικό επιθήλιο (TCC) κυτταρικές σειρές κλωνοποιούνται χωριστά από δείγμα του ίδιου ασθενούς, αλλά με διαφορετικές βιολογικά χαρακτηριστικά [8], [9], [10]. Στη συνέχεια, αναφέρθηκε μια νέα ετικέτα εκφράζεται αλληλουχίας (EST) (Genbank αριθμός πρόσβασης DR159656) που απομονώνεται από αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιώντας αφαιρετική υβριδοποίηση καταστολής (SSH) τεχνική [11]. Με βάση αυτήν την EST, κλωνοποιήσαμε και προσδιόρισε ncRNA ονομάζεται ουροθηλιακά καρκίνο που σχετίζεται 1 (UCA1) (Genbank αριθμός πρόσβασης EU334869) [12]. UCA1 ανήκει στον lncRNAs λόγω της έλλειψης μιας ισχυρής συναινετική αλληλουχία Kozak για έναρξη μετάφρασης σε οποιοδήποτε από τα κωδικόνια ATG σε πολλαπλές μικρές ORFs [12]. Πολλές μελέτες πρότειναν ότι UCA1 μπορεί να δρα ως μοριακός δείκτης καρκίνου της ουροδόχου κύστης λόγω της εξαιρετικής ειδικότητας και ευαισθησίας του [13], [14]. Μια προηγούμενη μελέτη στο εργαστήριο μας επίσης να εννοηθεί ότι η αυξημένη έκφραση UCA1 μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων και την προώθηση της εισβολής των καρκινικών κυττάρων κύστης [12], υποδηλώνοντας ότι θα ήταν μια νέα θεραπευτική γονίδιο στόχος του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Παρά το ενδιαφέρον αυτό, λίγα είναι γνωστά για το

cis-ρυθμιστικών στοιχείων

εμπλέκονται άμεσα στη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου UCA1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, η μελέτη από το εργαστήριο μας έδειξαν ότι υπάρχουν τρεις παραλλαγές ματίσματος του γονιδίου UCA1 υπάρχουσα σε καρκινικά κύτταρα κύστης [12], [15]. Η αυξημένη έκφραση του UCA1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και η ύπαρξη ματίσματος παραλλαγών που δείχνουν έντονα ότι η μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου UCA1 ελέγχεται στενά. Η UCA1

cis

κανονισμός μπορεί να διαμορφώσει πολύπλοκα δίκτυα έκφραση γονιδίου που τελικά οδηγούν βιολογικές διαδικασίες, όπως την κυτταρική απόπτωση.

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε τον υποκινητή του γονιδίου της ανθρώπινης UCA1 για πρώτη φορά και διερευνήθηκε η ρύθμιση του προωθητή UCA1 από τον παράγοντα μεταγραφής Ets-2. Ets-2 μπορεί να επηρεάσει την απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης με τη ρύθμιση της έκφρασης του UCA1. Βρήκαμε επίσης lncRNA UCA1 μπορεί να εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt. Η έρευνα αυτή θα παρέχει διορατικότητα στο ρυθμιστικό μηχανισμό της έκφρασης UCA1 σε περαιτέρω μελέτες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανάδοχος Πρόβλεψη

Προηγουμένως, το πλήρες μήκος του cDNA UCA1 και της θέση έναρξης μεταγραφής (TSS) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τεχνολογία SMART RACE [12]. Σε αυτή τη μελέτη, MegaBLAST πρόγραμμα (NCBI) χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση του γονιδίου UCA1 και πλευρικές ακολουθίες της περιοχής και το DNA 5 ‘είχαν κατεβάσει από GenBank (NC_000019.9). Το TSS του γονιδίου UCA1 χαρακτηρίστηκε ως +1. Για την πρόβλεψη των παραγόντων υποκινητή και υποτιθέμενη μεταγραφή, τα ακόλουθα μερικά σε απευθείας σύνδεση λογισμικό χρησιμοποιήθηκαν. Ο υποκινητής και TSS προβλέψει εργαλεία περιλαμβάνουν το πρόγραμμα FPROM από το λογισμικό Softberry (https://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom group=programs subgroup=promoter) και το πρόγραμμα PromoterInspector από genomatix (http: //www.genomatix.de/online_help/help_gems/PromoterInspector_help.html) [16]. Το πρόγραμμα MatInspector από genomatix (https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) [17], [18] χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη παράγοντα μεταγραφής.

Το πλασμίδιο κατασκευάσματα

Για να δημιουργήσετε pGL3-UCA1-2000 πλασμίδιο, ένα θραύσμα DNA που περιέχει το

cis

περιοχή του γονιδίου UCA1 -1800 – 200 bp ενισχύθηκε με PCR (PrimeSTAR® ΕΣ DNA πολυμεράσης, TaKaRa, Νταλιάν ). Το PCR προϊόν στη συνέχεια αποκόπηκε από πηκτή αγαρόζης και απομονώθηκε με τη χρήση της γέλης αγαρόζης DNA θραύσμα Recovery Kit (Takara, Dalian). Το καθαρισμένο τεμάχιο DNA στη συνέχεια εισάγεται εντός της λουσιφεράσης που εκφράζουν φορέα pGL3-Basic (Promega, USA) μέσω

Κρη

Ι και

Nhe

sites Ι. Άλλες περικομμένο θραύσματα έγιναν με τον προαναφερόμενο τρόπο. Οι ομάδες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για αυτή τη σειρά των προϊόντων δόθηκαν στον Πίνακα 1. Τα ενισχυμένα θραύσματα DNA εισήχθηκαν σε pGL3-βασικό φορέα μέσω της ίδιας ενδονουκλεάσες περιορισμού sites. Όλα τα κατασκευάσματα DNA αλληλουχήθηκαν.

Η

Τοποκατευθυνόμενη Μεταλλαξογένεση

Αντικατάσταση μετάλλαξη του ETS-2-θέσεις δέσμευσης δημιουργήθηκε με την κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση βασιζόμενη σε PCR (Byotime, Κίνα) . Ο φορέας pGL3-UCA1-1200 χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα DNA, και η θέση σύνδεσης Ets-2 πυρήνα (GGGAAG) αντικαταστάθηκε με ένα

Hind θέση περιορισμού

III (AAGCTT) (Πίνακας 1). Το μεταλλαγμένο φορέας ονομάστηκε ως pGL3-UCA1-1200-mut. Οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με πέψη ενζύμου περιορισμού και αλληλούχιση.

Cell Culture, παροδική επιμόλυνση

κύστη μεταβατικό καρκίνωμα ανθρώπινων κυττάρων (TCC) κυτταρικές σειρές BLZ-211 και BLS-211 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). κυτταρικές σειρές BLZ-211 και BLS-211 καθιερώθηκαν με εργαστήριο μας κατά το 1994. Ο ιστός καρκίνου της ουροδόχου κύστης ήταν από χειρουργικά δείγματα ενός 55-ετών άνδρας με τη διάγνωση της πολυεστιακής θηλώδους καρκινώματος μεταβατικού κυττάρου (TCC) βαθμού II. Όλη η διαδικασία χορηγήθηκε unber την έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας της First Affiliated Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Xi’an Jiaotong Πανεπιστήμιο [8]. Τα κύτταρα με περισσότερο από 80% συρροή χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση.

BLZ-211 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο FuGENE®HD Transfection (Roche, USA) σε πλάκα 24 φρεατίων. Κάθε φρεάτιο περιείχε 2 × 10

5 κύτταρα, 0,5 μg του pGL3-UCA1 φορέα σειρά, 0.02 μ§ του φορέα εσωτερικού ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ (Promega, USA), 1 μΐ FuGENE®HD, και 500 μΙ RPMI 1640 χωρίς ορό ή αντιβιοτικά. pGL3-βασικό (Promega, USA) φορέας επιμολύνθηκε ως έλεγχος. Για siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο διαμόλυνσης X-tremeGENE siRNA (Roche, USA) σε πλάκα 6 φρεατίων. Τόσο Ets-2 siRNA και κωδικοποιημένα siRNA ελέγχου είναι εμπορικά προϊόντα (Santa Cruz, USA).

λουσιφεράσης

Πριν από τη δοκιμασία κύτταρα ξεπλύθηκαν με ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) σε 48 ώρες μετά την διαμόλυνση και λύθηκαν σε μια παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega, USA). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με ένα φωτόμετρο (Promega, USA) χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase κιτ δοκιμασίας ρεπόρτερ (Promega, USA). Αποτέλεσμα κανονικοποιήθηκε στη δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla. Αναφέρθηκαν δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Κινητικότητα ηλεκτροφορητικής Shift Δοκιμασία (EMSA)

Πυρηνική πρωτεΐνες που προέρχονται από τα κύτταρα BLZ-211 χρησιμοποιώντας κιτ εκχυλίσματος πυρηνικής πρωτεΐνης (Byotime, Κίνα ). Στη συνέχεια δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας διεξήχθη σύμφωνα με EMSA Kit (Pierce, USA). Στη συνέχεια, οι ανιχνευτές παρασκευάστηκαν επί τη βάσει της θέσης σύνδεσης Ets-2 στο γονίδιο υποκινητή UCA1 και αντίστοιχη συμπληρωματική του αλληλουχία (5′-TGTCCTCTGGGAAGAAATGACC-3 ‘) που ονομάζεται UCA1-WT-Ets συνοδεύεται με ένα μεταλλαγμένο έκδοση (5′-TGTCCTCTGTATAGAAATGACC-3′ ), καθώς, το όνομα UCA1-mut-ETS. Ένα 5’-βιοτίνη τροποποίηση συμπεριλήφθηκε στην ανιχνευτής UCA1-κβ-ETS. Για τις δοκιμασίες ανταγωνισμού, 200-πλάσια περίσσεια μη επισημασμένου ανιχνευτών και μη επισημασμένο μεταλλακτικό ανιχνευτές επωάστηκαν με το μίγμα της αντίδρασης πριν την προσθήκη του επισημασμένου ανιχνευτή.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

1 × 10

7 κύτταρα με σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, συλλέχθηκαν με απόξεση και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Roche, USA). Μετά από επώαση για 10 λεπτά σε πάγο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κατεργασία υπερήχων για να δημιουργηθεί περίπου 200-1000 bp θραυσμάτων DNA, και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα χωρίσθηκαν και επωάστηκαν είτε με αντι-Ets-2 αντίσωμα (Santa Cruz, USA), ή IgG (Boster, Κίνα) ως αρνητικός έλεγχος σε 4 ° C όλη τη νύκτα με περιστροφή, αντίστοιχα. Τα ανοσοσύμπλοκα καταβυθίστηκαν με DNA σπέρματος σολομού /πρωτεΐνης G-αγαρόζης (Millipore, USA) για 2 ώρες στους 4 ° C, στη συνέχεια ανακτήθηκαν, πλύθηκαν, εκλούσθηκαν με ρυθμιστικό ChIP έκλουσης και αντίστροφη σταυροειδείς δεσμούς με θέρμανση στους 65 ° C για 4 ώρες. DNA καθαρίστηκε από ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα ή από δείγματα εισόδου και αναλύθηκαν με PCR, χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που πλευρίζουν Ets-2 θέσης πρόσδεσης στο γονίδιο υποκινητή UCA1 (Πίνακας 1). δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν εις διπλούν.

Western Blot

Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν και στη συνέχεια λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Scientific, USA). Μετά ανάλυση SDS-PAGE και μεταφορά μεμβράνης, οι πρωτεΐνες-στόχοι ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα έναντι ανθρώπινου Ets-2 (Santa Cruz, USA), Akt, pAkt (Cell Signaling, USA), Βαχ (Epitomics, USA) ή GAPDH (Abmart, Κίνα ) που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα ανοσοσφαιρίνης συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Santa Cruz, USA). Τέλος, οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Pierce, USA) και οι ειδικές ζώνες καταγράφηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης, τα κύτταρα βάφονται με Annexin V και ΡΙ χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC /PI απόπτωση (Keygene Biotech, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε από μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Ιαπωνία) και κυτταρομετρία ροής κυανό ADP 9 χρώματα από την Beckman Coulter (Beckman Coulter Brea, CA). Η κυτταρομετρία ροής πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως το μέσο ± τυπική απόκλιση (SD) από τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 13.0 λογισμικού. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την Student

t-τεστ

.

P

& lt?. 0.05 αξία θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Κλωνοποίηση και Bioinformatial Ανάλυση της περιοχής του υποκινητή η UCA1

Σε προηγούμενη μελέτη, η θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) της UCA1 ταυτοποιήθηκε με 5′-RACE [12]. Το πρόγραμμα MegaBLAST της NCBI χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της TSS του UCA1 γονίδιο, το οποίο βρισκόταν σε 15.939.757 θέση του CHR19 (GRCh37 /hg19). Σήμανση αυτό το site ως 1, ένα σύνολο 3.0 kb DNA αλληλουχίες της περιοχής που πλευρίζουν κανονισμός UCA1 5 ‘(-2000 BP-+ 1000 bp) ελήφθη από την GenBank, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για Βιοπληροφορική ανάλυση. Το αποτέλεσμα του προγράμματος FPROM πρότεινε ότι η TSS βρίσκεται στο 135 bp, και ένα ΤΑΤΑ-κουτί στο 105 bp. Η ανάλυση του προγράμματος PromoterInspector έδειξαν ότι η περιοχή του υποκινητή είναι μεταξύ -515 bp και 100 bp περιοχή. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα αποτελέσματα 5′-RACE και τα αποτελέσματα πρόβλεψης, επιλέξαμε τις αλληλουχίες από -1800 bp έως 200 bp για την παρακολούθηση της έρευνας. Για την αξιολόγηση της δραστηριότητας UCA1 υποκινητή, κατασκευάσματα ανταποκριτή που περιέχει μια σειρά από τα 5’-πλευρικές αλληλουχίες (pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900, pGL3-UCA1-600, pGL3-UCA1-350) μετρήθηκαν με δοκιμασία λουσιφεράσης σε BLZ-211 κύτταρα. Τα κατασκευάσματα pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900 και pGL3-UCA1-600 εμφανίζεται διαφορετική δραστηριότητα υποκινητή. Το pGL3-UAC1-1200 έδωσε την ισχυρότερη δραστικότητα προαγωγέα σε αυτά τα κατασκευάσματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν το θραύσμα DNA μεταξύ -400 bp και -150 bp διαγράφηκε, η δραστικότητα προαγωγέα ήταν σχεδόν καταργήθηκε (Εικ. 1Α), γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη μιας κρίσιμης θετικό ρυθμιστικό στοιχείο σε αυτή την περιοχή. Αυτά τα πειράματα διαγραφή υποδηλώνουν ότι η δραστηριότητα UCA1 υποκινητή ανιχνευθεί σε BLZ-211 κύτταρα οφείλεται κυρίως στη θετική ρυθμιστικό στοιχείο μεταξύ -400 bp και -150 bp της περιοχής προαγωγού. Υπήρχαν πολλοί μεταγραφικού παράγοντα (TF) -σύνδεση θέσεις στην περιοχή αυτή προβλέπεται από την MatInspector πρόγραμμα βιοπληροφορική, συμπεριλαμβανομένων των υποθετικών Ets-2, C /EBP, SP-1, c-Myb,

et, al

. (Εικ. 1Β). Από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής, εμείς επιλέξαμε Ets-2, όπως το δυναμικό TF λόγω υψηλότερη βαθμολογία πρόβλεψης της.

(Α) δοκιμασία λουσιφεράσης. Πέντε κολοβωμένη θραυσμάτων DNA της περιοχής προαγωγού UCA1 σε pGL3 φορείς, ένας αρνητικός φορέα αναφοράς, pGL3-βασικό, και θετικό φορέα ελέγχου, pGL3-ελέγχου, διαμολύνθηκαν σε BLZ-211 κύτταρα. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετράται σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05. (Β) μεταγραφικοί παράγοντες πρόβλεψης με τη χρήση λογισμικού MatInspector. μεταγραφικών παραγόντων με υψηλή βαθμολογία πρόβλεψη ήταν παρόντες.

Η

Ets-2-δεσμευτική τοποθεσίες Συμβολή στην Διοργανώτρια Ενεργοποίηση

Για να διερευνηθεί κατά πόσο Ets-2 είναι κρίσιμη για τη δράση προαγωγού UCA1, αντικαταστήσαμε το ΣΕΔΕ-2 περιοχές για να τις

Hind

III θέσεις περιορισμού ενδονουκλεάση σε pGL3-UCA1-1200-mut δεσμευτική. Σε σύγκριση με την δραστικότητα λουσιφεράσης του άγριου τύπου pGL3-UCA1-1200, το pGL3-UCA1-1200-mut έδωσε μια πολύ χαμηλότερη δραστικότητα προαγωγέα σε BLZ-211 κύτταρα (Εικ. 2Α), καταδεικνύοντας ότι αυτά τα Ets-2 θέσεις δέσμευσης πράγματι παίζεται ένα ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση της δραστικότητας UCA1 υποκινητή. Για να επιβεβαιώσετε εάν μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 μπορεί να συνδεθεί με την περιοχή αυτή, πυρηνικό εκχύλισμα από BLZ-211 κύτταρα παρασκευάστηκε και EMSA έγινε. Τα 22 bp ολιγονουκλεοτίδια από -378 -357 nt να περιέχουν τα Ets-2 θέσεις δέσμευσης χρησιμοποιήθηκε σαν το άγριου τύπου ιχνηλάτη και την ίδια περιοχή με μεταλλαγμένες θέσεις πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκε ως το μεταλλαγμένο ιχνηλάτη (Εικ. 2Β). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, ένας εξέχων σύμπλοκο DNA-πρωτεΐνης σχηματίστηκε με τον ανιχνευτή άγριου τύπου. Η δέσμευση ανταγωνίστηκε μακριά από ένα πλεόνασμα 200-πλάσια μη επισημασμένου άγριου τύπου ιχνηλάτη, αλλά όχι από ένα 200-πλάσια περίσσεια μη επισημασμένου ιχνηλάτη μεταλλάγματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η περιοχή αυτή ήταν υπεύθυνη για τον σχηματισμό συμπλόκου ϋΝΑ-πρωτεΐνης. Για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν Ets-2 μπορεί να προσδεθεί απ ‘ευθείας με το εγγύς UCA1 υποκινητή

in vivo

, Chip διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι Ets-2 για την ανοσοκαταβύθιση φορμαλδεΰδη χρωματίνη από BLZ-211 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, εξέχοντα PCR προϊόντα που περιέχουν τις Ets-2 θέσεις πρόσδεσης ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας DNA έλκεται προς τα κάτω από το αντίσωμα έναντι Ets-2, ενώ δεν παρατηρήθηκε ενίσχυση στο DNA ανοσοκατακρημνίστηκε με IgG, αποδεικνύοντας ότι Ets-2 μπορεί να προσδεθεί απ ‘ευθείας με τον προαγωγό UCA1 σε BLZ-211 κύτταρα.

(Α) δοκιμασία λουσιφεράσης. Οι θέσεις σύνδεσης Ets-2 (GGGAAG) αντικαταστάθηκαν με

Hind III

sites (AAGCTT) με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (άνω πάνελ). Σχετική δραστηριότητες της λουσιφεράσης του άγριου τύπου (wt) και μεταλλαγμένων φορείς (μεταλλαγμένο) μετρήθηκαν με δοκιμασία λουσιφεράσης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05. (Β)

In vitro

ανίχνευση του ETS-2 δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής στην περιοχή υποκινητή του γονιδίου UCA1 με δοκιμασία EMSA. Μία κυρίαρχη ζώνη παρατηρήθηκε όταν βιοτίνη σημασμένο ανιχνευτή Ets-2 επωάστηκε με το πυρηνικό εκχύλισμα (διαδρομή 2). Ets-2 πρόσδεση δεν θα μπορούσε να ανασταλεί από το μεταλλαγμένο ανιχνευτή (λωρίδα 3), ενώ είχε ανταγωνίστηκε με τη μη επισημασμένη κρύο ανιχνευτή (λωρίδα 4). (C)

In vivo

ανίχνευση του ETS-2 δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής στην περιοχή προαγωγού από το γονίδιο υποκινητή UCA1 με δοκιμασία chip. χρωματίνη Input (Input), το οποίο αντιπροσώπευε τμήματα σε υπερήχους χρωματίνης πριν ανοσοκαταβύθιση, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. αντίσωμα IgG χρησιμοποιήθηκε ως negtive έλεγχο του προσδιορισμού chip.

Η

Ets-2 είναι απαραίτητη για την ρύθμιση μεταγραφής του UCA1

Για να προσδιορίσετε αν μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση UCA1 , ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε μετά να χτυπήσει κάτω Ets-2 από ειδικές siRNA σε BLZ-211 κύτταρα. Τα αποτελέσματα της PCR έδειξαν ότι η έκφραση του mRNA UCA1 μειώθηκε κατά περίπου 50% μετά την εξασθένηση της έκφρασης Ets-2 (Σχ. 3Α). Επιπλέον, όπως φαίνεται τα αποτελέσματα της ανάλυσης λουσιφεράσης, όταν συν-επιμολύνονται με το ειδικό siRNA Ets-2 ή ομελέτα ελέγχου siRNA με pGL3-UCA1-1200 σε BLZ-211 κύτταρα, knockdown του ETS-2 προκάλεσε την μειωμένη δραστηριότητα του υποκινητή UCA1 σε σύγκριση με το ανακατωμένο ομάδα siRNA ελέγχου (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ets-2 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση της UCA1 επηρεάζοντας την δραστηριότητα του υποκινητή UCA1.

(Α) Εκφραση του ETS-2 και UCA1 μετρήθηκε με RT-PCR εξής Ets-2 ειδικό siRNA ή ομελέτα θεραπεία siRNA σε BLZ-211 κύτταρα. 18 S rRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) δοκιμασία λουσιφεράσης. Ets-2 ειδικά siRNA ή ομελέτα ελέγχου siRNA ήταν συν-επιμολυσμένα με pGL3-UCA1-1200 σε BLZ-211 κύτταρα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05. NSC: μη ειδικό έλεγχο siRNA

Η

UCA1 μπορεί να εμπλέκονται στην απόπτωση που προκαλείται από Ets-2 νοκ ντάουν στον BLZ-211 κύτταρα

Ο ρόλος του ETS-2 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. είναι ασαφές, έτσι επαληθεύσαμε τη λειτουργική συνέπεια Ets-2 knockdown σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Μια επίπεδο αύξηση της απόπτωσης παρατηρήθηκε μετά από αγωγή 48 ωρών με Ets-2 siRNAs σε BLZ-211 κύτταρα μέσω μικροσκοπίου φθορισμού. Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών κυτταρικής απόπτωσης έδειξαν αυξημένο επίπεδο απόπτωσης σε BLZ-211 κύτταρα όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ets-2 ειδικό siRNA σε σχέση με το κωδικοποιημένο θεραπεία siRNA μάρτυρα (Σχ. 4Α). Για να επαληθεύσετε αν Ets-2 που προκαλείται από γονιδιακή έκφραση UCA1 συμμετείχε στην απόπτωση μελετήσαμε άλλη κύστης κυτταρική σειρά TCC, που ονομάζεται BLS-211. BLS-211 είναι η έλλειψη ενδογενούς έκφρασης UCA1 και προέρχεται από τον ίδιο ασθενή όπως BLZ-211 κυτταρική γραμμή. Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από να χτυπήσει κάτω από το γονίδιο Ets-2, δεν παρατηρήθηκε επακόλουθη απόπτωση σε BLS-211 κύτταρα (Εικ. S1). Επιπρόσθετα, μετρήσαμε τα αποπτωτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής στις δύο κυτταρικές σειρές χωριστά. Συνεπής με τα αποτελέσματα μικροσκόπιο φθορισμού, η κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση των κυττάρων προ-απόπτωσης (άνω δεξιά τεταρτημόριο) μετά από Ets-2 νοκ ντάουν στον BLZ-211 κύτταρα (12.49 ± 1.21%

vs.

6,40 ± 1,47%), ενώ καμία αύξηση των προ-απόπτωσης παρατηρήθηκε μετά από Ets-2 knockdown σε BLS-211 κύτταρα (4,12 ± 0,28%

vs.

3,20 ± 2,50%) (Σχ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι UCA1 μπορεί να εμπλέκονται στην απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από την καταστολή του Ets-2.

(Α) Η επαγωγή της απόπτωσης μετά από θεραπεία 48 ωρών του ETS-2 siRNA ή ομελέτα τα siRNA ελέγχου σε κύτταρα BLZ-211 εξετάστηκε με χρήση μικροσκοπίου φθορισμού. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αννεξίνη V (πράσινο) και ΡΙ (κόκκινο). μπαρ κλίμακα 25 μm. Οι εικόνες ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Η απόπτωση ποσοτικοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FCM). Τα αποτελέσματα FCM ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. διεργασίες κυτταρική απόπτωση (άνω δεξιά τεταρτημόριο) αυξήθηκαν μετά Ets-2 νοκ ντάουν στον BLZ-211 κύτταρα (12.49 ± 1.21% έναντι 6.40 ± 1.47%, *

P

& lt? 0,05), ενώ καμία σημαντική αλλαγή στο BLS-211 κύτταρα (4,12 ± 0,28% έναντι 3,20 ± 2,50%,

P

& gt? 0,05). NSC:. Μη ειδικό έλεγχο siRNA

Η

UCA1 μπορούν να συμμετέχουν στην αδρανοποίηση της AKT οδό στο κινητό απόπτωση που προκαλείται από Ets-2 προς τα κάτω ρύθμιση

Για να προσδιοριστεί αν η καταστολή του ETS -2 επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης μέσω Akt μονοπάτι, ένα μονοπάτι privotal ρυθμιστής της απόπτωσης, ερευνήσαμε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του συνολικού Akt και φωσφορυλιωμένο Akt (pAkt). Είναι ενδιαφέρον ότι οι western αποτύπωση αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά την φίμωση του Ets-2, pAkt έκφραση στη συνέχεια μειώθηκε, ενώ η έκφραση του προαποπτωτικών πρωτείνης Bax αυξήθηκε (Εικ. 5, αριστερό πάνελ). Τα αποτελέσματά μας άφησε να εννοηθεί ότι Ets-2 νοκ ντάουν τη δυνατότητα να επάγει απόπτωση σε BLZ-211 κύτταρα μέσω απενεργοποίηση της Akt μονοπατιού και οδήγησαν σε αλλαγές στις κατάντη μόρια-στόχους. Έτσι υποθέσαμε ότι η έκφραση του γονιδίου UCA1 μπορεί να σχετίζεται με την ενεργοποίηση του Akt μονοπάτι το οποίο εμπλέκεται στη μεσολάβηση διαδικασία αντι-απόπτωσης Ets-2 σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Για την αντιμετώπιση αυτής της έννοιας, μελετήσαμε την επόμενη το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης Akt, pAkt και Bax στα BLS-211 κύτταρα. Όπως φαίνεται, δεν ήταν εμφανής διαφορά μεταξύ της ομάδας αντιμετωπίζονται Ets-2 siRNA και κωδικοποιημένα ομάδα στην οποία χορηγήθηκε siRNA (Σχ. 5, δεξί πάνελ). Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι τα κάτω ρύθμιση του ETS-2, ένα παράγοντα μεταγραφής του γονιδίου UCA1, μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε BLZ-211 κύτταρα με μείωση της έκφρασης UCA1 και αυτό μπορεί να συνεισφέρει στην αδρανοποίηση του Akt μονοπατιού (Εικ. 6).

Ets-2 και πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. NSC:.. Μη ειδικό έλεγχο siRNA

Η

Η διακεκομμένη γραμμή από UCA1 να Akt δείχνει ότι η σχέση μεταξύ UCA1 και Akt μπορεί να είναι έμμεση

Η

Συζήτηση

καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες στην Κίνα, καταλαμβάνοντας ως το πρώτο συχνή νεόπλασμα του ουροποιητικού συστήματος. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι UCA1 μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων και εισβολή στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [12]. UCA1 είναι ένα lncRNA, δεδομένου ότι έχει πολλαπλά μικρά ORF και αν δεν ισχυρή συναινετικές αλληλουχίες Kozak βρέθηκαν σε οποιοδήποτε από τα κωδικόνια ATG [12], [13]. Αρκετές lncRNAs έχουν εντοπιστεί που συνδέονται με ανθρώπινες ασθένειες και έχουν ειδικές λειτουργίες που σχετίζονται με ασθένειες του ανθρώπου [19]. Προηγουμένως, δείξαμε το μοτίβο έκφρασης χωρική και χρονική του UCA1. Ωστόσο, η μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης UCA1 δεν έχει μελετηθεί. Εδώ, για πρώτη φορά έχουμε χαρακτηρίσει την περιοχή προαγωγέα του ανθρώπινου γονιδίου UCA1 και αναφέρθηκαν ρύθμιση της από Ets-2 παράγοντα μεταγραφής.

Σε αντίθεση με τα συμβατικά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι αλληλουχίες, οι θέσεις έναρξης της μεταγραφής , οι δομές εξόνιο, και τα μήκη αυτών των μακράς μη-κωδικοποίησης των γονιδίων είναι όλα εξαιρετικά μεταβλητή [20]. Με βάση την γονιδιωματική γειτνίασής τους με τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι lncRNAs ταξινομούνται ως επικαλύψεις, cis-αντίθετης φοράς, αμφίδρομη ή ιντρονικές ncRNAs [21], [22] .Οι μηχανισμοί της έκφρασης lncRNA είναι άγνωστη, αν και υπάρχουν πολλά στοιχεία που να δείχνουν ότι lncRNAs ρυθμίζονται από παρόμοιους μηχανισμούς ως γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη. Εν συντομία, στη μελέτη των Wang et al, βρήκαν μία περιοχή πυρήνα υποκινητή (από τα νουκλεοτίδια -132 έως -48) του γονιδίου lncRNA HULC και χαρακτηρίζεται από μια θέση σύνδεσης μεταξύ των νουκλεοτιδίων -67 και -53 στην περιοχή του υποκινητή πυρήνα CREB [ ,,,0],23]. Σε μια άλλη μελέτη από τον Zhao et al, ανέλυσαν ένα 5 kb γονιδιωματικό θραύσμα DNA ανάντη του πρώτου εξονίου του γονιδίου lncRNA MEG3, που χαρακτηρίζεται από μία θέση CRE εμπλέκονται στη γονιδιακή MEG3 μεταγραφή και βρέθηκε επίσης αρκετές πρωτεΐνες από την οικογένεια CREB δεσμεύονται άμεσα με την CRE περιοχή [24]. Επιπλέον, πολλές μελέτες δείχνουν ότι οι μηχανισμοί με τους οποίους η έκφραση ncRNA μεταβάλλεται σε καρκίνους είναι παρόμοιες με εκείνες για επιγενετικών μηχανισμών κωδικοποίησης γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών [25], [26], [27], [28].

στη μελέτη μας, αναλύσαμε την περιοχή εγγύς υποκινητή του UCA1 η οποία βρίσκεται σε -2000 νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου UCA1. Δείξαμε με δοκιμασία λουσιφεράσης δραστηριότητα και ανάλυση διαγραφής ότι η περιοχή μεταξύ των νουκλεοτιδίων -400 έως -150 μπορούν να συμβάλλουν στην βασική δραστηριότητα προαγωγέα. Και σε αυτή την περιοχή έχουμε προβλέψει πολλούς γνωστούς μεταγραφικού παράγοντα μέσω των μεθόδων πρόβλεψης της βιοπληροφορικής. Δείξαμε επίσης από τον EMSA και την ανάλυση τσιπ που οι θέσεις σύνδεσης Ets-2 μεταξύ των νουκλεοτιδίων -385 και -380 έπαιξε σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δραστηριότητας UCA1 υποκινητή. Στη μελέτη μας χρησιμοποιήσαμε BLS-211 κύτταρα, τα οποία απέτυχαν να εκφράσουν το γονίδιο UCA1 παρόλο που εξέφραζαν το γονίδιο Ets-2. Όταν αντιμετωπίζονται τα κύτταρα με Ets-2 siRNA, η δραστηριότητα UCA1 υποκινητή δεν καταργήθηκε πλήρως. Και οι δύο παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η έκφραση UCA1 μπορεί να ελέγχεται με άλλες μεταγραφικές παράγοντες. Αξίζει να σημειωθεί, όταν η περιοχή μεταξύ των νουκλεοτιδίων -700 και -400 διεγράφη, η δραστηριότητα υποκινητή μειωθεί σημαντικά. Προτείνει μια παρουσία κάποιων μεταγραφικών ενεργοποιητών σε αυτή την περιοχή. Για περαιτέρω διευκρίνιση μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να εστιάζεται σε άλλες TFs της περιοχής προαγωγέα του γονιδίου UCA1, οι οποίες συμβάλλουν στη δραστηριότητα του γονιδίου UCA1.

Ets-2 αρχικά χαρακτηρίστηκε ως πρωτο-ογκογονίδιο. Με τα χρόνια η οικογένεια παράγοντα μεταγραφής Ets έγινε ένα κοινό στοιχείο στην ογκογένεση [29]. Ευρήματα από Carbone

κ.ά.

πρότεινε ότι προς τα κάτω ρύθμιση του ETS-2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που σχετίζεται με μειωμένα επίπεδα του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη bcl-x (L), αυξητικούς παράγοντες ρυθμιστικών κυκλίνη D1, και c-myc . Αυτή η μελέτη αποκάλυψε τον ειδικό ρόλο του ETS-2 στην προαγωγή της ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [30]. Σε μια άλλη μελέτη, έδειξαν ότι η παροδική έκφραση του ETS-2 προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση μέσω της αύξησης της δραστικότητας υποκινητή του Bcl-XL και, κατά συνέπεια, την ενίσχυση των επιπέδων του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές μεσοθηλιώματος [31]. Προηγουμένως, Hanke

κ.ά.

βρέθηκε ότι η αναλογία του ETS-2 mRNA σε ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (υΡΑ) mRNA στα ούρα θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός δείκτης για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [32]. Αν και υπάρχουν στοιχεία, υποστήριξε ότι Ets-2 παίρνει μέρος στην ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης, οι ακριβείς ρόλοι και οι μηχανισμοί του ETS TFs στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι ως επί το πλείστον άγνωστα.

Στη μελέτη μας, δείξαμε μια αναστολή της έκφρασης UCA1 που προκαλείται από Ets-2 γονιδιακή σίγηση. Λειτουργική συνέπεια του ETS-2 γονιδιακή σίγηση οδήγησε σε απόπτωση σε BLZ-211 κύτταρα. Δείξαμε επίσης ότι Akt μονοπατιού είχε εμπλακεί σε αυτή τη διαδικασία. Η κινάση σερίνης-θρεονίνης Akt (επίσης γνωστή ως πρωτεΐνη κινάση Β) είναι ένα κεντρικό κόμβο σύγκλιση σε ένα εν πολλοίς επιρροή δίκτυο σηματοδότησης. Akt ρυθμίζει βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως η μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, και το μεταβολισμό [33]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της Akt μονοπατιού διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην αναστολή της απόπτωσης που επάγεται από έναν αριθμό ερεθισμάτων συμπεριλαμβανομένης της ανάκλησης του αυξητικού παράγοντα, αποκόλληση του εξωκυττάριας μήτρας, UV ακτινοβολία, ασυμφωνία του κυτταρικού κύκλου και την ενεργοποίηση του FAS σηματοδότησης [34], [35] , [36]. Για να ελεγχθεί αν Ets-2 ρυθμίζει Akt μονοπάτι μέσω UCA1, χρησιμοποιήσαμε μια άλλη κύστη κυτταρική σειρά καρκίνου BLS-211, το οποίο στερείται της γονιδιακής έκφρασης UCA1 και προέρχεται από τον ίδιο ασθενή όπως BLZ-211. Πιο ενδιαφέρον είναι, μετά την έκφραση του εξασθενημένου Ets-2 σε BLS-211 κύτταρα δεν παρατηρήσαμε κάτω ρύθμιση των pAkt και αύξησης κυτταρικής απόπτωσης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι UCA1 μπορεί να εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του μονοπατιού pAkt με Ets-2 (Εικ. 6). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι pAkt ρυθμίζεται προς τα κάτω στις σταθερές knockdown BLZ-211 κύτταρα UCA1 [37]. LncRNAs έχουν δειχθεί ότι φιλοξενούν βιολογικές δραστηριότητες. Μέχρι στιγμής, όπως είναι γνωστό, η ευρεία λειτουργική ρεπερτόριο lncRNAs περιλαμβάνει ρόλους σε υψηλής τάξης χρωμοσωμικές δυναμική, τελομερών βιολογία και υποκυτταρικών δομική οργάνωση [22], [38]. Εκτός μελέτη μας, άλλες μελέτες πρότειναν επίσης ότι lncRNA μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της οδού σήματος, όπως Wnt μονοπάτι, Ras μονοπάτι [39], [40]. Ωστόσο, ο μηχανισμός ότι το πώς Ets-2 ρυθμίζει Akt μονοπατιού παραμένει ασαφής και αν η Akt σηματοδότησης πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν άμεσα με UCA1 χρειάζεται να αποδειχθεί περαιτέρω.

Εν ολίγοις, κοιτάξαμε ρυθμιστικά στοιχεία που εμπλέκονται άμεσα στην μεταγραφή του γονιδίου UCA1 και διαπίστωσε ότι η δραστικότητα προαγωγέα του UCA1 οφείλεται κυρίως στη θέση σύνδεσης Ets-2 εντός της περιοχής εγγύς υποκινητή. Δείξαμε ότι ο παράγοντας μεταγραφής Ets-2 μπορεί να δεσμευτεί άμεσα με αυτήν την περιοχή και είναι απαραίτητο να τον μεταγραφικό έλεγχο έκφρασης UCA1. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι UCA1 μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της Akt μονοπατιού με Ets-2. Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι Ets-2 ρυθμίζει την έκφραση UCA1, εξάλλου lncRNA UCA1 μπορεί να εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της Akt μονοπατιού σηματοδότησης με Ets-2. Τα ευρήματά μας συνηγορούν για περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα. Αυτή είναι μία νέα πεδίο με συνεχώς αυξανόμενη σημασία. Είναι μια αυξανόμενη σημασία και το ενδιαφέρον να διερευνήσει τη λειτουργία και τη ρύθμιση αυτών των lncRNAs.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.