Αφηρημένο

Η έκφραση της φλεγμονώδους G-πρωτεΐνη υποδοχέα CysLT

1Κ έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η συσχέτιση μεταξύ CysLT

1Κ και την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

in vivo

χρησιμοποιώντας CysLT

1Κ ανταγωνιστές (ZM198,615 ή Μοντελουκάστη) και το γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. καθιερώθηκαν δύο αγωγές χορήγησης του φαρμάκου. Το πρώτο σχήμα συστάθηκε για να διερευνήσει τη σημασία της CysLT

1Κ στην έναρξη του όγκου. Γυμνά ποντίκια εμβολιάστηκαν με 50 μΜ CysLT

1Κ ανταγωνιστής προεπεξεργασμένων HCT-116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου και έλαβαν τη συνέχιση της θεραπείας (5 mg /kg /ημέρα, ενδοπεριτοναϊκώς). Η δεύτερη αγωγή με στόχο την αντιμετώπιση του ρόλου της CysLT

1Κ στην πρόοδο του όγκου. Γυμνά ποντίκια εμβολιάστηκαν με μη προεπεξεργασμένων HCT-116 κύτταρα και δεν έλαβαν CysLT

θεραπεία ανταγωνιστής 1Κ μέχρι εγγράψιμο εμφάνιση όγκων. Και τα δύο σχήματα είχαν ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου, που αποδίδεται σε αλλαγές στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, όπως καθορίζεται από τα μειωμένα επίπεδα Ki-67 και αυξημένα επίπεδα της p21

WAF /Cip1 (

P

& lt? 0.01), διασπασμένη κασπάση 3, και ο κασπάσης-διασπασμένο προϊόν της κυτοκερατίνης 18. Μειωμένα επίπεδα του VEGF (

P

& lt? 0,01) και μειωμένο μέγεθος σκάφους (

P

& lt? 0,05) παρατηρήθηκαν επίσης, το τελευταίο μόνο στην ZM198,615-προεπεξεργασίας ομάδα. Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί μια σειρά από

in vitro

μελέτες χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου HCT-116 και CysLT

1Κ ανταγωνιστές. Εκτός από την σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την προσκόλληση και τον σχηματισμό αποικίας, παρατηρήσαμε επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η ικανότητα των Montelukast να αναστέλλει την ανάπτυξη του ανθρώπινου ξενομοσχεύματος καρκίνου του παχέος εντέρου περαιτέρω επικυρωθεί με τη χρήση δύο επιπλέον κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, SW-480 και ΗΤ-29. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CysLT

ανταγωνιστές 1R αναστέλλουν την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου κατά κύριο λόγο από τη μείωση του πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Σαβαρί S, Liu Μ, Zhang Υ, Sime W, Sjolander Α (2013) CysLT

1Κ ανταγωνιστές αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (9): e73466. doi: 10.1371 /journal.pone.0073466

Επιμέλεια: Lishan Su, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 του Νοέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 22 Ιουλ 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπτέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Σαβαρί et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις για AS από το σουηδικό ίδρυμα Cancer (CAN 2009/1185, 10 0478), το σουηδικό Ιατρικό Ερευνητικό Συμβούλιο (Χ-10356), Ίδρυμα Gunnar Nilsson Καρκίνο (www.cancerstiftelsen.com), το Ίδρυμα Osterlund, το Ίδρυμα στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Skåne, και για WS Βασιλικής φυσιογραφικούς Society στο Lund (www.fysiografen.se). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα εικοσανοειδή περιλαμβάνουν μια ευρεία ποικιλία βιοδραστικών μεταβολιτών λιπιδίων που προέρχονται από πολυακόρεστα 20-άνθρακα απαραίτητα λιπαρά οξέα. Το αραχιδονικό οξύ ανήκει στην οικογένεια ωμέγα-6 και είναι ο πρόδρομος των εικοσανοειδών όπως προστανοειδή, λευκοτριένια, υδροξύλιο εικοσατετραενοϊκό οξέα (ΗΕΤΕ), και εποξείδια. Αυτά τα εικοσανοειδή θεωρούνται προ-φλεγμονώδεις? επιδημιολογικές, κλινικές και εργαστηριακές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η παρεκκλίνουσα μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος μέσω της κυκλοοξυγενάσης (COX) και της λιποοξυγενάσης (LOX) οδούς, οι οποίες παράγουν προστανοειδών και λευκοτριενίων, αντίστοιχα, μπορεί να προωθήσει τη χρόνια φλεγμονή και την καρκινογένεση [1], [2 ]. Το ασταθές λευκοτριενίου Α

4 (LTA

4) σχηματίζεται από την 5-LOX στην παρουσία 5-λιποξυγενάσης-πρωτεΐνης ενεργοποίησης (FLAP). LTA

4 περαιτέρω μεταβολίζεται είτε LTB

4 ή τις κυστεϊνυλικά λευκοτριένια, LTC

4, LTD

4, και LTE

4 [3].

Κυστεϊνύλ λευκοτριένια εμπλέκονται στις διαδικασίες των αναπνευστικών οδών, όπως η έκκριση βλέννας, αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα, ηωσινοφίλων χημειοταξία, και βρογχοσυστολή [4], [5], [6], [7]. Τα κυστεϊνυλο λευκοτριένια εμπλέκονται επίσης σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το άσθμα, και φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου (IBD) [8], [9], [10]. Η φλεγμονώδης περιβάλλον έχει γίνει ευρέως αντιληπτό ως ένας από τους επιτρέπουν χαρακτηριστικά του καρκίνου [11]. Κατά συνέπεια, υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ μακροχρόνια IBD, όπως η ελκώδης κολίτιδα και η νόσος του Crohn, στην οποία προ-φλεγμονωδών εικοσανοειδών (δηλαδή, παράγωγα του αραχιδονικού οξέος) είναι άφθονα και του παχέος εντέρου [12], [13]. Καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στον κόσμο και έχει το τέταρτο υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας [14]. Εκτιμάται ότι οι ασθενείς που πάσχουν από ΦΕΠ έχουν μια κατά προσέγγιση 30-φορές αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου [15]. Άλλα εικοσανοειδή προέρχονται από το αραχιδονικό μονοπάτι που εμπλέκονται στον καρκίνο του παχέος εντέρου περιλαμβάνουν τα προστανοειδή. Η προσταγλανδίνη Ε

2 (PGE

2) προέρχεται από αραχιδονικό οξύ μέσω της οδού της COX και είναι η πιο άφθονη και πιο εκτεταμένα μελετηθεί προστανοειδούς στον καρκίνο, ιδιαίτερα τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PGE

2 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει το φορτίο όγκου στο έντερο τόσο του APC

Min /+ και επάγεται αζοξυμεθάνιο ποντικούς [2]. LOX-5 και COX-2, τα ένζυμα που ευθύνονται για την παραγωγή λευκοτριενίων και κυστεϊνύλ PGE

2, αντίστοιχα, έχουν επίσης ενοχοποιηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου. αυξημένη έκφραση τους έχει τεκμηριωθεί σε ασθενείς με ορθοκολικό αδενοκαρκινώματα [16].

κυστεϊνυλίου λευκοτριένια μεσολαβούν επιδράσεις τους μέσω G-πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs) και αναφέρονται ως CysLT

1Κ και CysLT

2R, με βάση την φαρμακολογική χαρακτηρισμό τους και λειτουργικά προφίλ σε απάντηση σε μια σειρά αγωνιστών ή ανταγωνιστών σε διαφορετικά κυτταρικά και ιστών συστήματα [17]. CysLT

1Κ έχει υψηλότερη συγγένεια για LTD

4, το πιο ισχυρό κυστεϊνυλικά λευκοτριενίων, ενώ CysLT

2R έχει μικρότερη αλλά ίση συγγένεια για τόσο LTD

4 και LTC

4 [18] , [19]. ZM198,615 και Montelukast είναι εκλεκτικοί CysLT

ανταγωνιστές 1Κ χρησιμοποιηθεί σε μελέτες των φλεγμονωδών νόσων όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα και το άσθμα [20], [21]. Η τελευταία CysLT

ανταγωνιστής 1Κ χρησιμοποιείται επίσης στην κλινική για τη θεραπεία ασθματικών ασθενών [22].

Η ισορροπία μεταξύ της CysLT

1 και CysLT

2 υποδοχέα φαίνεται να είναι σημαντικό στην αιτιολογία της νόσου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Στην πραγματικότητα, έχουμε δείξει ότι αυτές οι δύο υποδοχείς είναι συν-εντοπισμένα και σχηματίζουν τις δύο ετερο-και ομοδιμερή στην ανθρώπινη εντερική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή Int 407 και ότι LTC

4 διέγερση του CysLT

2R ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση κυτταρικής επιφάνειας της CysLT

1Κ [23]. προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει επίσης ότι LTD

4, μέσω CysLT

1Κ επάγει την προς τα πάνω ρύθμιση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, όπως COX-2, β-κατενίνης, και Bcl-2 στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα [24] . Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι CysLT

1Κ υπερεκφράζεται σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και σχετίζεται με κακή πρόγνωση [16], ενώ η ταυτόχρονη χαμηλή έκφραση του CysLT

1Κ και υψηλή έκφραση του CysLT

2R μεσολαβούν καλή πρόγνωση [25]. Επιπλέον, η προηγούμενη εργασία μας έχει δείξει ότι LTD

4-επαγόμενη CysLT

1Κ σηματοδότηση καταλήγει σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη μετανάστευση [26], [27]. Σε αντίθεση, LTC

4 διέγερση του CysLT

2R έχει δειχθεί ότι επάγει την διαφοροποίηση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, και μειωμένη έκφραση CysLT

2R σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών [28].

στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η λειτουργία της CysLT

1Κ στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας CysLT

1Κ ανταγωνιστές. Τα αποτελέσματα της CysLT

1Κ ανταγωνιστές σε HCT-116 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου παχέος εντέρου μελετήθηκαν τόσο

in vitro

και

in vivo

χρησιμοποιώντας το γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η CysLT

1Κ ανταγωνιστή ZM198,615 (ICI-198615) ήταν ένα δώρο από την AstraZeneca και την CysLT

1Κ ανταγωνιστή Μοντελουκάστη αγοράστηκε από την Cayman Chemicals Co. (Ann Arbor, MI). Κυττάρων αντιδραστήριο πολλαπλασιασμός WST-1 και το μονοκλωνικό ποντικού Μ30 CytoDEATH αντίσωμα (1:10) ήταν από τη Roche (Βασιλεία, Ελβετία). Το κιτ ανίχνευσης αννεξίνης V-ΡΕ απόπτωση από την BD Pharmingen (San Diego, CA). Το Αντιδραστήριο Quick Start ™ Μπράντφορντ Dye, Mini-PROTEAN TGX ™ Τζελ, δευτεροβάθμιας χρένο-συζευγμένα αντισώματα, και αντιδραστήριο ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ήταν από την Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). αντι-ανθρώπινο αντίσωμα διασπάται κασπάσης 3 κουνελιού μονοκλωνικό (1:200) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Το αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Ki67 μονοκλωνικό κουνελιού (1:500) ελήφθη από Thermo Fisher Scientific (Waltham, ΜΑ). PECAM-1 (CD31) αντίσωμα κατσίκας πολυκλωνικό αντι-ποντικού (1:700) και αντι-ανθρώπινο αντίσωμα VEGF πολυκλωνικό κουνελιού (1:200) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ποντίκι μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο p21

WAF1 /Cip1 αντίσωμα (1:1200) ήταν από DakoCytomation (Glostrup, Δανία). Πολυκλωνικός αντι-ανθρώπινο CysLT

1Κ αντίσωμα (1:250) ελήφθη από Innovagen (Lund, Σουηδία). Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης ήταν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Το κιτ Κυστεϊνύλ λευκοτριενίων ΕΠΕ αγοράστηκε από την Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Όλα τα άλλα χημικά ήταν αναλυτικής καθαρότητας και ελήφθησαν από την Chemicon International (Temecula, CA) ή τη Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ).

Cell Culture

HCT-116 κύτταρα ( ATCC

® Νο CCL-247), που προέρχεται από ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος εντέρου, SW-480 (ATCC

® Νο CCL-228) και ΗΤ-29 (ATCC

® Νο ΗΤΒ-38), που προέρχεται από ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA).

HCT-116 και ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α, ενώ SW-480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) 55 μg /ml στρεπτομυκίνη, 55 IU /ml πενικιλλίνη, και 1,5 μg /ml fungizone. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί 5 ημέρες στους 70

–

80

%

συρροή στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με κύτταρα σε περάσματα 5 έως 30, και τα κύτταρα ελέγχονται τακτικά για να διασφαλιστεί η απουσία μόλυνσης από μυκόπλασμα.

ξενομοσχεύματος όγκου Σπουδών

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Περιφερειακό Ηθικής Επιτροπή για την Έρευνα των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Lund, Σουηδία (M205-10). Θηλυκό 6-έως 8-εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια (BalbC ηυ /ηυ) αγοράστηκαν από την Taconic Ευρώπη A /S (Ry, Denmark). Για να προκληθεί υποδόρια ξενομοσχεύματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, 2,5 × 10

6 χαμηλής διόδου HCT-116 κύτταρα σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν σε δύο πλευρές ανά ποντικό (η = 7 ποντικοί /ομάδα). Δύο σχήματα χορήγηση του φαρμάκου καθορίστηκαν για να διερευνήσει την λειτουργική σημασία της CysLT

ανταγωνιστές 1R σε έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Ζώα σε αγωγή σύμφωνα με την πρώτη αγωγή εμβολιάσθηκαν με HCT-116 κύτταρα προκατεργάστηκαν με είτε DMSO (DMSO Ι), 50 μΜ ZM198,615 (Pre-ΖΜ) ή 50 μΜ μοντελουκάστη (Pre-Montelukast), για 30 λεπτά. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με trypan blue δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό και μόνο τα βιώσιμα κύτταρα θεωρήθηκαν για υποδόρια ένεση. Στη συνέχεια, από την ημέρα του εμβολιασμού, τα ποντίκια έλαβαν καθημερινά ε.π. ενέσεις με DMSO ή CysLT

1Κ ανταγωνιστές (5 mg /kg) διαλύονται σε DMSO, αραιωμένο σε PBS για έναν συνολικό όγκο 100 μΙ (Σχήμα 1Α). Σύμφωνα με τη δεύτερη αγωγή, τα ζώα εμβολιάστηκαν με μη προεπεξεργασμένων κυττάρων ΗΟΤ-116. Μόλις ψηλαφητών όγκων καθορίστηκαν 6 ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες και στη συνέχεια αποφάσισε ποια ομάδα θα πρέπει να αντιμετωπίζονται με DMSO (DMSO II), ZM198,615, ή Montelukast. Οι ποντικοί έλαβαν καθημερινά ε.π. ενέσεις DMSO ή το CysLT

1Κ ανταγωνιστές (5 mg /kg) (Εικόνα 1 Ε)

(Α) Πειραματικό πρωτόκολλο για τις ομάδες προεπεξεργασίας.? BalbC (ηυ /ηυ) ποντικούς εγχύθηκαν υποδορίως σε δύο πλευρές με HCT-116 κύτταρα που προκατεργάστηκαν με ZM198,615 ή μοντελουκάστη (50 μΜ), και έλαβαν θεραπεία ενδοπεριτοναϊκά από την ημέρα του εμβολιασμού με DMSO, ΖΜ 198.615, ή μοντελουκάστη (5 mg /kg /ημέρα). (Β) Tumor συχνότητα των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με DMSO (Ι ομάδα DMSO), ZM198,615 (ομάδα Pre-ΖΜ) ή μοντελουκάστη (Pre-Montelukast ομάδα) και (Γ) βάρος όγκου σε σύγκριση με την ομάδα DMSO Ι στο τέλος του το πείραμα (ημέρα 21). (D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες όγκου από την ομάδα προεπεξεργασία. (Ε) Πειραματικό πρωτόκολλο για τη μελέτη της θεραπείας? μη προεπεξεργασμένων HCT-116 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε δύο πλευρά γυμνών ποντικών. DMSO (ομάδα DMSO II), ZM198,615 (ομάδα ZM), ή Μοντελουκάστη (ομάδα Μοντελουκάστη) θεραπεία άρχισε την ημέρα 6 μετά από ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. (F) Οι όγκοι των όγκων κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 21 ημερών και (G) βάρος του όγκου στο τέλος του πειράματος (ημέρα 21). (H) Αντιπροσωπευτικές εικόνες όγκου από την ομάδα αγωγής. Τα ποσοτικά δεδομένα που δείχνονται είναι η μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001. Ο όγκος του όγκου ανάλυση διεξήχθη με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ και βάρος όγκου ανάλυση διεξήχθη με του Student

t

δοκιμή.

Η

Επιπλέον, SW-480 ή ΗΤ-29 κύτταρα, 2,5 × 10

6 χαμηλής διόδου κύτταρα σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν σε δύο πλευρές ανά ποντικό (n = 12 και n = 18 ποντίκια για SW-480 και ΗΤ-29, αντίστοιχα) για να προκληθεί υποδόρια ξενομοσχεύματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου σε θηλυκούς 6 -να 8 εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια (BalbC ηυ /ηυ). Όλα τα ποντίκια είχαν ψηλαφητούς όγκους εγκατεστημένος σε αμφότερες τις πλευρές κατά την ημέρα 7 και χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες για κάθε κυτταρική γραμμή. Πριν από την έναρξη των θεραπειών, ένας ερευνητής μέτρησε τις μεγέθη του όγκου όλων των όγκων για να εξασφαλίσει ότι δεν υπήρχε διαφορά μεγέθους μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Οι ποντικοί στη συνέχεια λάβαμε ημερήσιες ενέσεις ίρ για 14 ημέρες με είτε DMSO ή μοντελουκάστη (5 mg /kg) (= 6 και η = 9 ποντίκια ανά ομάδα αγωγής για SW-480 και ΗΤ-29, αντίστοιχα).

Mouse σωματικού βάρους και του όγκου του μεγέθους καταγράφονταν κάθε τρίτη μέρα. Ο τύπος για τον υπολογισμό του όγκου των όγκων ήταν

V

= π /6 × 1,58 (

μήκος Χ πλάτος

)

3/2 [29]. Μετά από 21 ημέρες, όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν, και οι όγκοι απομακρύνθηκαν, μετρώνται, ζυγίστηκαν, και φωτογραφήθηκαν. ιστοί όγκου σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη για ανάλυση ανοσοϊστοχημείας ή /και καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C για ανάλυση στυπώματος Western.

Η δόση μοντελουκάστης (5 mg /kg) επελέγη με βάση τα δημοσιευμένα στοιχεία, όπου δοσολογίες κυμαινόμενες από 5-10 mg /kg έχουν αναφερθεί σε ένα ευρύ φάσμα των ποντικών πειραματικά μοντέλα [30], [31], [32]. Οι δοσολογίες των 2 mg /kg και 10 mg /kg ερευνήθηκαν επίσης και τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν παρόμοιες τάσεις σε αναστολή ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ανοσοϊστοχημεία

ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές που λαμβάνεται από ξενομόσχευμα όγκοι τομές (5 μm) για ανοσοϊστοχημική χρώση. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Dako αυτόματο slide χρώσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι διαφάνειες φωτογραφήθηκαν με μια Nikon Eclipse 800 μικροσκόπιο και αξιολογήθηκαν με τυφλό τρόπο από δύο παρατηρητές ανεξάρτητα. Ολόκληρο το Ki-67 χρωματισμένο τμήματα σαρώθηκαν με Aperio ScanScope CS (Aperio Technologies, Inc, Vista, CA) και μια περιοχή στην οποία χρώση ήταν ιδιαίτερα διαδεδομένη (δηλαδή, hot spot) εντοπίστηκε σε κάθε όγκου χρησιμοποιώντας ένα πεδίο χαμηλής ισχύος (× 40). 3 πεδίο υψηλής ισχύος (Χ 400) εικόνες επιλέχθηκαν για ανάλυση σε κάθε hot spot. Χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΝΑΚ-Στοιχεία ένα όριο ορίστηκε για τον ορισμό και τη μέτρηση της αναλογίας του Ki-67 θετικών λεκιασμένη περιοχή με τη συνολική έκταση πεδίο υψηλής ισχύος. Εκτίμηση των αποπτωτικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με ανίχνευση της κασπάσης-διασπασμένο προϊόν της κυτοκερατίνης 18 με CytoDEATH (M30). Ανάλογα με το μέγεθος του όγκου, 5-10 τυχαία πεδία επιλέχθηκαν, και μετρήθηκε ο μέσος αριθμός αποπτωτικών κυττάρων ανά πεδίο (χ 200). Αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι CD31 χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD). Εικόνες (× 100) ελήφθησαν από τρεις περιοχές με την υψηλότερη πυκνότητα των μικροαγγείων εμφάνιση (δηλαδή, hot spots) και η μέση τιμή των μετρήσεων CD31-θετικών υπολογιστεί. Για να εκτιμηθεί η έκταση των CD31-θετικών δομές (περιοχή σκάφους), οι εικόνες αποθηκεύονται ως αρχεία TIFF. Θετική χρώση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη λειτουργία κατωφλίου Adobe Photoshop και σε συνδυασμό με τις αναλύσεις ιστόγραμμα. Καταγράφηκε ο μέσος αριθμός των θετικών pixel ανά τμήμα όγκου από τρία hot spots.

Western Blot

Για διασπασμένης κασπάσης 3 και CysLT

αναλύσεις 1R, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί 5 ημέρες για να 70% συρροή. Μόνο προσκολλημένα HCT-116, SW-480 και ΗΤ-29 κύτταρα συλλέχθηκαν για CysLT

1Κ αναλύσεις. Για την ανάλυση της διασπασμένης κασπάσης 3 χρησιμοποιήσαμε τα δύο προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα HCT-116. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. εκχύλιση πρωτεΐνης από ξενομόσχευμα ιστό όγκου διεξήχθη με υπερήχους. Εν συντομία, οι ιστοί του όγκου σε 700 μΐ παγωμένου αναγωγικό ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (62,5 mM Tris, ρΗ 6.8, 6 Μ ουρία, 10% γλυκερόλη, και 2% SDS) που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης (2 mM Na

3νο

4, 4 μg /ml λευπεπτίνη, και 60 μg /ml φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο) υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους σε πάγο για 30 δευτερόλεπτα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων φυγοκεντρήθηκαν στα 3400 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Βρωμοφαινόλης μπλε (0,003%) και μερκαπτοαιθανόλη (5%) προστέθηκαν στα υπερκείμενα του δείγματος. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε προκατασκευασμένα τυχόν πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου kD ™ και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με είτε 5% άπαχο ξηρό γάλα ή 5% BSA σε 0,05% Tween /PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τέλος, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύεται με ένα αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας. αποτελέσματα Ανοσοκηλίδωση έγιναν ορατά με το XRS Σύστημα Μοριακής Imager ChemiDoc και το λογισμικό Image Lab (Bio-Rad Laboratories).

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση της ανιχνεύσεως πολλαπλασιασμού των κυττάρων WST-1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πλάκες επίπεδου πυθμένα των 96 φρεατίων σε 1500 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε μέσο που περιείχε 2% FBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CysLT

ανταγωνιστές 1Κ για διαφορετικά χρονικά σημεία. Μετά την επώαση με 10 μΐ WST-1 αντιδραστηρίου για 90 λεπτά, η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε στα 440 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας Tecan άπειρη M200.

Κυτταρομετρίας Ροής

κύκλου κυττάρου και κυττάρου μετρήσεις θάνατο αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, HCT-116 κύτταρα ήταν άνευ ορού επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CysLT

1Κ ανταγωνιστές σε φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 2% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα συγκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS. Για προφίλ κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα αμέσως σταθεροποιήθηκαν σε 70% (ν /ν) αιθανόλη, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,1% κιτρικό νάτριο και 100 μg /ml RNase Α, και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C με ιωδιούχο 50 μg /ml προπίδιο. Διέγερση απόπτωσης προσδιορίσθηκε σε βιώσιμα κύτταρα χρησιμοποιώντας την αννεξίνη V-ΡΕ Apoptosis Detection Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλες οι μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της ροής FACS Calibur κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, San Jose, CA), και οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση FCS Express, έκδοση 4.0 (de novo Software).

Δοκιμασία πρόσφυσης

HCT-116 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο που περιείχε 2% FBS σε πυκνότητα 2,0 × 10

5 κύτταρα /ml και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς CysLT

1Κ ανταγωνιστές για 30 λεπτά στους 37 ° C πριν από την επίστρωση σε επίπεδη -bottomed 12-φρεατίων (Corning, 1 ml /φρεάτιο). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 1 ώρα, που ακολουθείται από τρεις πλύσεις με PBS για την απομάκρυνση μη συνδεδεμένα κύτταρα. Μετά τη σταθεροποίηση σε 4% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (5 mg /ml σε 2% αιθανόλη) επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν εκτενώς, και χρώση απελευθερώθηκε χρησιμοποιώντας 2% SDS σε PBS. Η ένταση χρώσης ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία στα 550 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας Tecan άπειρη M200.

Soft Δοκιμασία άγαρ

HCT-116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε 2% FBS με ή χωρίς CysLT

1Κ ανταγωνιστές. Εν συντομία, 1 ml 0.5% και (κάτω στρώμα) /άγαρ προστέθηκε σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να στερεοποιηθούν για τουλάχιστον 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, 1,0 × 10

4 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 1 ml μέσου με 0,35% αγαρόζη (άνω στρώμα). Διαφορετικές δόσεις CysLT

1Κ ανταγωνιστές προστέθηκαν στο αγαρόζη (το κορυφαίο στρώμα) και άγαρ (η κάτω στιβάδα) προτού τοποθετήθηκαν πάνω στα φρεάτια. Ένα επιπλέον 2 ml μέσου καλλιέργειας που περιέχει το CysLT

1Κ ανταγωνιστές τοποθετήθηκαν πάνω από το ανώτερο στρώμα. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες με ή χωρίς την προσθήκη CysLT

ανταγωνιστές 1Κ. Μετά από 14 ημέρες επώασης στους 37 ° C, οι αποικίες έγιναν ορατές με χρώση με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση της ChemiDoc ™ XRS + System και οι αποικίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

κυστεϊνυλίου λευκοτριενίων Enzyme Immunoassay

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες στους 70-80% συρροή. Την ημέρα 4 τα μέσα αλλάχθηκαν και συλλέγονται σε ημέρα 5 για διαχωρισμό κυστεϊνύλ λευκοτριενίου με εκχύλιση στερεάς φάσης Sep-Pak Vac RC (C18-500 mg) φυσίγγια από Water Corporation (Milford, ΜΑ). παραγωγή κυστεϊνυλο λευκοτριενίου μετρήθηκε με ένα ένζυμο ανοσοδοκιμασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν σε Prism Software (GraphPad, Inc.), και η στατιστική σημαντικότητα των στοιχείων ήταν καθορίζεται ως

P

& lt? 0,05. Για τη σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων, είτε σε συνδυασμό ή αταίριαστο

t

δοκιμή (

t

test του Student) χρησιμοποιήθηκε. Μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA για να συγκριθούν πολλές ομάδες. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM).

Αποτελέσματα

CysLT

1Κ Ανταγωνιστές Μείωση Ξενομοσχεύματος Ανάπτυξη Όγκου

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου ξένου μοσχεύματος μοντέλο που χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση των επιπτώσεων της CysLT

ανταγωνιστές 1Κ στην ανάπτυξη του καρκίνου

in vivo

. Να εξετάσει τα αποτελέσματα της CysLT

1Κ ανταγωνιστές για την έναρξη του όγκου, θα εμβολιάζεται γυμνά ποντίκια με HCT-116 κύτταρα προεπεξεργασία με CysLT

1Κ ανταγωνιστές. Η θεραπεία άρχισε αμέσως είτε με ZM198,615 ή μοντελουκάστη (5 mg /kg /ημέρα) κατά την ημέρα του εμβολιασμού. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν την ημέρα 21, πριν οι όγκοι του όγκου έφθασαν 1 cm

3, σύμφωνα με ηθικές άδεια (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, εμφάνιση όγκου καθυστέρησε σημαντικά στην ομάδα προ-ΖΜ (4 όγκοι) σε σύγκριση με την ομάδα DMSO Ι (12 όγκοι) την ημέρα 6. Επιπλέον, Montelukast προεπεξεργασίας ανέστειλε πλήρως την παραγωγή όγκου HCT-116. Το μέσο βάρος του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα προ-ZM σε σύγκριση με την ομάδα DMSO I (0,165 ± 0,048 g

vs

0,372 ± 0,082 g?. Σχήμα 1 C).

Επιπλέον, εξετάσαμε τις επιδράσεις της CysLT

ανταγωνιστές 1Κ επί της προόδου όγκου με εμβολιασμό γυμνούς ποντικούς με μη προεπεξεργασμένων HCT-116 κύτταρα. Μετά την έναρξη εγγράψιμο όγκου (κατά την ημέρα 6), CysLT

1Κ θεραπείες ανταγωνιστή διεξήχθησαν για 2 εβδομάδες (Σχήμα 1 Ε). Την ημέρα 21, το μέσο μέγεθος του όγκου των ομάδων ZM198,615 και Montelukast ήταν σημαντικά μικρότερος από ό, τι οι όγκοι στην ομάδα DMSO II (490,1 ± 66,21 mm

3 και 336,9 ± 55,38 mm

3

vs.

711,6 ± 82,6 χιλιοστά

3

P

& lt? 0,05 ή

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα) (Σχήμα 1 F). Ομοίως, το μέσο βάρος όγκου στις ομάδες ZM198,615 και Montelukast έναντι της ομάδας DMSO II ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 1G?. 0.31 ± 0.037 g και 0.22 ± 0.036 g

vs

0,424 ± 0,038 g, αντίστοιχα,

P

& lt? 0,05). Το Σχήμα 1D και Η είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες του όγκου που λαμβάνονται από κάθε ομάδα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι CysLT

1Κ είναι σημαντική για την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

CysLT

1Κ Ανταγωνιστές Μείωση της διάδοσης και επάγει απόπτωση

Στη συνέχεια ερευνήσαμε των υποκείμενων μηχανισμών με την οποία CysLT

1Κ ανταγωνιστές άσκησαν ανασταλτικές επιδράσεις τους στην ανάπτυξη του όγκου. τομές όγκων HCT-116 χρωματίστηκαν με το δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67 ή του δείκτη απόπτωσης M30 CytoDEATH. Η πιο διαδεδομένη Ki-67 λεκιασμένη περιοχή επιλέχθηκε για κάθε όγκο ξένου μοσχεύματος και τρεις εικόνες πεδίο υψηλής ισχύος εντός της περιοχής αυτής αναλύθηκαν περαιτέρω. Το επίπεδο Ki-67 σε αυτές τις επιλεγμένες περιοχές ήταν μέτρια μείωση στην ομάδα Pre-ZM (Pre-ZM

vs

DMSO μου ομάδα?. Σχήμα 2Α και Β) και στατιστικά σημαντικά (

P & lt?

0.05) μειώθηκε σε ομάδες θεραπείας (ZM198,615

vs

DMSO ομάδα II?. Εικόνα 2C και D). αριθμός αποπτωτικός κυτταρικός αυξήθηκε ελαφρά σε όγκους από την ομάδα Προ-ΖΜ (Pre-ΖΜ

vs

DMSO Ι ομάδα?. Σχήμα 2Ε και F) και οι ομάδες θεραπείας (ZM198,615 ή Montelukast

vs.

DMSO ομάδα II?. Σχήμα 2G και H)

(Α και C) Εκπρόσωπος Ki-67-χρωματισμένο εικόνες από τομές παραφίνης των όγκων ξενομοσχεύματος (× 400). (Β και D) Μία Ki-67-χρωματισμένο καυτό σημείο επιλέχθηκε από κάθε όγκο και 3 ξεχωριστούς χώρους εντός αυτών των hot spots αναλύθηκαν σε πεδίο υψηλής ισχύος (Χ 400). Ki-67 θετικών κλάσμα περιοχή προσδιορίστηκε ως αναλογία λεκιασμένη περιοχή με συνολική έκταση πεδίο υψηλής ισχύος. (Ε και Ζ) Εκπρόσωπος M30 CytoDEATH-χρωματισμένο εικόνες από τομές παραφίνης των όγκων ξενομοσχεύματος (× 200). Μαύρο και άσπρο βέλη δείχνουν θετικά χρωματισμένα κύτταρα. Συσκευασμένο περιοχές εντός της κύριας πάνελ δείχνει τα θετικά χρωματισμένα κύτταρα υποδεικνύεται από τα λευκά βέλη σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (χ 400). (F και H) Μέσος αριθμός αποπτωτικών κυττάρων ανά πεδίο προσδιορίστηκε από M30- θετικές μετρήσεις (μαύρα βέλη) σε τμήματα ξενομοσχεύματος όγκου μεσαία μεγέθους που λαμβάνονται από το μεσαίο τμήμα. Τα ποσοτικά δεδομένα που δείχνονται είναι η μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt?. 0.05 από

t

test του Student

Η

Τα αποτελέσματα της CysLT

1Κ ανταγωνιστές στην αγγείωση του όγκου μελετήθηκαν με χρώση για CD31 , ένα ενδοθηλιακό κυττάρου-ειδικό αντιγόνο. Παρατηρήσαμε μια ελαφρώς μειωμένο αριθμό σκαφών στα τμήματα που λαμβάνονται από την ομάδα προ-ZM σε σύγκριση με την ομάδα DMSO I (46,1 ± 6,7

vs

56,0 ± 7,9?. Σχήμα 3Α και Β). Αγγειακή αριθμός δεν είναι η μόνη παράμετρος για να δείξει επαρκή παροχή αίματος στον όγκο? περιοχή σκάφος είναι επίσης ένας κρίσιμος προσδιοριστής της ροής αίματος όγκου [33]. Σε τομές όγκων από την ομάδα προ-ZM, έχουμε παρατηρήσει ότι τα σκάφη εμφανίστηκε μικρότερο και λεπτότερο, και είχαν λιγότερο διακλάδωση. Τα σκάφη όγκου στην ομάδα DMSO I εμφανίστηκε πιο ώριμη με αυλούς, χοντρούς τοίχους, και ισχυρή χρώση CD31 κατά το μήκος τους. Ως εκ τούτου, μετρήθηκαν τα CD31-θετικά περιοχές χρώση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, οι όγκοι από την προ-ZM198,615 ομάδα είχε μια στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,05) μείωσε τη μέση του CD31-θετικών έκταση σε σύγκριση με όγκους στην ομάδα DMSO I (2596 ± 121,4 pixels

vs.

3900 ± 522,3 εικονοστοιχεία, αντίστοιχα), που αντιστοιχεί σε μείωση 33%. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέσο αριθμό των σκαφών και των αγγειακών μέγεθος μεταξύ των ποντικών στις ομάδες αγωγής (DMSO II

vs

ZM198,615 ή Montelukast?. Σχήμα 3Δ, Ε και F). Το μειωμένο μέγεθος αγγειακή στα τμήματα του όγκου που λαμβάνονται από την ομάδα προ-ZM έδειξαν ότι CysLT

1Κ θεραπεία ανταγωνιστή για 21 ημέρες θα μπορούσε να αναστείλει την αγγείωση του όγκου και να έχουν μια πιο έντονη επίδραση στην εξέλιξη του όγκου.

(Α και Δ) Εκπρόσωπος CD31 βάφονται εικόνες (× 100). (Β και Ε) η πυκνότητα του σκάφους προσδιορίστηκε με μετρήσεις CD31-θετικά σε τρεις διαφορετικούς τομείς (hot spots). (C και F) Η ποσοτική ανάλυση των περιοχών CD31-θετικά χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop. Τα ποσοτικά δεδομένα που δείχνονται είναι η μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt? 0,05 από Φοιτητών

t

τεστ

Η

Στη συνέχεια, τα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο, απόπτωση και την αγγειογένεση ήταν. διερευνώνται. ρ21

WAF /Cip1, ένας δυνητικός αναστολέας του κυτταρικού κύκλου, δείχθηκε να απορυθμίζεται σημαντικά σε δείγματα όγκων από την ομάδα προ-ZM σε σύγκριση με την ομάδα DMSO Ι (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 4Α) . Παρατηρήσαμε επίσης μέτρια αύξηση των επιπέδων της διασπασμένης κασπάσης 3 θραύσματα (Σχήμα 4Β) και σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του VEGF (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 4C) σε όγκους από την ομάδα προ-ZM σε σύγκριση με το DMSO Ι ομάδα. Παρόμοια ανάλυση έγιναν για τις ομάδες θεραπείας (ZM198,615 ή Μοντελουκάστη

vs.

DMSO ΙΙ). Σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του p21

WAF /Cip1 (

P

& lt? 0,01? Εικόνα 3D) και μειωμένα επίπεδα έκφρασης του VEGF (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 4D) θα μπορούσε να είναι παρατηρήθηκε για την ομάδα του montelukast αγωγή, αλλά όχι για την ομάδα ZM198,615 αγωγή σε σύγκριση με την ομάδα DMSO II. Αυξημένα επίπεδα διασπασμένης κασπάσης 3 θραύσματα παρατηρήθηκαν επίσης στις ομάδες θεραπείας (ZM198,615 ή Montelukast

vs.

DMSO II) (Σχήμα 4Ε).

δείγματα όγκου (τρεις ή τέσσερις όγκους από κάθε ομάδα) υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για ρ21 (Α και D)

WAF /Cip1? (Β και Ε) διασπασμένη κασπάση 3? και (Γ και Δ) VEGF. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν βάσει της β-ακτίνης επίπεδα. Η πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 από

t

test του Student

Η

CysLT

1Κ Ανταγωνιστές Μειώστε Διάδοση και Προκαλέστε G

1 σύλληψη HCT-116 κύτταρα

Επειδή παρατηρήσαμε ότι CysLT

1Κ θεραπεία ανταγωνιστής θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

εν μέρει από την επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου , ήμασταν δίπλα ενδιαφέρονται να επιβεβαιώσει αυτό το εύρημα

in vitro

. Για να διερευνηθεί αν CysLT

ανταγωνιστές 1Κ είχε καμία άμεση επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, ο προσδιορισμός του πολλαπλασιασμού των κυττάρων WST-1 πραγματοποιήθηκε. Η θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ZM198,615 προκάλεσε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων HCT-116 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Την ημέρα 4, η ανάπτυξη των κυττάρων σε επεξεργασία με 12,5, 25 και 50 μΜ ZM198,615 μειώθηκε κατά 11%, 31%, και 88% αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου DMSO-αγωγή (Σχήμα 5Α). Όταν χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες συγκεντρώσεις Montelukast ως ZM198,615, παρατηρήσαμε μια ακόμα ισχυρότερη επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων? 35%, 88%, και 100% για 12.5, 25, και 50 μΜ Montelukast, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου DMSO-αγωγή (Σχήμα 5Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η CysLT

1Κ ανταγωνιστής μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης των HCT-116 κύτταρα οφειλόταν σε παρέμβαση του κυτταρικού κύκλου. Βρήκαμε ότι Montelukast επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου των HCT-116 κυττάρων εντός 24 h σε G

1 φάση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, δεξιά πάνελ, 81% και 87% των κυττάρων σε επεξεργασία με 12,5 και 25 μΜ Montelukast, αντίστοιχα, ήταν στο G

1 φάση σε σύγκριση με το 64% των κυττάρων σε επεξεργασία με DMSO.