Αφηρημένο

Διαφορετικές καρκινικά κύτταρα παρουσιάζουν αλλαγμένη ευαισθησία στην αγωγή με μετφορμίνη. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν αυτά τα ευρήματα μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην πρακτική καλλιέργειας κοινή κύτταρο χρησιμοποιώντας υψηλής γλυκόζης, και όταν μειώνεται η γλυκόζη, η μετφορμίνη γίνεται όλο και περισσότερο κυτταροτοξική σε καρκινικά κύτταρα. Σε συνθήκες χαμηλού γλυκόζης που κυμαίνονται από 0 έως 5 mm, μετφορμίνη ήταν κυτταροτοξική σε καρκίνο του μαστού MCF7 κυτταρικές γραμμές, MDAMB231 και SKBR3, και κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης OVCAR3, και ΡΑ-1. MDAMB231 και SKBR3 είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικά στη μετφορμίνη σε κανονικό μέσο υψηλής γλυκόζης. Όταν η γλυκόζη αυξήθηκε σε 10 mM ή παραπάνω, όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές ανταποκρίνονται λιγότερο στην αγωγή με μετφορμίνη. θεραπεία μετφορμίνη μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του ΑΤΡ στα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσα με χαμηλή γλυκόζη (2,5 mM), υψηλή περιεκτικότητα σε φρουκτόζη (25 mM) ή γαλακτόζη (25 mM). Οι μειώσεις στα επίπεδα του ΑΤΡ δεν παρατηρήθηκαν με υψηλή γλυκόζη (25 mM). Αυτό αντισταθμίστηκε από αυξημένη γλυκόλυση μέσω της ενεργοποίησης της ΑΜΡΚ όταν οξειδωτική φωσφορυλίωση ανεστάλη από τη μετφορμίνη. Ωστόσο, αυξημένη γλυκόλυση ήταν είτε μειωμένη ή να καταργηθούν με την αντικατάσταση 25 mM γλυκόζης με 2,5 mM γλυκόζης, 25 mM φρουκτόζη ή 25 mM γαλακτόζη. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μείωση της γλυκόζης ενισχύει προκαλούμενη μετφορμίνη κυτταρικό θάνατο μέσω της μείωσης της μετφορμίνης τονωθεί γλυκόλυση. Επιπλέον, κάτω από συνθήκες χαμηλής γλυκόζης μετφορμίνη μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και διάφορους στόχους της mTOR, ενώ φωσφο-ΑΜΡΚ δεν επηρεάσθηκε σημαντικά. Έτσι η αναστολή της σηματοδότησης mTOR φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ. Περαιτέρω in vivo μελέτες με τη χρήση του μοντέλου ποντικού καρκίνου του μαστού 4Τ1 επιβεβαίωσαν ότι η αναστολή της μετφορμίνης της ανάπτυξης του όγκου ενισχύθηκε όταν τα επίπεδα γλυκόζης στον ορό μειώθηκαν μέσω δίαιτες χαμηλής περιεκτικότητας σε υδατάνθρακες Κετογενική. Τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο θεραπεία μετφορμίνης των καρκινικών κυττάρων σε μέσο χαμηλής γλυκόζης οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο με τη μείωση της παραγωγής και της αναστολής των οδών σηματοδότησης επιβίωσης ΑΤΡ. Η ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της μετφορμίνης κατά των καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε in vitro και in vivo

Παράθεση:. Zhuang Υ, Chan DK, Haugrud AB, Miskimins WK (2014) μηχανισμοί με τους οποίους Χαμηλή Γλυκόζη Ενισχύει την κυτταροτοξικότητα της μετφορμίνη σε καρκινικά κύτταρα Τόσο

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e108444. doi: 10.1371 /journal.pone.0108444

Επιμέλεια: Viji Shridhar, Mayo Clinic College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 29 Αύγ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhuang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε μέσω KG100497 επιχορήγησης (W.K. Miskimins) από την Susan G. Komen για τη θεραπεία. Seahorse XF24 πειράματα που υποστηρίζονται από το βραβείο COBRE 5P20GM10358 (W.K Miskimins) από το Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Το έργο υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από ένα πιλοτικό βραβείο COBRE (Υ Zhuang) και επιχορήγηση PHS 1R01CA180033-01 (W.K. Miskimins) από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στο μετασχηματισμό με τον καρκίνο, τα κύτταρα υποβάλλονται σε επαναπρογραμματισμό των απλών μεταβολικές λειτουργίες τους για να διευκολυνθεί η ταχεία αύξηση της ζήτησης. Otto Warburg ανέφεραν υψηλά ποσοστά γλυκόλυση στα καρκινικά κύτταρα ακόμη και σε αερόβιες συνθήκες. Αυτή η παράδοξη αλλαγή είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα έχουν προσαρμοστεί για την ταχεία διάδοση. Ως αποτέλεσμα αυτής της αλλαγμένης μεταβολισμού, τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν μεγάλες ποσότητες γλυκόζης και παράγουν μεγάλες ποσότητες γαλακτικού οξέος. Η γλυκόζη μεταβολισμός μέσω γλυκόλυσης συμβάλλει στην σύνθεση ΑΤΡ και παρέχει ενδιάμεσα για άλλες βιοσυνθετικές διαδικασίες. Έτσι, τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται από τα υψηλά ποσοστά της πρόσληψης γλυκόζης και το μεταβολισμό για την επιβίωση [1], [2].

Οι τρέχουσες μέθοδοι

in vitro

καρκινικό κύτταρο πολιτισμού συνήθως χρησιμοποιούν υψηλής γλυκόζης, 25 mM (450 mg /dL), στο μέσο ανάπτυξης. Ενώ η υψηλή μέσο γλυκόζης δημιουργεί ένα βέλτιστο περιβάλλον για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, αυτά τα επίπεδα γλυκόζης μπορεί να περιπλέξει την ερμηνεία των μελετών αποτελεσματικότητας του φαρμάκου. Υψηλή γλυκόζη είναι το μόνο την ικανότητα να ενεργοποιούν οδούς πολλαπλασιασμό σε ένα κύτταρο καρκίνου του [2], και η συνεχής διαθεσιμότητα γλυκόζης τοποθετεί λίγο από την κανονική εμπειρία καρκίνου του στρες των κυττάρων

in vivo

. Σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, Σίνετ-Smith

et al

. [3] διαπιστώθηκε ότι οι δράσεις της μετφορμίνης για την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ ενισχύθηκαν με τη χρήση 5 mM γλυκόζη μέσο σε καλλιεργημένα κύτταρα.

Κανονικό γλυκόζης ορού συνήθως διατηρείται μεταξύ 4 και 6 mM (περίπου 72 έως 108 mg /dL). Σε περιπτώσεις χαμηλών διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών, τα επίπεδα της γλυκόζης του ορού μπορεί να πέσει σε 2.5 mM (45 mg /dL), με τα επίπεδα ιστού της γλυκόζης συνήθως χαμηλότερη. Μείωση της διαθεσιμότητας της γλυκόζης έχει επίσης επιχειρηθεί ως θεραπεία του καρκίνου με μία ποικιλία μεθόδων. Τροποποίηση της διατροφής από τον άμεσο περιορισμό θερμίδων ή η νηστεία έχει ερευνηθεί ως μέθοδος μείωσης της ανάπτυξης του καρκίνου με μερικά ελπιδοφόρα αποτελέσματα [4] – [6]. Γενικά, η νηστεία φαίνεται να είναι πιο αποτελεσματική από την σταθερή περιορισμός της θερμιδικής στη μείωση του καρκίνου ανάπτυξης [5]. Εκτός τροποποίηση δίαιτα, αντιδιαβητικά φάρμακα είναι ένα άλλο μέσο μείωσης της γλυκόζης του πλάσματος. Σε μια κλινική μελέτη που συνέκρινε την αποτελεσματικότητα της μετφορμίνης προς υφιστάμενα φάρμακα διαβήτη τύπου II, η μετφορμίνη βρέθηκε σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις γλυκόζης στο πλάσμα κατά περίπου 3 mm (55 mg /dL) από τα επίπεδα προθεραπείας [7]. Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι η μετφορμίνη δεν έχουν σημαντικές επιπτώσεις στη μείωση της γλυκόζης του πλάσματος σε μη διαβητικούς [8].

Πρόσφατα η μετφορμίνη έχει αποκτήσει ανανεωμένο ενδιαφέρον ως εν δυνάμει θεραπευτικό του καρκίνου και τη χημειοθεραπεία ανοσοενισχυτικό. δυναμικό αντικαρκινική δράση μετφορμίνη είχε εμπλακεί με την χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου σε διαβητικούς τύπου II έναντι άλλων φαρμάκων έλεγχο της γλυκόζης [9]. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν αρχικά αποδοθεί σε συστημικές ιδιότητες της γλυκόζης και της ρύθμισης της ινσουλίνης μετφορμίνη της. Αργότερα μετφορμίνη βρέθηκε επίσης ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου σε κυτταρικό επίπεδο. Το αντι-ογκογόνο δράση για τη μετφορμίνη είναι πιθανόν ένας συνδυασμός συστημικές επιδράσεις ελέγχου ινσουλίνη και άμεσες κυτταρικές επιδράσεις. Πολλές ομάδες έχουν δείξει δράση της μετφορμίνης είναι

in vitro

σε μια ποικιλία τύπων καρκίνου [10] – [14]. Ωστόσο, για να μιμούνται τα αποτελέσματα της μετφορμίνης

in vitro

που παρατηρούνται

in vivo

, υψηλές συγκεντρώσεις, συνήθως 5-20 mM, της μετφορμίνης είναι απαραίτητες. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν αυτά τα ευρήματα μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην πρακτική καλλιέργειας κοινή κύτταρο χρησιμοποιώντας υψηλής γλυκόζης, και όταν μειώνεται η γλυκόζη, η μετφορμίνη γίνεται όλο και περισσότερο κυτταροτοξική σε καρκινικά κύτταρα [15], [16]. Επιπροσθέτως, η πηγή άνθρακα για τα καρκινικά κύτταρα βρέθηκε να μεταβάλλει σημαντικά αντικαρκινικές επιδράσεις της μετφορμίνης κατά τη σύγκριση της γλυκόζης σε γλουταμίνη [17]. Σε αυτή τη μελέτη καρκινικά κύτταρα εκτίθενται σε υψηλές γλουταμίνη σε απουσία γλυκόζης ήταν πολύ πιο ευαίσθητα στην αναστολή από τη μετφορμίνη.

Ενώ ο ακριβής μηχανισμός για την κυτταροτοξικότητα του καρκίνου μετφορμίνη παραμένει άγνωστος, συστημικές δράσεις της μετφορμίνης είναι πιθανό συνδυάζονται με την άμεση κυτταρική δράση για την ενίσχυση της επίδρασή της στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και καρκινικών κυττάρων θάνατο. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η χαμηλή σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης, σε αντίθεση με συνθήκες υψηλής γλυκόζης, ενισχύουν τη δράση της μετφορμίνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και του μαστού. Οι πιθανοί μηχανισμοί για τη δραστηριότητα αυτή διερευνώνται. Οι παρατηρήσεις αυτές μπορεί να αποκαλύψουν τόσο πιο σχετικές τεχνικές καλλιέργειας κυττάρων για τη μελέτη της μετφορμίνης σε καρκίνο, καθώς παρέχουν πληροφορίες για κλινική χρήση μετφορμίνης ως θεραπεία του καρκίνου ανοσοενισχυτικό.

Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Οι παρακάτω χημικές ουσίες χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: μετφορμίνη (1, 1-dimethylbiguanide,), D – (-) – φρουκτόζη, D – (+) – γαλακτόζη, 2-δεοξυ-D-γλυκόζη, ολιγομυκίνης (Sigma Chemical co). Του Dulbecco τροποποιημένου Eagle που Medium (DMEM) με υψηλή γλυκόζη (Hyclone), Gibco DMEM χωρίς γλυκόζη (Technology Life), SYTOX Πράσινη Nucleic Acid Stain (Invitrogen), και κιτ δοκιμασίας ΑΤΡ (Invitrogen).

Κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές MCF7, MDAMB231, OVCAR3, ΡΑ-1, SKRB3, και τα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του μαστού ΜΟΡ10Α ήταν όλα αγοράστηκαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου με ποικίλα επίπεδα γλυκόζης και 1% πενικιλίνη στρεπτομυκίνη στους 37 ° C κάτω από μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Όλες οι κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν εντός πέρασμα δέκα μετά την παραλαβή από την ATCC να εξασφαλίσει τον έλεγχο ταυτότητας κυτταρική γραμμή.

ποσοτικού προσδιορισμού κυτταρικού θανάτου με τη χρήση Sytox Πράσινη Nucleic Acid Stain

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με η ενδεικνυόμενη θεραπεία για μία ή δύο ημέρες. Sytox Πράσινη λεκέ νουκλεϊκού οξέος (10 μΜ) προστέθηκε άμεσα σε κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 10 λεπτά. Η πλάκα διαβάστηκε στα διέγερσης /εκπομπής των 485 nm και 530 nm, αντίστοιχα, με αποκοπή 515 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού (SpectraMax M5 Multi-Λειτουργία Microplate Reader, Molecular Devices, LLC). Ο φθορισμός μετρήθηκε για να ληφθεί αριθμός των νεκρών κυττάρων. Στη συνέχεια, για να προσδιοριστεί συνολικό αριθμό κυττάρων, 0,4% Triton-Χ100 προστέθηκε σε κάθε δείγμα και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να καταστούν διαπερατά όλα τα κύτταρα, και φθορισμού στα 485/530 nm μετρήθηκε ξανά για να ληφθεί το συνολικό αριθμό των κυττάρων .

δοκιμασίας ΑΤΡ

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 και ακολούθησε επώαση για 24 ώρες. Η θεραπεία δόθηκε με φρέσκο ​​μέσο για 24 ώρες. Ίσοι αριθμοί κυττάρων λύθηκαν σε κάθε ομάδα θεραπείας και 10 μΙ χρησιμοποιήθηκαν από κάθε δείγμα ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για δοκιμασίες ΑΤΡ (Invitrogen, ΑΤΡ Kit Προσδιορισμός, A22066). Εν συντομία, 100 μΐ προτύπου διαλύματος αντίδρασης μετρήθηκε σε ένα φωτόμετρο για φόντο φωταύγειας. Στη συνέχεια, 10 μΙ του υπερκειμένου λύματος προστέθηκε στο διάλυμα της αντίδρασης και η φωταύγεια μετρήθηκε και πάλι. Ιστορικό φωταύγεια αφαιρέθηκε από φωταύγεια του δείγματος και τα αποτελέσματα χαράσσονται ως φορές μεταβολής από δείγματα ελέγχου.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα σε δίσκους 35 χλστ ξεπλύθηκαν μία φορά με PBS και λύθηκαν με προσθήκη δωδεκυλοθειϊκού νατρίου ( SDS) ρυθμιστικού δείγματος [2,5 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 2.5% SDS, 100 mM διθειοθρεϊτόλη, 10% γλυκερίνη, 0,025% πυρονίνης Y]. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε ομάδα αγωγής διαχωρίστηκαν σε 10% ή 15% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon Ρ (Millipore) με χρήση συσκευής Trans-blot ημίξηρων Bio-Rad με ρυθμιστικό μεταφοράς 48 mM Tris-HCl και 39 mM γλυκίνη. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα ή 5% BSA σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris [10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl] που περιέχει 0.1% Tween-20 (ΤΒδ-Τ) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με το κατάλληλο αντίσωμα σε ΤΒδ-Τ που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα ή 5% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από έκπλυση σε TBS-T, η μεμβράνη επωάστηκε με το κατάλληλο υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας σήμα υπέρ West Pico (Pierce Biochemical). Αντι-β-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα (A5441, χρησιμοποιούνται σε 1:10,000) αγοράστηκε από την Sigma. Αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ σε θρεονίνη 473 (# 05-669 χρησιμοποιούνται σε 1:1000) αγοράστηκε από την Upstate Biotechnologies. Αντισώματα έναντι ΑΚΤ φωσφορυλιώνεται σε θρεονίνη 308 (# 4056, που χρησιμοποιούνται σε 1:1000), ATK (# 4691, που χρησιμοποιούνται σε 1:1000), φωσφορυλιωμένη S6K (# 9206, που χρησιμοποιούνται σε 1:2000), S6K (# 9202, που χρησιμοποιούνται σε 1:2000), PARP (# 9542, χρησιμοποιήθηκε σε 1:2000), διασπασμένη PARP (# 9541, χρησιμοποιήθηκε σε 1:2000), ΑΜΡΚ φωσφορυλιωμένο στο θρεονίνη 172 (# 2535, χρησιμοποιήθηκε σε 1:1000), και ΑΜΡΚ (# 2532, χρησιμοποιήθηκε σε 1:1000), διασπασμένη κασπάση 7 (# 9491, που χρησιμοποιείται στο 1:1000) αγοράστηκαν από την Cell σηματοδότηση Technology. Δευτερογενής υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη αντι-ποντικού (# 31430, που χρησιμοποιείται στο 1:5000) και αντι-κουνελιού (# 31460, που χρησιμοποιείται στο 1:5000) αντισωμάτων IgG αγοράσθηκαν από την Pierce Biochemical.

Lactate δοκιμασίας

MCF7 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται για 15 ώρες. Μέσο από κάθε κατεργασία συλλέχθηκε και δοκιμάστηκε για γαλακτικό συγκέντρωση χρησιμοποιώντας ένα L-Γαλακτικό Assay Kit (Eton Biosciences Inc.). Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Sytox μέθοδο πράσινη χρώση όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Σχετικά επίπεδα γαλακτικού οξέος ελήφθησαν μετά την ομαλοποίηση με το συνολικό αριθμό των κυττάρων.

Μέτρηση Extra Cellular Η οξίνιση Rate (ECAR) και οξυγόνου Κατανάλωση (OCR)

ECAR και OCR μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή Seahorse XF24 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Seahorse Bioscience). Εν συντομία, τα κύτταρα MCF7 απλώθηκαν σε 40000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες XF24 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται την επόμενη μέρα. Πριν από την επεξεργασία με τον αναλυτή Seahorse XF24, τα κύτταρα πλύθηκαν και εξισορροπήθηκαν με ρυθμιστικό μέσο ελεύθερο (D5030, Sigma) στους 37 ° C σε ένα

2-δωρεάν επωαστήρα για μία ώρα CO. Οι αρχικές μετρήσεις της ECAR και OCR ελήφθησαν ακολουθείται από προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων γλυκόζης (2,5 mM ή 25 mM), φρουκτόζη (25 mM) ή γαλακτόζη (25 mM). ECAR και OCR περαιτέρω μετρήθηκαν μετά την ένεση του ολιγομυκίνη και 2-δεοξυγλυκόζη. Ο αριθμός των κυττάρων ελήφθη με θρυψίνη κυττάρων και μέτρηση χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. ECAR και OCR χαράχθηκαν μετά την ομαλοποίηση με το συνολικό αριθμό των κυττάρων

In vivo

μελέτες ποντίκι

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε συμφωνία με τις θεσμικές και τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές και κανονισμούς.? το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την θεσμική επιτροπή φροντίδα των ζώων και τη χρήση της Sanford Έρευνας. Εν συντομία, χρησιμοποιώντας μια βελόνα 25-gauge, ποντικούς Balb /C εγχύθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

5 κυττάρων στο πλευρό (10 ποντίκια ανά κατάσταση θεραπείας). Τέσσερις ημέρες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων, τα ποντίκια είχαν αλλάξει σε περιορισμένες θερμίδες χαμηλής περιεκτικότητας σε υδατάνθρακες δίαιτα (BIOSERV P3666) για την ομάδα KD (βλέπε παρακάτω για λεπτομέρειες σχετικά με δίαιτες). Οι ομάδες ελέγχου παρέμειναν στην κανονική τροφή ποντικών (Teklad Παγκόσμια 18% πρωτεΐνη τρωκτικών Διατροφή) και τράφηκαν όπως κατά βούληση. Μετφορμίνη (2 mg /ποντικό) χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς καθημερινά ξεκινώντας 7 ημέρες μετά την ένεση του όγκου. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας A

2 × Β όπου το Α είναι η μεγαλύτερη διάμετρος και το Β είναι η μικρότερη διάμετρο. Τα ζώα θανατώθηκαν όταν το μέγεθος του όγκου ήταν μεγαλύτερη από 15 mm σε μεγαλύτερη διάσταση, ή οι όγκοι του όγκου φθάσει 3000 χιλιοστά

3, ή όταν το ζώο ήταν αισθητά αδυνατισμένος.

Ορός μέτρηση της γλυκόζης

επίπεδα γλυκόζης ορού μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας φλέβα της ουράς του αίματος μετά την διάτρηση του ουρά με βελόνα 25 gauge για να παράγει μία σταγόνα αίματος για κάθε δοκιμή. Η γλυκόζη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Bayer Contour Glucometer και ταινίες μέτρησης γλυκόζης.

Πληροφορίες Διατροφή

Η χαμηλή σε υδατάνθρακες δίαιτα αγοράστηκε από BIOSERV (# F3666). Αυτή η δίαιτα παρέχει θερμίδες από πρωτεΐνη, λίπος και υδατάνθρακες σε περίπου 4,6%, 93,4%, και 2%, αντίστοιχα. Όλοι οι ποντικοί που τροφοδοτείται αυτή η δίαιτα υποβλήθηκαν σε 30% περιορισμό των θερμίδων (7 kcal /ημέρα /ποντίκι) από την έναρξη της 4

ης ημέρας μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Περιορισμός θερμίδων προσδιορίστηκε με μέτρηση του βάρους των τροφίμων που καταναλώνονται κάθε μέρα. Η κατάλληλη ποσότητα του δίαιτα παρασχέθηκε κάθε μέρα σε ένα τρυβλίο Petri μέσα στο κλουβί. Θερμίδες αυξήθηκαν σε 7,5 kcal /ημέρα /ποντικό (25% περιορισμός) την ημέρα 7 μετά την έναρξη της δίαιτα για την πρόληψη της απώλειας βάρους. Θερμίδες αυξήθηκαν περαιτέρω σε 8 kcal /ημέρα /ποντικό την ημέρα 11 μετά την έναρξη της δίαιτα και διατηρείται σε αυτό το επίπεδο μέχρι το τέλος του πειράματος. Οι ομάδες δίαιτα ελέγχου σιτίστηκαν κατά βούληση με τυπική τροφή ποντικού (Teklad Παγκόσμια 18% πρωτεΐνες διατροφή τρωκτικών) το οποίο παρέχει θερμίδες από πρωτεΐνη, λίπος και υδατάνθρακες σε περίπου 24%, 18%, και 58%, αντίστοιχα.

Στατιστική ανάλυση

οι ράβδοι σφαλμάτων που παρουσιάζονται είναι τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις. Δίπλευρη κατά ζεύγη Μαθητή

t

δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση δύο ομάδων.

P

τιμές μικρότερες από ή ίσο με 0,05 θεωρήθηκαν ότι έχουν σημασία.

Αποτελέσματα

προηγούμενες έρευνες μας έχει δείξει ότι η μετφορμίνη δεν είναι κυτταροτοξική σε πολλές καρκίνο του μαστού και κυτταρικές γραμμές ωοθηκών . Ωστόσο, ορισμένες κυτταρικές σειρές όπως οι κυτταρικές σειρές του μαστού MDAMB231 και SKBR3 εμφάνισαν αντοχή στην αγωγή με μετφορμίνη κυτταροτοξικότητα [14], [18], [19]. Προηγούμενα πειράματα διεξήχθησαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 25 mM γλυκόζη, η οποία είναι σημαντικά υψηλότερη από κανονικές φυσιολογικές συνθήκες 4-8 mM. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της γλυκόζης επιρροή έχει στην κυτταροτοξικότητα της μετφορμίνης, εξετάσαμε τις επιδράσεις διαφορετικών συγκεντρώσεων της γλυκόζης στο μέσο καλλιέργειας των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε θεραπεία με μετφορμίνη. Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες αρχικά διατηρήθηκαν σε μέσο υψηλής γλυκόζης (25 mM γλυκόζη) και επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων για μία ημέρα, τα επόμενα κύτταρα ημερών υποβλήθηκαν σε αγωγή με μετφορμίνη (0 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM και 16 mM) σε μέσο που περιέχει διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM και 25 mM) για μία ημέρα. Καθώς τα επίπεδα της γλυκόζης στο μέσο μείωσης, θεραπεία με μετφορμίνη αύξησε σημαντικά το ποσοστό των νεκρών κυττάρων σε MDAMB231, MCF7, και κυττάρων SKBR3 (Σχήμα 1Α, 1Β, 1C). Προηγούμενα στοιχεία δείχνουν ότι, σε υψηλό μέσο γλυκόζης, και τα δύο κύτταρα MDAMB231 και SKBR3 είναι ανθεκτική στη θεραπεία με μετφορμίνη (8 mM) για έως και τρεις ημέρες [14], [18], [19]. Σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης Αυτές οι κυτταρικές σειρές, MDAMB231 και SKBR3, συνέχισαν να είναι ανθεκτικά σε θεραπείες μετφορμίνη έως και 16 mM συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Ωστόσο, όταν τα επίπεδα της γλυκόζης μειώθηκαν σε 2,5 mm ή μικρότερη τόσο MDAMB231 και SKBR3 δείχνουν μία κυτταροτοξική ανταπόκριση στη θεραπεία με μετφορμίνη από 4 mm έως 16 mm.

Όλα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης (0, 2 , 4, 8, 16 mM) σε μέσο που περιέχει διάφορα επίπεδα της γλυκόζης (0, 2,5, 5, 10, 15, 25 mM) για μία ημέρα. Ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Sytox πράσινη χρώση. Η μετφορμίνη αύξησε σημαντικά το ποσοστό των νεκρών κυττάρων με μειούμενη συγκέντρωση γλυκόζης στο (Α) MDAMB231 κύτταρα, (Β) κύτταρα MCF7, και (Γ) Κύτταρα SKBR3 αλλά όχι σε (D) κύτταρα ΜΟΡ10Α. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.

Η

Παράλληλα, εξετάστηκαν οι επιδράσεις της μετφορμίνης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της γλυκόζης στο μη-ανθρώπινο καρκίνο του μαστού επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ΜΟΡ10Α (Σχήμα 1 D). Σε αντίθεση με τις καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων, μείωση της συγκέντρωσης γλυκόζης δεν ευαισθητοποιεί σημαντικά ΜΟΡ10Α στην αγωγή με μετφορμίνη διάρκεια αυτής της περιόδου. Αυτή η διαφορά μπορεί να είναι αποτέλεσμα της υποκείμενης διαφορές στο μεταβολισμό της γλυκόζης μεταξύ φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων μαστού και καρκινικά κύτταρα.

Για να δοκιμαστεί εάν αυτά τα αποτελέσματα με μετφορμίνη κυτταροτοξικότητα εφαρμοστεί σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων, εξετάσαμε επίσης τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών . Κατά παρόμοιο τρόπο, η μείωση του γλυκόζη βρέθηκε να αυξάνει την κυτταροτοξικότητα της μετφορμίνης στις κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης OVCAR3 και ΡΑ-1 (Σχήμα 2). Αυτό υποδηλώνει ότι η μείωση της ροής γλυκόζης σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της μετφορμίνης, και ότι αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να είναι σε γενικές γραμμές σχετικές με διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων.

A. Μετά από 48 θεραπείες ώρες με μετφορμίνη (5 mM, +) ή το όχημα μάρτυρα (H

2O, -), τα ζώντα αριθμός των κυττάρων OVCAR3 προσδιορίστηκε μετρώντας trypan blue αρνητικά κύτταρα και τα νεκρά αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με καταμέτρηση trypan blue θετικά κύτταρα. Β κυτταρικό θάνατο ΡΑ-1 προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στις εικόνες αντίθεσης Α Φάση (40χ) των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν με (κατώτερο εικόνα) ή χωρίς (άνω εικόνα) θεραπεία με μετφορμίνη. ιστογράμματα αντιπροσώπευαν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Όλες οι ομάδες έλαβαν μετφορμίνη σε μέσο που περιέχει χαμηλά επίπεδα γλυκόζης (1 mM) ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις ομάδες ελέγχου τους. * Δηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων.

Η

Άλλες γνωστές κυτταρικές δράσεις της μετφορμίνης περιλαμβάνουν αναστολή συμπλόκου Ι της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και οξειδωτική φωσφορυλίωση [20]. Η δράση αυτή μπορεί να οδηγήσει σε αποθανόντος παραγωγή ΑΤΡ και άλλων κυτταρικών ενδιαμέσων. Τα κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ του MCF7, MDAMB231, και ΡΑ-1 εξετάστηκαν μετά από θεραπεία με μετφορμίνη (24 ώρες) σε είτε υψηλή γλυκόζη (25 mM) ή χαμηλής γλυκόζης (2,5 mM) μέσου καλλιέργειας ιστού (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετφορμίνη μειώνει δραστικά τα επίπεδα ΑΤΡ μόνο σε μέσο χαμηλής γλυκόζης. Σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης, σε αυτό το χρονικό σημείο, η μετφορμίνη είχε την τάση να αυξήσει την ΑΤΡ, αλλά όχι σε ένα επίπεδο σημαντικότητας.

MDAMB231 (Α) και (Β) κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (8 mM) είτε 25 mM γλυκόζη ή 2.5 mM γλυκόζης για μία ημέρα και τα επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν και διπλώνουν αλλαγή του ΑΤΡ σε σύγκριση με τον έλεγχο παραστάθηκε γραφικά. Μετρήσεις Γ ΑΤΡ στα κύτταρα ΡΑ-1 μετά από 12 ώρες με ή χωρίς μετφορμίνη. Αυτή χρονικό σημείο επιλέχθηκε λόγω του γρήγορου ρυθμού του ΡΑ-1 ανάπτυξη κάτω από συνθήκες καλλιέργειας ελέγχου. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Όλες οι ομάδες έλαβαν μετφορμίνη σε μέσο που περιέχει χαμηλά επίπεδα γλυκόζης (2,5 mM) ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις ομάδες ελέγχου τους. * Δηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων.

Η

Σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης, τα κύτταρα έλαβαν μετφορμίνη πιθανώς να διατηρήσει τα επίπεδα ATP με την ενεργοποίηση της AMPK και ενισχύοντας τη γλυκόλυση [21], [22]. Για να δοκιμάσετε αυτό, τα κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μετφορμίνη (8 mM) για 15 ώρες, κυτταρική κατανάλωση οξυγόνου (OCR) και εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR) μετρήθηκαν με τη χρήση του ιππόκαμπος αναλυτή XF24. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μετφορμίνη αναστέλλει σημαντικά την κατανάλωση οξυγόνου των κυττάρων MCF7 σε μέσο που περιέχει είτε 25 mM ή 2,5 mM γλυκόζης (Σχήμα 4Α). Ενισχυμένη γλυκόλυση σε κύτταρα κατεργασμένα μετφορμίνη σε μέσο που περιέχει 25 mM γλυκόζη επιβεβαιώθηκε με την αύξηση της οξύτητας του εξωκυτταρικό μέσο (Σχήμα 4Β) και γαλακτικού έκκριση (Σχήμα 4C). Ωστόσο, σε συνθήκες χαμηλού καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζονται γλυκόζης παρουσίασαν μειωμένη αύξηση του ECAR και παραγωγής γαλακτικού οξέος από τη μετφορμίνη, υποδεικνύοντας μια μειωμένη ικανότητα να προωθηθεί η αύξηση γλυκόλυση (Σχήμα 4Β, 4Γ). Έτσι, η αποτυχία να προωθήσει επαρκώς γλυκόλυση συσχετίζεται με μια ανικανότητα να διατηρήσει ενδοκυτταρικό ΑΤΡ υπό αυτές τις συνθήκες.

Α. κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (8 mM) επί 15 ώρες είτε 25 mM ή 2,5 mM γλυκόζη μέσων που περιέχουν. ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το όργανο FX24 για μεταβολική ανάλυση ροής. ομάδες που έλαβαν μετφορμίνη ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις ομάδες ελέγχου τους. κύτταρα Β MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (8 mM) για 15 ώρες. Εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το όργανο FX24 για μεταβολική ανάλυση ροής. ομάδες που έλαβαν μετφορμίνη ήταν σημαντικά διαφορετικές η μία από την άλλη και ομάδες ελέγχου τους. κύτταρα C. MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (8 mM) για 15 ώρες, και μέσον επίπεδα γαλακτικού μετρήθηκαν ως δείκτης της γλυκολυτικής ροής. ομάδες που έλαβαν μετφορμίνη ήταν σημαντικά διαφορετικές η μία από την άλλη. Δ Εκχυλίσματα MCF7 και MDAMB231 κύτταρα που συλλέγονται μίας ημέρας θεραπεία με μετφορμίνη είτε 25 ή 2.5 mM γλυκόζης χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western ανίχνευση φωσφορυλιωμένης ΑΜΡΚ και συνολική ΑΜΡΚ. β-ακτίνης ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Πυκνομετρία ρ-ΑΜΡΚ /ΑΜΡΚ ή ​​ρ-ΑΜΡΚ /Actin για κύτταρα MCF7 παρουσιάζεται ως ραβδόγραμμα. Διασπασμένη capsase 7 στα κύτταρα MCF7 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση western. β-ακτίνης ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Κύτταρα Ε MCF7 σε υψηλής γλυκόζης υποβλήθηκαν σε αγωγή με μετφορμίνη (8 mM) και η ένωση C (10 μΜ) όπως υποδεικνύεται για 15 ώρες. DMSO είναι ο έλεγχος του οχήματος για την ένωση Γ ECAR προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Β μετφορμίνη αγωγή ομάδες ήταν σημαντικά διαφορετικές η μία από την άλλη. κύτταρα F. MCF7 σε υψηλής γλυκόζης υποβλήθηκαν σε αγωγή με μετφορμίνη (8 mM) και η ένωση C (10 μΜ) όπως υποδεικνύεται για 15 ώρες. Μεσαία επίπεδα γαλακτικού προσδιορίστηκαν όπως στις υπό θεραπεία ομάδες C. Η μετφορμίνη ήταν σημαντικά διαφορετικό από κάθε άλλο. Όλα τα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μέσες ± τυπική απόκλιση. * Δηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων

Η

AMPK είναι γνωστό ότι ρυθμίζει γλυκόλυση με την ενίσχυση της πρόσληψης γλυκόζης και τη ρύθμιση των διαφόρων βασικών ενζύμων στην οδό [21] – [25].. προηγούμενα δεδομένα μας έδειξαν ότι η μετφορμίνη μπορεί να ενεργοποιήσει ΑΜΡΚ ενισχύοντας την φωσφορυλίωση της ΑΜΡΚ στη θρεονίνη 172 σε μέσο που περιέχει 25 mM γλυκόζη [14]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκαν τα επίπεδα της ενεργοποίησης ΑΜΡΚ με τη θεραπεία με μετφορμίνη σε τόσο υψηλά επίπεδα γλυκόζης και χαμηλής γλυκόζης. MCF7 και MDAMB231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (8 mM) για μία ημέρα σε είτε 25 mM ή περιέχει μέσο 2,5 mM γλυκόζης. Κηλίδωση Western Διεξήχθη για την ανίχνευση φωσφορυλιωμένης ΑΜΡΚ και συνολική ΑΜΡΚ. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές μετφορμίνη ενισχυμένη των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης του ΑΜΡΚ, την ενεργό μορφή του ενζύμου, σε μέσο που περιέχει 25 mM γλυκόζη, αλλά όχι σε μέσο που περιέχει 2,5 mM γλυκόζη μετά από μία θεραπεία ημέρα (Εικόνα 4D). Αντίθετα, ενώ η χαμηλή γλυκόζη, η ίδια, αυξημένη φωσφορυλίωση του ΑΜΡΚ, η προσθήκη της μετφορμίνης σε αυτές τις συνθήκες εμφανίστηκαν να μειώνεται τόσο φωσφο-ΑΜΡΚ και ολικά επίπεδα του ενζύμου. Αυτό αποδεικνύεται περαιτέρω από densitometery των Western blots των κυττάρων MCF7 για την ποσοτικοποίηση της αναλογίας του φωσφορυλιωμένου AMPK προς το σύνολο ΑΜΡΚ και την αναλογία των φωσφορυλιωμένων AMPK να ακτίνης (Σχήμα 4D). Σε μέσο που περιέχει 2.5 mM γλυκόζη, μετφορμίνη ακόμη ενίσχυσε την ενεργοποίηση της AMPK σύγκριση με τον έλεγχο, αποδεικνύεται από την αυξημένη αναλογία των φωσφορυλιωμένων AMPK προς το σύνολο ΑΜΡΚ. Ωστόσο, λόγω της ισχυρής μείωσης των συνολικών ΑΜΡΚ, συνολικός φωσφορυλιωμένη ΑΜΡΚ μειώθηκε με θεραπεία μετφορμίνης σε σύγκριση με τον έλεγχο. Η μείωση των επιπέδων ΑΜΡΚ με θεραπεία με μετφορμίνη σε μέσο που περιέχει 2,5 mM γλυκόζη σχετίστηκε με σημαντική αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη διασπασμένη κασπάση 7 (Εικόνα 4D κάτω πάνελ). Η διακύμανση των επιπέδων των ενεργών ΑΜΡΚ μεταξύ υψηλής και χαμηλής μέσης γλυκόζης που περιέχει θα μπορούσε να είναι η βασική αιτία της διαφοράς γλυκολυτικού διέγερση μεταβολισμού από αγωγή με μετφορμίνη. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το ρόλο της στην προώθηση της ΑΜΡΚ γλυκόλυση, τα κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ένωση C (10 μΜ), ένας ειδικός αναστολέας της ΑΜΡΚ. Μετά από 15 ώρες σε μέσο που περιέχει 25 mM γλυκόζη, με ή χωρίς μετφορμίνη, ECAR καθώς και γαλακτικό μετρήσεις ελήφθησαν. Η έκταση της αύξησης ECAR και τη συσσώρευση γαλακτικού οξέος με τη θεραπεία με μετφορμίνη ήταν εν μέρει μπλοκαριστεί από ταυτόχρονης θεραπείας με την ένωση C (Σχήμα 4Ε, 4F). Αυτό υποστηρίζει έναν ρόλο για την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ μετφορμίνη επαγόμενη στη διέγερση γλυκόλυση σε μέσο που περιέχει υψηλής γλυκόζης. Επιπλέον, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η αποτυχία να ενεργοποιήσετε ή να διατηρήσουν την ενεργοποίηση AMPK από τη μετφορμίνη σε χαμηλά επίπεδα γλυκόζης στο μέσο που περιέχει οδηγεί σε εξάντληση του ΑΤΡ.

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις ενδοκυτταρικές αλλαγές που συμβαίνουν με τη θεραπεία με μετφορμίνη σε υψηλές και χαμηλές εξετάστηκαν media γλυκόζη, τα επίπεδα της πρωτεΐνης αρκετών κινασών. Τόσο MCF7 και MDAMB231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (8 mM) για μία ημέρα σε μέσο που περιέχει είτε 25 mM ή 2,5 mM γλυκόζης. Κηλίδωση Western Διεξήχθη να δοκιμαστεί φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και στόχων σηματοδότησης mTOR. Η απάντηση σε μετφορμίνη ήταν πολύ σημαντικά μεταβληθεί σε συνθήκες χαμηλού γλυκόζης. Σε συνθήκες χαμηλού γλυκόζη μετφορμίνη βρέθηκε να μειώσει σημαντικά τη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και μειώνουν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των στόχων του mTOR (S6K και 4EBP1), σε σύγκριση με τις συνθήκες υψηλής γλυκόζης (Σχήμα 5Α, 5Β). Δεδομένου ότι αυτά τα μονοπάτια είναι γνωστό ότι προάγουν την επιβίωση των κυττάρων, καθώς και γλυκολυτικά μεταβολισμό, η αναστολή τους με μετφορμίνη μπορεί να συμβάλλει στη μειωμένη γλυκόλυση, επακόλουθη εξάντληση του ΑΤΡ, και τελικά κυτταρικό θάνατο.

MCF7 και MDAMB231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη σε ϋΜΕΜ που περιέχει είτε 25 mM γλυκόζης ή 2.5 mM γλυκόζης για μία ημέρα. Κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των επιπέδων του ρ-ΑΚΤ (Thr308), ρ-ΑΚΤ (Thr473), ολική Akt, ρ-S6K, σύνολο S6K, 4EBP1 (κατώτερο ζώνες αντιπροσωπεύουν υποφωσφορυλιωμένη και υψηλότερες ζώνες αντιπροσωπεύουν υπερφωσφορυλιωμένη), και β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης.

η

για να διερευνηθεί περαιτέρω το ρόλο της γλυκόζης σε προστατεύοντας τα κύτταρα από τη μετφορμίνη που προκαλείται θάνατος, τα αποτελέσματα της γλυκόζης σε σύγκριση με εκείνες των σχετικών σακχάρων, συμπεριλαμβανομένης της εξόζες φρουκτόζη και γαλακτόζη. Έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι φρουκτόζη και γαλακτόζη δεν συμβάλλουν σημαντικά στην γλυκολυτική μεταβολισμού σε καρκινικά κύτταρα [26], [27]. Επιπλέον, η επεξεργασία των γαλακτόζη μέσω γλυκόλυσης αποτελέσματα σε καμία καθαρή σύνθεση ΑΤΡ. Με βάση αυτές εύρεση προβλέψαμε ότι φρουκτόζη και γαλακτόζη θα ήταν σε θέση να υποστηρίξει την σύνθεση ΑΤΡ παρουσία της μετφορμίνης. Για να ελεγχθεί αυτό, μέσο κυτταρικής καλλιέργειας χωρίς γλυκόζη συμπληρώθηκε με γλυκόζη, φρουκτόζη, ή γαλακτόζη και οι καλλιέργειες πάλι αναλύθηκαν για κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 6Α, 6Β). Μαστού καρκινικές κυτταρικές σειρές MCF7 και MDAMB231 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς μετφορμίνη για 1,5 ημέρες σε DMEM που περιέχει γλυκόζη (0 ή 25 mM), φρουκτόζη (25 mM), γαλακτόζη (25 mM), ή φρουκτόζη συν γαλακτόζη (12.5 mM καθένα). Παρόμοια με τα προηγούμενα αποτελέσματα, η αύξηση της συγκέντρωσης γλυκόζης μειώνεται σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της μετφορμίνης σε τόσο MCF7 και MDAMB231 κύτταρα. Ωστόσο, η φρουκτόζη και γαλακτόζη δεν ήταν αποτελεσματική στην πρόληψη της κυτταροτοξικότητας της μετφορμίνης. επίπεδα ΑΤΡ εξετάστηκαν επίσης σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη σε μέσο που περιέχει τις διάφορες εξόζες. θεραπεία μετφορμίνη οδήγησε σε μειωμένα σημαντικά τα επίπεδα ΑΤΡ σε χαμηλή γλυκόζη, υψηλής περιεκτικότητας σε φρουκτόζη, ή συνθήκες υψηλής γαλακτόζη, αλλά όχι σε υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης (25 mM) συνθήκες. Η μείωση της ΑΤΡ παρά υψηλής φρουκτόζης ή γαλακτόζη μπορεί να εξηγήσει γιατί αυτά τα σάκχαρα είναι σε θέση να διασώσει τα κύτταρα από προκαλούμενη μετφορμίνη κυτταροτοξικότητα.

MCF7 (Α) και MDAMB231 κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη σε ϋΜΕΜ χωρίς γλυκόζη, με 25 mM γλυκόζη, με 25 mM γαλακτόζη, 25 mM φρουκτόζη, ή 12,5 mM φρουκτόζη συν 12.5 mM γαλακτόζη για 1,5 ημέρες. Ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίστηκε με Sytox πράσινη χρώση. θεραπεία ομάδες μετφορμίνη σε 25 mM γαλακτόζη, 25 mM φρουκτόζη και 12.5 mM φρουκτόζη συν 12.5 mM γαλακτόζη ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις ομάδες έλαβαν μετφορμίνη σε 25 mM γλυκόζης. Τα κύτταρα MCF7 (C) και MDAMB231 (D) υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη μέσο με ή χωρίς μετφορμίνη (8 mM) για μία ημέρα και μετρήθηκαν τα επίπεδα ΑΤΡ. θεραπεία ομάδες μετφορμίνη σε 2,5 mM γλυκόζη, 25 mM γαλακτόζη και 25 mM φρουκτόζη ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις ομάδες ελέγχου τους. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον έλεγχο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων.

Η

Για να εξεταστεί περαιτέρω η γλυκόζη ως ειδική πηγή άνθρακα για τη διατήρηση γλυκόλυση και την παραγωγή ΑΤΡ παρουσία της μετφορμίνης, ελέγξαμε την επόμενη τις επιδράσεις του φαρμάκου επί οξειδωτική φωσφορυλίωση και γλυκόλυση με τη μέτρηση της οπτικής αναγνώρισης χαρακτήρων και ECAR σε 25 mM γλυκόζη, 25 mM φρουκτόζης, ή 25 mM γαλακτόζη μέσα ενημέρωσης. Zhou et al.