Αφηρημένο

Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να καθορίσει τις βιολογικές επιπτώσεις των νέων αναλογικών θαλάσσιων αλκαλοειδές 7- (4-φθοριοβενζυλαμινο) -1,3,4,8-τετραϋδρο [4,3,2-de ] κινολιν-8 (1Η) -όνη (FBA-TPQ) σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών για πιθανές αντικαρκινικές του και των υποκείμενων μηχανισμών ως νέου χημειοθεραπευτικό παράγοντα. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Α2780 και OVCAR-3), και αθανατοποιημένες μη ογκογονικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών Επιφάνεια (IOSE-144), εκτέθηκαν σε FBA-TPQ για αρχική αξιολόγηση κυτταροτοξικότητα (μέσω κιτ δοκιμασίας MTS, Promega). Η αναλυτικά

in-vitro

(επίπεδο κυττάρων) και

in-vivo

(ζωικό μοντέλο) μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις κατά του όγκου και την πιθανή υποκείμενων μηχανισμών δράσης των ενώσεων διεξήχθησαν στη συνέχεια. FBA-TPQ ασκείται ισχυρή κυτταροτοξικότητα εναντίον ανθρώπινου Α2780 καρκίνο των ωοθηκών και OVCAR-3 κύτταρα ως αποτελεσματικός αναστολέας της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού, ενώ ασκώντας μικρότερες επιδράσεις επί μη ογκογόνα κύτταρα IOSE-144. Περαιτέρω μελέτη στην πιο ευαίσθητη κυτταρική σειρά OVCAR-3 έδειξε ότι θα μπορούσε ισχυρά επάγει απόπτωση των κυττάρων (αννεξίνη δοκιμασία V-FITC), G2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψη (ανάλυση χρώση ΡΙ) και επίσης δοσοεξαρτώμενο αναστέλλουν OVCAR-3 όγκων ξενομοσχεύματος ‘ ανάπτυξη σε θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια (BALB /c, ηυ /ηυ). Μηχανιστικές μελέτες (αμφότερα

in vitro

και

in vivo

) αποκάλυψε ότι FBA-TPQ μπορεί να ασκεί τη δραστηριότητά του μέσω δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) -associated ενεργοποίηση του υποδοχέα θανάτου, ρ53-MDM2, και ΡΙ3Κ-Akt περιόδων OVCAR-3 κύτταρα, τα οποία είναι σύμφωνα με το

in vitro

μικροσυστοιχιών (Human μικροσυστοιχίες γονιδίωμα, Agilent) ανάλυση των δεδομένων (GEO αριθμός πρόσβασης: GSE25317). Συμπερασματικά, FBA-TPQ εμφανίζει σημαντική αντικαρκινική δραστικότητα εναντίον καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, με ελάχιστη τοξικότητα σε μη-ογκογόνα IOSE-144 ανθρώπινα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Chen T, Xu Υ, Guo Η, Liu Υ, Hu P, Yang Χ, et al. (2011) Πειραματική θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με Συνθετικό Makaluvamine Αναλογική:

In Vitro

και

In Vivo

Αντικαρκινική Δραστηριότητα και μοριακούς μηχανισμούς δράσης. PLoS ONE 6 (6): e20729. doi: 10.1371 /journal.pone.0020729

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Νοεμ 2010? Αποδεκτές: 11 Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουνίου του 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από εκατό τάλαντα Πρόγραμμα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστήμη (30870513, 31070680 και 91029715), το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2007CB947100), η Επιστήμη και Τεχνολογία Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης ( 08391910800, 10391902100), Εθνικό Επιστήμης και Τεχνολογίας Major Project «Key Νέο φάρμακο Δημιουργία και Παραγωγής Προγράμματος» (2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011), ο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής, της Xuhui Περιφέρεια του Δήμου Σαγκάης (RCT201001, CRC2010002), Διευθυντής του Ιδρύματος της INS (20090101), το Ερευνητικό Κέντρο Ασφάλειας Τροφίμων και Βασικά Εργαστήριο διατροφής και μεταβολισμού του INS, SIBS, CAS. R.Z. υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγεί R01 CA112029 και R01 CA121211. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 5 τοις εκατό των καρκίνων του θανάτου των γυναικών, τώρα είναι η πέμπτη κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες των ΗΠΑ [1]. Περίπου το 70% όλων των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών διαγιγνώσκονται σε πιο προχωρημένα στάδια της νόσου, που οδηγεί σε κακή πρόγνωση [2], [3]. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, αν και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών έχει σημαντικά βελτιωμένη λόγω της εφαρμογής του σε επιτυχή χειρουργική επέμβαση και την ανάπτυξη ή την βελτιστοποίηση της ογκοκτόνο φαρμάκων, η επιβίωση παραμένει χαμηλή, σε περίπου 30% [2] – [4]. Επομένως, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία της νόσου.

Οι θαλάσσιοι οργανισμοί αποτελούν μια πλούσια πηγή πιθανών ενώσεων μολύβδου με μοναδικές φαρμακολογικές ιδιότητες [5], [6]. Πολλά θαλάσσια φυσικά προϊόντα με νέες μοριακές δομές και διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες έχουν αναφερθεί κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών [7]. Makaluvamines, μια κατηγορία θαλάσσιων αλκαλοειδών που απομονώθηκαν από pyrroloiminoquinone σφουγγάρια των γενών

Zyzzya

, έχουν αναφερθεί ότι έχουν ισχυρή

in vitro

και

in vivo

κυτταροτοξικότητα έναντι διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικές γραμμές, και αυτή η δράση αποδίδεται στην δράση τους ως αναστολείς της τοποϊσομεράσης II [8] – [14]. Αρκετές άλλες makaluvamines αποδειχθεί ότι προκαλεί άμεσες βλάβες στο DNA που οδηγούν σε αποτελέσματα κατά των όγκων [6], [15].

Έχουμε συντίθεται περισσότερα από 40 νέα ανάλογα makaluvamine και αξιολογούνται συστηματικά αντικαρκινική τις δραστηριότητές τους στον καρκίνο του μαστού κυττάρων γραμμές. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η ισχυρή ανάλογο makaluvamine, FBA-TPQ, θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της ενεργοποίησης καταστολέων όγκου, αναστολή των ογκογονιδίων, και ενεργοποίηση της απόκρισης βλάβης του DNA [6], [16]. Στην παρούσα έκθεση, επεκτείναμε τη μελέτη μας για να αξιολογήσει τις δραστηριότητες κατά του όγκου των FBA-TPQ κατά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και προσπάθησε να διαφωτίσει περαιτέρω τους πιθανούς μηχανισμούς δράσης.

Αποτελέσματα

Το

in vitro

κυτταροτοξικότητα του FBA-TPQ να Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα εκτιμήθηκαν πρώτα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS (Promega). Α2780 και OVCAR-3 και ανθρώπινο IOSE144 (Απαθανάτισε μη ογκογόνα ωοθηκών επιφανειακών επιθηλιακών κυττάρων) ωοθηκών κύτταρα εκτέθηκαν σε FBA-TPQ (βλέπε Σχ. 1Α) σε διάφορες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα της Α2780 και των κυττάρων OVCAR-3 ήταν σημαντικά μειωμένη, με IC

50 του 1780 ηΜ (Α2780) και 980 ηΜ (OVCAR-3) (Εικ. 1Β). Η έκθεση σε FBA-TPQ οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων, την αναστολή της βιωσιμότητας Α2780 κατά 25,2%, 45,7%, και 65,8% ενώ αναστέλλει OVCAR-3 κύτταρα βιωσιμότητα με 33,9%, 56,7%, και 73,7%, αντίστοιχα, για το 0.5, 1.0 και 2.5 μΜ συγκεντρώσεις, αντίστοιχα, (Σχήμα 1, ρ & lt?. 0.05). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα IOSE144 ήταν πολύ λιγότερο ευαίσθητα σε θεραπεία FBA-TPQ, με IC

50 πάνω από 10 μΜ (Σχήμα 1Β, σ & lt?. 0.01). Η έκθεση σε FBA-TPQ μείωσε τη βιωσιμότητα των IOSE-144 κύτταρα με 2,7%, 7,7% και 25,6%, αντίστοιχα, για τους μΜ συγκεντρώσεις 0.5, 1.0 και 2.5 (Σχ. 1Β), υποδεικνύοντας ότι FBA-TPQ έχει εκλεκτική δράση έναντι ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, FBA-TPQ ανέστειλε Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα πολλαπλασιασμού με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 1 C και 1ϋ), ενώ τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της ήταν πολύ λιγότερο εμφανείς στα κύτταρα IOSE144 αγωγή με τις ίδιες συγκεντρώσεις FBA- TPQ (Εικ. 1 Ε). Στην πραγματικότητα, FBA-TPQ ανέστειλε σημαντικά Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα πολλαπλασιασμού ξεκινώντας σε συγκέντρωση 0,5 μΜ (Σχ 1C και 1D, ρ & lt?. 0.05), ενώ δεν υπήρξε σημαντική αναστολή στα κύτταρα IOSE-144 σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις ( έως 1 μΜ? Σχ. 1 Ε, ρ & gt? 0,05). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι FBA-TPQ μπορούν να αναστείλουν επιλεκτικά Α2780 και OVCAR-3 ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και του πολλαπλασιασμού ενώ ασκώντας λιγότερο ισχυρά αποτελέσματα επί μη ογκογόνα IOSE144 κύτταρα.

Α, Χημική δομή και μοριακό τύπο FBA-TPQ ? Β, Cell βιωσιμότητα (MTS) δοκιμασία κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος των ωοθηκών (Α2780 και OVCAR-3) και μη καρκινογενής ΟΣΕ κύτταρα (IOSE144) μετά από 48 ώρες επώασης με FBA-TPQ? C & amp? D & amp? Ε, αναστολή ανάπτυξης κυττάρων μετά από 0, 24, 48 ή 72 ώρες έκθεση του Α2780 (C), OVCAR-3 (D) και IOSE-144 (Ε) κύτταρα για να FBA-TPQ (σε συγκεντρώσεις 0, 0,5 , 0.75 και 1.0 μΜ). Όλες οι τιμές είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα, και παρουσιάζονται ως το ποσοστό της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων, όπου τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα θεωρήθηκαν ως το 100% βιώσιμα (0% αναστολή ανάπτυξης).

Η

Δεδομένου ότι FBA-TPQ δραματικά μειωμένη επιβίωση OVCAR-3 και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων, εμείς επιλέξαμε αυτό το επόμενο πιο FBA-TPQ ευαίσθητη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών για τη διερεύνηση της υποκείμενης μηχανισμός που ευθύνεται για τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων που εκτίθενται στην ένωση. Πρώτον, αξιολογήσαμε εάν FBA-TPQ μπορεί να διεγείρει απόπτωση OVCAR-3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και 2Β, FBA-TPQ επάγεται ισχυρά απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο κατά την διάρκεια 24 έκθεση ώρες. Με 0.5 μΜ συγκέντρωση, FBA-TPQ αυξημένη απόπτωση στα 3 OVCAR-κυττάρων σε 260% (των κυττάρων ελέγχου), ενώ στο 1.5 μΜ συγκέντρωση, ο δείκτης απόπτωσης αυξήθηκε κατά σχεδόν 4 φορές (Σχήμα 2Β, ρ & lt?. 0.05 ). Τα προ-αποπτωτικά αποτελέσματα ήταν πιο βαθιά σε συγκέντρωση 2,5 μΜ (αποπτωτικό δείκτη αυξήθηκε σε περίπου 600% σε σύγκριση με τον έλεγχο) (Σχ 2Β, ρ & lt?. 0.01). Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι FBA-TPQ μπορούν να επάγουν σημαντική απόπτωση στα OVCAR-3 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

Α, απόπτωση των κυττάρων OVCAR-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με σειριακές συγκεντρώσεις FBA-TPQ για 24 ώρες? Β, περίληψη των δεδομένων και ανάλυση του αποπτωτικού δείκτη (Q1 αντανακλά νέκρωση, Q2 αντανακλά αργά απόπτωση, Q3 αντανακλά υγιή πληθυσμό κυττάρων που δεν επηρεάζονται από την απόπτωση ή νέκρωση, ενώ το 4ο τρίμηνο αντανακλά πρώιμη απόπτωση). C, Cell αξιολόγηση κύκλο OVCAR-3 κύτταρα σε επεξεργασία με σειριακές συγκεντρώσεις FBA-TPQ για 12 ώρες? D, η ανάλυση των δεδομένων των κυττάρων παρουσιάζονται ως τη διανομή τοις εκατό μιας συγκεκριμένης φάσης (*,

σ

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου, **,

σ

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου, αντίστοιχα ). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά των τιμών από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Θα διερευνηθεί επίσης κατά πόσον FBA-TPQ έχει καμία επίδραση στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα OVCAR-3. Για την ανίχνευση αυτή, μπορούμε μειώθηκε ο χρόνος επώασης FBA-TPQ έως 12 ώρες για να για να αποφευχθεί η υψηλή επαγωγή απόπτωσης. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 2C και 2D, μετά από μια θεραπεία 12-h, FBA-TPQ προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις στον αριθμό των κυττάρων στο G

2 /Μ-φάση σε 1500 ηΜ (21,6% αύξηση του ελέγχου, ρ & lt? 0,05) και 2,5 μΜ (30,0% αύξηση του ελέγχου, σ & lt? 0,05) συγκεντρώσεις. Επιπλέον, η θεραπεία FBA-TPQ οδήγησε επίσης σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων στην S-φάση σε συγκέντρωση 2,5 μΜ (Σχήμα 2D, ρ & lt?. 0.05). Όπως συνοψίζεται στο Σχ. 2D, FBA-TPQ προκάλεσε μια ταυτόχρονη, εξαρτώμενη από τη δόση, ελάττωση στον αριθμό των κυττάρων στην G0 /G1 φάσης (ρ & lt? 0,01). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα του FBA-TPQ στη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη μπορεί να σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης και διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

Σε προηγούμενη εργασία μας, έχουμε αναφερθεί ότι FBA-TPQ δύναται ασκούν βλάβη του DNA σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [6]? Εδώ, ερευνήσαμε αν FBA-TPQ μπορούν να επάγουν κυτταρικό στρες ROS και να προκαλέσει οξειδωτική βλάβη στο DNA των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Σε αυτή τη δοκιμασία, μπορούμε μειώθηκε ο χρόνος επώασης ξανά έως 4 ώρες (για να αποφευχθεί η εξασθένηση ROS), ενώ αύξησε τις σειριακές συγκεντρώσεις σε 0, 1,0, 2,0 και 3,0 μΜ (για την παραγωγή γρήγορη επαγωγή ROS για μπλοκάρισμα της εικόνας). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α και 3Β, μετά από 4 ώρες επώασης, FBA-TPQ προκάλεσε μία σημαντική (ρ & lt? 0,05) δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην κυτταρική παραγωγή ROS σε OVCAR-3 κύτταρα (Σχ 3Β).. Με βάση την παρατήρηση μας ότι FBA-TPQ μπορούσε να επάγει απόπτωση, αξιολογήσαμε τα μιτοχόνδρια trans-δυναμικού μεμβράνης (

ΔΨm

) απαγωγή ως δείκτης της μιτοχονδριακής μεμβράνης και διάσπαση κυττάρων που υφίστανται απόπτωση. Η χρήση της βαφής JC-1, παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία FBA-TPQ οδήγησε σε σημαντική (ρ & lt? 0,05) δοσοεξαρτώμενη

διάχυση ΔΨm

(εξαρτώμενη από τη δόση μείωση του JC-1 συσσωματώματα υποδεικνύεται από μειωμένη αναλογίες κόκκινο /πράσινο ένταση φθορισμού) μετά από 24 ώρες έκθεσης (Σχ. 4Α και 4Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις ότι FBA-TPQ προκαλεί αυξημένη παραγωγή κυτταρικής ROS και την απώλεια του δυναμικού της μεμβράνης των μιτοχονδρίων, την έναρξη της ενδογενούς ROS στρες ενεργοποιείται νωρίς κυτταρικό μονοπάτι της απόπτωσης

& amp?. Β, FBA-TPQ προκαλεί δόση -εξαρτώμενη ROS στρες σε OVCAR-3 κύτταρα (A, η δόση-εξαρτώμενη αύξηση του ROS όπως υποδεικνύεται από CM-H

2DCFDA? Β, στοιχεία συνοψίζονται ως το ποσοστό σε σχέση με τον έλεγχο). C, ανάλυση στυπώματος Western των κυτταρικών επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης της σχετικής οδού, υποδεικνύοντας FBA-TPQ μπορεί να λάβει επιδράσεις μέσω της ROS-συνοδευόμενη, και ΡΙ3Κ-μεσολαβεί η ΑΚΤ /p53-MDM2 που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο εξέλιξης σχετίζεται μονοπάτι επί OVCAR-3 κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών μετά από 24 ώρες έκθεση (250.750 και 1.000 ηΜ συγκεντρώσεις).

η

Α και Β, η ένταση φθορισμού (JC-1 παράγει κόκκινο φθορισμό εντός των μιτοχονδρίων ως JC-1 -aggregates ενώ εκπέμπει πράσινο φθορισμό όταν διαρροές στο κυτταρόπλασμα ως JC-1-μονομερή? ένταση φθορισμού μετατόπιση μεταξύ πράσινου και κόκκινου είναι ανάλογη με το

ΔΨm

αλλαγή) τιμές του JC-1 βαφή σε συγκεκριμένα μήκη κύματος διέγερσης και η αντίστοιχη αναλογία κόκκινο /πράσινο μεταβολή (% του ελέγχου) μετά από έκθεση σε FBA-TPQ για 24 h (*,

ρ

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου). C & amp? D, Αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς που φέρουν OVCAR-3 όγκους ξενομοσχεύματος (*,

ρ

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου? **

ρ

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου) , και οι αντίστοιχες μεταβολές του σωματικού βάρους κατά τη διάρκεια της θεραπείας (

σ

& gt? 0,05)? Ε, ανάλυση Western-κηλίδος πρωτεϊνών (των ποντικών ξενομοσχεύματος όγκους μετά την αγωγή FBA-TPQ από 0, 1 ή 10 mg /kg δόση) που συμμετέχουν στην FBA-TPQ-ενεργοποιείται, και ΡΙ3Κ-Akt μεσολάβηση /p53-MDM2-συναφείς μονοπάτι.

η

για τον περαιτέρω καθορισμό των επιδράσεων του FBA-TPQ στην κυτταρική απόπτωση, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και τον πολλαπλασιασμό, ερευνήσαμε το επίπεδο έκφρασης ενός πάνελ πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε αυτές τις οδούς σε OVCAR-3 κύτταρα (βλέπε Σχ. 3C). Μετά από θεραπεία 24 ωρών του FBA-TPQ (με συγκεντρώσεις 0, 0.25, 0.75 και 1.0 μΜ), παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στην έκφραση του cleaved- Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και Caspase- 3, καθώς και Βαχ, με ταυτόχρονη δοσοεξαρτώμενη μείωση της Bcl-2. Ερευνήσαμε περαιτέρω τα πιθανά μηχανισμών που ευθύνονται για τις αντι-πολλαπλασιαστικές και του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικές επιδράσεις του FBA-TPQ. Όπως και παραπάνω, αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών που συνδέονται με τον πολλαπλασιασμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, και παρατήρησε την προς τα κάτω ρύθμιση του cdc25C, CyclinB1 και εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) 1, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη μετάβαση φάσης G2 /M, και βρέθηκε μια αύξηση στην έκφραση των πρωτεϊνών Rb, ρ21 και ρ27, όπως επίσης και μια μείωση στην πρωτεΐνη E2F1, όλα εκ των οποίων εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχ. 3C). Επιπλέον, τα στοιχεία μας έδειξαν ότι FBA-TPQ μπορεί να μειώσει την έκφραση και την ενεργοποίηση (υποδεικνύεται με φωσφορυλίωση) της Akt, καθώς και ανάντη της κινάσης καταλυτική υπομονάδα της ΡΙ3Κ-110α ΡΙ3Κ του. Αξιολογήσαμε περαιτέρω οι ρυθμιστικές επιδράσεις των FBA-TPQ για ρ53, και βρήκαν ότι FBA-TPQ ενεργοποιημένης ρ53, με ένα συνοδευτικό κάτω ρύθμιση στην έκφραση ΜΌΜ2 (βλέπε Σχ. 3C), και αυξημένη διάσπαση της PARP και κασπάσες-3. Αυτά τα ευρήματα είναι ενδεικτικά της απόπτωσης ή /και αντι-πολλαπλασιαστική και του κυτταρικού κύκλου ανασταλτικά αποτελέσματα. Όπως καταδεικνύεται στο Σχ. 3C, παρατηρήσαμε επίσης μία δοσο-εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση του Fas, υποδεικνύει ότι το μονοπάτι του υποδοχέα του θανάτου, μαζί με ρ53, μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην απόκριση προς FBA-TPQ και διέγερση της ROS στρες. Στο σύνολό τους, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι FBA-TPQ μπορεί να ασκήσει

in vitro

αποτελέσματα μέσω της ROS-συνδέονται, και PI3K-Akt μεσολάβηση /p53-MDM2 που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης που σχετίζονται μονοπάτια της (Εικ. 5).

η

Ιδρύσαμε το μοντέλο ξενομοσχεύματος OVCAR-3 όγκου για την αξιολόγηση του

in vivo

δράση κατά των όγκων του FBA-TPQ. Η ένωση χορηγήθηκε 5 ημέρες την εβδομάδα ί.ρ. σε δόση 1 mg /kg ή 10 mg /kg. Θεραπευτικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με την εξέταση της ανάπτυξης του όγκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, FBA-TPQ εμφανίζει σημαντική (ρ & lt? 0,01) αναστολή όγκου σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι ανασταλτικές επιδράσεις σημαντική αύξηση του όγκου άρχισε να είναι εμφανής από την ένατη ημέρα της θεραπείας (p & lt? 0,05). Μετά από 18 ημέρες θεραπείας, FBA-TPQ κατέληξε σε 20,5% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου) στη χαμηλότερη δόση 1 mg /kg, και 69,4% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου στην υψηλότερη /δόση kg 10 mg (Σχ. 4C , p & lt? 0,01). Επιπλέον, αν και οι ποντικοί που έλαβαν τη δόση των 10 mg /kg παρουσίασαν ελαφρά απώλεια του σωματικού βάρους, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην απώλεια σωματικού βάρους (p & gt? 0,05) μεταξύ των τριών ομάδων, υποδεικνύοντας ότι FBA-TPQ μπορεί να έχει ένα αποδεκτό προφίλ ασφάλειας (Εικ. 4D).

για να επικυρώσετε το

in vitro

ευρήματα σχετικά με το μηχανισμό δράσης του FBA-TPQ, θα αξιολογηθεί περαιτέρω το

in vivo

επίπεδο έκφρασης του πρωτεΐνες που εξετάστηκαν στα καλλιεργημένα κύτταρα (Σχ. 4Ε). Συνεπής με το

in vitro

δεδομένων, τα πρότυπα έκφρασης πρωτεΐνης στο κατεργασμένο ιστό ξενομοσχεύματος όγκου ήταν ουσιαστικά τα ίδια με τα κυτταρικά παρατηρήσεις (βλέπε Σχ. 3C και το Σχ. 4Ε), επιβεβαιώνοντας ότι τα αποτελέσματα κατά του όγκου του FBA-TPQ είναι, τουλάχιστον εν μέρει διαμεσολαβείται μέσω της επαγωγής των ROS το άγχος και την επακόλουθη κατάρρευση των μιτοχονδρίων, τα οποία οδηγούν σε μεταβολές στην κυτταρική καταρράκτες που εμπλέκονται στην απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.

Συζήτηση

η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που διερευνά συστηματικά τη νέα συνθετικά makaluvamine αναλογική FBA-TPQ του

in vitro

και

in vivo

κατά του όγκου αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Έχουμε αποδείξει ότι FBA-TPQ εξασκεί αντικαρκινική δραστηριότητές του σε Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα με αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού. Περαιτέρω χρήση μελέτη, η πιο ευαίσθητη κυτταρική σειρά OVCAR-3 αποκάλυψε ότι θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Τέτοια λειτουργικά αποτελέσματα επιτυγχάνονται μέσω ενός καταρράκτη αντιδράσεων στο εσωτερικό αυτών των οδών, συμπεριλαμβανομένων επαγωγή κυτταρικού στρες ROS, η ενεργοποίηση του θανάτου-υποδοχέα και μιτοχονδριακή κατάρρευση, και την επακόλουθη ρύθμιση του p53-MDM2 και PI3K-Akt συνδέεται μονοπάτια.

προηγούμενες μελέτες μας, αποδείξαμε ότι FBA-TPQ είναι το πιο ισχυρό ανάλογο makaluvamine όσον αφορά την επαγωγή της βλάβης του DNA, την απόπτωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την αναστολή του πολλαπλασιασμού σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [6]. Ωστόσο, οι πιθανές υποκείμενοι μηχανισμοί για τις δραστηριότητες αυτές κατά του όγκου και τη δυνατότητα εφαρμογής της ένωσης για άλλους τύπους καρκίνου δεν έχει διασαφηνιστεί. Το επίκεντρο της παρούσας μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν FBA-TPQ θα μπορούσε να αποτελέσει ένα πολλά υποσχόμενο υποψήφιο για τη μελλοντική ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου, καθώς και για την περαιτέρω διαλεύκανση του μηχανισμού (ες) της δράσης του.

Αρχικά παρατήρησε ότι FBA- TPQ ασκεί σημαντική κυτταροτοξικότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επιδράσεις αναστολής προς Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3. Μεταγενέστερες αξιολόγηση αποκάλυψε ένα εξαρτώμενο από την δόση επίδραση του FBA-TPQ επί OVCAR-3 κύτταρα απόπτωσης, και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (G2 /M κυττάρων φάση διακοπής κύκλου). Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζονται περαιτέρω από προφίλ έκφραση των σχετικών πρωτεϊνών σε OVCAR-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Σε μια προσπάθεια να διερευνήσει τον μηχανισμό (ες) της δράσης βασίζονται οι παρατηρούμενες βιολογικές δραστηριότητες του FBA-TPQ, βρήκαμε ότι FBA-TPQ μπορούν να επάγουν κυτταρικό στρες ROS και την επακόλουθη μιτοχονδριακή κατάρρευση, παρέχοντας μια πιθανή εξήγηση για καταρράκτη ενεργοποίησης του

in vitro

αντικαρκινικά αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η

in vivo

δραστικότητα του FBA-TPQ στο μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου των ωοθηκών OVCAR-3, και έδειξαν ότι FBA-TPQ μπορούν να ασκήσουν πάλι ισχυρή ογκοκτόνο δραστηριότητα, με έως και 69,4% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε η δόση 10 mg /kg. Εμείς συστηματικά (και τα δύο

in vitro

και

in vivo

) αξιολογούνται υποκείμενο μηχανισμό (ες) της δράσης, και μας

in vivo

μελέτες επιβεβαίωσαν ότι το FBA-TPQ ασκεί του ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου κυρίως επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης και διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

Η διάσπαση της PARP και procaspase-3 είναι οι καλά τεκμηριωμένες δεικτών απόπτωσης [18], [19]. Τα μέλη της οικογένειας Bcl-2, όπως Bcl-2 και Bax, είναι γνωστά κρίσιμη ρυθμιστές υπεύθυνος για την επιβίωση των κυττάρων /απόπτωση [20] – [22]. Έχουμε αποδείξει μια δοσοεξαρτώμενη διάσπαση της PARP και procaspase-3, καθώς και μία μείωση εξαρτώμενη από τη δόση σε αναλογία Bcl-2 /Bax σε FBA-TPQ-κατεργασμένα κύτταρα και όγκους, παρέχοντας αποδείξεις ότι FBA-TPQ επάγει απόπτωση. Με βάση τα προηγούμενα δεδομένα μας δείχνουν ότι FBA-TPQ μπορεί να δράσει ως παράγοντα βλάβης του DNA, αξιολογήσαμε το επίπεδο ROS σε OVCAR-3 κύτταρα μετά FBA-TPQ επώαση, η οξείδωση (μαζί με μεθυλίωση, αποπουρίνωση και απαμίνωσης) που προκαλείται από ROS στρες μπορεί να συμβάλει στην βλάβη του DNA [23]. Πράγματι, παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στο επίπεδο κυτταρικής ROS, καθώς και μια δοσοεξαρτώμενη απαγωγή του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης. Από την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης θεωρείται ένα πρώιμο γεγονός στην απόπτωση [18], [24], μπορούμε να συμπεράνουμε ότι FBA-TPQ πυροδοτεί την παρατηρήθηκε απόπτωση σε OVCAR-3 κύτταρα με διέγερση σε ένα υπερυψωμένο επίπεδο της κυτταρικής ROS, που οδηγεί σε επακόλουθη μιτοχονδριακή μεμβράνη κατάρρευσης [23], [24].

τα κύτταρα χρησιμοποιούν τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου για τη διασφάλιση της ορθής εκτέλεσης του κυτταρικού κύκλου, προκειμένου να προστατεύσει τη διαίρεση των κυττάρων από δυνητικά μοιραία βλάβη του DNA [25], [26]. Τα κύτταρα μπορεί να συλληφθεί στη φάση G2 /M, προκειμένου να υποβληθούν σε επιδιόρθωση του DNA ή αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [26], [27]. Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι επιδράσεις του FBA-TPQ κατά τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, ως αποτέλεσμα της επαγωγής της βλάβης του DNA, αξιολογήσαμε διαμόρφωση της έκφρασης των βασικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην G2 /M σηματοδότηση, και παρατηρήθηκε μία δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην έκφραση της CDC25C και CDK1 /κυκλίνης Β1, του οποίου η ενεργοποίηση είναι το κλειδί για την G2 /M εξέλιξη [26], [28], [29]. Αυτό επιβεβαιώνει ότι FBA-TPQ προωθεί G2 /M σύλληψη του OVCAR-3 κύτταρα μετά από ROS προκαλούμενη βλάβη.

Η ενεργοποίηση της ρ53 είναι ένας σημαντικός μηχανισμός δράσης για πολλούς παράγοντες βλάβης του DNA [6]. Παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην έκφραση μεταλλαγμένης-p53 σε OVCAR-3 κύτταρα, τα οποία είναι συνεπής με προηγούμενη αναφορά μας ότι τα κύτταρα ανταποκρίνονται σε βλάβη FBA-TPQ ανεξάρτητα από το καθεστώς p53 τους [6]. Παρατηρήσαμε επίσης προς τα κάτω ρύθμιση της MDM2 και μια συνακόλουθη μείωση στη E2F1, και αυξημένη έκφραση του Rb, ρ21 και ρ27 [30], [31], υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση του ρ53-MDM2 βρόχος ανάδρασης είναι πιθανόν υπεύθυνη για την FBA- TPQ θεραπεία προκαλούμενη αύξηση στην απόπτωση και κυτταρικό κύκλο σύλληψη και τη μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό σε Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3. Η οδός σηματοδότησης Akt διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης [32], [33]. Η ενεργοποίηση του Akt από ΡΙ3Κ (φωσφοϊνοσιτιδίου-3-ΟΗ-κινάση) κινάση μπορεί να ρυθμίσει μεταγραφικά παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, καθώς και αυξητικούς παράγοντες για την επιβίωση σε απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα ή βλάβη [32]. Η φωσφορυλιωμένη Akt (ρ-Akt) έχει αναφερθεί ότι είναι σε θέση να παρεμποδίσει την απόπτωση και την ανάπτυξη καταστολή ρ53-εξαρτώμενη με φωσφορυλίωση MDM2 [34]. Τα δεδομένα μας έδειξαν εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην p-Akt (και τ-Akt) και ανάντη ενεργοποιητή του ΡΙ3Κ (καταλυτική υπομονάδα) και μια αύξηση στην Fas (υποδοχέας θανάτου), υποδηλώνοντας ότι το ερέθισμα FBA-TPQ -suppresses την ΡΙ3Κ-Ακί (ρ-Akt) οδό και φωσφορυλιώνει MDM2 να ρυθμίζουν την έκφραση των αυξητικών παραγόντων (E2F1, Rb, ρ21 και ρ27, κ.λπ.) ή αποπτωτικά (PARP, Bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3, κλπ) και συναφή κυτταρικού κύκλου (CDC25C, CDK1 και κυκλίνης Β1, κλπ) πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα την συνεχή αντικαρκινικές επιδράσεις της ένωσης

Λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας από καρκίνο των ωοθηκών [1] – [4]., είναι ανάγκη να διερευνήσει νέοι παράγοντες που μπορεί να δράσει μέσω νέων μηχανισμών δράσης για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το πιο αποτελεσματικό ανάλογο makaluvamine, FBA-TPQ, μπορεί να είναι μια νέα και πολλά υποσχόμενη καρκινικού παράγοντα αντι-ωοθηκών, στο ότι μπορεί προνομιακά και αναστέλλουν ισχυρά ωοθηκών OVCAR-3 κύτταρα (αλλά όχι μη ογκογόνων OSE κύτταρο) ανάπτυξη. Σύμφωνα με μας

in vitro

και

in vivo

δεδομένα, πιστεύουμε ότι FBA-TPQ μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη του καρκινώματος των ωοθηκών με την ενεργοποίηση του Fas σχετίζεται /ROS-συνδέονται, και ΡΙ3Κ-Akt μεσολάβηση /p53-MDM2 που σχετίζονται με αύξηση της κυτταρικής απόπτωσης και αναστολή του κυτταρικού κύκλου και τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικ. 5). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν στο επίπεδο της πρωτεΐνης στο

in vitro

και

in vivo

, και ήταν σύμφωνα με την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μας (βλέπε Κείμενο S1, Εικ. S1, Πίνακες S1, S2, S3 ), ότι FBA-TPQ ασκεί δραστηριότητα της κυρίως μέσω επαγωγής της ROS και βλάβης του DNA, τη ρύθμιση της «οδού στον καρκίνο», «μονοπάτι σηματοδότησης ρ53» και «σύστημα σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλη (π.χ., ΡΙ3Κ-Akt), καθώς επίσης και αρνητικά ρύθμιση της CDK (π.χ., CDK1 και της σχετικής CDC25C και CyclinB1).

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας έδειξε ότι FBA-TPQ μπορεί να ασκήσει ισχυρή κυτταροτοξικότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επιδράσεις αναστολής προς Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3. Εκτός από την επαγωγή της απόπτωσης, μπορεί επίσης να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και αναστέλλει την ανάπτυξη OVCAR-3 όγκων ξενομοσχεύματος ‘μέσω του υποδοχέα που ενεργοποιείται από ROS /θάνατο, και ΡΙ3Κ-Akt μεσολάβηση /p53-MDM2 που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο πορείες εξέλιξης σχετιζόμενη (που απεικονίζεται στο Σχ. 5). Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός (ες) της ένωσης, και εάν ασκεί τα ίδια αποτελέσματα σε άλλους όγκους τύποι έχουν ακόμη καλά διευκρινιστεί. Στο μέλλον, η παρούσα μελέτη, σε συνδυασμό με τα προηγούμενα αναφερθεί ευρήματά μας [6], θα βελτιώσει σίγουρα την κατανόησή μας για τους μηχανισμούς δράσης των αναλογικών makaluvamine και θα παρέχει επίσης τη βάση για τη μελλοντική κλινική ανάπτυξη τους FBA-TPQ ως νέο αντι -cancer παράγοντα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις και αντιδραστήρια

Όλα τα χημικά ήταν όλα αναλυτικής καθαρότητας. FBA-TPQ ήταν ένα είδος δώρο από τον καθηγητή Sadanandan Velu (UAB, Birmingham, AL, USA). Ιωδιούχο προπίδιο (Ρ4170) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, ΜΟ, USA). Η χρωστική JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδιούχο) (Τ-3186), το αντιδραστήριο TRIZOL και CM-H

2DCFDA [5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2 ‘, 7’- dichlorodihydrofluorescein διοξικής ακετυλεστέρας] (C6827) αγοράστηκαν από την Invitrogen-Molecular Probes Co. (Πόλη, Νομός, USA). Το κινητό CellTiter 96® AQ

ueous One Λύση (G3580) Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (δοκιμασία MTS) kit αγοράστηκε από την Promega Co., Ltd. (Madison, WI). Το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης DC (500-0113) λήφθηκε από την Bio-Rad (Hercules, CA, USA), και το ECL plus σύστημα αγοράστηκε από την Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Όλες οι προμήθειες κυτταρικής καλλιέργειας ελήφθησαν από την Invitrogen-Gibco Co. (Πόλη, Νομός, USA). Το αντι-ανθρώπινο αντίσωμα MDM2 ελήφθη από Calbiochem® του EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Γερμανία), η κασπάση-3 αντίσωμα (8G10) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ, USA), και αντι -ανθρώπινη β-ακτίνης (AC-74) αντίσωμα ελήφθη από την Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, ΜΟ). Αντι-ανθρώπινο ρ53 (SC-98), Fas (SC-8009), PI3K110a (SC-7189), PI3K85a (SC-423), ΑΚΤ (SC-8312), π-ΑΚΤ (SC-7985-R), PARP (H-250, SC-7150), Bax (SC-493), Bcl-2 (SC-509), Rb (SC-50), ρ21 (SC-817), p27 (SC-528), E2F1 (SC -193), CDK1 (SC-8395), η κυκλίνη Β1 (SC-595), και CDC25C (SC-13138) αντισώματα, μαζί με όλα τα δευτερογενή αντισώματα (αντι-ποντικού, αντι-κατσίκας και ανοσοσφαιρίνη αντι-κουνελιού G) αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

ανθρώπινο Α2780 καρκίνωμα ωοθηκών και OVCAR-3 κύτταρα και τα ανθρώπινα ωοθηκών IOSE144 (Απαθανάτισε μη ογκογόνο ωοθηκών επιφανειακών επιθηλιακών κυττάρων) που είχαν αρχικά ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ήταν δώρα από τον Δρ Jing Fang (Ινστιτούτο Διατροφής Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, σύμφωνα με τις οδηγίες του ATCC του. FBA-TPQ διαλύθηκε σε DMSO στη συνέχεια αραιώνεται σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας (& lt? 0,1%, τελική συγκέντρωση επώασης).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Η κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία MTS χρησιμοποιώντας η CellTiter 96® AQ

ueous One Λύση κυττάρων Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού σετ (G3580, Promega). Εν συντομία, 4 × 10

3 κύτταρα (ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με FBA-TPQ (διαλυμένη σε DMSO & lt? 0,1%, τελική συγκέντρωση) σε σειριακές συγκεντρώσεις (0 , 100, 500, 750, 1000, 1500 και 2500 ηΜ), ή υποβλήθηκαν σε θεραπεία για διάφορους χρόνους (0, 24, 48 και 72 ώρες) με FBA-TPQ σε συγκεντρώσεις των 0, 500, 750 και 1000 nm. Μετά τη θεραπεία 24~72 ώρες, 20 μι διαλύματος MTS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 2~4 ώρες στους 37 ° C, μετά την οποία η απορρόφηση στα 490 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα SpectraMax

190 αναγνώστη μικροπλακός (Molecular Devices, USA) για τον υπολογισμό των ποσοστών επιβίωσης των κυττάρων.

Ανίχνευση απόπτωσης

απόπτωση κυττάρων ανιχνεύθηκε μέσω ενός αννεξίνης V-FITC kit αγοράστηκε από BioVision, Inc [6], [17]. Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την ένωση δοκιμής (FBA-TPQ) σε 0.5, 1.5 και 2.5 μΜ για 24 ώρες πριν από την ανάλυση. Τα επιπλέοντα και επεξεργασία με θρυψίνη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και προετοιμάστηκαν για την ανίχνευση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν με ροή FACSAria ™ κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, USA) μετά από επώαση στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Κύτταρα θετικά για πρώιμη απόπτωση (Αννεξίνη V-FITC βάφονται μόνο, δείτε Q

4 στο σχήμα 2Α) και για την καθυστέρηση της απόπτωσης (Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ βάφονται, βλέπε Q

2 στο σχήμα 2Α) συνενώθηκαν.

κύκλου κυττάρου Ανάλυση

ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση διεξήχθη για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του FBA-TPQ επί του κυτταρικού κύκλου [6]. Εν συντομία, 6 × 10

5 κύτταρα που σπάρθηκαν σε δίσκους 6 cm εκτέθηκαν σε FBA-TPQ (σε 0, 0,5, 1,5 και 2,5 μΜ) και επωάστηκαν για 12 ώρες πριν από την ανάλυση. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 1 mL 70% αιθανόλη (700 μί 100% αιθανόλης προστέθηκε σε 300 μL PBS) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση (3000 rpm, 5 λεπτά), η επώαση με RNase (100 μg /ml) και χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml) για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε από ένα εργαστήριο κυττάρων Quanta ™ SC κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter, USA).

Μέτρηση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

Η παραγωγή των ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας 5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2 ‘, 7’- dichlorodihydrofluorescein διοξική ακέτυλο εστέρα (CM-H2DCFDA). Εν συντομία, κύτταρα (~ 7 χ 10

5) σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα και εκτέθηκαν σε FBA-TPQ για 4 ώρες σε σειριακές συγκεντρώσεις (0, 1,0, 2,0 και 3,0 μΜ), μετά το οποίο συλλέχθηκαν τα κύτταρα και πλένονται με PBS μία φορά, στη συνέχεια επωάστηκαν με 5 μΜ CM-H2DCFDA (σε DMSO) για 30 λεπτά στους 37 ° C σε ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο RPMI 1640.