: PLoS ONE Οι

Αφηρημένο

Αναπτυξιακά γονίδια σιγήσει σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα από μια δισθενή ιστονών με βάση το σήμα χρωματίνης. Έχει προταθεί ότι αυτό σήμα παρέχει επίσης μια προδιάθεση προς παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΟΚΓ) στον καρκίνο. Αναφέρουμε εδώ ότι η αποσιώπηση ενός σημαντικού ποσοστού αυτών των ΕΠΠΕ σε ανθρώπινα εμβρυϊκά και τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα συνδέεται με το DNA προαγωγός υπερμεθυλίωση. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ένα ρόλο για την μεθυλίωση του DNA στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα και υποδηλώνουν ότι, για τα γονίδια καταστέλλονται με υπερμεθυλίωση προαγωγού σε βλαστικά κύτταρα

in vivo

, η παρεκκλίνουσα διαδικασία σε καρκίνο θα μπορούσε να εκληφθεί ως ένα ελάττωμα στην ίδρυση μη μεθυλιωμένο υποστηρικτής κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, όχι ως ανώμαλη διαδικασία του

de novo

υπερμεθυλίωση

Παράθεση:. Calvanese V, Horrillo Α, Hmadcha Α, Suarez-Álvarez Β, Φερνάντες AF , Lara E, et al. Γονίδια (2008) Καρκίνος υπερμεθυλίωση σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 3 (9): e3294. doi: 10.1371 /journal.pone.0003294

Επιμέλεια: Maarten M. S. van Lohuizen, Ολλανδικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ολλανδία

Ελήφθη: 30, Απριλίου του 2008? Δεκτές: 1, Σεπ 2008? Δημοσιεύθηκε: 29 Σεπ 2008

Copyright: © 2008 Calvanese et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε κυρίως από την Ευρωπαϊκή Ένωση (LSHG-CT-2006-018739? ESTOOLS). ΠΔΠ χρηματοδοτείται από την ισπανική Ramon & amp? Πρόγραμμα Cajal και το Υπουργείο Υγείας της ισπανικής κυβέρνησης (PI061267). Η ομάδα του Καρκίνου Επιγενετική στο CNIO υποστηρίζεται από την Διεύθυνση Υγείας (FIS01-04) και Παιδείας και Επιστημών (I + D + I MCYT08-03, FU2004-02073 /BMC και Consolider MEC09-05) Τμήματα της ισπανικής κυβέρνησης, της Ευρωπαϊκής Grant TRANSFOG LSHC-CT-2004-503438, και η Ισπανική Ένωση κατά του Καρκίνου (AECC). VC είναι αποδέκτης μιας υποτροφίας από το Ερευνητικό Πρόγραμμα FPU ισπανικά. ΧΛΛ και BSA υποστηρίζονται από το Υπουργείο Υγείας της ισπανικής κυβέρνησης (PI051707). Η BACM υποστηρίζεται από την Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (0029 και 0030/2006 για την PM) και, το ισπανικό Υπουργείο Υγείας στο PM (FIS PI070026). CB υποστηρίζεται από το Διεθνές Ίδρυμα Jose Carreras κατά της λευχαιμίας (EDThomas-05) και το ISCIII (FIS 3 + 3 της σύμβασης). Το Ινστιτούτο Επανορθωτικής Νευροβιολογίας λάβει πρόσθετη χρηματοδότηση από την DFG και το Ίδρυμα Hertie. BS, ABH και AnH υποστηρίζονται από το Fundación Progreso y Salud και Instituto de Salud Carlos III-Κόκκινο Española de Terapia Celular (RD06 /0010/0025). PWA, ΝΗ και HDM υποστηρίζεται επίσης από το MRC

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. , τα κύτταρα αρχικά παντοδύναμα αλλά, μετά από μερικά τμήματα, αρχίζουν να χάνουν την δραστικότητα και μετατρέπονται σε πολυδύναμα κύτταρα, τελικά, σε τελικά διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα. Η προοδευτική απώλεια ισχύος κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης έχει θεμελιώδεις συνέπειες για τη νόσο διότι η ανάκαμψη της πλειοδυναμίας μέσα από την πυρηνική επαναπρογραμματισμό είναι μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της αναγεννητικής ιατρικής [1], και λόγω διακοπής της αναπτυξιακής διαδικασίας που οδηγεί σε τελικά διαφοροποιημένα σωματικών κυττάρων από της αντιστοιχεί προγονικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε κακοήθη μετασχηματισμό [2].

Διαφοροποίηση των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (βλαστοκύτταρα) απαιτεί την καταστολή των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διατήρηση pluripotency και την ενεργοποίηση των αναπτυξιακών γονιδίων. Και οι δύο μέθοδοι κατευθύνονται από ειδικές επιγενετικών μηχανισμών. Ένα παράδειγμα του πρώτου τύπου είναι ο υποκινητής υπερμεθυλίωση εξαρτώμενη καταστολή των γονιδίων πλειοδυναμίας-διατηρώντας όπως Nanog και Oct4 ως βλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται [3]. Μέχρι στιγμής, η ενεργοποίηση των αναπτυξιακών γονιδίων κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων κατά μεθυλίωσης του DNA έχει λιγότερο μελετηθεί λεπτομερώς. Αντ ‘αυτού, αυτές οι αναπτυξιακές γονίδια έχουν αναφερθεί ότι βρίσκονται σε κατάσταση καταστολής κατά τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης που οφείλεται στη δημιουργία ενός συγκεκριμένου σχεδίου τροποποίησης των ιστονών, που ονομάζεται «δισθενή τομείς», η οποία αποτελείται από μεγάλες περιοχές της H3 λυσίνη 27 μεθυλίωσης υπόθαλψη μικρότερες περιφέρειες της H3 λυσίνη 4 μεθυλίωση [4]. Αυτή η κατάσταση χρωματίνη-κατασταλτική διαμεσολαβείται από την Polycomb ομάδα πρωτεϊνών [5], [6] και θεωρείται ότι προδιαθέτουν σε παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση προαγωγέα στον καρκίνο [7] – [9]. Το εύρημα ότι η θεραπεία της hESCs με το φάρμακο απομεθυλιωτικής 5′-Aza-2’-δεοξυκυτιδίνη προκαλεί καρδιακή διαφοροποίηση και η γονιδιακή επανενεργοποίηση [10] μας ώθησε να εξετάσει κατά πόσον το DNA υποστηρικτής μεθυλίωση θα μπορούσε να συμβάλει στη δημιουργία και διατήρηση συγκεκριμένων γονιδίων καταστολής στην hESCs . Για να διαπιστωθεί η ύπαρξή του και υποθετική σχέση της με παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση προαγωγού σε καρκίνο, συγκρίναμε το πρότυπο μεθυλίωσης του DNA προαγωγού ενός πάνελ 800 γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο μεταξύ hESCs και διαφόρων τύπων τελικά διαφοροποιημένα ιστούς ενηλίκων και καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Αποτελέσματα

Ανάδοχος μεθυλίωσης του DNA προφίλ σε βλαστοκύτταρα, η κανονική διαφοροποιημένους ιστούς και τα δείγματα καρκίνου

Χρησιμοποιήσαμε Illumina goldenGate μεθυλίωση Πίνακες © να συγκρίνει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των 1.505 αλληλουχιών (από 807 γονίδια) σε οκτώ ανεξάρτητα απομονωθεί hESCs γραμμές, 21 φυσιολογικών ανθρώπινων πρωτογενών ιστών (NPTs) που αντιστοιχεί σε έξι φυσιολογικό τύπους ιστών (NTTs) και 21 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (CCLs) (βλέπε Μέθοδοι). Τα γονίδια που περιλαμβάνονται στις συστοιχίες μεθυλίωση επελέγησαν με βάση τη σημασία τους για την κυτταρική συμπεριφορά και διαφοροποίηση και περιλαμβάνονται γονίδια προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι διαφορικά μεθυλιωμένη, καθώς και ογκοκατασταλτικά γονίδια, ογκογονίδια και γονίδια που κωδικοποιούν παράγοντες που εμπλέκονται στην κυτταρικού κύκλου σημείο ελέγχου [ ,,,0],11]. Έχουμε επιλέξει πρώτα τα γονίδια αυτοσωματικό (766) από τις συστοιχίες για να αποκλείσει μεθυλίωσης του DNA που εξαρτάται από το Χ χρωμόσωμα αδρανοποιηθεί τα γονίδια. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση των δειγμάτων αποκλειστικά με τη χρήση των σημάτων μεθυλίωσης των γονιδίων αυτοσωματικό (1421 σειρές) που περιέχονται στις συστοιχίες επέτρεψε την ορθή κατάταξη του κάθε δείγματος στο πλαίσιο αντίστοιχη ομάδα της (hESC, NPT, ή CCL) (Εικόνα 1Α, και βλέπε Σχήμα S1 στην online συμπληρωματικά δεδομένα για αυτό το άρθρο), επιβεβαιώνοντας έτσι ότι κάθε ομάδα δειγμάτων έχει ειδική μεθυλίωσης του DNA υπογραφή [11]. Στη συνέχεια προσπάθησε να ταξινομήσει τα γονίδια στη συστοιχία σε σχέση με την κατάσταση μεθυλίωσης τους σε τρεις τύπους του αναλυόμενου δείγματος (hESC, CCL, και ΝΡΤ) (Σχήμα 1Α, και Πίνακες 1 και S1). Βρήκαμε ότι το 65,31% (928 /1.421) των ακολουθιών δεν είχαν συχνά υπερμεθυλίωση στο hESCs (array signal≤0.7 in≥25% (2/8) των δειγμάτων) και ότι οι μισοί από αυτούς (464/928) ήταν συχνά υπερμεθυλίωση σε CCLs (array σήμα & gt? 0,7 in≥25% (6/21) των δειγμάτων). Η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των αλληλουχιών (99,78%, 463/464) ήταν μη μεθυλιωμένα σε τουλάχιστον ένα από τα NTTs αναλύθηκαν (array σήμα & lt? 0,3 in≥1 /6 NTTs). Το εύρημα αυτό συμφωνεί με την άποψη ότι τα γονίδια παρεκκλίνοντα υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο (δηλαδή, όχι υπερμεθυλίωση σε φυσιολογικούς ιστούς) δεν υπερμεθυλίωση σε hESCs [8]. Ζητήσαμε αυτή η ομάδα των γονιδίων κλασικής κλάσης Α καρκίνο υπερμεθυλίωση γονίδια (Πίνακες 1 και S1).

(Α) προφίλ μεθυλίωση της κατηγορίας ΑΙ (350), Α-ΙΙ (94), BI (20), και Β-ΙΙ (107) γονίδια στα hESCs (8), η κανονική (21), και του καρκίνου (21) δείγματα που λαμβάνονται με συστοιχίες Illumina. Τα επίπεδα μεθυλίωσης διαφέρουν από πλήρως μεθυλιωμένα (κόκκινο) σε πλήρως μη μεθυλιωμένη (λευκό). Οι στήλες δεξιά δείχνουν την κατάσταση μεθυλίωσης του ιστόνης Η3 και Polycomb πληρότητα των ίδιων γονιδίων που λαμβάνονται από προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα [5], [12], [16]. Μπλε, μεθυλίωση στο Κ4 και Κ27? πορτοκαλί, μεθυλίωση στο Κ4 και μόνο? πράσινο, δεν μεθυλίωση σε Κ4 ή Κ27? μαύρο, παρουσία του Polycomb πρωτεΐνης SUZ12. (Β) Εμπλουτισμός της πρωτεΐνης SUZ12 Polycomb, η δισθενής χρωματίνης υπογραφή (K4 /K27) ή η απουσία και των δύο σημάτων (κανένα) στα γονίδια κλάσης Α και κλάσης Β (άνω τμήμα) και της Κλάσης I και ΙΙ γονιδίων (κάτω πίνακας) .

η

Αξίζει να σημειωθεί, διαπιστώσαμε ότι 34,69% (493 /1.421) από τις ακολουθίες συχνά υπερμεθυλίωση στο hESCs (array σήμα & gt? 0,7 in≥25% (2/8) των δειγμάτων ). Οι περισσότεροι από αυτούς (79,72%, 393/493) ήταν επίσης συχνά υπερμεθυλίωση στο CCLs (σήμα σειρά & gt? 0,7 in≥25% (6/21)) των δειγμάτων). Πάλι, πολλοί από αυτούς (32,32%, 127/393) ήταν μη μεθυλιωμένα σε τουλάχιστον ένα από τα NTTs αναλύθηκαν (array σήμα & lt? 0,3 in≥17% (1/6) NTTs) (Σχήμα 1, και Πίνακες 1 και S1). Σε αντίθεση με την κλάση ενός καρκίνου υπερμεθυλίωση γονίδια, όσοι αυτής της ομάδας ήταν επίσης συχνά υπερμεθυλίωση στα βλαστοκύτταρα, γι ‘αυτό προτείνω να μπορούν να θεωρηθούν μέλη μιας διαφορετικής κατηγορίας του καρκίνου μεθυλιωμένο γονιδίων, τα οποία έχουμε ονομάζεται cancer κατηγορίας Β υπερμεθυλίωση γονίδια. Από τις 697 αλληλουχίες που συχνά υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο και μη μεθυλιωμένη σε τουλάχιστον μία από τις NTTs αναλύθηκαν, 444 (66,70%) και 127 (18,22%) ήταν αντίστοιχα ταξινομούνται ως γονίδια κλάσης Α και κλάσης Β (Σχήμα 1, και Πίνακες 1 και S1) , γεγονός που δείχνει, σε αντίθεση με την προσδοκία, ότι ένα σημαντικό ποσοστό (περίπου 20%) του καρκίνου μεθυλιωμένο γονίδια είναι επίσης συχνά υπερμεθυλίωση σε βλαστοκύτταρα.

είναι ενδιαφέρον, δεν είναι όλα τα γονίδια συχνά υπερμεθυλίωση στο CCLs ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένα σε όλα τα NTTs αναλύθηκαν (Σχήμα 1, και πίνακες 1 και S1). Η συχνότητα των υπερμεθυλίωση σε φυσιολογικούς ιστούς είναι μόνο μέτριας σημασίας για την κατηγορία Α κλασική καρκίνο μεθυλιωμένο γονίδια, καθώς οι περισσότεροι από αυτούς (78,83%? 350/444 σειρές) είναι μη μεθυλιωμένα στην NPTs. Από την άλλη πλευρά, μόνο 20 αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε γονίδια κλάσης Β ήταν μη μεθυλιωμένη σε όλα τα NTTs αναλύθηκαν (Πίνακας 1). Όταν ένα γονίδιο μεθυλιώνεται σε κάποια, αλλά όχι όλους τους φυσιολογικούς ιστούς, η μεθυλίωση πιθανώς εμπλέκεται στην προδιαγραφή ενός τύπου ιστού κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης [12]. Όταν το γονίδιο δεν υπερμεθυλίωση σε hESCs, πρέπει να συμβούν τύπου ιστού που εξαρτάται από επιλεκτική μεθυλίωση. Αντιθέτως, όταν το γονίδιο συχνά υπερμεθυλίωση σε hESCs, αυτό πιθανότατα γίνεται επιλεκτικά απομεθυλιώνεται κατά τη διαφοροποίηση ως επιγενετική μηχανισμός που είναι σε θέση να διευκολύνει την προδιαγραφή ιστό. Αντιστρόφως, όταν ένα γονίδιο είναι μη μεθυλιωμένο σε όλες τις κανονικές διαφοροποιημένα κύτταρα και υπερμεθυλίωση σε βλαστικά κύτταρα, η απώλεια της μεθυλίωσης υποκινητή που συμβαίνει απαραίτητα κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης είναι πιο πιθανό να εμπλέκονται σε διαδικασίες νωρίς διαφοροποίηση σε σχέση με τις προδιαγραφές ιστό [12]. Έτσι, ορίσαμε δύο νέες υποκατηγορίες για τα δύο καρκίνο μεθυλιωμένα γονίδια κατηγορίας Α και Β: Υποκατηγορία Ι, για τα γονίδια που είναι πάντα μη μεθυλιωμένα σε φυσιολογικούς ιστούς, και υποκατηγορία II, για γονίδια που μερικές φορές μεθυλιωμένα σε φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1, και Πίνακες 1 και S1). Το ποσοστό της κατηγορίας Α-ΙΙ και τα γονίδια κλάσης Β-ΙΙ είναι αρκετά παρόμοια (7,53% και 6,61%) (Πίνακας 1). Ωστόσο, το ποσοστό των γονιδίων στην κατηγορία Α-Ι (24,63%) είναι πολύ υψηλότερη από εκείνη στην κατηγορία Β-Ι (1,41%). Τα γονίδια σε αυτές τις τέσσερις κατηγορίες (Α-Ι, Α-ΙΙ, Β-Ι και Β-ΙΙ) αντιπροσωπεύουν το 58,2% του συνόλου των αλληλουχιών που υπάρχουν στις συστοιχίες μεθυλίωσης. Με την εξέταση της κατάστασης μεθυλίωσης των τριών ομάδων των δειγμάτων (hESCs, NPTs, και CCLs) ήμασταν σε θέση να συγκεντρώνονται οι περισσότερες από τις υπόλοιπες γονιδίων στη συστοιχία σε οκτώ πρόσθετες κατηγορίες (Πίνακας 1), η οποία περιελάμβανε, για παράδειγμα, δύο κατηγορίες γονίδια που ορίζουμε ως συστατικά μεθυλιωμένο (μεθυλιωμένο σε βλαστοκύτταρα, CCLs, και όλα τα NTTs? 11,19%) ή μόνιμα μη μεθυλιωμένα (μη μεθυλιωμένη σε βλαστοκύτταρα, CCLs, και όλα τα NTTs? 28,43%) γονίδια, αντίστοιχα. Προτείνουμε συνεπώς ότι μεθυλίωσης του DNA δεν είναι σημαντική για τη ρύθμιση των γονιδίων σε αυτές τις κατηγορίες. Η κατάταξη των γονιδίων σύμφωνα με την κατάσταση τους μεθυλίωσης σε hESCs, CCLs, και NTTs, και την ερμηνεία του βιολογικού ρόλου της μεθυλίωσης του DNA στα γονίδια σε κάθε ομάδα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Πίνακας S1 απαριθμεί τα γονίδια σε κάθε ομάδα.

είναι σημαντικό να σημειωθεί εδώ ότι όλες οι περιγράφηκε προηγουμένως ποσοστά αναφέρονται στη 807 γονίδια που περιλαμβάνονται σε συστοιχίες μεθυλίωση, ενώ το συνολικό ποσοστό των γονιδίων σε κάθε ομάδα θα μπορούσε να είναι διαφορετική εάν θεωρούνταν ολόκληρο το γονιδίωμα. Το όριο ταξινόμησης που χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση γονιδίων συχνά υπερμεθυλίωση σε hESCs (πάνω από το 70% του προαγωγού CpG μεθυλίωσης σε περισσότερο από το 25% των δειγμάτων που αναλύονται) είναι εκείνη η οποία συνήθως χρησιμοποιείται για να ορίσει ένα γονίδιο ως συχνά υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο [13] . Για να εκτιμηθεί κατά πόσον οι παρατηρήσεις μας ισχύει και για τις στυπτικές όρια ταξινόμησης που επανεξετάζονται τα δεδομένα μας σε αναζήτηση: i) ακολουθίες υπερμεθυλίωση στα περισσότερα από τα βλαστοκύτταρα που αναλύθηκαν (array σήμα & gt? 0,7 in≥75% (6/8) της hESCs) και, ii ) αλληλουχίες »πλήρως μεθυλιωμένο» σε κάποια από τα hESCs αναλύθηκαν (σήμα συστοιχία & gt? 0,8) in≥25% (2/8) του hESCs) (Πίνακας S2). Βρήκαμε ότι το 5 BI και 84 σειρές Β-ΙΙ τοποθετηθεί το πρώτο κριτήριο, και 13 BI και 86 σειρές Β-ΙΙ τοποθετηθεί το δεύτερο (Πίνακας S2), γεγονός που δείχνει ότι τα συμπεράσματά μας εξακολουθούν να ισχύουν ακόμη και με αυτά τα αυστηρότερα όρια ταξινόμησης.

πρόσφατα έχει δειχθεί ότι η παρατεταμένη

in vitro

κουλτούρα hESCs σχετίζεται με τη μεθυλίωση του DNA αστάθεια [14], [15]. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον υπερμεθυλίωση υποκινητή των γονιδίων μας Κατηγορίας Β συνδέεται με το

in vitro

διαδικασία του πολιτισμού, συγκρίναμε τα δεδομένα μας με εκείνους που προηγουμένως δημοσιευθεί από Bibikova

et al.

[11]. Αυτοί οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν την πλατφόρμα μεθυλίωση GoldenGate να συγκρίνουν την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG 1505 θέσεις που περιέχονται στις συστοιχίες σε δέκα γραμμές hESC σε χαμηλές και υψηλές περάσματα. Βρήκαν ότι, αν και οι αλλαγές μεθυλίωσης συνέβη με τον αριθμό πέρασμα, οι αλλαγές αυτές ήταν μικρές σε σχέση με τις διαφορές μεταξύ των κυτταρικών τύπων. Βρήκαν πέντε γονίδια (

ASCL2

,

GALR1

,

MEST

,

ΝΡΥ,

και

SLC5A8

) να υπερμεθυλίωση σταθερά με τον αριθμό διόδου (αύξηση σε επίπεδο μεθυλίωσης & gt? 0,34 σε τουλάχιστον δύο κυτταρικές σειρές (20%)). Τρία από αυτά τα γονίδια (

ASCL2

,

ΝΡΥ,

και

SLC5A8

) είναι μέλη της Κατηγορίας Β-Ι, αλλά, περιέργως, κανένας ήταν ένα γονίδιο κατηγορίας Β-ΙΙ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παρατεταμένη

in vitro

πολιτισμού ήταν υπεύθυνος μόνο για την υπερμεθυλίωση υποστηρικτής της ένα μικρό κλάσμα (3/97, 3%) των γονιδίων μας κατηγορίας Β, και ότι η επίδραση φαίνεται να είναι μεγαλύτερη στην κατηγορία BI γονίδια.

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, έχει πρόσφατα προταθεί ότι οι αναπτυξιακές γονίδια σιγήσει σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα από ένα Polycomb εξαρτώμενη δισθενής ιστόνης που βασίζεται σήμα χρωματίνης [4], [5], η οποία θεωρείται ότι προδιαθέτουν με παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση υποστηρικτής του DNA των ΕΠΠΕ στον καρκίνο [7] – [9]. Όπως διαπιστώσαμε ότι ένα υποσύνολο του καρκίνου μεθυλιωμένο γονιδίων μπορεί επίσης να μεθυλιωθεί σε hESCs θέλαμε να ερευνήσει τη σχέση μεταξύ υπερμεθυλίωση προαγωγού και του Polycomb-εξαρτώμενο πρότυπο τροποποίησης των ιστονών σε βλαστοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό, συγκρίναμε τα δεδομένα μεθυλίωσης μας για την Κατηγορία ΑΙ, Α-ΙΙ, BI, και τα γονίδια Β-ΙΙ με την προηγουμένως αναφερθείσα προφίλ τροποποίηση ιστονών και Polycomb πληρότητα των ίδιων γονιδίων σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα [5], [12] [16], (Σχήμα 1 και Πίνακας S3). Συνεπής με την προηγούμενη έκθεση [9], βρήκαμε ότι περίπου το 35% των ακολουθιών συχνά υπερμεθυλίωση στον καρκίνο και μη μεθυλιωμένη σε τουλάχιστον ένα από τα NTTs αναλύθηκαν περιείχε χρωματίνης-κατασταλτικά σήματα υποστηρικτές τους (228 – 277/697 έτρεφε meK27, και 236/697 περιέχονται SUZ12). Περιέργως, συγκρίνοντας τα δεδομένα μεθυλίωση μας με αυτά των Mikkelsen

et al.

[16] παρατηρήσαμε ότι η συντριπτική πλειοψηφία (96,4%) των γονιδίων που φιλοξενούν meK27 περιείχε επίσης ΜΕΚ4 και ότι μόνο περίπου το 30% των γονιδίων συχνά υπερμεθυλίωση στον καρκίνο του παρουσίασε το δισθενή περιοχή χρωματίνης (ΜΕΚ4 /meK27) σε βλαστοκύτταρα (Πίνακας S3).

Όταν συγκρίναμε τα πρότυπα της χρωματίνης και Polycomb πληρότητα στην κλάση AI, A-II, BI, και τα γονίδια Β-ΙΙ βρήκαμε κάθε ομάδα να έχει ένα συγκεκριμένο χρωματίνης υπογραφή (p & lt? 0,00001). γονίδια κατηγορίας Α ήταν πιο εμπλουτισμένο σε Polycomb και δισθενή σήματα (47,5% και 45,5 έως 57,3% των γονιδίων, αντίστοιχα) από ό, τι τα γονίδια κατηγορίας Β (19,7% και 21,4 έως 32,7%, αντίστοιχα) (p & lt? 0,00001) (Εικόνα 1Β και S4 ). Ο εμπλουτισμός του δισθενούς σήμα γονίδια κατηγορίας Α είναι κατά κύριο λόγο οφείλεται στα χαμηλά επίπεδα αυτής της χρωματίνης υπογραφής σε γονίδια Τάξης Β-ΙΙ (Πίνακας S4). Πράγματι, τα γονίδια Τάξης Β-Ι παρουσιάζουν παρόμοια επίπεδα ΜΕΚ4 /meK27 με γονίδια κατηγορίας Α (Πίνακας S4) (p & lt? 0,00001). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα γονίδια Τάξης II, ήταν πολύ λιγότερο συχνά καταλαμβάνεται από Polycomb πρωτεΐνες και εμφάνισαν λιγότερα δισθενή σήματα (33,3% και 26,5 έως 38,8% των γονιδίων, αντίστοιχα) (ρ & lt? 0,00001) από ό, τι τα γονίδια Τάξης Ι (45,7% και 47,6 – 59,3 %, αντίστοιχα), (Σχήμα 1 Β και Πίνακας S4). Τα χαμηλότερα επίπεδα του δισθενούς σήμα στην κατηγορία ΙΙ γονιδίων οφείλονταν κυρίως στα χαμηλά επίπεδα αυτής της χρωματίνης υπογραφής σε γονίδια Τάξης Β-ΙΙ (Πίνακας S4). Πράγματι, τα γονίδια κατηγορίας Α-ΙΙ είχαν παρόμοια επίπεδα ΜΕΚ4 /meK27 με εκείνες των γονιδίων Τάξης Ι (Πίνακας S4) (p & lt? 0.00001).

ΕΠΠΕ καταπιεσμένη από υπερμεθυλίωση προαγωγού σε hESCs

Για να δοκιμάσουν τις υποθέσεις διατυπώνονται με βάση τα στοιχεία που προκύπτουν από τις συστοιχίες μεθυλίωση, εστιάσαμε την προσοχή μας σε τέσσερα γονίδια κατηγορίας Β (συχνά υπερμεθυλίωση στον καρκίνο και hESCs) που είχαν προηγουμένως αναφερθεί ευρέως για να είναι γονίδια με όγκο ιδιότητες καταστολέα και που συχνά υπερμεθυλίωση στον καρκίνο. Έχουμε επιλέξει δύο (MGMT και SLC5A8) [17], [18] από την υποκατηγορία Class BI (μη μεθυλιωμένα σε όλα τα NTTs) και δύο (PYCARD και RUNX3) [19], [20] από κλάση Β-ΙΙ (μη μεθυλιωμένη σε μια σειρά της NTTs). Χρησιμοποιήσαμε πρώτο όξινο θειώδες αλληλούχιση πολλαπλών κλώνων για να προσδιοριστεί με ακρίβεια την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA προαγωγού αυτών των γονιδίων σε hESCs και φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 2Α, και τα Σχήματα S2, S3, S4, S5). Σε όλες τις περιπτώσεις, τα δεδομένα αλληλούχισης οξίνου θειώδους επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τις συστοιχίες και έδειξε ότι η υπερμεθυλίωση παρατηρείται σε hESCs επηρέασε την πλειοψηφία των CpGs που περιβάλλουν την έναρξη μεταγραφής τόπο των επιλεγμένων γονιδίων. MGMT και SLC5A8 (Class ΒΙ) παρουσιάζονται πυκνά υπερμεθυλίωση προαγωγού σε hESCs αλλά όχι σε φυσιολογικά διαφοροποιημένους ιστούς (Σχήμα 2Α, και τα Σχήματα S2, S3) ενώ τα γονίδια κλάσης Β-ΙΙ συχνά υπερμεθυλίωση σε hESCs και μερικές φορές σε φυσιολογικούς ιστούς (Σχήματα S4, S5 ). Για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου στην υπερμεθυλίωση υποστηρικτής των επιλεγμένων ΕΠΠΕ μας στο hESCs και NTTs, χρησιμοποιήσαμε Q-RT-PCR για να μετρηθεί η έκφρασή τους και στις δύο ομάδες του δείγματος (Σχήμα 2Β, και τα σχήματα S2, S3, S4, S5). Βρήκαμε ότι υπερμεθυλίωση προαγωγού πάντα συνδέεται με γονίδιο καταστολής, αλλά η απουσία του σε σωματικά πρωτογενείς ιστούς δεν περιλαμβάνει απαραιτήτως την προς τα πάνω ρύθμιση του γονιδίου. Για παράδειγμα, ενώ

SLC5A8

ήταν μεθυλιωμένος εις όλους τους φυσιολογικούς ιστούς που αναλύθηκαν (Σχήμα S3A, Β), ήταν υπερεκφράζεται μόνο στον εγκέφαλο, το ήπαρ, και του παχέος εντέρου (Σχήμα S3C).

(Α ) Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση πολλαπλών κλώνων του προαγωγέα MGMT σε hESCs (I3, Η14), η κανονική πρωτεύοντες ιστούς (ανοιχτή λεμφοκύτταρα, η κανονική του μαστού) και δύο CCLs λεμφοειδούς προέλευσης και του μαστού (U937 και MDA-MB-231, αντίστοιχα). Μαύρο, μετουσιωμένες CpG? λευκό, μη μεθυλιωμένα CpG? κόκκινο, CpG δεν υπάρχει. Η πράσινη μπάρα πάνω από το διάγραμμα του νησιού MGMT CpG υποδεικνύει τη θέση του ανιχνευτή που χρησιμοποιείται στις συστοιχίες μεθυλίωσης. (Β) Σχέση μεταξύ υπερμεθυλίωση MGMT υποκινητή και την έκφραση σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, τα δείγματα φυσιολογικό, και ο καρκίνος. Το άνω πάνελ δείχνει το σχετικό σήμα μεθυλίωση που λαμβάνεται με τις συστοιχίες μεθυλίωση και το κάτω πάνελ τα επίπεδα έκφρασης του mRNA MGMT σε σχέση με GAPDH.

Η

Απώλεια υπερμεθυλίωση προαγωγού και ενεργοποίησης γονιδίων κατά τη διάρκεια

in vitro

διαφοροποίηση των hESCs

Για να καταδειχθεί περαιτέρω ότι η διαφοροποίηση των hESCs συνδέεται με λιγότερο μεθυλίωση του DNA στην περιοχή του υποκινητή ορισμένων γονιδίων, που προκαλείται από το

in vitro

διαφοροποίηση της γραμμής hESC Shef -1 σε δύο κυτταρικές γραμμές (που μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα και νευρωνικά προδρόμους) (Σχήμα 3Α). Εκτιμήσαμε την προδιαγραφή γενεαλογία χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευθέντα δείκτες [21] (Σχήμα 3Α, δεξιά πάνελ) και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται συστοιχίες μεθυλίωσης για την ταυτοποίηση γονιδίων που έγιναν κατά τη διάρκεια της υπο-μεθυλιωμένα διαφοροποίησης. Βρήκαμε ότι 12,98% (37/285) των γονιδίων υπερμεθυλίωση σε Shef-1 (τα οποία δεν είχαν μεθυλιωμένο σε όλα τα NTTs αναλύθηκαν) γίνονται μη μεθυλιωμένο κατά τη διάρκεια

in vitro

διαφοροποίηση. Από αυτούς, 12 γονίδια γίνει μη μεθυλιωμένα κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των νευρώνων και 25 κατά την αυθόρμητη διαφοροποίηση (Πίνακας S5). Τρία από αυτά τα γονίδια ήταν κοινή και στις δύο ομάδες (Σχήμα 3Β) και δύο από αυτούς ανήκαν στην Κλάση Β-ΙΙ. Είναι ιδιαίτερη σημείωση ότι, ενώ 9/25 των γονιδίων μη μεθυλιωμένων κατά την αυθόρμητη διαφοροποίηση ήταν της κατηγορίας Β-ΙΙ, καμία από τις 12 μη μεθυλιωμένα γονίδια κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των νευρώνων ανήκε σε αυτή την κατηγορία.

(Α) Αριστεράς εικόνες χέρι, σειρά αρχέγονων κυττάρων Shef-1 (άνω) και τα ίδια κύτταρα μετά νευρικής διαφοροποίησης (μέση) και αυθόρμητη διαφοροποίηση σε παρόμοια με ινοβλάστη κύτταρα (κατώτερο). Τα πάνελ δεξιά δείχνουν τα σχετικά επίπεδα mRNA του πλειοδυναμίας (Nanog, Oct4), νευροεξωδερμικής (Pax6, NEUROD1), και μεσοδερμικό (COL1A1, FN1) δείκτες πριν και μετά Shef-1 διαφοροποίηση. (Β) Αριθμός σειρών μεθυλιωμένος κατά τη διάρκεια Shef-1 νευρικά (κόκκινος κύκλος) και αυθόρμητη (μπλε κύκλος) διαφοροποίηση και επικάλυψη τους με τα γονίδια Τάξης Β-II (μαύροι κύκλοι) Κατηγορία Β-I και II. (Γ) Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση πολλαπλών κλώνων του προαγωγέα DLC1 σε Shef-1 βλαστοκυττάρων γραμμή (άνω) και τα ίδια κύτταρα μετά νευρικής διαφοροποίησης (μέση) και αυθόρμητη διαφοροποίηση σε παρόμοια με ινοβλάστη κύτταρα (κατώτερο). Ο κωδικός χρώματος είναι όπως για το Σχήμα 2. (D) Σχέσεις μεταξύ υπερμεθυλίωση DLC1 υποκινητή και την έκφραση κατά την διάρκεια της διαφοροποίησης των κυττάρων Shef-1. Το άνω πάνελ δείχνει το σχετικό σήμα μεθυλίωση που λαμβάνεται με τις συστοιχίες μεθυλίωση και το κάτω πάνελ τα επίπεδα έκφρασης του mRNA DLC1 σχέση με GAPDH.

Η

Για να καταδειχθεί ότι κάποιοι ΕΠΠΕ που συχνά υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο και hESCs μπορεί χάσουν μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, εστιάσαμε την προσοχή μας σε DLC1. Επιλέξαμε το γονίδιο αυτό επειδή οι συστοιχίες μεθυλίωση είχαν δείξει ότι χάνεται μεθυλίωση προαγωγού κατά την αυθόρμητη διαφοροποίηση των Shef-1, και επειδή είναι γνωστό ότι είναι μια TSG που συχνά υπερμεθυλίωση σε καρκίνο (Σχήμα S6) [22], [23]. Bisulfite αλληλούχιση πολλαπλών κλώνων επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τις συστοιχίες μεθυλίωση και έδειξε ότι υποκινητής DLC1 είναι υπερμεθυλιωμένο σε Shef-1 και γίνεται μη μεθυλιωμένη κατά την αυθόρμητη, αλλά δεν νευρικών, διαφοροποίηση (Σχήμα 3C). Στο Q-RT-PCR πειραμάτων DLC1 ήταν κακώς εκφράζεται στην κυτταρική γραμμή Shef-1 και έγινε υπερεκφράζεται κατά την αυθόρμητη, αλλά δεν νευρικών, διαφοροποίηση (Σχήμα 3D).

ΕΠΠΕ καταστέλλεται από υπερμεθυλίωση προαγωγού σε αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα των βλαστικών κυττάρων

Αφού απέδειξε ότι ορισμένα γονίδια του καρκίνου υπερμεθυλίωση και καταστέλλεται σε βλαστοκύτταρα και ότι μπορούν να χάσουν μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια

in vitro

διαφοροποίηση hESCs, ερευνήσαμε αν το φαινόμενο αυτό περιορίζεται στην εμβρυϊκή ανάπτυξη ή, αντίθετα , είναι μια επιγενετική μηχανισμός που σχετίζεται με την κατάσταση βλαστική ικανότητα, ανεξάρτητα από το στάδιο οντογενετικές του κυττάρου. Χρησιμοποιήσαμε συστοιχίες μεθυλίωσης για τον εντοπισμό γονιδίων υπερμεθυλίωση σε CD34 + σωματικών βλαστικών κυττάρων προγόνων (Σχήμα S7) σε σύγκριση με τα λεμφοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα περιφερικού αίματος, δύο τύποι ενήλικων πρωτογενών κυττάρων που προέρχονται από τα CD34 + αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα. Εντοπίσαμε 362 σημαντικά υπερμεθυλίωση ακολουθίες στα CD34 + κυττάρων (πίνακας σήμα & gt? 0,7) (Πίνακας S6). Η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των αλληλουχιών (92,27%, 334/362) επίσης μεθυλιωμένη σε hESCs και οι περισσότεροι είχαν συχνά υπερμεθυλίωση σε CCLs (83,43%, 302/362) (Σχήμα 4Α και ο Πίνακας S6). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερμεθυλίωση των γονιδίων του καρκίνου μπορεί να συμβεί σε βλαστικά κύτταρα, ανεξάρτητα από το στάδιο οντογενετικές (έμβρυο έναντι ενηλίκων). Εμείς επόμενη εντοπίστηκαν εννέα ακολουθίες που ήταν σημαντικά υπερμεθυλίωση σε CD34 + κυττάρων σε σχέση με περιφερικά λεμφοκύτταρα, και 16 αλληλουχίες που υπερμεθυλίωση σε αυτά τα προγονικά κύτταρα σε σχέση με τα ουδετερόφιλα (Πίνακας S7). Οι περισσότερες από τις αλληλουχίες που ταυτοποιούνται επίσης συχνά υπερμεθυλίωση σε hESCs (8/9 για τα λεμφοκύτταρα και 14/16 για τα ουδετερόφιλα) και CCLs (6/9 για τα λεμφοκύτταρα και 13/16 για τα ουδετερόφιλα). Επιπλέον, δεν υπήρχαν κοινά σε λεμφοκύτταρα και ουδετερόφιλα ακολουθίες και οι περισσότεροι από αυτούς ήταν μερικές φορές υπερμεθυλίωση στο NPTs. Είναι ενδιαφέρον, 28 από αυτές τις αλληλουχίες είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί ως γονίδια Τάξης Β-ΙΙ, ενώ κανένα από αυτά δεν ήταν από την κατηγορία BI (Εικόνα 4Α).

(Α) Το αριστερό πάνελ δείχνει τον αριθμό των σειρών που έχουν υπερμεθυλίωση στα σωματικά βλαστικά κύτταρα CD34 +, και υπερμεθυλίωση στα βλαστοκύτταρα και CCLs. Σημειώστε ότι οι περισσότερες από τις αλληλουχίες υπερμεθυλίωση σε σωματικά βλαστικά κύτταρα έχουν επίσης υπερμεθυλίωση σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα. Ο πίνακας δεξί χέρι δείχνει τον αριθμό των ακολουθιών υπερμεθυλίωση στα CD34 + κύτταρα (μαύρος κύκλος) ταξινομούνται ως γονίδια Τάξης Β-ΙΙ (κόκκινος κύκλος). Ακολουθίες υπερμεθυλίωση στα CD34 + κύτταρα δεν είχαν ταξινομηθεί ως γονίδια Κατηγορίας Β-Ι (μπλε κύκλος). (Β) Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση πολλαπλών κλώνων του προαγωγέα AIM2 σε Shef-1 και I3 βλαστικών κυττάρων (άνω), CD34 + αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων προγόνων (μέση), και τελικά διαφοροποιημένα αιμοποιητικά κύτταρα (περιφερικά λεμφοκύτταρα και ουδετερόφιλα). Ο κωδικός χρώματος είναι όπως για το Σχήμα 2. (C) Σχέσεις μεταξύ

AIM2

και

RUNX3

υπερμεθυλίωση προαγωγού και έκφραση σε CD34 + σωματικά προγονικών αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων και τελικά διαφοροποιημένα αιμοποιητικά κύτταρα (περιφερικά λεμφοκύτταρα και ουδετερόφιλα ). Το άνω πάνελ δείχνει το σχετικό σήμα μεθυλίωση που λαμβάνεται με τις συστοιχίες μεθυλίωση και το κάτω πάνελ τα επίπεδα έκφρασης του

AIM2

και

RUNX3

mRNAs σε σχέση με GAPDH.

Η

Τέλος, για να αποδείξει ότι ορισμένα καρκινικά μεθυλιωμένο γονίδια είναι επίσης συχνά μεθυλιώνονται σε σωματικά προγονικά βλαστικά κύτταρα και ότι η μεθυλίωση τους είναι σημαντική για την προδιαγραφή της γενεαλογίας, θεωρήσαμε δύο γονίδια:

RUNX3

και

AIM2

. Έχουμε επιλέξει

RUNX3

διότι, σε συμφωνία με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα [24], συστοιχίες μεθυλίωση μας έδειξαν ότι, σε σχέση με τα κύτταρα CD34 +,

RUNX3

ήταν μεθυλιωμένος εις περιφερικά λεμφοκύτταρα, αλλά όχι σε περιφερειακό ουδετερόφιλα. επιλεγμένα

AIM2

έγινε επειδή στο παρελθόν ήταν πιστεύεται ότι είναι μια TSG που συχνά υπερμεθυλίωση στον καρκίνο (Σχήμα S8) [25] και επειδή, σε αντίθεση με

RUNX3

, καθίσταται μη μεθυλιωμένες συγκεκριμένα στο μυελοειδή γράμμωσης (Σχήμα 4Β, C). Τα δεδομένα διθειώδες αλληλούχισης επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τις συστοιχίες, που δείχνουν ότι οι CD34 + κύτταρα και τα περιφερικά λεμφοκύτταρα πυκνά μεθυλιώνεται στην υποκινητή του

AIM2

γονίδιο ενώ τα περιφερειακά ουδετερόφιλα ήταν σχεδόν μη μεθυλιωμένο (Σχήμα 4Β). Για τον προσδιορισμό του ρόλου της υπερμεθυλίωσης υποκινητή του

AIM2

και

RUNX3

σε αιμοποιητικά διαφοροποίηση, χρησιμοποιήσαμε q-RT-PCR για να αναλυθεί η έκφρασή τους σε ομάδες μας των δειγμάτων (Σχήμα 4C). Βρήκαμε ότι η υπερμεθυλίωση προαγωγού πάντα που σχετίζονται με το γονίδιο καταστολής και στα δύο γονίδια και ότι η απώλεια της μεθυλίωσης υποκινητή στο

AIM2

και

RUNX3

στα περιφερικά λεμφοκύτταρα και ουδετερόφιλα, αντίστοιχα, συνδέθηκε με επανέκφραση τους ( Εικόνα 4C).

Συζήτηση

η ανώμαλη υπερμεθυλίωση υποστηρικτής των ΕΠΠΕ και παράγοντες διαφοροποίησης είναι ένα κεντρικό επιγενετική μεταβολή στον καρκίνο [26], [27]. Τα γονίδια που υποβάλλονται σε τέτοιες μεταβολές στον καρκίνο έχει αναφερθεί να κατασταλεί με βλαστοκύτταρα από την ίδρυση του «δισθενή περιοχές χρωματίνης» που αποτελείται από την ενεργοποίηση (H3 λυσίνη 27 μεθυλίωσης) και την καταστολή (H3 λυσίνη 4 μεθυλίωση) σημάδια της ιστόνης που να τους κρατήσει είναι έτοιμη για την ενεργοποίηση, αλλά , την ίδια στιγμή, να τους προδιαθέτει σε παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση προαγωγού στην ενήλικη καρκίνους [7] – [9]. Εδώ αποδεικνύουμε ότι υπάρχει ένα άλλο επίπεδο πολυπλοκότητας όπου μερικά από τα γονίδια που συχνά παρεκκλίνοντα υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο επίσης συχνά υπερμεθυλίωση σε hESCs. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, όπως και στο παρελθόν είχε προταθεί για τα κύτταρα ποντικού [28], υποστηρικτής μεθυλίωση του DNA μπορεί να είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση του γονιδίου σε βλαστοκύτταρα.

Βάσει της κατάστασης μεθυλίωσης στο hESCs ιδρύσαμε δύο κατηγορίες καρκίνο μεθυλιωμένο γονιδίων: γονίδια κατηγορίας Α, οι οποίες είναι συχνά μη μεθυλιωμένες στην hESCs, και τα γονίδια της κατηγορίας Β, οι οποίες συχνά υπερμεθυλίωση σε βλαστοκύτταρα. Όπως έχουμε απροσδόκητα βρει ότι ένα σημαντικό ποσοστό των γονιδίων που περιλαμβάνονται στις δύο ομάδες ήταν επίσης συχνά υπερμεθυλίωση στην κανονική διαφοροποιημένους ιστούς, ιδρύσαμε δύο νέες υποκατηγορίες καρκίνου μεθυλιωμένο γονίδια: υποκατηγορία Ι, για τα γονίδια που είναι ως επί το πλείστον μη μεθυλιωμένα σε φυσιολογικούς ιστούς, και την υποκατηγορία ΙΙ , για γονίδια που μερικές φορές υπερμεθυλίωση σε φυσιολογικούς ιστούς. Η βιολογική ερμηνεία της ανώμαλης μεθυλίωσης κατά του καρκίνου μεθυλιωμένο γονίδια κατηγοριών Α και Β και δύο υποκατηγορίες τους είναι εντελώς διαφορετική. γονίδια κατηγορίας Α-Ι συχνά υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς ή hESCs. Αυτά τα γονίδια δεν υποτίθεται ότι πρέπει να ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA κατά τη διάρκεια της κανονικής ανάπτυξης και έτσι η υπερμεθυλίωση στον καρκίνο πρέπει πάντα να ερμηνεύονται ως παρεκκλίνουσα διαδικασία. γονίδια κατηγορίας Α-ΙΙ συχνά μεθυλιωμένη σε CCLs και μερικές φορές σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά σπάνια σε hESCs. Η μεθυλίωση των γονιδίων αυτών μπορεί να είναι σημαντική για την προδιαγραφή γενεαλογία και πρέπει να θεωρηθεί παρεκκλίνουσα στον καρκίνο, όταν εμφανίζεται σε ένα τύπο όγκου στου οποίου αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό δεν είναι υπερμεθυλιωμένο. Κλάση BI γονίδια (εκτός από

ASCL2

,

ΝΡΥ,

και

SLC5A8

γονιδίων, των οποίων προαγωγός υπερμεθυλίωση του DNA σε γραμμές ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα θα μπορούσε να οφείλεται στο

in vitro

διαδικασία πολιτισμού [11]) συχνά υπερμεθυλίωση στα βλαστοκύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα γραμμές αλλά ποτέ σε φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια της μεθυλίωσης στους υποστηρικτές αυτών των γονιδίων μπορεί να είναι μια σημαντική επίδραση στην απώλεια πλειοδυναμίας κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. υπερμεθυλίωση τους στον καρκίνο θα πρέπει πάντα να θεωρείται ως παρεκκλίνουσα. γονίδια κλάσης Β-ΙΙ συχνά υπερμεθυλίωση σε hESCs και καρκινικά κύτταρα, αλλά, όπως είναι επίσης μερικές φορές μεθυλιωμένα σε φυσιολογικούς ιστούς, υπερμεθυλίωση τους στον καρκίνο μπορεί να θεωρηθεί παρεκκλίνουσα σε τύπους όγκου μόνο στου οποίου κανονικά αντίστοιχά είναι εντελώς μεθυλιωμένη. Εκτός από αυτό, το γεγονός ότι δεν είναι όλα τα γονίδια συχνά υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένη σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς που αναλύθηκαν είναι ένα εξαιρετικά σημαντικό εύρημα σε επιγενετική καρκίνο [26], επειδή η υπερμεθυλίωση προαγωγέα ενός γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο τύπο όγκου δεν θα πρέπει να είναι