Αφηρημένο

Ιστορικό

παράγοντα ιστού (TF) αναστολέας οδού (TFPI) υπάρχει σε δύο ισομορφές? TFPIα και TFPIβ. Και οι δύο ισομορφές είναι κυτταρική επιφάνεια συνημμένο κυρίως μέσω γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (GPI) άγκυρες. TFPIα Έχει επίσης προταθεί να δεσμεύουν άλλα μόρια επιφανείας, όπως γλυκοζαμινογλυκάνες (GAG). κυτταρικής επιφάνειας TFPIβ έχει δειχθεί ότι εξασκούν υψηλότερη αντιπηκτική δραστικότητα από TFPIα, προτείνοντας εναλλακτικές λειτουργίες για TFPIα. Περαιτέρω χαρακτηρισμός και η αναζήτηση για τα νέα τους συνεργάτες δεσμευτική TFPI είναι ζωτικής σημασίας να κατανοήσουμε πλήρως τις βιολογικές λειτουργίες που σχετίζονται κυττάρου TFPI.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

πιθανή συσχέτιση του TFPI σε θειική ηπαρίνη (HS) πρωτεογλυκανών στην συνδεκάνιο οικογένεια αξιολογήθηκαν από γκρεμίσουμε μελέτες και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. επιφανείας κυττάρου colocalization αξιολογήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία, και αυτοφυή PAGE ή ανοσοκαταβύθιση ακολουθούμενη από κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί για την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης. Ηπαρινάσης χρησιμοποιήθηκε για να υποβαθμίσει ενζυματικά GAGs HS κυτταρικής επιφάνειας. Η αντιπηκτική δυναμικό αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δραστικότητας του παράγοντα Χα (FXa). Γκρεμίζω συνδεκανίου-3 σε ενδοθηλιακά, – ομαλή muscle- και του μαστού καρκινικά κύτταρα μείωσε τα επίπεδα επιφάνειας TFPI κατά 20-50%, και μια ένωση του TFPIα να syndecan-3 στην επιφάνεια του κυττάρου επιδείχθηκε. Κηλίδωση Western έδειξε ότι TFPIα βρέθηκε σε σύμπλοκο με syndecan-3. Το TFPI συνδέεται προς syndecan-3 δεν αναστέλλει την παραγωγή FXa. Απομάκρυνση του ΕΣ GAGs δεν απελευθερώνουν αντιγόνο TFPI από τα κύτταρα.

Συμπεράσματα

Έχουμε καταδείξει τη σύνδεση μεταξύ TFPIα και syndecan-3 στα αγγειακά κύτταρα και στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία δεν φαίνεται να εξαρτάται στο ΕΣ GAGs. Δεν αντιπηκτική δράση ανιχνεύθηκε για TFPI συνδέονται με syndecan-3, η οποία μπορεί να υποδεικνύει πήξη ανεξάρτητες λειτουργίες για αυτήν σχετίζονται κύτταρο πισίνα TFPI. Αυτό, όμως, απαιτεί περαιτέρω έρευνα

Παράθεση:. Tinholt Μ, Stavik Β, Louch W, Carlson CR, Sletten Μ, Ruf W, et al. (2015) syndecan-3 και ΤΡΡΙ συνεντοπίζονται πάνω στην επιφάνεια ενδοθηλιακών, Smooth Muscle-, και καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (1): e0117404. doi: 10.1371 /journal.pone.0117404

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Aamir Ahmed, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 13 του Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 23 Δεκεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιανουαρίου 2015

Copyright: © 2015 Tinholt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Το έργο χρηματοδοτήθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από την Νοτιοανατολική Νορβηγία Περιφερειακή Αρχή Υγείας, Hamar, Νορβηγία και Α Jahre και HG Andrine Berg Laapersveld, Ολλανδία). Εικόνες αναλύθηκαν και παρουσιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα J εικόνας (έκδοση 1.4.3.67).

Λύσης ρυθμιστικά διαλύματα και τα πειράματα ανοσοκαθίζησης

Sum102 κύτταρα, HCAECs και HCASMCs συλλέχθηκαν σε Triton ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM HEPES , ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% ανάλυση Triton Χ-100, 0,2% απρωτινίνη, 0,6% 100 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο PMSF, και 1,0% αναστολέα της φωσφατάσης κοκτέιλ) για φυσική (μη-αναγωγικό) PAGE και για πειράματα ανοσοκαταβύθισης (αναγωγικές συνθήκες).

2 μg αντι-syndecan-3 ή κανονικό γίδινο IgG (αρνητικός μάρτυρας) προστέθηκε σε κάθε προϊόν λύσης κυττάρου και επωάστηκαν για ανοσοκαθίζηση όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα ανοσοσύμπλοκα συλλέχθηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης Α /Ο και πλένεται τρεις φορές σε ρυθμιστικό λύσης Triton πριν τη ζέση σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS ακολουθούμενη από ανάλυση SDS-PAGE.

PAGE αναλύσεις και ανοσοκηλίδωση

πρωτεΐνη κυτταρικής λύματα, ανοσοκαθιζήματα και ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη TFPI (100 ng) αναλύθηκαν σε προκατασκευασμένα 4-15% Κριτήριο γελών Tris-HCl (# 345-0028, BioRad Laboratories) με (μείωση) ή χωρίς 0,1% SDS (μη-αναγωγικές συνθήκες) σε Tris /γλυκίνης /SDS (25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη, 0.1% SDS, ρΗ 8,3, # 161-0772,) ή Τρις /γλυκίνης ρέον ρυθμιστικό (25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη, ρΗ 8.3, # 161-0771, BioRad Laboratories), αντίστοιχα. Ένας ντόπιος ρυθμιστικό δείγματος (# 161-0738, BioRad Laboratories) χρησιμοποιήθηκε για τη μη-αναγωγικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες PVDF (RPN 303F, GE Healthcare), που είχαν μπλοκαριστεί σε 1% καζεΐνη σε TBST για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα, πλένεται τρεις φορές 10 λεπτά σε TBST και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα χράνου-συζευγμένο με υπεροξειδάση. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ECL Prime (RPN 2232, GE Healthcare). Τα σήματα χημειοφωταύγειας ανιχνεύθηκαν με Las 1000 (Fujifilm, Tokyo, Japan). Ανοσοστυπώματα του ανοσοϊζήματα απογυμνώνεται για 30 λεπτά μεταξύ αντισωμάτων. Για αυτοφυή PAGE, δύο πανομοιότυπες ανοσοστυπώματα έτρεξαν παράλληλα να εξασφαλίζεται συγκεκριμένα σήματα από αντι-TFPIα και αντι-syndecan-3. Στη συνέχεια, οι ανοσοστυπώματα απογυμνώθηκαν για 45 λεπτά (Pierce) και ξαναϊχνηθετούνται να επιβεβαιώσει ότι τα αντισώματα αναγνώρισαν μια σύνθετη πρωτεΐνη ταυτόσημου μεγέθους. ImageJ χρησιμοποιήθηκε για πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των ζωνών πρωτεΐνης σε ανοσοστυπώματα.

TF-Fvlla δραστηριότητα

HCAEC και Sum102 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA κατά syndecan-3 (48 ώρες) σε 12-φρεατίων πλάκες όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε διάλυμα πλύσης (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 4 mM KCl και 11 mM γλυκόζη, ρΗ 7.5) και επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C σε διάλυμα αντίδρασης (ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης με 5 mg /mL BSA και 5 mM ΟαΟ

2, ρΗ 7.5) που περιέχει 10 ηΜ FVIIa και 175 ηΜ FX. Μετά την επώαση, 50 μL μεταφέρθηκαν σε 100 μL διαλύματος διακοπής (50 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, 25 mM EDTA, και 1 mg /mL BSA, ρΗ 7,5) επί πάγου πριν επωάστηκαν με 50 μΐ υποστρώματος FXa (CS-11 ( 22)). Η απορρόφηση στα 405 nm καταγράφηκε στους 37 ° C για 45 λεπτά σε διαστήματα 15 δευτερολέπτων χρησιμοποιώντας ένα Spectra Max Plus 384 αναγνώστη μικροπλακός (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Οι μέγιστες ταχύτητες (V

max) σε mU /min χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της ποσότητας του FXa που δημιουργείται, χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη που λαμβάνεται με γνωστές συγκεντρώσεις του FXa. HCAEC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΜΑ (10 ηΜ, 6 ώρες) πριν από τη δοκιμασία για να επάγει την έκφραση TF. Ένα ~ 600-φορές προς τα πάνω ρύθμιση των επιπέδων mRNA TF επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR.

Στατιστικές μέθοδοι

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.0 (PRISM5) (GraphPad Software Inc, LaJolla , CA). t-tests του Student έγιναν για τη δοκιμή για σημαντικές διαφορές όταν κανονικά κατανεμημένα δεδομένα. Διαφορετικά, χρησιμοποιήθηκε η μη παραμετρική Mann Whitney U test. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης των syndecans στο TFPI-κύτταρα που εκφράζουν

HSPGs έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι συνδέεται TFPI. Στην έρευνα για πιθανούς υποψηφίους δεσμευτικός TFPI, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της syndecans 1-4 προσδιορίστηκαν σε μια επιλογή του TFPI-εκφράζοντα κύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης των syndecans διέφερε σημαντικά μεταξύ των τριών τύπων κυττάρων δοκιμάστηκαν? HCAEC, HCASMC, και Sum102 (Εικ. 1). Οι syndecans εκφράστηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές, και τα επίπεδα έκφρασης συνδεκανίου-3 και 4 έδειξαν το λιγότερο παραλλαγή μεταξύ των κυττάρων.

Sum102, HCAEC, και τα κύτταρα HCASMC αναλύθηκαν για έκφραση mRNA συνδεκανίου 1-4 από qRT-PCR. Η μέθοδος ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σχετική έκφραση (RQ) έναντι του μέσου όρου έκφραση ενδογενούς ελέγχου μεταξύ όλων των κυττάρων, και το όριο ορίστηκε σε Ct = 40 (χωρίς ενίσχυση). Μέσες τιμές + SD (n = 3 βιολογικές ομοιότητες) παρουσιάζονται.

Η

Επίδραση του συνδεκανίου γκρεμίζω στα επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας του TFPI

Για να διερευνήσουν κατά πόσον οι syndecans θα μπορούσε να είναι εν δυνάμει TFPI υποψηφίους δεσμευτική κυτταρική επιφάνεια, εφαρμόστηκε η τεχνολογία siRNA. Μετά παροδική γκρεμίσουμε του syndecans 1-4, τα κύτταρα αφέθηκαν να συνδέονται σε ένα ειδικό αντίσωμα TFPI που ακολουθείται από χρώση με δευτερογενές αντίσωμα RPE-συνδεδεμένο και ανάλυση κυτομετρίας ροής.

Δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στα επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας του TFPI παρατηρήθηκε για οποιονδήποτε από τους τύπους κυττάρων μετά γκρεμίσουμε συνδεκανίου 1, 2 ή 4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση, syndecan-3 γκρεμίζω στα HCAECs, HCASMCs, και τα κύτταρα Sum102 μείωσε τα επίπεδα της κυτταρικής επιφάνειας του TFPI κατά 52 ± 9%, 23 ± 6%, και 39 ± 12% (μέση τιμή ± SD), αντίστοιχα (Εικ. 2). Γκρεμίσουμε αποδόσεις των syndecans σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR και υπολογίζεται ως ποσοστό νοκ-κάτω σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA. Οι γκρεμίσουμε αποδόσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 69 – 97% για συνδεκάνιο 1, 45-85% για συνδεκάνιο 2, 83-95% για συνδεκάνιο-3, και 44 έως 72% για συνδεκάνιο 4 (S1 Εικ.). Επιπλέον, η syndecan-3 γκρεμίζω επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western σε όλους τους τύπους κυττάρων (Εικ. 3Α), και ένα 32 ± 13% (μέσος όρος ± SD) μείωση syndecan-3 επίπεδα αντιγόνου στην επιφάνεια του κυττάρου μετά syndecan-3 knock κάτω αποδείχθηκε με κυτταρομετρία ροής σε HCAEC (Σχ. 3Β).

Cells χτυπηθεί κάτω για syndecan-3 από την τεχνολογία siRNA αναλύθηκαν για τα επίπεδα της κυτταρικής επιφάνειας TFPI με κυτταρομετρία ροής. Το ιστόγραμμα παρουσιάζει διάμεση ένταση φθορισμού που λαμβάνεται μετά από την επισήμανση συγκεκριμένων αντισωμάτων TFPI σε Α) κύτταρα Sum102, Β) κύτταρα HCAEC και C) κύτταρα HCASMC. Syndecan-3 γκρέμισε κύτταρα (siSDC3)? διακεκομμένη γραμμή, αρνητικό siRNA ελέγχου? μαύρη συνεχής γραμμή και άσχετο έλεγχο? γκρι σταθερή γραμμή. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία επιμέρους πειράματα (n≥6 βιολογική παραλληλισμούς) εμφανίζεται για κάθε τύπο κυττάρου.

Η

Α) syndecan-3 επίπεδα αντιγόνου (το 55 kDa μονομερής μορφή) σε κυτταρικά λύματα από HCAECs Sum102 κύτταρα και HCASMCs με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-syndecan-3 και φόρτωσης ελέγχου (ακτίνη). Ένας εκπρόσωπος της μεμβράνης των δύο εμφανίζεται. Syndecan-3 εντάσεις πρωτεϊνική ζώνη (μετά από κανονικοποίηση κατά τον έλεγχο φόρτωσης) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου ενδείκνυνται για κάθε τύπο κυττάρου. Η ανασυνδυασμένη syndecan-3 (rSDC3) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος (~ 110 kDa). Β) κυτταρικής επιφάνειας που σχετίζονται syndecan-3 επίπεδα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα HCAEC. Το ιστόγραμμα παρουσιάζει μέση ένταση φθορισμού που λαμβάνεται μετά από syndecan-3 ειδική επισήμανση αντισωμάτων. Syndecan-3 γκρέμισε κύτταρα (siSDC3)? σκούρο γκρι σκίαση, αρνητικό siRNA ελέγχου? μέσο γκρι σκίαση και άσχετο έλεγχο? ανοιχτό γκρι σκίαση. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από δυο ξεχωριστών πειραμάτων (η = 4 βιολογική παραλληλισμοί) δείχνεται.

Η

Ούτε ηπαρινάσης (S2 Εικ.) Ούτε ηπαρινάση Ι + ΙΙΙ (τα δεδομένα δεν φαίνονται) θεραπεία του Sum102, HCAEC και HCASMC κύτταρα άλλαξε τα επίπεδα αντιγόνου TFPI στα υπερκείμενα των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Επίδραση του TFPI γκρεμίζω στην έκφραση του mRNA syndecan-3

γκρεμίζω συνδεκανίου-3 δεν επηρέασε το mRNA TFPI έκφραση (Εικ. 4Α) ή τα επίπεδα TFPI πρωτεΐνη (Εικ. 4Β). Παρ ‘όλα αυτά, τα πειράματα διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί εάν υπήρχε ένας ρυθμιστικός μηχανισμός μονής κατεύθυνσης. Η έκφραση του mRNA syndecan-3 μειώθηκε κατά μέσο όρο 30% σε τρεις ξεχωριστές ομάδες των κυττάρων Sum102, στην οποία και οι δύο ισομορφές TFPI ήταν σταθερά γκρέμισε (το TFPI γκρεμίζω αποδόσεις ήταν 40-60%, όπως περιγράφεται στο Stavik

et al

. 2011 [6]). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του mRNA syndecan-3 ανιχνεύτηκαν όταν μόνο η ισομορφή TFPIβ χτυπήθηκε κάτω (Εικ. 5) (η TFPIβ γκρεμίζω αποδόσεις ήταν 53% και 64% για shRNA7b και shRNA 9b, αντίστοιχα). Σε HCAEC και HCASMC κύτταρα, μια 48% και 43% μείωση της έκφρασης mRNA συνδεκανίου-3 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα με 88-94% παροδική TFPI (α + β) γκρεμίζω (48 ώρες). Επιπλέον, γκρεμίζω μόνης ισομορφής TFPIα (έκφραση TFPIβ παρέμεινε ανεπηρέαστη) σε κύτταρα Sum102 (72 ώρες) και HCAECs (48 ώρες) είχε ως αποτέλεσμα μια αντίστοιχη 34% και 53% μείωση της έκφρασης συνδεκανίου-3 mRNA. Το TFPI γκρεμίσουμε αποδόσεις όλων των τύπων κυττάρων που χρησιμοποιούνται φαίνονται στο S3 Εικ.

Α) HCAEC, Sum102 και HCASMC κύτταρα με syndecan-3 γκρέμισε αναλύθηκαν για την έκφραση TFPI mRNA από qRT-PCR. Η μέθοδος ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σχετική έκφραση TFPI (RQ) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Neg. Έλεγχος siRNA). Οι μέσες τιμές + SD (n≥6 βιολογική παραλληλισμούς) των τριών επιμέρους πειράματα που παρουσιάζονται. Β) επίπεδα αντιγόνου TFPI μετρήθηκαν με ELISA σε κυτταρικά λύματα από HCAEC, Sum102 και HCASMC μετά syndecan-3 γκρεμίζω. Τα επίπεδα αντιγόνου TFPI σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου που φαίνεται. Οι μέσες τιμές + SD (n≥6 βιολογική παραλληλισμοί) δύο ξεχωριστών πειραμάτων που παρουσιάζονται.

Η

syndecan-3 mRNA έκφραση μετρήθηκε με qRT-PCR σε τρία ανεξάρτητα σταθερών κλώνων με δύο ισομορφές του TFPI (α + β) γκρέμισε (shRNA 4, 6 και 7) και δύο ανεξάρτητους σταθερούς κλώνους μόνο με την ισομορφή TFPIβ γκρέμισε (shRNA7β και 9β). Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν ενάντια ενδογενή έλεγχο και τη σχετική εκφράσεις (RQ) υπολογίστηκαν σε σχέση με τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (pSiRPG). Οι μέσες τιμές + SD (η = 3 βιολογικές ομοιότητες) παρουσιάζονται.

Η

TFPI και syndecan-3 colocalization

Για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν η μειωμένη πρόσδεση της κυτταρικής επιφάνειας TFPI οφειλόταν σε μια άμεσο αποτέλεσμα του syndecan-3 γκρεμίζω, εξετάσαμε αν TFPIα και syndecan-3 colocalized στην επιφάνεια των κυττάρων. Colocalization επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας διπλή χρώση και συνεστιακή μικροσκοπία σε Sum102, HCAEC, και τα κύτταρα HCASMC. Το colocalization δεν ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένη, μάλλον συμπυκνώθηκε για να περιοριστεί θέσεις της κυτταρικής μεμβράνης (Εικ. 6, S4 Σχ. Και S5 Εικ.).

Σταθερή κύτταρα χρωματίστηκαν με διπλό TFPI (πράσινο) και syndecan- 3 (κόκκινο) πρωτογενή αντισώματα και Alexa Fluor δευτερογενή αντισώματα με 488 και 633 μήκη κύματος nm διέγερση, αντίστοιχα, πριν από εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Κίτρινο χρώμα στις εικόνες επικάλυψης αποδεικνύει χωρική επικάλυψη μεταξύ TFPI και syndecan-3. Sum102 κύτταρα (κορυφή), κύτταρα HCAEC (μέση) και τα κύτταρα HCASMC (κάτω). μπαρ κλίμακα 50 μΜ (30 μΜ για μεγεθυσμένη εικόνες). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ξεχωριστά πειράματα παρουσιάζεται για κάθε κυτταρικό τύπο.

Η

Αναγνώριση ενός TFPI-syndecan-3 πρωτείνη συγκρότημα

Αν και η συνεστιακή απεικόνιση πρότεινε ότι TFPIα και syndecan-3 διαμείνει στην ίδια φυσική θέση (Εικ. 6, S4 Σχ. και S5 Σχ.), αυτοφυή PAGE που ακολουθείται από μετέπειτα κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για τη δοκιμή για μια αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο μορίων (Σχ. 7Α). Σε προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από Sum102, HCAEC και κύτταρα HCASMC, δύο συγκροτήματα πρωτεΐνη που μεταναστεύει στα εμφανή μάζες ~ 150 kDa και ~ 180 kDa αναγνωρίστηκαν τόσο από αντι-TFPIα και αντι-syndecan-3 (Σχ. 7Α). Τα δύο συγκροτήματα πιθανότατα προκύπτουν από διαφορετικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως η γλυκοζυλίωση. Ασθενέστερη ζώνες παρατηρήθηκαν για τα κύτταρα HCAEC, αντανακλώντας τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης εφαρμόζονται. Τα σχετικά μεγάλα μεγέθη των παρατηρούμενων συμπλοκών έδειξαν ότι TFPIα (Σχ. 7Β, 45 kDa) ήταν παρών με τη διμερή μορφή του syndecan-3, η οποία έχει ένα κατά προσέγγιση μέγεθος των 110kDa (Σχ. 7C). Οι εκτιμήσεις του μεγέθους θα πρέπει, ωστόσο, να ερμηνευθούν με κάποια προσοχή δεδομένου ότι η μη μείωση χρησιμοποιήθηκαν (μητρική) προϋποθέσεις και, επίσης, επειδή ακριβή διαχωρισμό των συμπλεγμάτων υψηλού μοριακού βάρους με ηλεκτροφόρηση σε γενικές γραμμές είναι δύσκολο.

λύματα πρωτεΐνης απομονώθηκαν από κύτταρα, υποβλήθηκαν σε εγγενή ανάλυση PAGE ή πειράματα ανοσοκαταβύθισης και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Α) αυτοφυή PAGE προϊόντων λύσης από κύτταρα Sum102 (20 μg), HCAECs (12 μg) και HCASMCs (18 μg) ανοσοαποτύπωση με αντι-TFPIα (επάνω) και αντι-syndecan-3 (κάτω) (ένας εκπρόσωπος μεμβράνη από τα τρία είναι φαίνεται), Β) SDS-PAGE του πλήρους μήκους ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης TFPIα ανοσοαποτύπωση με αντι-TFPIα, και C) SDS-PAGE του syndecan-3 λύμα 293Τ ελέγχου ανοσοστυπώθηκαν με αντι syndecan-3. D) HCAEC (40 μg), Ε) SUM102 (160 μg) και στ) HCASMC (40 μg) λύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς syndecan-3 αντισώματα (n = 2 για το SC-30883, n = 1 για SC- 9495) ή τον έλεγχο κατσίκας IgG (n = 2). Τα προϊόντα λύσεως και ανοσοκαταβύθισης αναλύθηκαν για την παρουσία ενδογενούς syndecan-3 και TFPI με ανοσοστύπωση. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη TFPIα (άνω αριστερό πλαίσιο) και προϊόν λύσης κυττάρου (κάτω αριστερό πλαίσιο) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την ανοσοκηλίδωση σε D-F.

Η

Η αλληλεπίδραση TFPI-syndecan-3 αναλύθηκε επίσης με ανοσοκαταβύθιση. Ανοσοκαταβύθιση syndecan-3 από HCAEC λύμα χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς syndecan-3 αντισώματα απεκάλυψε συν-καταβύθιση του TFPI (Σχ. 7D), γεγονός που υποδηλώνει ότι TFPI συνδέονται με syndecan-3. Σε συμφωνία με την ανάλυση αυτοφυή PAGE (Σχ. 7Α), το σύμπλοκο TFPI-syndecan-3 ήταν παρούσα και στις SUM102 (Εικ. 7Ε) και HCASMC λύμα (Εικ. 7F), αν και η καθίζηση TFPI εμφανίστηκε κάπως ασθενέστερη.

διανομής TFPI παρακάτω syndecan-3 γκρεμίζω

για να καθορίσει τη μοίρα του TFPI σε syndecan-3 ανεπάρκεια των κυττάρων, το αντιγόνο TFPI μετρήθηκε με ELISA στο υπερκείμενο των Sum102 και κυττάρων HCAEC μετά γκρεμίσουμε συνδεκανίου -3. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση 20-30% των επιπέδων αντιγόνου TFPI στο υπερκείμενο σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. 8).

επίπεδα αντιγόνου TFPI (σύνολο) μετρήθηκαν με ELISA σε υπερκείμενα από Sum102 (αριστερά) και HCAEC (δεξιά) μετά syndecan-3 γκρεμίζω. Τα σχετικά επίπεδα αντιγόνου TFPI σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που φαίνεται. Μέσες τιμές + SD (n≥9 βιολογική παραλληλισμούς) δύο (HCAEC) και τρεις (Sum102) Οι επιμέρους πειράματα που παρουσιάζονται.

Η

δραστηριότητα TF-Fvlla στην επιφάνεια του syndecan-3 γκρεμίζω κυττάρων

για να διερευνήσουν κατά πόσον TFPI δεσμεύεται να syndecan-3 θα μπορούσε να συλλάβει πηκτική δράση TF, μετρήθηκε η δραστηριότητα TF-Fvlla στην επιφάνεια της Sum102 και κυττάρων HCAEC πριν και μετά την παροδική γκρεμίσουμε συνδεκανίου-3. δραστικότητα TF-Fvlla προσδιορίστηκε έμμεσα με την ποσοτικοποίηση του FXa που δημιουργείται σε μια χρωματομετρική δοκιμασία όπου FVIIa και FX έγιναν εξωγενώς προστέθηκαν σε προσκολλημένα κύτταρα. Καμία αλλαγή στην παραγωγή FXa μετά syndecan-3 γκρεμίζω παρατηρήθηκαν σε οποιοδήποτε από τους δύο τύπους κυττάρων (Εικ. 9). Όπως ήταν αναμενόμενο, ένα ~ 2-φορές αύξηση στην δραστικότητα TF-Fvlla παρατηρήθηκε κατά την προσθήκη του αντι-ΤΡΡΙ προς τη δοκιμασία (θετικός έλεγχος).

Sum102 και HCAEC κύτταρα χτυπηθεί κάτω από syndecan-3 (siSDC3) ήσαν αναλύθηκαν για δραστικότητα κυτταρικής επιφάνειας TF-Fvlla, έμμεσα, η παραγωγή FXa. HCAEC κύτταρα διεγέρθηκαν με 10 ηΜ ΡΜΑ για 6 ώρες πριν από την ανάλυση. Anti-ΤΡΡΙ προστέθηκε ένα πείραμα με κύτταρα HCAEC. Οι μέσες τιμές + SD (n≥8 βιολογική παραλληλισμούς) των τριών ξεχωριστών πειραμάτων παρουσιάζονται.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αποδείξει τη σύνδεση των ενδογενώς εκφράζονται TFPI με το διαμεμβρανικό syndecan-3 HSPG μόριο. Η προσέγγισή μας ήταν να γκρεμίσουμε την έκφραση HSPGs ανήκουν στην συνδεκάνιο οικογένεια, και να αναλύσει τα επίπεδα αντιγόνο επιφανείας TFPI με κυτταρομετρία ροής. Επιλέξαμε ενδοθηλιακών, ομαλή muscle-, και κύτταρα καρκίνου του μαστού με υψηλό ενδογενή έκφραση TFPI για διερεύνηση. Τα επίπεδα έκφρασης συνδεκανίου κυμαινόταν μεταξύ αυτών των τύπων κυττάρων, σύμφωνα με το γεγονός ότι η έκφραση HSPG διαφέρει σε ένα κύτταρο τύπου και αναπτυξιακή ειδικό τρόπο [13, 24]. Μειωμένα επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας του TFPI ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά syndecan-3 γκρεμίζω σε όλους τους τρεις τύπους κυττάρων, υποδεικνύοντας εμπλοκή syndecan-3 σε κυτταρική επιφάνεια συνδέσμου του TFPI. Επιπλέον, η μειωμένη syndecan-3 mRNA έκφραση σε HCAECs και τα κύτταρα Sum102 με TFPIα χτυπηθεί κάτω, και σε Sum 102 κύτταρα με τις δύο ισομορφές TFPI (α + β) χτύπησε κάτω, αλλά δεν TFPIβ μόνη της, υποστηρίζει περαιτέρω τη σχέση μεταξύ syndecan-3 και TFPI, συγκεκριμένα η ισομορφή TFPIα. Είτε αυτό είναι μια άμεση ή έμμεση ρύθμιση παραμένει να διευκρινιστεί.

Προηγουμένως, συνδεκάνιο 4 καθαρίζεται από κύτταρα EA.hy926 έχει δειχθεί ότι δεσμεύουν TFPI σε μία ανίχνευση στερεάς φάσεως [19]. Για το καλύτερο της γνώσης μας, με την παρούσα παρέχουν την πρώτη έκθεση σχετικά με τη σύνδεση TFPI σε συνδεκάνιο μόριο στην επιφάνεια του κυττάρου.