Αφηρημένο

Εισαγωγή

Σε αυτό το άρθρο, αναφέρουμε 7 νέες γονιδιακές μεταλλάξεις KRAS ανακαλύφθηκε, ενώ εκ των υστέρων μελέτη του επιπολασμού και της διεξαγωγής των μεταλλάξεων KRAS σε καρκινικούς ιστούς που λαμβάνονται από 56 ασθενείς Σαουδική σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου από την ανατολική επαρχία.

Μέθοδοι

το γονιδιακό DNA εξήχθη από φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη καρκινικά και noncancerous παχέος ιστούς. Η επιτυχής και ειδική PCR προϊόντα ήταν τότε αμφίδρομα ακολουθία για να ανιχνεύσει το εξόνιο 4 μεταλλάξεις ενώ Detection κιτ Mutector II χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12, 13 και 61. Η λειτουργική επίπτωση των νέων μεταλλάξεων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική εργαλεία και μοριακής μοντελοποίησης.

Αποτελέσματα

μεταλλάξεις του γονιδίου KRAS εντοπίστηκαν στον ιστό του καρκίνου του 24 περιπτώσεις (42,85%). Από αυτούς, 11 είχαν εξόνιο 4 μεταλλάξεις (19,64%). Μπορούν έτρεφε 8 διαφορετικές μεταλλάξεις οι οποίες εκτός από δύο μεταβληθεί η ακολουθία KRAS πρωτεΐνης αμινοξέων και όλα εκτός από ένα ήταν μυθιστόρημα, όπως αποκαλύφθηκε από COSMIC βάση δεδομένων. Οι ανιχνεύονται νέες μεταλλάξεις βρέθηκαν να είναι σωματικά. Μία μετάλλαξη προβλέπεται να είναι καλοήθης. Οι υπόλοιπες μεταλλάξεις αναμένεται να προκαλέσει σημαντικές αλλαγές στη δομή της πρωτεΐνης. Από αυτά, η μετάλλαξη ανοησίες Q150X είναι η δεύτερη μετάλλαξη περικοπή να αναφερθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου στη βιβλιογραφία.

Συμπεράσματα

Η ανακάλυψή μας των νέων εξόνιο 4 μεταλλάξεις KRAS που είναι, μέχρι στιγμής, μοναδικό σε ασθενείς Σαουδική καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να αποδοθεί σε περιβαλλοντικούς παράγοντες ή /και φυλετικές /εθνοτικές διαφορές οφείλονται σε γενετικές διαφορές. Εναλλακτικά, μπορεί να σχετίζονται με ανεπάρκεια των κλινικών μελετών για μεταλλάξεις, εκτός εκείνων στα κωδικόνια 12, 13, 61 και 146. δοκιμών Περαιτέρω KRAS σε ένα μεγάλο αριθμό ασθενών διαφόρων εθνοτήτων, ιδιαίτερα πέρα ​​από τα πιο κοινά αλληλόμορφα hotspot στα εξόνια 2 και 3 είναι απαραίτητη για την αξιολόγηση του επιπολασμού και να εξερευνήσετε την ακριβή προγνωστική και προβλεπτική σημασία των ανακαλύψει νέες μεταλλάξεις καθώς και πιθανός ρόλος τους στην καρκινογένεση του παχέος

Παράθεση:. Naser WM, Shawarby MA, Al-Tamimi DM, Seth Α, al-Quorain Α, Nemer AMA, et al. (2014) Μυθιστόρημα KRAS μεταλλάξεις γονιδίων σε Σποραδικές του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (11): e113350. doi: 10.1371 /journal.pone.0113350

Επιμέλεια: Klaus Brusgaard Πανεπιστημίου Odense νοσοκομείο, Δανία

Ελήφθη: 12 του Ιούνη του 2014? Αποδεκτές: 22 Οκτ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Νοέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Naser et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση της έρευνας για την «K-ras, p53, EGFR και HER2 γονιδίου εκτροπές σε καρκίνο του παχέος εντέρου» από την Κοσμητεία της Επιστημονικής Έρευνας, Πανεπιστήμιο της Dammam, Σαουδική Αραβία (επιχορήγηση # 2011003). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη του καρκίνου (καρκινογένεσης) είναι μια διαδικασία πολλαπλών βημάτων που πιστεύεται ότι προκύπτει από τη συσσώρευση των γενετικών αλλοιώσεων σε ένα μόνο κύτταρο κατά τη διάρκεια ζωής ενός ατόμου. Ο αριθμός των γονιδίων βρέθηκε να σχετίζεται με διαφορετικές μορφές καρκίνου αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς. Οι πιο συχνά ενεργοποιημένα γονίδια είναι μέλη της οικογένειας γονιδίων RAS, δύο εκ των οποίων (Harvey- Η) και (Kirsten-Κ) προσδιορίστηκαν αρχικά ως ομόλογη με ιικό μετασχηματισμό γονιδίων, ενώ το τρίτο (ΕΡΑ) ταυτοποιήθηκε σε έναν άνθρωπο νευροβλάστωμα . Το προϊόν γονίδιο RAS είναι ένα μονομερές μεμβράνη-εντοπισμένο πρωτεΐνη G 21 kd που λειτουργεί ως μοριακός διακόπτης που συνδέει υποδοχέα και ενεργοποίηση κινάσης τυροσίνης μη υποδοχέα στους μεταγενέστερους κυτοπλασμική ή πυρηνικά γεγονότα. Κάθε κύτταρο θηλαστικού περιέχει τουλάχιστον τρία διακριτά RAS πρωτο-ογκογονίδια που κωδικοποιεί στενά συνδεδεμένα, αλλά διακριτές πρωτεΐνες. γονίδια RAS μπορεί να ενεργοποιηθεί από διάφορες μεταλλάξεις σημείου περιλαμβανομένων και εκείνων που κωδικόνια 12, 13, 61, ή 113-117. Η μεταγωγή σήματος μέσω πρωτεϊνών ras περιλαμβάνει υδρόλυση του GTP, και ενεργοποίηση μεταλλάξεων αναστέλλουν αυτή τη διαδικασία, το κλείδωμα της πρωτεΐνης στην διαμόρφωση «στο» σηματοδότηση [1]. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε αυτές τις πρωτεΐνες RAS οδηγούν σε ιδιοσυστατική σηματοδότηση, διεγείροντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και αναστέλλοντας την απόπτωση.

ογκογόνος KRAS μεταλλάξεις είναι διαδεδομένη σε σχεδόν όλους τους τύπους καρκίνου, καθιστώντας KRAS ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια σε ανθρώπινους καρκίνους [ ,,,0],2]. Τα ογκογονίδια RAS, σε συνδυασμό με το γονίδιο καταστολής όγκων ρ53, είναι τα γονίδια που βρέθηκαν πιο σταθερά που πρόκειται να μεταλλαχθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου [3] – [4] στην οποία τα επιθηλιακά κύτταρα της προόδου παχέος εντέρου από μικρές αδένωμα μέσω μεγάλων αδένωμα, και τέλος, να γίνει αδενοκαρκίνωμα [3].

Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει τη συχνότητα των μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Η μεγαλύτερη σειρά ήταν το «κάθαρμα» μελέτη του 2721 παχέος περιπτώσεων καρκίνου αναφέρουν ότι η επίπτωση του 37,7% [5]. Συγκρίσιμες συχνότητες έχουν αναφερθεί στη συνέχεια [6] – [8]

Ο σκοπός αυτού του άρθρου είναι να αναφέρουν επτά νέες μεταλλάξεις KRAS και να ανοίξει την πόρτα για περαιτέρω δοκιμή KRAS σε ένα μεγάλο αριθμό ασθενών, προκειμένου να εκτιμηθεί η. επιπολασμός και να εξερευνήσετε την ακριβή προγνωστική και προβλεπτική σημασία των ανακάλυψαν μεταλλάξεις, καθώς και ο πιθανός ρόλος τους στην παχέος καρκινογένεση. Οι νέες μεταλλάξεις που ανακαλύφθηκαν, ενώ εκ των υστέρων μελέτη του επιπολασμού και της διεξαγωγής των μεταλλάξεων KRAS σε καρκινικούς ιστούς που λαμβάνονται από 56 ασθενείς Σαουδική σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου από την ανατολική επαρχία, και συσχετίζοντας αυτές με τα κλινικά χαρακτηριστικά, και p53, EGFR (επιδερμικού αυξητικού παράγοντα) και HER2 ( ανθρώπινου παράγοντα receptor2 επιδερμικού αυξητικού) έκφραση της πρωτεΐνης, και την κατάσταση μεταλλάξεων του γονιδίου EGFR. Δεν ήταν πρόθεσή μας να διερευνήσει όλες τις πιθανές μεταλλάξεις KRAS που μπορεί να βρεθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου, γι ‘αυτό ακριβώς στοχεύει τις μεταλλάξεις που εμπλέκονται συνήθως σε αυτή την ασθένεια. Η ανακάλυψη νέων μεταλλάξεων προήλθε μόνο από τύχη κατά την εκτέλεση της μελέτης. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για το πρότυπο των μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS σε ασθενείς Σαουδική καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από τη μόνιμη επιτροπή δεοντολογίας της έρευνας σε ζωντανά πλάσματα (SCRELC), η οποία είναι η IRB του θεσμικού μας οργάνου (αριθμός έγκρισης: IRB-2014-01-324). Δεν ήταν δυνατό να λάβει γραπτή συγκατάθεση από τους συμμετέχοντες όπως οι περισσότεροι από τους ασθενείς είχαν χαθεί για την παρακολούθηση. Το θέμα αυτό συζητήθηκε με την επιτροπή, η οποία συμφώνησε ότι, σύμφωνα με τις «Κατευθυντήριες γραμμές για την Ηθική Έρευνα Πρακτική» [9], δεν απαιτείται συγκατάθεση σε μια τέτοια αναδρομική μελέτη όπως και οι πληροφορίες που χρησιμοποιούνται από τους συντάκτες ήταν ήδη προσιτά στο κοινό και έκανε δεν αποκαλύπτει την ταυτότητα του ασθενούς. Επιπλέον, η μελέτη που κανένα κίνδυνο για τους συμμετέχοντες.

Πενήντα έξι σποραδικά παχέος περιπτώσεις καρκινώματος της Σαουδικής ασθενείς ανασύρθηκαν από τα αρχεία του Τμήματος Παθολογίας του βασιλιά Φαχντ Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου. Οι περιπτώσεις επιλέχθηκαν τυχαία με βάση την διαθεσιμότητα των κλινικών δεδομένων και μπλοκ ιστού εκπρόσωπος παραφίνη επαρκούν για την εκτέλεση των απαιτούμενων διαδικασιών, καθώς και αρνητικά οικογενειακό ιστορικό για τον ορθοκολικό καρκίνο. Το χρονικό πλαίσιο που ήταν 11 ετών (1998-2008).

Κλινική και παθολογικές

δεδομένων

Οι κλινικές και παθολογικές δεδομένων συμπεριλαμβανομένου του τύπου ιστολογική, τον βαθμό και το στάδιο του καρκίνου συλλέχθηκαν από τα αρχεία των ασθενών . Κλινικά και παθολογικά δεδομένα ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας κριτήρια του WHO [10].

Ανοσοϊστοχημική χρώση

Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε για EGFR, HER2 και ρ53 στις 4 μm πάχους τομές παραφίνης κόβονται από μπλοκ του ορθοκολικού καρκινωματώδεις ιστός. Η χρώση πραγματοποιήθηκε σε ένα Benchmark Ventana αυτοματοποιημένη ανοσοκηλιδωτή σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Ventana Medical Systems Inc., Στρασβούργο). Οι πηγές και οι αραιώσεις των πρωτογενών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη φαίνονται στον Πίνακα S1. Οι ανοσοχρωματίστηκε τομές εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός και αξιολογήθηκαν με το χέρι από δύο παθολόγους. Οριστικά μεμβράνη ή /και κυτταροπλασματική χρώση ήταν αναγκαίο να εξεταστεί μια υπόθεση ως EGFR ή HER2 /neu θετική, ενώ η πυρηνική χρώση τουλάχιστον το 10% των καρκινικών κυττάρων που απαιτούνται για την p53 θετικότητα (Σχήμα S1).

Γονιδιωματική DNA

εκχύλιση

Πέντε έως οκτώ 10 μm πάχους σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, τομές καρκινικού ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση γενωμικού DNA. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν δύο φορές για 5 λεπτά σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν διαδοχικά σε 100, 96 και 70% αιθανόλη για 30 δευτερόλεπτα το καθένα, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη για 30 δευτερόλεπτα, ξεπλύθηκαν με νερό και επωάστηκαν για μία νύχτα σε 1 Μ NaSCN στους 37 ° C για να απομακρυνθεί διασταυρούμενων έδαφος διά παιγνίδι γκολφ. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν δύο φορές για 10 λεπτά σε 1 χ PBS σε θερμοκρασία δωματίου, και εντελώς ξηραίνεται στον αέρα. Όπως υποδεικνύεται από έναν έμπειρο παθολόγο, καρκινικό ιστό αποξέστηκε από την επιφάνεια γυάλινη πλάκα με νυστέρι για τη λήψη τουλάχιστον 70% των κυττάρων του όγκου και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε σωλήνες μικρο-φυγοκέντρησης 2,0 ml. Γονιδιωματικό DNA στη συνέχεια εκχυλίσθηκε χρησιμοποιώντας το WaxFree DNA Kit (TrimGen, Maryland) για την εφαρμογή το πρότυπο πρωτόκολλο που περιγράφεται από τον κατασκευαστή με ολονύκτια επώαση στο στάδιο 14 του πρωτοκόλλου. Εκχυλίσματα γενωμικό DNA ποσοτικοποιήθηκε με Epok φασματοφωτόμετρο και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 0,8% για να απεικονίσει κατανομή μεγέθους DNA.

Για τους ασθενείς που εμφάνισαν νέα KRAS εξόνιο 4 μεταλλάξεις, εξάγαμε επίσης γενωμικού DNA από noncancerous ορθοκολικό ιστό, όπως περιγράφεται πάνω από. Η noncancerous ιστός ελήφθη από έναν όγκο ελεύθερο περιθώριο εκτομή από το δείγμα κολεκτομή του ίδιου ασθενούς.

PCR ενίσχυση του KRAS εξονίου 4

Sequencing εφαρμόστηκε για την ανίχνευση KRAS εξόνιο 4 μεταλλάξεις ως κιτ για ανίχνευση A146T – η οποία είναι η εξόνιο 4 μετάλλαξη αναφερθεί ότι εμπλέκεται συνήθως σε καρκίνο του παχέος εντέρου [11] – [12] – δεν ήταν διαθέσιμα στο εμπόριο. Μια ένθετη προσέγγιση PCR παρόμοια με εκείνη που εγκρίθηκε από Fadhil, et al [13] τέθηκε σε εφαρμογή για να ενισχύσουν και να εκτελέσει την ανάλυση τήξη για εξώνιο 4 του γονιδίου KRAS, προκειμένου να ελέγξει για την επιτυχή αντιδράσεις PCR και ειδικότητα. Ο πρώτος γύρος της PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα τελικό όγκο 25 μΙ. Κάθε αντίδραση περιείχε 1 × QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, 0,5 × Q-διάλυμα, 2 ζεύγη εκκινητών (Πίνακας 1) που καλύπτει hotspots σε KRAS εξόνιο 4 με 0,3 μΜ τελική συγκέντρωση για κάθε εκκινητή και 10 ng εκμαγείου DNA. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Veriti Thermal Cycler ΑΒΙ (Life Technologies) για 15 λεπτά στους 95 ° C, 40 κύκλοι η κάθε μία από 30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, 90 δευτερόλεπτα στους 55 ° C και 90 δευτερόλεπτα στους 72 ° C, που ακολουθείται από 10 λεπτά στους 72 ° C. Μετά την προσθήκη 2 μΐ (5 x) φόρτωση χρωστικής, 10 μΙ κάθε ενισχυμένου δείγματος σε ηλεκτροφόρηση σε 2% ΤΒΕ αγαρόζης αιθίδιο γέλη βρωμιούχο χρωματίστηκαν και visiualized με σύστημα GelDoc από Biorad.

Η

υψηλής ανάλυσης ανάλυση καμπύλης τήξης (HRM) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φωλιασμένη αντίδραση PCR σε ένα τελικό όγκο 15 μΐ, το οποίο περιείχε 1 × HRM Master Mix (Qiagen) και 1 ζεύγος εκκινητών ειδικών για το εξόνιο 4 (Πίνακας 1) με κάθε εκκινητή σε 0,7 μΜ τελική συγκέντρωση . Το εκμαγείο αποτελείτο από 1.5 μλ αραίωσης 1:100 του προϊόντος από τον πρώτο γύρο PCR αντίδραση. αντίδραση ένθετη PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο οδηγιών του HRM Type-it Kit (Qiagen).

HRM χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της διάστασης (τήξη) τα χαρακτηριστικά του δίκλωνου DNA (dsDNA). σύνθεση ζευγών βάσεων και GC επιρροή περιεχόμενο τήξη συμπεριφορά των διαφόρων τεμαχίων dsDNA. Κατά τη διάρκεια του HRM, dsDNA εκτίθεται σε βαθμιαία αυξανόμενη θερμοκρασία υπό την παρουσία μιας φθορίζουσας χρωστικής (π.χ. EvaGreen). Η φθορίζουσα χρωστική φθορίζει μόνο όταν δεσμεύεται σε dsDNA. Ο φθορισμός παρακολουθείται κατά τη διάρκεια της μετάβασης του dsDNA σε μονόκλωνο DNA (ssDNA), η οποία μειώνεται καθώς λιώνει dsDNA. Χάραξη αλλαγές στον φθορισμό μετά τη δημιουργία ειδικών θραυσμάτων DNA κατά την διάρκεια της PCR οδηγούν σε ενιαίο κορυφές που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένες αμπλικόνια [14].

DNA

αλληλούχιση

Μετά την HRM, επιτυχής και ειδικών προϊόντων PCR που δείχνει κορυφή ενός τήξης ήταν στήλη καθαρίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προϊόντα PCR εκλούεται με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης 30 μΐ και αραιώθηκαν 1:10 με νερό. Αραιωμένο PCR προϊόντα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σαν εκμαγείο για αλληλούχηση κύκλου μέσω συσκευασία Big Dye Terminator v1.1 (Applied Biosystems). Αμφίδρομη αλληλουχίας (δηλαδή προς τα εμπρός και προς τα πίσω) διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντίδραση προσδιορισμού αλληλουχίας κύκλου (10 μΐ τελικός όγκος) που αποτελείται από 1 × τερματιστή προμίγμα, 1 ρυθμιστικό × αλληλούχιση, 0.4 μΜ είτε M13-F ή Μ13-R εναρκτήρες (Πίνακας 1) και 4 μΐ αραιωμένου προτύπου. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν επί Veriti (ϋίβ Technologies) σύμφωνα με το ακόλουθο πρωτόκολλο: Ένας κύκλος 95 ° C για 15 λεπτά? 30 κύκλοι των 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 5 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 4 λεπτά. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας καθαρίστηκαν με κιτ καθαρισμού της ABI BigDye XTerminator (Life Technologies) και φορτώθηκαν σε ένα Γενετικό Αναλυτή 3500 (Life Technologies). δεδομένα αλληλουχίας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έκδοση V5.4 αλληλουχίας Ανάλυση και SeqScape λογισμικά v2.7 (Life Technologies).

Μαγνητοσκοπημένα δοκιμασίες τερματισμού (STA)

STA βασίζεται σε μεθόδους επέκτασης εκκινητή, όπου 3 ολιγονουκλεοτίδια (2 για την ενίσχυση και 1 για ανίχνευση μετάλλαξης) χρησιμοποιούνται για να ανιχνευθεί μια ειδική μετάλλαξη. Ωστόσο, STA χρησιμοποιεί την ενσωμάτωση των πολλαπλών σημασμένων νουκλεοτιδίων στον εκκινητή ανίχνευση σε σύγκριση με ενσωμάτωση ενός μόνο επισημασμένου νουκλεοτιδίου σε άλλες μεθόδους επέκτασης εκκινητή που βασίζονται. Ο εκκινητής ανίχνευσης αναδιατάσσεται μία βάση πριν από την θέση του στόχου και στη συνέχεια επεκτάθηκε μόνο όταν η περιοχή στόχος είναι μεταλλαγμένο. Παράταση της αστάρι ανίχνευσης με πολλαπλές σημασμένα νουκλεοτίδια εντείνει σήμα και αυξάνει την PCR μήκους θραύσματος επιτρέπει τις διακρίσεις μετάλλαξη από άγριου τύπου μέσω του χρώματος αιχμής και το μέγεθος του τεμαχίου μετά την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση [15].

Χρησιμοποιήσαμε Mutector II Mutation Detection κιτ (TrimGen, Maryland) για τον εντοπισμό μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12, 13 και 61 του γονιδίου KRAS που είναι οι μεταλλάξεις KRAS αναφερθεί ότι εμπλέκεται συχνότερα σε καρκίνο του παχέος εντέρου [11] – [12], καθώς και ειδικές μεταλλάξεις του γονιδίου EGFR σε χαρακτηριστικές θέσεις στα εξόνια 18-21, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων σημειακές μεταλλάξεις, απαλοιφές και εισαγωγές που ταυτοποιηθούν οι ασθενείς που είναι πιο πιθανό να ανταποκριθεί σε στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων κινάσης τυροσίνης erlotinib και gefitinib. Τα κιτ ανίχνευσης μετάλλαξης Mutector II εφαρμόσουν την τεχνολογία STA για την ταυτόχρονη ανίχνευση και διαφοροποίηση των μεταλλάξεων που συμβαίνουν στην ίδια θέση-στόχο. Mutector II Mutation Detection Kit GP05-CM ανιχνεύει και να διαφοροποιεί τα 12 μεταλλάξεις που συμβαίνουν στα κωδικόνια 12 και 13, ενώ ανίχνευση μεταλλάξεων Mutector II Kit GP06 έχει σχεδιαστεί για 5 μεταλλάξεις που συμβαίνουν στο κωδικόνιο 61. Mutector ΙΙ Ανίχνευση Κιτ μετάλλαξης GP07-02 ανιχνεύει μεταλλάξεις σε χαρακτηριστικές θέσεις στα εξόνια 18-21 του γονιδίου EGFR. τεχνολογία STA βελτιώνει σημαντικά την ευαισθησία. Ανιχνεύει τόσο χαμηλά όσο 1% σωματικές μεταλλάξεις σε σύγκριση με το 15-20% μέσω αλληλούχισης Sanger [15]. Εν συντομία, 50 ng gDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια που παρέχονται μέσω των συνθηκών PCR που περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Τα προϊόντα PCR καθαρίζονται και μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12, 13, και 61 εμπλουτίστηκαν χωριστά με μετάλλαξη ειδική αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Δείγματα που περιέχουν εμπλουτισμένο μεταλλάξεις καθαρίστηκαν από την περίσσεια φθορίζουσες χρωστικές, αραιώνεται 5-10 φορές με νερό. Τρία μικρολίτρα των αραιωμένων προϊόντα επέκτασης εκκινητή αναμείχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης που παρέχονται στο κιτ και θραύσμα μεγέθους μέσω τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης σε 3500 Genetic Analyzer ΑΒΙ (Life Technologies). τριχοειδή ηλεκτροφόρηση συνθήκες και ρύθμιση του οργάνου για τη συλλογή δεδομένων τρέχει εξηγούνται αναλυτικά στο εγχειρίδιο οδηγιών Mutector II Κιτ μετάλλαξης.

Λειτουργική πρόβλεψη και μοριακής μοντελοποίησης νέων μεταλλάξεων KRAS

Οι λειτουργικές επιπτώσεις της μη -synonymous (πρωτεΐνη δομή αλλοίωση) εξόνιο 4 μεταλλάξεις αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας POLYPHEN-2 (πολυμορφισμός φαινοτυπική v2) [16] και να κοσκινίσει (διαλογή δυσανεξία από ανεκτική εργαλεία) [17]. Χρησιμοποιήσαμε επίσης το βαθμολογητή μετάλλαξη [18] για την πρόβλεψη της λειτουργικής επίδραση των μεταλλάξεων με βάση την εξελικτική διατήρηση του προσβεβλημένου αμινοξέος σε ομόλογα πρωτεΐνης. Επιπροσθέτως, μοριακή μοντελοποίηση εφαρμόσθηκε για την πρόβλεψη της λειτουργικής επίδραση των νέων μεταλλάξεων ανιχνεύονται. Η δομή της πρωτεΐνης K-ras που χρησιμοποιούνται για τη μοντελοποίηση λήφθηκε από την Protein Data Bank (ΡϋΒ ID: 3gft). Μοντελοποίηση των μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε και κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας PyMOL [19] – [20]. PyMOL εμφανίζει πληροφορίες σχετικά με όλες τις στερική παρεμβολή μεταξύ του μεταλλαγμένου αμινοξέος και άλλες πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων και της διαμόρφωσης με τη μικρότερη στερεοχημική παρεμβολή επιλέγεται χειροκίνητα. Τα μεταλλαγμένα πλευρικές αλυσίδες μοντελοποιήθηκαν σε θέσεις της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας στροφομερών με χαμηλότερο αντικρουόμενες Van der Waals ακτίνες και τη διαμόρφωση με τη μικρότερη στερεοχημική παρεμβολή με άλλες πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων. Η άγριου τύπου και η μεταλλαγμένη πρωτεϊνική δομή ήταν επάνω για να τονίσει τις προβλεπόμενες αλλαγές διαμόρφωσης που προκαλείται από κάθε μετάλλαξη.

Η στατιστική ανάλυση

Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του SPSS για Windows, έκδοση 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Τα αποτελέσματα ήταν εγκάρσια πινακοποιημένες να εξετάσει τις σχέσεις μεταξύ των μεταβλητών. Η στατιστική ανάλυση των κατηγορικών μεταβλητών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση χ-τετράγωνο για τη δοκιμή του συνεταιρίζεσθαι και το ακριβές τεστ του Fisher ανάλογα με την περίπτωση. Όπου εξετάστηκαν δύο συνεχείς ανεξάρτητες μεταβλητές, χρησιμοποιήθηκαν t-test και ανάλυση της διακύμανσης. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρείται σημαντική σε όλες τις στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Μυθιστόρημα KRAS μεταλλάξεις

μεταλλάξεις του γονιδίου KRAS εντοπίστηκαν στον καρκινικό ιστό της 24ης έξω 56 περιπτώσεις που μελετήθηκαν (42,85%). Από αυτούς, 11 (19,64%) είχαν εξόνιο 4 μεταλλάξεις εντοπισμένη μεταξύ των κωδικονίων 134 και 150, ενώ 13 (23,21%) είχαν μεταλλάξεις στο εξόνιο 2, που επηρεάζουν κωδικόνια 12 και 13. Μεταλλάξεις δεν ανιχνεύθηκαν στο κωδικόνιο 61 του εξονίου 3. Η κατανομή μεταλλάξεων σε ομάδα μας φαίνεται στον πίνακα S2.

Οι 11 περιπτώσεις με το εξώνιο 4 εκτροπές harbored 8 διαφορετικές μεταλλάξεις (Πίνακας 2) των οποίων το ένα προηγουμένως αναφέρθηκε (p.Ala146Thr, μια παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη) και 7 ήταν μυθιστόρημα, όπως αποκαλύφθηκε από την κοσμική βάση δεδομένων προσβάσιμες στο 19/09/2014. Εμείς επιβεβαίωσε όλα τα νέα παραλλαγές αλληλουχίας ανιχνεύθηκαν σε ομάδα μας με αλληλούχιση το αντίθετο σκέλος. Όλα τα δείγματα έδειξαν μια ταυτόσημη παραλλαγή αλληλουχίας στο αντίθετο κλώνο. Το ασθενές σήμα σε δείγμα 33 (Σχήμα 1) θα μπορούσε να αποδοθεί σε μείωση της περιεκτικότητας σε ιστό όγκου? η άλλη (προς τα εμπρός) κλώνος έδειξε επίσης ένα ασθενές σήμα της παραλλαγής αλληλουχίας (c.404G & gt? Α), καθώς και. Ωστόσο, αλληλούχιση του noncancerous ιστό του ασθενούς δεν έδειξε απολύτως για μεταβολή c.404G & gt σήμα? Α που δηλώνει ότι το σήμα στο δείγμα είναι πάνω από το όριο ανίχνευσης του πρωτοκόλλου προσδιορισμού σειράς. Ένα από τα νέα μεταλλάξεις (G138G) ανιχνεύθηκε σε τρεις ασθενείς και ένας άλλος (Q150X), ανιχνεύθηκε σε δύο άλλους ασθενείς. Τέσσερα από τα επτά μεταλλάξεις ήταν εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις μεταβάλλοντας την αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης (A134V, R135K, E143K και R149G), ενώ δύο μετάλλαξη ήταν συνώνυμες (G138G και K147K) και ένα, μια ανοησία περικοπή μετάλλαξη (Q150X). Οι παρανοηματική και ανοησίες εξόνιο 4 μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν σε επτά ασθενείς (12,5% του συνόλου). Το Σχήμα 1 είναι μία ηλεκτροφεροδιάγραμμα για τις εξόνιο 4 ανοησίες και εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις KRAS που περικόπτεται ή μετέβαλε την αλληλουχία KRAS πρωτεΐνη αμινοξέων, αντίστοιχα. Δείγματα 32 και 45 περιείχαν επίσης μια άλλη μετάλλαξη (p.Gly12Asp) στο κωδικόνιο 12 του εξονίου 2, όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση STA, που συχνά ανιχνεύονται σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (Σχήμα 2). Τα νέα εξόνιο 4 μεταλλάξεις KRAS βρέθηκαν να είναι σωματικά αφού τμήματα noncancerous ορθοκολικό ιστό από ασθενείς οι οποίοι φιλοξενούνται αυτές οι μεταλλάξεις έδειξε την αλληλουχία άγριου τύπου (Σχήμα 1).

Όλα απεικονίζεται μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν μέσω αλληλουχίας του προς τα εμπρός κλώνο. τον αριθμό του δείγματος και η ονοματολογία μετάλλαξη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές HGVS επισημαίνονται πάνω από κάθε μετάλλαξη. Τα βέλη δείχνουν την θέση της αλλαγής του ζεύγους βάσεων

Η

Κάτω πάνελ είναι για το δείγμα 32 που δείχνει την 2η κόκκινη κορυφή (GGT & gt? GAT). Και το 3ο μαύρη κορυφή (άγριου τύπου)

Η λειτουργική επίπτωση των μη συνώνυμες μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη KRAS εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική εργαλεία και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 3. για παράδειγμα, οι E143K και Q150X μεταλλάξεις προβλέπεται να έχουν επιζήμιες και υψηλή επίπτωση επί της πρωτεΐνης ενώ το R135K προβλέπεται να γίνει ανεκτή ή να ουδέτερη επίπτωση επί της πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα χρησιμοποιήσαμε μοριακή μοντελοποίηση για την αξιολόγηση της λειτουργικής επίδραση αυτών των νέων μεταλλάξεων KRAS και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3. Η μοριακή ταιριάζει δεδομένα μοντελοποίηση με την πρόβλεψη από POLYPHEN-2 και να κοσκινίσει, καθώς και στοιχεία διατήρησης (Πίνακας 3). Για παράδειγμα, η μετάλλαξη R135K προβλέπεται να είναι καλοήθεις και μοντελοποίηση έδειξε επίσης μικρή προβλεπόμενη επίδραση στην δομή των πρωτεϊνών. Οι υπόλοιπες μεταλλάξεις αναμένεται να προκαλέσει σημαντικές αλλαγές στη δομή της πρωτεΐνης σύμφωνα με την προβλεπόμενη βλαπτική επίδραση από POLYPHEN-2.

άγριου τύπου (WT) KRAS εμφανίζεται σε μπλε χρώμα και οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες φαίνεται στο κίτρινο . Οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων που φαίνεται στο πράσινο για τα υπολείμματα WT και κόκκινο για τα μεταλλαγμένα υπολείμματα. α) WT K-RAS δείχνει πλευρική αλυσίδα του Α134 (πράσινο). β) Επικάλυψη των WT και μεταλλαγμένου KRAS A134V δείχνει προβλέψει διαμορφωτικές αλλαγές που προκαλούνται από την μετάλλαξη A134V (σημειώστε τις αλλαγές στο έλικας και βήτα φύλλου). γ) Επικάλυψη των WT και μεταλλαγμένων R135K KRAS δείχνει προβλεπόμενες αλλαγές διαμόρφωσης που προκαλείται από τη μετάλλαξη R135K (σημειώστε τις αλλαγές στις αλυσίδες έλικα και θηλιά), αλλά δεν επηρεάζει την θύλακα σύνδεσης GTP. δ) Επικάλυψη των WT και μεταλλαγμένου KRAS E143K που δείχνουν προέβλεψε αλλαγές διαμόρφωσης που προκαλείται από τη μετάλλαξη E143K (σημειώστε τις αλλαγές στο βρόχο κοντά στο θύλακα σύνδεσης GTP). ε) Επικάλυψη των WT και μεταλλαγμένων T144I KRAS που δείχνει προβλέψει διαμορφωτικές αλλαγές που προκαλούνται από την μετάλλαξη T144I (σημειώστε τις αλλαγές στο θύλακα σύνδεσης GTP και τις αλλαγές στον προσανατολισμό του δεσμευμένου GTP? πράσινο είναι κβ και το κόκκινο είναι μεταλλαγμένο). στ) Επικάλυψη των WT και μεταλλαγμένου KRAS R149G που δείχνουν προβλέψει διαμορφωτικές αλλαγές που προκαλούνται από την μετάλλαξη R149G (σημειώστε τις αλλαγές στις έλικα και θηλιά αλυσίδες κοντά στο θύλακα σύνδεσης GTP). ζ) Επικάλυψη των WT και μεταλλαγμένου KRAS Q150X που δείχνουν προβλέψει διαμορφωτικές αλλαγές που προκαλούνται από την μετάλλαξη Q150X (σημειώστε τις αλλαγές στην αλυσίδα βρόχο).

Η

Οι σημειακές μεταλλάξεις που ορίζεται από το κιτ EGFR ανίχνευση μεταλλάξεων στο εξώνια 18, 20 και 21 του γονιδίου EGFR δεν ανιχνεύθηκαν σε οποιαδήποτε από τις 56 περιπτώσεις που μελετήθηκαν. μεταλλάξεις Indel στα εξώνια 19 και 20 επίσης δεν ανιχνεύθηκε.

Οι κύριες κλινικές, παθολογικές και ανοσοϊστοχημικές ευρήματα στις περιπτώσεις που αναφέρθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Πίνακες 5 και 6 δείχνουν μια επικράτηση του γυναικείου φύλου σε περιπτώσεις με νέα μεταλλάξεις KRAS σε σύγκριση με τις περιπτώσεις με άλλες μεταλλάξεις KRAS και KRAS μετάλλαξη αρνητικές περιπτώσεις (70%, 42,8% και 43,75%, αντίστοιχα). Δείχνουν επίσης χαμηλότερο επιπολασμό λεμφαδένα μετάστασης και έκφραση p53 αν και οι διαφορές δεν είναι στατιστικά σημαντική (ρ τιμή που κυμαίνεται μεταξύ 0.078 και 1.0). Δεν βρήκαμε EGFR ή έκφραση πρωτεΐνης HER2, ή γονιδιακές μεταλλάξεις του EGFR σε οποιαδήποτε από τις 10 περιπτώσεις. Επίσης δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων σχετικά με την ηλικία του ασθενούς, καθώς και το μέγεθος του όγκου, το βάθος και την ποιότητα.

Η

Η

Τρεις από τους πέντε ασθενείς που φιλοξενούν τις επιβλαβείς μεταλλάξεις είχαν πιο προηγμένες νόσος με αυξημένο βάθος του όγκου και μετάσταση λεμφαδένα (περιπτώσεις 32, 45 και 51), ενώ οι δύο είχαν εντοπισμένο νόσου (περιπτώσεις 41 και 48).

Οι δύο περιπτώσεις με την ταυτόχρονη εξόνιο 2 μετάλλαξη (περιπτώσεις 32 και 45) έδειξαν μεγαλύτερη του μεγέθους του όγκου και του βάθους σε σύγκριση με τις περισσότερες από τις άλλες περιπτώσεις, με τα νέα μεταλλάξεις και είχε επίσης μετάσταση λεμφαδένα.

Συζήτηση

η ενεργοποίηση του ογκογονιδίου KRAS έχει ενοχοποιηθεί στην καρκινογένεση του παχέος, να μεταλλαχθεί σε 30-40% των αδενοκαρκινωμάτων [5] – [8], ένα επικράτηση συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη (42,85%). Η μεταγραφή του mRNA του γονιδίου KRAS αποτελείται από 5765 βάσεις που κωδικοποιούν για 188 αμινοξέα. Τα εξόνια 1, 2, 3, 4, και 5 περιέχουν 181, 122, 179, 160, και 5123 βάσεων, αντίστοιχα [21]. Η πλειοψηφία των σωματικών μεταλλάξεων συμβαίνουν στα κωδικόνια 12 και 13 (που βρίσκεται στο εξώνιο 2). Άλλες λιγότερο συχνές μεταλλάξεις συμβαίνουν στο εξόνιο 3 (κωδικόνια 59/61) και το εξόνιο 4 (κωδικόνια 117/146) [22] – [23]. Περίπου το ένα τρίτο των καρκίνων του παχέος εντέρου έτρεφε μεταλλάξεις στο G12 και G13 κωδικόνια, ενώ το εξόνιο 4 μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 117 και 146 ανιχνεύθηκαν σε μόνο μέχρι 5,5% των όγκων [24]. Η μελέτη μας έδειξε πολύ χαμηλότερο επιπολασμό του εξονίου 2 μεταλλάξεων (23,21%) και πολύ μεγαλύτερη επικράτηση του εξονίου 4 μεταλλάξεις (19,64%) με τα εξόνιο 4 μεταλλάξεις εντοπισμένη μεταξύ των κωδικονίων 134 και 150 αντί να περιλαμβάνουν κωδικόνια 117 και 146.

οι

μεταλλάξεις εξόνιο 4 KRAS υποτιμηθεί αφού όλες οι προσπάθειες των κλινικών δοκιμών επικεντρώθηκε εξονίου 2 (κωδικόνια 12 και 13) και το εξόνιο 3 (κωδικόνιο 61) μεταλλάξεις [22] – [25]. Όλα τα επτά νέες μεταλλάξεις KRAS αναφέρθηκαν στο παρόν άρθρο συνέβη στο εξώνιο 4 και εντοπισμένη μεταξύ των κωδικονίων 134 και 150. Έτσι προτείνουμε να συμπεριλάβετε κωδικόνια 134 – 150 ως hotspot για συνήθη KRAS ανάλυση μεταλλάξεων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αντί να επικεντρώνεται μόνο στα κωδικόνια 117 και 146. Διαπιστώσαμε εσφαλμένου νοήματος και ανοησίες εξόνιο 4 μεταλλάξεις στο 12,5% των περιπτώσεων η οποία είναι υψηλότερη από ό, τι είχε ήδη αναφερθεί, η οποία ανήλθε σε 10%, αλλά περιλαμβάνονται επίσης εξόνιο 3 και ΕΡΑ στην προσθήκη στο εξώνιο 4 μεταλλάξεις [24]. Όλα τα νέα μεταλλάξεις βρέθηκαν να είναι σωματικά αφού όλα τα τμήματα του noncancerous ορθοκολικό ιστό από τις 10 περιπτώσεις που έφεραν τις μεταλλάξεις έδειξε την αλληλουχία φυσικού τύπου.

Η λειτουργική επίπτωση των νέων μη συνώνυμες μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη KRAS ήταν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική εργαλεία και μοριακής μοντελοποίησης (πίνακες 2 & amp? 3, Σχήμα 3). Η μετάλλαξη R135K είχε ως αποτέλεσμα την υποκατάσταση της Arg για την παρομοίως φορτισμένα Lys που προβλέπεται να προκαλέσουν μικρές αλλαγές στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ γειτονικών καταλοίπων. εργαλεία βιοπληροφορικής έδειξε ότι η μετάλλαξη R135K προβλέπεται να έχει ουδέτερη επίδραση επί της πρωτεΐνης. Ομοίως, η μοριακή μοντελοποίηση έδειξε μια μικρή αλλαγή στη δομή της πρωτεΐνης που προκαλείται από αυτή τη μετάλλαξη (Σχήμα 3). Αντίθετα, η μετάλλαξη E143K προβλέπεται να έχει βλαβερή επίδραση επί της πρωτεΐνης με βιοπληροφορικής εργαλεία (Πίνακας 3) και με μοριακή μοντελοποίηση (Σχήμα 3). Αυτή η μετάλλαξη είχε σαν αποτέλεσμα την αντικατάσταση του αρνητικά φορτισμένου Glu για το θετικά φορτισμένο Lys (Πίνακας 2), η οποία είναι πιθανό να προκαλέσει σημαντικές μεταβολές στις αλληλεπιδράσεις των γειτονικών καταλοίπων αμινοξέων. Το Σχήμα 3 δείχνει ότι η μετάλλαξη E143K προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στη δομή της πρωτεΐνης KRAS ειδικά στο βρόχο πλησίον του θύλακα σύνδεσης GTP. Η μετάλλαξη R149G προβλέπεται να είναι ουδέτερος αλλά μοριακής μοντελοποίησης έδειξε ότι αυτή η μετάλλαξη προκαλείται αλλαγές στα έλικα και θηλιά αλυσίδες κοντά στο θύλακα σύνδεσης GTP. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στις μεταβολές στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καταλοίπων αμινοξέων που προκαλείται από την υποκατάσταση του θετικά φορτισμένου Arg για την μη πολική Gly (Πίνακας 2). Επιπλέον, αυτή η μετάλλαξη βρίσκεται κοντά στο συντηρημένο SAK μοτίβο και μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ένα κοντινό μετάλλαξη (K147E) οδηγεί σε ένα αυτόματο RAS πρωτεΐνη που μπορεί να δρουν ανεξάρτητα από ανάντη σημάτων και εμφανίζουν μικρότερη συγγένεια για RAF κινάση [26]. Η μετάλλαξη Q150X εισήγαγε ένα πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού και προβλέπεται να έχει επίδραση επί της σταθερότητας του mRNA μέσω ανοησίες μεσολάβηση αποσύνθεση με αποτέλεσμα τη μειωμένη έκφραση της κομμένης πρωτεΐνης. Για το καλύτερο της γνώσης μας, η Q150X μετάλλαξη ανιχνεύτηκε στην παρούσα μελέτη είναι η δεύτερη KRAS περικοπή μετάλλαξη να αναφερθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου στη βιβλιογραφία. Μια μετάλλαξη KRAS (CAG & gt? TAG) τον καθορισμό ενός πρόωρου σήματος διακοπής στο κωδικόνιο 22 (Gln22Stop) έχει προηγουμένως βρεθεί σε έναν ασθενή με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου από Palmirotta, et al [27]. BRAF και p53 γονίδια δεν βρέθηκαν να τροποποιηθεί και μικροδορυφορικού αστάθεια δεν ήταν παρούσα. Ο ασθενής, όμως, βρέθηκε να μην αποκρίνεται σε ένα αντι-EGFR θεραπεία. Είναι ενδιαφέρον ότι δύο ασθενείς μας που φέρει τη μετάλλαξη περικοπή ήταν EGFR αρνητικά από την IHC. Είχαν, επίσης, δεν γονιδιακές μεταλλάξεις του EGFR. Αρκετές προκλινικές [28] και της κλινικής [29] μελέτες έχουν δείξει ότι η εμφάνιση του KRAS μεταλλάξεων σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι μια ανεξάρτητη προγνωστική παράμετρο του EGFR στοχευμένη αντίσταση θεραπεία. Τέλος, αν και οι συνώνυμες νέα εξόνιο 4 μεταλλάξεις που αναφέρονται στην παρούσα μελέτη (συμπεριλαμβανομένης της μετάλλαξης G138G που εντοπίστηκε σε τρεις ασθενείς) δεν μετέβαλε πρωτεϊνική σύνθεση αμινοξέων, μπορούν ακόμα να αποδειχθεί σημαντική στην ογκογένεση. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οι συνώνυμες μεταλλάξεις (συχνά αναφέρεται λανθασμένα ως «σιωπηλή») μπορεί να επηρεάσει τη μεταγραφή, μάτισμα, μεταφοράς mRNA και μετάφραση, κάποια από τα οποία θα μπορούσαν να αλλάξουν φαινότυπο, καθιστώντας το συνώνυμη μετάλλαξη μη σιωπηλή [30].

Διαπιστώσαμε μία από τις νέες μεταλλάξεις σε τρεις περιπτώσεις (G138G) και ένα άλλο σε δύο περιπτώσεις (Q150X). μέγεθος του δείγματος μας είναι μάλλον μικρή για να διεξάγει ανάλυση συχνότητας και σύγκριση με μεγαλύτερες δημοσιευμένες μελέτες. Ωστόσο, το γεγονός ότι αυτές οι νέες μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν σε 5/56 περιπτώσεις δείχνει ότι περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να γίνουν.

EGFR υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνων, ιδιαίτερα καρκίνου του παχέος εντέρου, και φαίνεται να αντανακλά πιο επιθετική ιστολογικών και κλινικών συμπεριφορές [31]. Έχει επίσης δειχθεί ότι η πρωτεΐνη ρ53 υπερέκφραση μπορεί να βοηθήσει σε δυνητικά πρόβλεψη μεταστατική εξάπλωση στους λεμφαδένες σε καρκίνο του παχέος εντέρου [32]. Με βάση αυτές τις πληροφορίες, το χαμηλό επιπολασμό του λεμφαδένα μετάστασης και της έκφρασης p53 σε ασθενείς μας που φιλοξενούν τις νέες μεταλλάξεις σε συνδυασμό με την απουσία έκφρασης πρωτεϊνών EGFR και HER2 και οι μεταλλάξεις του γονιδίου EGFR μπορεί γενικά να προτείνει μια διαδρομή χαμηλής ποιότητας στην παχέος ανάπτυξης καρκίνου σε εκείνους ασθενείς, οι οποίοι είναι πιθανόν επίσης ανθεκτικά σε αντι-EGFR και θεραπεία αντι-HER2. Αυτή η κερδοσκοπία είναι σύμφωνη με τη διαπίστωση ότι οι μεταλλάξεις στο εξόνιο 4 του KRAS πρόβλεψη για μια πιο ευνοϊκή κλινική έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [24]. Ειρωνικά, τέσσερις από τις επτά νέων εξόνιο 4 μεταλλάξεις που ανιχνεύονται στην παρούσα μελέτη προβλέπεται ότι είναι επιβλαβής για την πρωτεΐνη KRAS όπως αποκαλύφθηκε από μοριακή μοντελοποίηση.