Αφηρημένο

Ιστορικό

EMX2 είναι ένα ανθρώπινο ορθόλογο του

Drosophila

γονίδιο ομοιοκυτίου άδειο spiracles που έχει εμπλακεί στην εμβρυογένεση. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πιθανή εμπλοκή EMX2 σε ανθρώπινους καρκίνους? Ωστόσο, ο ρόλος της στην καρκινογένεση EMX2 χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

Αποτελέσματα

Σε αυτή τη μελέτη, ανέφερε ότι κάτω ρύθμιση της έκφρασης EMX2 συσχετίστηκε σημαντικά με υπερμεθυλίωση EMX2 υποκινητή σε καρκίνο του στομάχου. Αποκατάσταση EMX2 έκφρασης χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απελευθέρωσης αδενοϊό σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου έχει έλλειψη ενδογενούς έκφρασης EMX2 οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και σηματοδότησης Wnt μονοπάτι τόσο in vitro όσο και σε ένα γαστρικό καρκίνο μοντέλο ξενομοσχεύματος in vivo. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με τον φορέα αδενοϊού έκφρασης EMX2 είχαν σημαντικά καλύτερη επιβίωση από εκείνους που αντιμετωπίστηκαν με άδειο φορέα αδενοϊού.

Συμπέρασμα

Η μελέτη μας δείχνει ότι EMX2 είναι ένα υποθετικό καταστολέας όγκου σε ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου. Το αδενοϊικό-EMX2 μπορεί να έχει δυνατότητες ως μια νέα γονιδιακή θεραπεία για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Li J, Μο Μ, Chen Ζ, Chen Ζ, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) αδενοϊό Παράδοση του EMX2 Gene καταστέλλει την ανάπτυξη στον τομέα των ανθρωπίνων γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 13, Απρ, 2012? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 21, Σεπτεμβρίου 2012

Copyright: © Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από κονδύλια από το Πρόγραμμα Εθνικό Key Βασική Έρευνα και την Ανάπτυξη (973) της Κίνας (2011CB910800 και 2012CB917304), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31.170.732), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang (Y2101329), και η Μεταδιδακτορικός Επιστήμη Ίδρυμα της επαρχίας Zhejiang (2010-BSH-031). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και τη δεύτερη πιο κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο [1], [2], [3]. Αν και παγκόσμια συχνότητα εμφάνισης του έχει μειωθεί, η επίπτωση εξακολουθεί να παραμένει σε υψηλά επίπεδα στις χώρες της Ασίας [2], [4], [5]. Οι περισσότεροι από τους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια [6]. Παρά τη βελτίωση στην στρατηγικές θεραπείας [7], [8], 5-ετή επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου οι οποίοι έλαβαν συμβατικές θεραπείες παραμένει λιγότερο από το 30% [4]. Ως εκ τούτου, εναλλακτικές προσεγγίσεις χρειάζονται επειγόντως.

Η γονιδιακή θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της σύστημα παροχής ιικών και μη ιικών γονιδίων, είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου [9]. Μεταξύ όλων των επί του παρόντος διαθέσιμο σύστημα, ανασυνδυασμένο αδενοϊό (Ad) φορείς είναι ιδιαίτερα ελπιδοφόρα. Τα πλεονεκτήματα της Ad φορείς περιλαμβάνουν την ικανότητα να παράγουν υψηλούς τίτλους, την ικανότητα να μολύνουν διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα αποτελεσματικά, τη σταθερότητα του γονιδιώματος, και χαμηλά επίπεδα ενσωμάτωσης DNA σε γονιδίωμα ξενιστή [9], [10]. Έχει αναφερθεί ότι η αποκατάσταση των γονιδίων μέσω αυτής της προσέγγισης οδηγεί σε υποχώρηση του όγκου και επάγει την απόπτωση

in vivo

χωρίς να επηρεάζει τους κανονικούς ιστούς [11], [12], [13].

EMX2, το ανθρώπινο ορθόλογο του

Drosophila

γονίδιο ομοιοκυτίου άδειο spiracles (EMS), ανήκει στην οικογένεια των γονιδίων ομοιοκυτίου που κωδικοποιεί μεταγραφικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες (ομοπρωτεΐνης) απαραίτητα για πολλές πτυχές της ανάπτυξης και διαφοροποίησης [14]. EMX2 διαδραματίζει ζωτικό ρόλο κατά τη διάρκεια του εγκεφάλου [15] και την σκελετική ανάπτυξη [16]. Ποντίκια που φέρουν ομόζυγο EMX2 μεταλλάξεις εμφανίζουν μείωση δραματική μέγεθος του ουραίου-μεσαίο τομείς, συμπεριλαμβανομένων ινιακό φλοιό και τον ιππόκαμπο [17], [18], [19]. Η διαταραχή της έκφρασης EMX2 μπορεί να μεταβάλει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων [20]. EMX2 ελέγχει επίσης την αναπαραγωγή των θηλαστικών με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού του ενδομητρίου κυττάρων χωρίς να επηρεάζει τη διαφοροποίηση [21].

Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πιθανή εμπλοκή EMX2 σε ανθρώπινους καρκίνους [22], [23], [24], [25]. Για παράδειγμα, EMX2 έχει αποδειχθεί ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του πνεύμονα, και χαμηλή έκφραση EMX2 σχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση και την επανάληψη επιβίωση χωρίς σε ασθενείς με αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα [22], [23]. Είναι, επίσης, αναφερθεί ότι η έκφραση EMX2 είναι άφθονη σε φυσιολογικό ενδομήτριο των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών αλλά απουσιάζει ή είναι μειωμένο σε ενδομητρίου όγκους, και τα επίπεδα EMX2 συσχετίζεται αρνητικά με πολλαπλασιασμό [24], [25]. Επιπλέον, μπορεί να ρυθμίζει EMX2 ογκογένεση μέσω Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι, ένα κρίσιμο μονοπάτι ρυθμίζει προσδιορισμός μοίρα των κυττάρων, ανάπτυξη ιστών και ογκογένεση [26], [27], [28]. EMX2 βρίσκεται ως άμεσος καταστολέας της έκφρασης Wnt1, και να χτυπήσει τα κάτω του γονιδίου EMX2 επάγει έκτοπη έκφραση της Wnt1 στον αναπτυσσόμενο τελεγκεφάλου και φλοιώδη δυσπλασία [29]. Επιγενετική σίγηση της έκφρασης EMX2 μπορεί να είναι σημαντική για ανώμαλη ενεργοποίηση της σηματοδότησης Wnt στον καρκίνο του πνεύμονα, και την επακόλουθη πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [22]. Ωστόσο, η λειτουργία του κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης EMX2 και αντίστοιχου μηχανισμού πρέπει να διευκρινιστεί περαιτέρω. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε EMX2 ως υποθετικό καταστολέας όγκων σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο. Έχουμε αποδείξει την κατιούσα ρύθμιση EMX2 και συσχέτιση με την κατάσταση μεθυλίωσης της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου σε καρκίνο του στομάχου. Δείχνουμε επίσης ότι η αποκατάσταση της EMX2 χρησιμοποιώντας ένα αδενοϊικό σύστημα χορήγησης αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και σηματοδότηση Wnt

in vitro

, και έχει ως αποτέλεσμα την καλύτερη επιβίωση ενός γαστρικού μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου

in vivo

. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν έντονα τις θεραπευτικές δυνατότητες της χρήσης του Ad-EMX2 η γονιδιακή θεραπεία για τη μελλοντική θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Xuanwu Νοσοκομείο Capital Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Πεκίνου. Μια γραπτή συγκατάθεση έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας, ελήφθη για κάθε ασθενή πριν από τη συλλογή δείγματος ιστού.

Cell Culture, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (ΕΑΒ) /τριχοστατίνη Α (TSA) Θεραπεία, και δείγματα ιστών

Ανθρώπινο γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (ΑΖ521, AGS και ΜΚΝ28) ελήφθησαν από την Κίνα Center for Type Culture Collection (Wuhan, Κίνα). Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα υγρό επωαστή με 5% CO

2. Για να αναλυθεί η αποκατάσταση του γονιδίου EMX2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4 μΜ DAC ή 300 ηΜ TSA (Sigma, St. Louis, USA) για 4 ημέρες, με αντικατάσταση του φρέσκο ​​μέσο που περιέχει την ίδια δόση του DAC ή TSA καθημερινά. Κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει DMSO. Τα κύτταρα, συνεπώς, συλλέχθηκαν για εκχύλιση του DNA /RNA.

Ένα σύνολο 20 εμπεδωθεί με παραφίνη μπλοκ σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ιστούς (10 γαστρικό καρκινικούς ιστούς και 10 πλησίον φυσιολογικούς ιστούς), καθώς και το συνολικό RNA από 15 δείγματα γαστρικού δυσπλασία και 20 γαστρικό καρκίνο χειρουργική δείγματα ελήφθησαν από Xuanwu Νοσοκομείο Capital Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Πεκίνου. Ολικό RNA και γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από ανθρώπινο ενήλικο κανονικό γαστρικό ιστοί αγοράσθηκαν από Biochain (Hayward, CA, USA).

DNA κατασκευάσματα

Topflash /Fopflash ρεπόρτερ που περιέχει αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων TCF /LEF sites αντίστοιχα ευγενώς από τον Dr. Yeguang Chen (Πανεπιστήμιο Tsinghua, Πεκίνο, Κίνα) δεσμευτικές. Ένα μεταλλαγμένο CTNNB1 (S45Y) κατασκεύασμα cDNA επίσης παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Yeguang Chen (Πανεπιστήμιο Tsinghua, Πεκίνο, Κίνα). Ανασυνδυασμένοι φορείς αδενοϊού που εκφράζουν EMX2 και τον φορέα ελέγχου αγοράστηκαν από την Vector Biolabs (Biolabs Vector, Burlingame, CA, USA).

μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) και όξινου θειώδους Αλληλούχιση (BS)

Η μετατροπή διθειώδους από ιστούς και κύτταρα έγιναν χωρίς την προϋπόθεση για καθαρισμό DNA χρησιμοποιώντας EZ μεθυλίωσης του DNA-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). Οι ιστοί FFPE ήταν πρώτα-παραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο (Sigma) και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη, πριν από την κατεργασία όξινου θειώδους σύμφωνα με τις οδηγίες κατασκευαστή. Για MSP, τροποποιημένο DNA ενισχύεται με τη χρήση εκκινητών MSP (παρατίθενται παρακάτω) που ειδικά αναγνωρίζεται είτε τις ακολουθίες μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα EMX2 υποστηρικτής μετά την κατεργασία όξινου θειώδους. PCR διεξήχθη σε ένα τελικό όγκο 20 μΐ που περιείχε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης MSP [30], 0,5 μΜ από κάθε εκκινητή και 1 U του Zymo

Taq

™ DNA πολυμεράση (Zymo). προϋπόθεση PCR ήταν ως ακολούθως: 10 λεπτά στους 95 ° C? 40 κύκλοι των 30 s στους 95 ° C, 30 s στους 50 ° C και 30 στους 72 ° C? και 7 λεπτά τελική επέκταση στους 72 ° C. Για BS, ενίσχυση όξινου θειώδους-μετατραπέντος DNA πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μΐ που περιέχει 1 μΜ από κάθε εκκινητή BS και 2 U του Zymo

Taq

™ DNA πολυμεράση. προϋπόθεση PCR ήταν ως ακολούθως: 10 λεπτά στους 95 ° C? 40 κύκλοι των 30 s στους 95 ° C, 40 s στους 55 ° C και 1 λεπτό στους 72 ° C? και 7 λεπτά τελική επέκταση στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε PMD-18Τ (Takara, Dalian, Κίνα). Είτε 5 ή 3 τυχαία επιλεγμένες θετικοί κλώνοι από κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αλληλουχίας σε Σαγκάη Invitrogen (Σαγκάη, Κίνα). Εκκινητών ήταν ως εξής:

MSP-M (προς τα εμπρός): 5′-TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 ‘

MSP-M (πίσω): 5′-GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3′

MSP-U (προς τα εμπρός): 5′-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 ‘

MSP-U (αντίστροφη): 5′-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3′

BS-Α (προς τα εμπρός): 5 ‘ -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 ‘

BS-Α (πίσω): 5′-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3′

BS-Β (προς τα εμπρός): 5′-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 ‘

BS-Β (πίσω): 5′-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 ‘

η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

IHC διεξήχθη μετά από τυπικό πρωτόκολλο. Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συμπεριλαμβάνονται ποντικού αντι-ανθρώπου Κί67 (1:100? BD, San Jose, CA, USA) και αντι-ανθρώπινη EMX2 ποντικού (1:500? Pierce, Rockford, IL, USA), και Alexa 594-συζευγμένη δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (1:200? Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα πλακίδια επίσης αντίθετα με hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 συνεστιακό μικροσκόπιο (Oberkochen, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η χρώση. Η ένταση του Κί67 ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας Image Pro® Plus. χρώση EMX2 οπτικοποιήθηκε με Ηϊδίοδΐαίη Plus DAB (ευρύ φάσμα, Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με αιματοξυλίνη (Sigma), και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Leica SCN400 σαρωτή διαφανειών (Leica, Germany).

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

τα κύτταρα σε πυκνότητα 5 × 10

3 ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων πριν από την επιμόλυνση. Topflash ή Fopflash πλασμίδια συν-επιμολύνθηκαν με PRL-ΤΚ πλασμίδιο. Αφού τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες, η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε με σύστημα διπλής Glo Luciferase Assay (Promega, Madison, USA). Η αναλογία μεταξύ της δραστηριότητας της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (Topflash /Fopflash) και δραστηριότητα renilla χρησιμοποιήθηκε για δραστηριότητα TCF /LEF μεταγραφής.

Ανοσοαποτύπωσης

Τόσο η συνολική πρωτεΐνη (20 μg) και εκχυλίσματα κυτταροπλάσματος (40 μg) υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση. Τα πρωτογενή αντισώματα περιελάμβαναν αντι-EMX2 (1:500? Pierce), αντι-β-ακτίνης (1:5000? Sigma), αντι-κυκλίνη D1 (1:500? BD) και αντι-ο-Μγο (1:200? Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

ο πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε με CellTiter 96 Υδατικό διάδοσης Assay Kit (Promega). Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων με τον αριθμό των 5 × 10

2 κύτταρα /φρεάτιο. Αφού τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για τις ημέρες 0, 2, 3 και 4, τα διαλύματα MTS προστέθηκαν στο μέσο και επωάστηκαν για 1,5 ώρα. Η απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο ανάγνωσης μικροπλάκας 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Colony Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα (1 × 10

3) που έχουν μολυνθεί με αδενοϊικό φορέα που εκφράζει EMX2 ή κενό φορέα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε δίσκους 100-mm. Φρέσκο ​​μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από καλλιέργεια για 3-4 εβδομάδες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 20 λεπτά και φωτογραφήθηκαν.

RNA Εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής -PCR (RT-PCR)

εκχύλιση RNA και πραγματικού χρόνου RT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών περιγράφηκαν προηγουμένως [22].

ζωικό μοντέλο και αδενοϊό Vector Παράδοση

Όλα τα πειράματα ποντίκια διεξήχθησαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκατάσταση ζώων του Πανεπιστημίου Tsinghua και εγκρίθηκε από το Θεσμικό Animal Care και Χρήση Επιτροπής του Πανεπιστημίου Tsinghua. Γαστρικό ξενομοσχεύματα καρκίνου καθιερώθηκαν σε 5-εβδομάδων θηλυκά BALB /c γυμνά ποντίκια. Εν συντομία, μετά καλλιεργήθηκαν μέχρι συρροής, ΜΚΝ28 ή AGS κύτταρα trypisnized και επαναιωρήθηκαν σε PBS (ρΗ 7.4) και στη συνέχεια αναμειγνύονται 1:01 (ν /ν) με Matrigel (Ζωηρά) στους 4 ° C για την ένεση ενός ποντικού σε συνολικό όγκο 150 μλ. Το μίγμα s.c εγχύεται δεξί πλευρό 16 θηλυκών ποντικών με 10

7 κύτταρα ανά ποντικό (ημέρα 0). Την ημέρα 7, τα ποντίκια που φέρουν τοπικές όγκους κυμαίνονταν από 50 έως 100 mm

2 λάβει άμεση ενδονεοπλαστική ένεση 1 × 10

9 μονάδες σχηματισμού πλακών της ενδεικνυόμενης αδενοϊό (αραιωμένο με PBS σε συνολικό όγκο 100 μΙ). Ο σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε για μέχρι και 1 ½ μήνες. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση της δαγκάνας και προσδιορίζεται με πολλαπλασιασμό επί 0,5 × πλάτος

2 × μήκος. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η επιβίωση των δύο ομάδων ζώων υπό θεραπεία. Κατά την ολοκλήρωση του πειράματος, οι όγκοι από κάθε κατεργασία συλλέχθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και κόπηκαν σε 5-μm φέτες πάχους για περαιτέρω ανίχνευση Ki-67. Κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών και λύμα ολόκληρων κυττάρων εκχυλίστηκαν επίσης από αυτούς τους όγκους για ανάλυση Western.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα υπολογίστηκαν ως μέσο ± τυπικές αποκλίσεις. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν με t-test διπλής όψης σπουδαστή. Ένα

P

αξία 0,05 ή λιγότερο θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Ελάττωση της EMX2 Ανθρώπων γαστρικός καρκίνος

Εξετάσαμε την έκφραση EMX2 στην εννέα ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, όπως επίσης και των όγκων και αντιστοιχισμένο παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από δέκα ασθενείς με γαστρικό καρκίνο (Σχήμα 1). Χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνο RT-PCR, βρήκαμε ότι η έκφραση του EMX2 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε οκτώ από τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν εννέα όταν συγκρίνεται με εκείνη στο φυσιολογικό γαστρικό ιστό (Ρ & lt? 0,01, Σχήμα 1Α). Από την άλλη πλευρά, μία κυτταρική σειρά ΑΖ521 έδειξαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης EMX2 ως εκείνη στην κανονική ελέγχου (Σχήμα 1Α). Με σκοπό την ανίχνευση EMX2 έκφραση πρωτεΐνης σε δείγματα ιστών ασθενών, ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκε και η ένταση της χρώσης IHC ποσοτικοποιήθηκε με Image Pro® Plus. Όλα τα δέκα δείγματα που αναλύθηκαν βρέθηκαν να εμφανίζουν είτε έλλειψη έκφρασης EMX2 ή μειωμένα επίπεδα έκφρασης EMX2 σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς (Ρ & lt? 0,01, Σχήμα 1Β). Για τη δημιουργία του πιθανού ρόλου EMX2 σε παθολογικές εξέλιξης του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου, αναλύσαμε EMX2 έκφρασης χρησιμοποιώντας ολικό RNA που λαμβάνεται από δεκαπέντε γαστρικά δείγματα δυσπλασία και είκοσι γαστρικού καρκίνου χειρουργική δείγματα. Βρήκαμε ότι η έκφραση EMX2 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε δείγματα δυσπλασία (Ρ & lt? 0,05). Και σχεδόν χαθεί σε δείγματα καρκίνου του σε σύγκριση με εκείνη σε ενήλικο ιστό κανονικό στομάχι (Σχήμα 1 C), γεγονός που υποδηλώνει ότι μειορρύθμιση EMX2 μπορούσε να συμβεί σε μη επεμβατικές προκαρκινικές στάδιο

(Α) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR της έκφρασης EMX2 σε ένα φυσιολογικό δείγμα στομάχι ιστού και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. (Β) IHC χρώση πρωτεΐνης EMX2 σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους από τους ίδιους τους ασθενείς. (100Χ, γραμμή κλίμακας = 500 μm? 400Χ, γραμμή κλίμακας = 100 μm). (C) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR αποτέλεσμα της 15ης γαστρικού δυσπλασίας και 20 γαστρικό καρκίνο χειρουργική δείγματα. Ένα δείγμα ιστού του στομάχου ενήλικος κανονική χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα 25η και 75η εκατοστιαία εκπροσωπήθηκαν ως περιθώρια ασφαλείας, 10ο και 90ο εκατοστημόριο παρουσιάζονται ως ράβδοι σφάλματος, και το μεσαίο αναπαρίσταται ως μια γραμμή στο κουτί.

Η

Διόρθωση μεταξύ EMX2 Έκφραση και υποστηρικτής μεθυλίωση Κατάσταση του

Εξετάσαμε κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή EMX2 σε εννέα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και φυσιολογικό γαστρικό ιστό. Περιοχές των CpG νησίδων (CGI) ταυτοποιήθηκαν με MethPrimer από -800 έως -470 και -55 έως 459 σε σχέση με τις αναμενόμενες θέσεις έναρξης μεταγραφής (1) του γονιδίου EMX2 (Εικόνα 2Α). κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκε με τη χρήση διθειώδους αλληλουχίας (BS) (Σχήμα 2Β) και ειδική της μεθυλίωσης PCR (MSP) (Σχήματα 2C-2D). BS μας και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MSP ο υποκινητής EMX2 σε φυσιολογικά γαστρικά κύτταρα των ιστών και ΑΖ521 ήταν μη μεθυλιωμένη, ενώ στις άλλες οκτώ κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν ήταν πυκνά μεθυλιώθηκε (Σχήματα 2Β-2C). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα επίπεδα έκφρασης EMX2 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές: υψηλή σε φυσιολογικό ιστό και ΑΖ521, αλλά χαμηλή στις άλλες οκτώ κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. Ένα μίγμα των μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων μπάντα βρέθηκε σε αρκετές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων ΜΚΝ28, Ν87, και SNU 16 υποδεικνύοντας μερική μεθυλίωση. Επιπλέον, βρήκαμε ότι κατάσταση μεθυλίωσης των δειγμάτων των ασθενών ιστού αποκαλύπτεται από MSP είναι σύμφωνη με τα επίπεδα έκφρασης EMX2 σε αυτά τα δείγματα (Σχήμα 2D, εξετάστηκαν τέσσερις από τις δέκα ζεύγη δειγμάτων ιστού λόγω μη διαθεσιμότητας του γενωμικού DNA από τα άλλα έξι ζεύγη ). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης EMX2 μπορεί να είναι αποτέλεσμα του υποκινητή υπερ-μεθυλίωση του σε καρκίνο του στομάχου.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της περιοχής προαγωγέα 5 ‘του γονιδίου EMX2. TSS υποδεικνύει την θέση μεταγραφικής έναρξης. MSP είναι το αμπλικόνιο MSP, και BS-Α /BS-Β είναι αμπλικόνια για θειώδους αλληλουχίας. (Β) Bisulfite αποτελέσματα αλληλούχισης του κανονικού δείγματος στομάχι ιστού και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Ανοίξτε και μαύρα τετράγωνα αντιπροσωπεύουν τις μη μεθυλιωμένες και μεθυλιωμένες περιοχές αντίστοιχα. αποτελέσματα (C) MSP της περιοχής προαγωγού EMX2 σε φυσιολογικό δείγμα στομάχι ιστού και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. (D) Αποτελέσματα MSP της περιοχής EMX2 υποκινητή σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης EMX2 και τη μεθυλίωση προαγωγού, υποβάλλαμε σε αγωγή κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ28 και AGS με έναν αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DAC και ενός αναστολέα TSA αποακετυλάσης ιστόνης. Η γραμμή κυττάρων ΑΖ521 χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος ως περιοχή προαγωγού του είναι μη μεθυλιωμένο. Παρατηρήσαμε ότι η unmethylation συγκεκριμένη ζώνη ήταν σημαντικά αυξημένη (Σχήμα 3Α) με τα επίπεδα έκφρασης EMX2 αυξητικά αναλόγως (Σχήμα 3Β) κατά την κατεργασία DAC και στις δύο AGS και κυττάρων ΜΚΝ28, ενώ εκείνες στις ΑΖ521 κύτταρα παρέμειναν αμετάβλητες (Σχήμα 3). Η θεραπεία της TSA είχε ελάχιστα αποτελέσματα επί τόσο κατάσταση μεθυλίωσης και EMX2 επίπεδα έκφρασης. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα το κάτω ρύθμιση της έκφρασης EMX2 συσχετίστηκε σημαντικά με την υπερμεθυλίωση EMX2 υποκινητή σε ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου.

MSP (Α) και Real-time RT-PCR (Β) αναλύει το γαστρικό καρκινικές κυτταρικές σειρές μετά από την επεξεργασία του DMSO, 1 μΜ DAC, 300 ηΜ TSA και ένα συνδυασμό DAC (1 μΜ) και TSA (300 ηΜ), αντιστοίχως (*:

P & lt? 0,05

, ***:

P & lt?. 0.001

)

η

η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων από τον αδενοϊό-παραδοθεί EMX2 in vitro

Εξετάσαμε την επόμενη το ρόλο της EMX2 στην κυτταρική ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων . Η ανάπτυξη των κυττάρων AGS και ΜΚΝ28 κατεστάλη σημαντικά κατά τη μόλυνση με αδενοϊό που εκφράζει EMX2 (Ad-EMX2) σε σύγκριση με ένα άδειο φορέα ελέγχου (Ad-Ctrl) (Ρ & lt? 0.001, Εικόνα 4Α), ενώ η αύξηση των κυττάρων ΑΖ521 δεν επηρεάστηκε (Ρ & gt? 0,05, Σχήμα 4Α). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν επίσης με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (Σχήμα 4Β). Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν τη λειτουργία αντι-πολλαπλασιασμό των EMX2 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

δοκιμασίας (Α) MTS. (Β) Ποσοτικοποίηση της δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας (**:

P & lt? 0,01

, ***:

P & lt? 0.001

). ad-ctrl και ad-Ε2 αντιπροσωπεύουν το άδειο αδενοϊικού φορέα ελέγχου και το αδενοϊικού φορέα που περιέχει EMX2 cDNA, αντίστοιχα.

Η

TCF /LEF ανάλυση δραστηριότητας δημοσιογράφος (Α), και κηλίδα Western του EMX2, του κυτταροπλάσματος β κατενίνης και κανονική Wnt γονίδια στόχους οδός (Β) σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου που έχουν μολυνθεί με ad-ctrl ή ad-Ε2. (C) Επίδραση της καταστολής του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από ad-EMX2 μετά από ένα σταθεροποιημένο επιμόλυνση β-κατενίνης. 0,5 μg μεταλλαγμένο CTNNB1 (S45Y) cDNA ή ένα κενό φορέα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε σε κάθε επιμόλυνση. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε την ημέρα 5 μετά την επιμόλυνση και τη μόλυνση. Δυτική ήταν να επιβεβαιωθεί η έκφραση της μεταλλαγμένης β-κατενίνης (*:

P & lt? 0,05

, **:

P & lt? 0,01,

***:

P & lt? 0.001

)

Η

καταστολή της Wnt μονοπάτι σηματοδότησης από αδενοϊό-παραδοθεί EMX2

Η λειτουργία της EMX2 έχει συνδεθεί με Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι.? Ως εκ τούτου, μελετήσαμε τη σχέση μεταξύ EMX2 και σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του στομάχου. Χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία ρεπόρτερ Topflash /Fopflash για τη μέτρηση της TCF δραστηριότητα /LEF-εξαρτώμενη μεταγραφή ρυθμίζεται από κανονικό μονοπάτι Wnt. Βρήκαμε ότι η δραστηριότητα TCF /LEF-εξαρτώμενη μεταγραφή ανεστάλη σημαντικά με Ad-EMX2 σε κύτταρα AGS και ΜΚΝ28 έλλειψη ενδογενούς έκφρασης EMX2 (Ρ & lt? 0,05), αλλά όχι σε κύτταρα ΑΖ521 εκφράζουν ενδογενή EMX2 (Ρ & gt? 0,05, Σχήμα 5Α). Σταθερά, τα επίπεδα πρωτεΐνης του κυτοσολίου β-κατενίνης και κανονική μονοπάτι Wnt κατάντη στόχοι c-myc και κυκλίνη D1 κατεστάλησαν σε αυτά AGS και τα κύτταρα ΜΚΝ28 μολύνθηκαν με Ad-EMX2, αλλά όχι σε ΑΖ521 κύτταρα (αποκατάσταση της έκφρασης EMX2 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές μετά λοίμωξη ad-EMX2 επιβεβαιώθηκε από τη Δυτική) (Εικόνα 5Β). Να εξετάσει περαιτέρω το ενδιαφέρον των Wnt μονοπάτι προς τα κάτω ρύθμιση και την καταστολή του πολλαπλασιασμού του Ad-EMX2, εμείς επιμολυσμένα και εξέφρασε σταθεροποιηθεί β-κατενίνης (S45Y μετάλλαξη) σε αυτά τα γαστρικά καρκινικά κύτταρα που έχουν μολυνθεί με Ad-EMX2. Παρατηρήσαμε ότι υπερεκφράζουν β-κατενίνης εξασθενημένα σημαντικά την ανάπτυξη καταστολή επίδραση του Ad-EMX2 στις δύο AGS και τα κύτταρα ΜΚΝ28 (Ρ & lt? 0,01), αλλά όχι σε ΑΖ521 κύτταρα (Σχήμα 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του EMX2 στην καταστολή της Wnt οδού σε γαστρικό καρκίνο.

(Α) Το μέγεθος του όγκου και του βάρους του όγκου του γαστρικού μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου (ΜΚΝ28 και AGS) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ad-ctrl ή ad-Ε2. (Β) Εικόνες του Ki-67 χρώση των ΜΚΝ28 όγκοι αντιμετωπίζονται με ad-ctrl ή ad-Ε2 (άνω τμήμα) και ποσοτικοποίηση της χρώσης (κάτω πίνακας). (C) κατά Kaplan-Meier εκτιμήσεις για αθροιστική επιβίωση των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με ad-ctrl ή ad-Ε2 (**:

P & lt? 0,01

). (D) Κηλίδα Western της EMX2, του κυτταροπλάσματος β-κατενίνης και κανονική Wnt γονίδια στόχους οδού στην ΜΚΝ28 και AGS όγκοι αντιμετωπίζονται με ad-ctrl ή ad-Ε2.

Η

Κατάργηση του γαστρικού ανάπτυξη του καρκίνου από αδενοϊό παραδοθεί EMX2 in vivo

Ιδρύσαμε τα μοντέλα ξενομοσχεύματος ΜΚΝ28 και AGS για να εξερευνήσετε το θεραπευτικό δυναμικό της αδενοϊό παραδίδεται EMX2 για καρκίνο του στομάχου

in vivo

. Μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό, τα ποντίκια που φέρουν όγκους τοπική κυμαίνεται από 50 έως 100 mm

2 λάβει άμεση ένεση εντός του όγκου 1 × 10

9 μονάδες σχηματισμού πλάκας του υποδεικνύεται αδενοϊού. Η ανάπτυξη των όγκων σε ποντίκια μολυσμένα Ad-EMX2 ήταν σημαντικά πιο αργή από ότι στην ομάδα ελέγχου (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 6Α άφησε δύο πάνελ). Κατά την ολοκλήρωση της μάζας του όγκου πείραμα σε Ad-EMX2 ποντίκια μολυσμένα επίσης σημαντικά μικρότερη από ότι στην ομάδα ελέγχου (Ρ & lt? 0,05 για ΜΚΝ28 όγκου, Ρ & lt? 0,01 για AGS όγκου, Σχήμα 6Α δεξιό πλαίσιο). Χρώση ένταση μιας πολλαπλασιαστικής δείκτη Κί67 των δειγμάτων όγκου κατά την ολοκλήρωση του πειράματος έδειξε ότι η παράδοση του Ad-EMX2 μείωσε σημαντικά την Ki-67 χρώση (Ρ & lt? 0,01, Σχήμα 6Β), υποδηλώνοντας αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε όγκους. Επιπλέον, η επιβίωση του Ad-EMX2 μολυνθεί ομάδα ήταν σημαντικά καλύτερη από εκείνη της ομάδας ελέγχου (Ρ = 0,014, Σχήμα 6C). Συνεπής με μας

in vitro

ανάλυση, κυτοσολική β-κατενίνης και κανονική μονοπάτι Wnt κατάντη στόχοι c-myc και κυκλίνης D1 ήταν επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε Ad-EMX2 μολυνθεί ΜΚΝ28 και AGS όγκων (αποκατάσταση της έκφρασης EMX2 σε αυτές in vivo όγκους επιβεβαιώθηκε και από τη Δυτική) (Σχήμα 6D). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν θεραπευτικές δυνατότητες του αδενοϊό παραδοθεί EMX2 για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Συζήτηση

γονίδια ομοιοκυτίου έχουν γνωστή για τη σημασία του στην ανάπτυξη για δεκαετίες, ενώ η μελέτη των αυτά τα γονίδια κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης είναι ακόμα στα σπάργανα. έχουν παρεκκλίνουσα γονιδιακή έκφραση ομοιοκυτίου έχουν τεκμηριωθεί σε διάφορους καρκίνους [32], [33], που δείχνει τις αλλαγές των εκφράσεων hemeobox μπορεί να είναι σημαντική για την ογκογένεση. Αυτό μπορεί να παρέχει μια μοριακή βάση για πιθανές κλινικές εφαρμογές. Ωστόσο, εξακολουθούν να χρειάζονται αρκετές θεμελιώδη ζητήματα που πρέπει να αντιμετωπιστούν πλήρως, συμπεριλαμβανομένων των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν την ανώμαλη έκφραση και προς τα κάτω τους στόχους και τα μονοπάτια που προωθούν την ογκογένεση σηματοδότησης. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε πληροφορίες σχετικά με αυτά τα ζητήματα ερευνώντας EMX2 στον ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου.

Η μελέτη μας ανέφεραν σημαντική μείωση και η απώλεια της έκφρασης EMX2 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και πρωτογενείς ιστούς όγκων, και έδειξε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω συσχετίστηκε σημαντικά με υπερ-μεθυλίωση του υποκινητή EMX2, προτείνοντας επιγενετική αποσιώπηση ως ένα σημαντικό μηχανισμό για EMX2 απορρύθμισης σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο. Πράγματι, επιγενετικές τροποποίηση έχει προταθεί ως βασικός μηχανισμός που ευθύνεται για τα γονίδια ομοιοακολουθίας προς τα κάτω ρύθμιση ή αποσιώπηση σε άλλους τύπους καρκίνου ιστό όπου αυτά τα γονίδια λειτουργούν σε καταστολή όγκου [14], [32]. Επιπλέον, η παρατήρηση μας του EMX2 dowregulation σε μη επεμβατικές γαστρική δυσπλασία υποστηρίζει μια πιθανή σημαντικό ρόλο της EMX2 σε παθολογικές εξέλιξης του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου. Ένας περιορισμός της μελέτης μας είναι ο αριθμός των δειγμάτων ιστού που αναλύθηκαν. θα πρέπει να εξεταστούν για να επικυρώσει περαιτέρω το εύρημα της μεθυλίωσης-αποσιώπηση του EMX2 σε γαστρικό καρκίνο Ένας μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων ασθενούς. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα μας παρέχουν μια πρώτη άμεση απόδειξη για τη στήριξη του μηχανισμού αυτού σε καρκίνο του στομάχου και να εντοπίσει EMX2 ως υποθετικό νέο καταστολέας όγκων σε καρκίνο του στομάχου.

Επιπλέον, ερευνήσαμε σημαντικό ογκογόνο μονοπάτια μέσω των οποίων EMX2 λειτούργησε σε γαστρικό καρκίνο , και διαπίστωσε ότι Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο που μεσολαβούν τη λειτουργία EMX2. Εμείς απεικονίζεται σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού ότι η υψηλή έκφραση του εξωγενούς EMX2 σημαντικά κατέστειλε την ανάπτυξη του γαστρικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών που στερούνται έκφρασης ενδογενούς γονιδίου (AGS και ΜΚΝ28 κύτταρα), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές ότι η διαφορά στην έκφραση EMX2 συσχετίζεται αρνητικά με τον πολλαπλασιασμό σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων [ ,,,0],24], [25]. Δείξαμε επίσης ότι μονοπάτι σηματοδότησης Wnt ανεστάλη δραματικά από EMX2

in vivo

και

in vitro

, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη ότι Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι μπορεί να προκαλεί την λειτουργία του EMX2 στον καρκίνο, όπως προτείνεται προηγουμένως [22 ].

Τέλος, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν τη δυνατότητα χρήσης γονιδιακής θεραπείας EMX2 για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. Η μόλυνση των όγκων με Ad-EMX2 κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και το πιο σημαντικό, η βελτίωση της συνολικής επιβίωσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι το σύστημα παροχής που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ήταν ανασυνδυασμένο αδενοϊό ορότυπου 5 (Ad5), το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο φορέα σε διάφορους τύπους γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου [11], [12], [34], [35]. Σε σύγκριση με αδενο-συνδεόμενο ιικό (ΑΑν) και ρετροϊικά συστήματα παράδοσης, αδενοϊικούς φορείς, όπως Ad5, έχουν σαφώς πολλά πλεονεκτήματα. Για παράδειγμα, φορείς αδενοϊού έχουν ευρεία τροπισμός επιτρέπει την αποτελεσματική στόχευση σε πολλούς ιστούς του ενδιαφέροντος, μεγάλη χωρητικότητα ωφέλιμου φορτίου και υψηλής μεταγωγή αποδοτικότητα σε σχέση με το σύστημα AAV [10] και επίσης ένα μη ενσωμάτωση χαρακτηριστικών τα οποία διαφορετικά επάγουν τον κίνδυνο τυχαίας μεταλλαξογένεσης γονιδιώματος [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Επιπλέον, αδενοϊικοί φορείς μπορούν να κατασκευαστούν με τον καρκίνο επιλεκτικό ογκολυτικοί ιοί [39], [40], [41], τα οποία είναι κρίσιμα για την κλινική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου. Ωστόσο, υπάρχουν ακόμη πολλές προκλήσεις από τη χρήση φορέων αδενοϊού για να παραδώσει θεραπείες γονιδίου σε ασθενείς. Για παράδειγμα, μπορούν να χαθούν γρήγορα από τα κύτταρα που διαιρούνται ταχέως μετά τη μόλυνση. Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν την κλινική εφαρμογή του αδενοϊικού διανομής περιλαμβάνουν την ικανότητα συσκευασίας και εύρος ξενιστών αδενοϊικών φορέων, το προφίλ γονιδιακής έκφρασης και της τάσης για την πρόκληση ανοσοαποκρίσεων, ιδιαιτέρως σημαντικό εάν η επαναλαμβανόμενη χορήγηση απαιτείται [42], [43]. Παρ ‘όλα αυτά, μας

in vivo

μελέτη της μόλυνσης Ad-EMX2 υποδηλώνει ότι η γονιδιακή θεραπεία EMX2 μπορεί να έχει δυνατότητα να γίνει ένα κλινικό αντινεοπλασματική θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου του στομάχου στο μέλλον.