Αφηρημένο

Η /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

DACT1

έχει ταυτοποιηθεί ως διαμορφωτής της Wnt σηματοδότησης μέσω της αλληλεπίδρασής της με Dishevelled (ϋνΙ), ένα κεντρικό μεσολαβητής τόσο των κανονικών και noncanonical Wnt μονοπάτια. Ωστόσο, οι λειτουργίες του

DACT1

στο σηματοδοτικό μονοπάτι WNT /β-κατενίνης παραμένουν ασαφείς. Εδώ, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι

DACT1

είναι ένα σημαντικό θετικό ρυθμιστή στον καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της ρύθμισης της σταθερότητας και της sublocation της β-κατενίνης. Δείξαμε ότι

DACT1

προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

και ενισχύει την μεταναστευτικών και επιθετική πιθανότητα καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Επιπλέον, η υψηλότερη έκφραση του

DACT1 αυξάνει

όχι μόνο τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα β-κατενίνης, αλλά επίσης αυξάνει κλάσμα του σχετίζονται με τη μεμβράνη. Η υπερέκφραση του

DACT1

οδηγεί στην αυξημένη συσσώρευση μη φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και ιδιαίτερα στους πυρήνες. Έχουμε αποδείξει ότι

DACT1

αλληλεπιδρά με GSK-3β και β-κατενίνης.

DACT1

σταθεροποιεί β-κατενίνης μέσω

DACT1

επαγόμενη συνέπειες στην GSK-3β και αλληλεπιδρά άμεσα με πρωτεΐνες β-κατενίνης. Το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης GSK-3β σε Ser9 αυξάνεται σημαντικά μετά την αυξημένη έκφραση του

DACT1

.

DACT1

μεσολαβεί στην υποκυτταρική εντόπιση του β-κατενίνης μέσω αύξησης του επιπέδου της φωσφορυλιωμένης GSK-3β εις Ser9 να αναστέλλουν τη δραστικότητα της GSK-3β. Στο σύνολό τους, προσδιορίζει μελέτη μας

DACT1

ως σημαντικός θετικός ρυθμιστής σε καρκίνο του παχέος εντέρου και προτείνει μια πιθανή στρατηγική για την θεραπευτική έλεγχο της β-κατενίνης οδού που εξαρτάται

Παράθεση:. Yuan G, Wang C, Ma C, Τσεν Ν, Tian Q, Zhang T, et al. (2012) τον ογκογόνο Λειτουργία του

DACT1

στον Καρκίνο του παχέος εντέρου, μέσω του κανονισμού της β-κατενίνης. PLoS ONE 7 (3): e34004. doi: 10.1371 /journal.pone.0034004

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιουλίου του 2011? Αποδεκτές: 21 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Μάρτη, 2012

Copyright: © 2012 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας, Νο 30770440. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

οι μεταλλάξεις και η απορυθμισμένη έκφραση των συστατικών του αρχαίου μονοπατιού σηματοδότησης Wnt συνδέονται με ογκογένεση σε πολλαπλά συστήματα, και έχουν ιδιαίτερα εμπλακεί στην έναρξη της καρκίνο του παχέος εντέρου [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Πάνω από το 90% των καρκίνων του παχέος προέρχονται από δραστικές μεταλλάξεις στο μονοπάτι Wnt [1]. Οι μεταλλάξεις έχουν περιγραφεί στο αδενωματώδη πολυποδίαση coli (

APC

) γονίδιο σε περιπτώσεις οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση (FAP), και αυτή η μετάλλαξη εμφανίζεται επίσης σε υψηλό ποσοστό των σποραδικών καρκίνων του παχέος [9], [10].

APC

μεταλλάξεις αντιπροσωπεύουν μια πρώιμη εκδήλωση του ορθοκολικού ογκογένεση [11].

β-κατενίνης (επίσημο σύμβολο CTNB1) θεωρείται ότι είναι ένας κεντρικός παίκτης στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Αν και Wnt ενεργοποίηση μπορεί να συμβεί μέσω μεταλλάξεων που επηρεάζουν θέσεις φωσφορυλίωσης στο εξώνιο 3 του β-κατενίνης σε μια μειοψηφία των όγκων παχέος εντέρου [12], [13], πολλά άλλα στοιχεία της οδού σηματοδότησης Wnt συμβάλλουν στην ορθοκολικό καρκίνο μέσω dysregulating τη δραστικότητα ή εντοπισμό του β-κατενίνης [14], [15].

Ο

DACT1

(Dapper1 /Dpr1) γονίδιο, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 14q22.3, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 836 αμινοξέων με ένα υποθετικό λευκίνη φερμουάρ (LZ) τομέα στο αμινο-τερματικό άκρο και ένα μοτίβο συναίνεσης ΡΟΖ δέσμευσης (ΡΟΖ-Β) στο τέλος καρβοξυ-τερματικό που επιτρέπει στο

DACT1

πρωτεΐνη για να αλληλεπιδράσει με το Dishevelled (ϋνΙ) περιοχή PDZ [ ,,,0],16]. Bioinformatic αναλύσεις αποκάλυψαν ότι

DACT1

mRNA εκφράζεται στο άμνιο, εμβρυϊκό εγκέφαλο, οφθαλμό, καρδιά, μυελός των ενηλίκων εγκεφάλου, γαστρικό καρκίνο (χαρακτηριστικά signet κύτταρο δακτυλίου), RER + όγκων του παχέος εντέρου, οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, φύτρο κυττάρου όγκου , όγκοι χονδροσάρκωμα, και παραθυρεοειδούς [17]. Επιπλέον, με βάση την εξελικτική και λειτουργική διατήρηση των Wnt μόρια σηματοδότησης, όπως επίσης και το ανθρώπινο χρωμοσωμικό εντοπισμό του DACT1, το

DACT1

γονίδιο επίσης αναμένεται να είναι ένα ισχυρό καρκινο-συναφές γονίδιο [17].

DACT1

έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [18]. Μια πρόσφατη έκθεση εντόπισε ένα συσχετισμό μεταξύ

DACT1

έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα και η κακή ιστολογική βαθμό, το μεγάλο μέγεθος του όγκου, την έκταση της εισβολής του όγκου και των λεμφαδένων μεταστάσεων [19].

Αν και μερικές μελέτες έχουν δείξει συσχετίσεις μεταξύ

DACT1

έκφραση και τον καρκίνο, τη λειτουργία του

DACT1

στο μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως παραμένει ασαφής. Ένας πιθανός μηχανισμός είναι ότι Dpr σταθεροποιεί GSK-3β και αξίνη στο συγκρότημα APC, όπως φαίνεται από τις μελέτες συν-ανοσοκαταβύθισης [16]. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι Dpr ανταγωνίζεται με Fz για σύνδεση στην περιοχή PDZ του ϋνΙ, μπλοκάροντας έτσι τη μεταγωγή σήματος μέσω ϋνΙ, και ως εκ τούτου αναστέλλει την ϋνΙ μεσολάβηση σταθεροποίηση β-κατενίνης [20]. Yau et al. ανέφεραν ότι η ανθρώπινη Dpr1 ήταν προς τα κάτω σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και αυτό προς τα κάτω ρύθμιση συσχετίστηκε με την κυτταροπλασματική συσσώρευση του β-κατενίνης [18]. Ωστόσο, στην παρούσα έκθεση, έχουμε βρει ότι

DACT1

υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και ενεργεί για να ενισχύσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Δείξαμε ότι

DACT1

αλληλεπιδρά με GSK-3β και β-κατενίνης. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι

DACT1

σταθεροποιεί της β-κατενίνης μέσω

DACT1

επαγόμενη επιδράσεις στην GSK-3β και αλληλεπιδρά άμεσα με β-κατενίνης. Έχουμε επίσης καταδείξει

DACT1

αναστέλλει τη δράση της GSK-3β μέσω αύξησης του επιπέδου της φωσφορυλιωμένης GSK-3β εις Ser9, η οποία μεταβάλλει την υποκυτταρική θέση του β-κατενίνης. Προωθεί ιδιαίτερα τα επίπεδα της β-κατενίνης στην πλασματική μεμβράνη και στον πυρήνα.

Αποτελέσματα

DACT1

υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο παχύ έντερο

καρκινώματος

Για την αναγνώριση οι πιθανοί ρόλοι των

DACT1

στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκινώματος του κόλου, χρησιμοποιήσαμε ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) για να εκτιμηθεί το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Συγκρίναμε την έκφραση σε έξι καρκινικούς ιστούς με εκείνες έξι ζεύγη δειγμάτων του φυσιολογικού ελέγχου βλεννογόνο του κόλου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο του

DACT1

mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα σε όλες τις έξι δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 1Α). Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με κηλίδωση Western, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση των προϊόντων λύσης κυττάρου που παρασκευάζονται διαλυτών από χειρουργικά δείγματα κολεκτομή. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα υψηλά επίπεδα του

DACT1

πρωτεΐνη είναι παρόντα σε καρκίνο του παχέος εντέρου (Εικόνα 1Β).

(Α)

DACT1

mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. Δείγματα του αδενοκαρκινώματος κόλου (Τ, λευκές ράβδοι) και με φυσιολογικό βλεννογόνο εμφανίζεται ελέγχου (Ν, μαύρες ράβδοι) αναλύθηκαν σε έξι περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου. (Β) Έκφραση

DACT1

πρωτεΐνης σε αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου κόλον (Τ) και κανονικού εμφανίζονται βλεννογόνο ελέγχου (Ν) σε έξι περιπτώσεις, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση Western ανοσοαποτύπωσης. Η έκφραση του GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

DACT1

ενισχύει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

in vitro

και του παχέος εντέρου ογκογένεση

in vivo

για να κατανοήσουμε τη λειτουργία του

DACT1

στον καρκίνο του παχέος εντέρου, διερευνήσαμε την επίδραση της έκτοπης

DACT1

έκφραση για την κυτταρική ανάπτυξη in vitro σε κυτταρικές σειρές με διαφορετικά επίπεδα ενδογενούς

DACT1

έκφρασης. Μετά την επιμόλυνση με ένα

DACT1

κατασκεύασμα έκφρασης cDNA, SW480 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, τα οποία εκφράζουν πολύ χαμηλά ενδογενή επίπεδα

DACT1

, έδειξαν σημαντική αύξηση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Σχήμα 2Α). Αντίθετα, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μειώθηκε κατά ενδογενούς

DACT1

έκφραση σιγήσει από σταθερή επιμόλυνση με siRNA φορείς που στοχεύουν

DACT1

στο HCT116, κυτταρικές σειρές LoVo και καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ29, τα οποία έχουν πολύ υψηλότερα επίπεδα ενδογενούς του

DACT1

(Σχήμα 2Β-D). Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα, η ενδογενής

DACT1

έκφραση σιγήσει από σταθερή επιμόλυνση με άλλα διανύσματα siRNA (

DACT1

siRNA1) που στοχεύει διαφορετικές περιοχές του

DACT1

στα κύτταρα HCT116 και παρατηρήθηκαν τα ίδια αποτελέσματα (Σχήμα S1 Α-Β)

(Α) αριστερά:. υπερέκφραση του

DACT1

σε σταθερά επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. δοκιμασία ανάπτυξης πολλαπλασιασμού καμπύλη στο

DACT1

επιμολυσμένα SW480 κύτταρα (μέση τιμή ± SEM? n = 3, * ρ & lt? 0,05 έναντι κενά κελιά φορέα-επιμολυσμένα): Σωστά. (B, C, D) Αριστερά:

DACT1

έκφραση σε άγριου τύπου, ελέγχει siRNA επιμολυσμένα, και

DACT1

siRNA επιμολυσμένα HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα. δοκιμασίες ανάπτυξης καμπύλη στο

DACT1

siRNA επιμολυσμένα HCT116, LoVo και κύτταρα ΗΤ29 (μέση τιμή ± SEM? n = 3, * ρ & lt? 0,05 έναντι κύτταρα άγριου τύπου): Σωστά. (Ε) ο μέσος καρκινικός όγκος αξιολογήθηκε εβδομαδιαίως μετά την ένεση των ζώων με έλεγχο siRNA-ή

DACT1

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 (μέσος όρος ± SEM? Η = 3, * ρ & lt? 0,05). (F) Εκπρόσωπος εικόνες οκτώ εβδομάδες μετά την έγχυση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων ποντικού με siRNA έλεγχο ή

DACT1

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα HCT116.

Η

Για να εξεταστούν τα αποτελέσματα της αποσιώπησης του

DACT1

στην αύξηση του όγκου του παχέος εντέρου in vivo, τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά ένα στοιχείο ελέγχου siRNA ή

χρησιμοποιήθηκαν DACT1

siRNA. Κύτταρα (5 × 10

6) εγχύθηκαν στον υποδόριο ιστό του γυμνού ποντικού (n = 8 ζώα ανά ομάδα). Οι όγκοι μετρήθηκαν εβδομαδιαία με βερνιέρο, και υπολογίστηκαν οι όγκοι τους, σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: π /6 χ Μήκος χ πλάτος

2 [21]. Όλα τα ζώα ένεση με κύτταρα HCT116 που εκφράζουν siRNA ελέγχου ανέπτυξαν όγκους κατά 14 ημέρες μετά την ένεση, ενώ μόνο το 75% (6/8) του

DACT1

ζώα siRNA ανέπτυξαν όγκους. Πενήντα έξι ημέρες μετά την ένεση, οι όγκοι των ζώων ελέγχου siRNA ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (Εικόνα 2F). Ο μέσος όγκος του όγκου ήταν 2,068.78 ± 561,57 mm

3 σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα HCT116 που εκφράζουν ελέγχου siRNA, σε σύγκριση με τον όγκο του όγκου μέση σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα HCT116 που εκφράζουν

DACT1

siRNA (503,46 ± 178,90 mm

3) (Σχήμα 2Ε). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν το σημαντικό ρόλο του

DACT1

στην προαγωγή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

DACT1

ενισχύει την μετανάστευση και την έλλειψη αγκύρωση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων

Anchorage-ανεξάρτητο πολλαπλασιασμό είναι ένα σήμα κατατεθέν της ογκογόνο μετασχηματισμό και θεωρείται ότι είναι ευνοϊκό για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μακριά από την αρχική περιοχή τους. Με αυτή τη γνώση, εξετάσαμε την ικανότητα του

DACT1

να οδηγεί την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου με μαλακά προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας agar. Η υπερέκφραση του

DACT1

ενισχυμένη αγκύρωση-ανεξάρτητο πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480 (Σχήμα 3Α). Προς τα κάτω ρύθμιση

DACT1

μείωσε την αγκύρωση-ανεξάρτητο δυναμικό της HCT116, LoVo και κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 3Β-D και S1c). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι

DACT1

υπερέκφραση ενίσχυσε την μεταναστευτικά δυναμικό των κυττάρων SW480 με επικοινωνούντα δοκιμασίες (Σχήμα 3Ε και Ι). Αντίθετα, το μεταναστευτικό δυναμικό των κυττάρων μειώθηκε όταν τα ενδογενή

DACT1

έκφραση σιγήσει από σταθερή επιμόλυνση με siRNA φορείς που στοχεύουν

DACT1

σε HCT116, LoVo και κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 3F-Ι). Μετά από αυτά τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

DACT1

ενισχύει αγκυροβόλιο ανεξαρτησία στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και τα μεταναστευτικά δυναμικό τους.

(Α) Soft δοκιμασία άγαρ σε

DACT1

επιμολυσμένα SW480 κύτταρα μετά από 14 ημέρες επώασης. (B, C, D) δοκιμασία μαλακού άγαρ σε siRNA επιμολυσμένα HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα μετά από 14 ημέρες επώασης. Τα (Ε) Εκπρόσωπος εικόνες που παρουσιάζονται για την υπερέκφραση του

DACT1

σε σταθερά επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο transwell και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν σε όλον τον θάλαμο προς κύτταρο-ειδικό ρυθμισμένο μέσο για 24 ώρες. Μικροφωτογραφίες των χρωματισμένων μεταναστεύουν κύτταρα που λαμβάνονται δυνάμει του φωτισμού φωτεινού πεδίου (20 ×). (F, G, H) Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται για

DACT1

siRNA επιμολυσμένα HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο transwell και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν σε όλον τον θάλαμο προς κύτταρο-ειδικό ρυθμισμένο μέσο για 24 ώρες. Μικροφωτογραφίες των χρωματισμένων μεταναστεύουν κύτταρα που λαμβάνονται δυνάμει του φωτισμού φωτεινού πεδίου (20 ×). (Ι) Ποσοτικός προσδιορισμός της δοκιμασίας μετανάστευσης. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ξεχωριστά πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η μετανάστευση προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε έξι τυχαία μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο (μέση τιμή ± SEM? * Ρ & lt? 0,05 έναντι κυττάρων ομάδα ελέγχου).

Η

DACT1

ενισχύει εισβολή των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

in vitro

ή

in vivo

η

το πιο επικίνδυνο χαρακτηριστικό της κακοήθειας είναι η επεμβατική και μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων. Για να ελέγξετε αν η κυτταρική εισβολή επηρεάστηκε από

DACT1

, διερευνήθηκε η επίδραση του

DACT1

στην κυτταρική εισβολή μέσω Matrigel. Η υπερέκφραση του

DACT1

ενισχυμένη από την εισβολή των κυττάρων SW480 (Εικόνα 4Α και Ε). Προς τα κάτω ρύθμιση του

DACT1

μείωσε την επιθετική πιθανότητα των HCT116, LoVo και κύτταρα ΗΤ29 μέσω του Matrigel (Σχήμα 4Β-Ε). Να εξετάσει τα αποτελέσματα του

DACT1

αποσιώπηση σχετικά με την εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα in vivo, εμείς μολυσμένα κύτταρα HCT116 που εξέφρασαν ελέγχου siRNA ή

DACT1

siRNA. Στη συνέχεια, 5 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του υποδόριου ιστού του κάθε γυμνού ποντικού (n = 8 ζώα ανά ομάδα). Πενήντα έξι ημέρες αργότερα, οι όγκοι των έξι από τα οκτώ ελέγχου siRNA επιμολυσμένα γυμνά ποντίκια είχαν εισβάλει μέσα στο μυϊκό σύστημα, ενώ μόνο δύο από τους όγκους σε

DACT1

siRNA επιμολυσμένα ζώα είχαν εισβάλει μέσα στο μυϊκό σύστημα. Αυτά τα δεδομένα περαιτέρω δείχνουν ότι

DACT1

επηρέασε την επιθετική πιθανότητα καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα in vitro και in vivo.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες που παρουσιάζονται για την υπερέκφραση του

DACT1

-επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια επεμβατική θάλαμο και αφέθηκαν να εισβάλουν στο θάλαμο προς κύτταρο-ειδικό ρυθμισμένο μέσο για 24 ώρες. Μικροφωτογραφίες των χρωματισμένων εισβάλλοντας κύτταρα που λαμβάνονται δυνάμει του φωτισμού φωτεινού πεδίου (20 ×). (B, C, D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται για

DACT1

siRNA επιμολυσμένα HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο εισβολή και αφέθηκε να εισβάλουν στο θάλαμο προς κύτταρο-ειδικό ρυθμισμένο μέσο για 24 ώρες. Μικροφωτογραφίες των χρωματισμένων εισβάλλοντα κύτταρα ελήφθησαν υπό φωτισμό φωτεινού (20 ×). (Ε) Ποσοτικοποίηση της δοκιμασίας μετανάστευσης. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ξεχωριστά πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η διήθηση προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε έξι τυχαία μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο (μέση τιμή ± SEM? * Ρ & lt? 0,05 έναντι κυττάρων ομάδα ελέγχου)

Η

DACT1

ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο αν και αυξάνεται. β-κατενίνης επίπεδα

Για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός που προκάλεσε περαιτέρω τα παραπάνω αποτελέσματα, εξετάσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης της β-κατενίνης και τα γονίδια-στόχους Wnt /β-κατενίνης, η κυκλίνη D1 [8] και c-Myc [22]. πείραμα μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση του

DACT1

οδήγησε σε σημαντική αύξηση των συνολικών επιπέδων β-κατενίνης, η κυκλίνη D1 και c-Myc στα κύτταρα SW480 (Σχήμα 5Α). Αντιστρόφως,

DACT1

siRNA, η οποία μεσολαβεί την αποσιώπηση του ενδογενούς

DACT1

έκφραση, μειωμένα τα συνολικά επίπεδα β-κατενίνης, η κυκλίνη D1 και c-Myc επίπεδα σε HCT116, LoVo και τα κύτταρα ΗΤ29 ( Εικόνα 5Β).

(Α) Εκπρόσωπος Western blots των κενών κυττάρων φορέα-επιμολυσμένα και

DACT1

επιμολυσμένα SW480. Η υπερέκφραση του

DACT1

αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα άνω του β-κατενίνης και ο παράγοντας Τ κυττάρων (TCF) γονιδίων στόχων, η κυκλίνη D1 και c-Myc. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Αντιπρόσωπος Western blots των HCT116 και LoVo και τα κύτταρα ΗΤ29 εκφράζουν ελέγχου siRNA ή

DACT1

siRNA. Αποσιώπηση του

DACT1

έκφραση σε HCT116 και LoVo και κύτταρα ΗΤ29 μειωμένα επίπεδα συνολικού β-κατενίνης, η κυκλίνη D1 και c-Myc. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Η επίδραση του

DACT1

υπερέκφραση σχετικά με το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SW480. Τρεις ημέρες μετά την ασιτία ορού, τα κύτταρα αναλύθηκαν για το προφίλ του κυτταρικού κύκλου τους με FACS. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, G2 και S φάσεις δεικνύονται. (D, E, F) Η επίδραση του

DACT1

siRNA επιμόλυνση στο προφίλ του κυτταρικού κύκλου των HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα. Τρεις ημέρες μετά την ασιτία ορού, τα κύτταρα αναλύθηκαν για το προφίλ του κυτταρικού κύκλου τους με FACS. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, οι φάσεις G2 και S απεικονίζεται.

Η

Θεωρώντας ότι η κυκλίνη D1 και c-Myc σχετίζονται με ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, εξετάσαμε την επίδραση της

DACT1

υπερέκφραση και σίγηση σχετικά με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Σε αυτά τα πειράματα, όλα τα κύτταρα συγχρονίστηκαν στις φάσεις G0 /G1 με ασιτία ορού. Κυττάρων κύκλος προφίλ με FACS έδειξε ότι η υπερέκφραση του

DACT1

σε κύτταρα SW480 σχετίστηκε με μια αύξηση στην αναλογία των κυττάρων στις φάσεις Ο0 /Ο1 (Σχήμα 5C). Σταθερά, σίγηση του

DACT1

έκφρασης με siRNA οδήγησε σε αυξημένο αριθμό κυττάρων στην S + G2 /M φάσεις του HCT116, κυτταρικές σειρές LoVo και ΗΤ29 (Σχήμα 5D-F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η S + G2 /M συσσώρευση κυττάρων μετά

DACT1

σίγηση είναι ειδικά συνδέεται με την απώλεια του

DACT1

πρωτεΐνη. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το

DACT1

προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου με τη διευκόλυνση της μετάβασης από το G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου.

Εκτός κυκλίνη D1, CDK4 είναι ένα άλλο βασικό παράγοντας που διευκολύνει την G1 /S μετάβαση. Σημειώσαμε ότι η υπερέκφραση του

DACT1

σε κύτταρα SW480 αύξησε την έκφραση της CDK4, ενώ τα επίπεδα CDK4 μειώθηκαν σημαντικά σε HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα που εξέφρασαν

DACT1

siRNA (Εικόνα S2). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι

DACT1

διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου με την προώθηση της εισόδου των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο μέσω της αύξησης των επιπέδων του β-κατενίνης.

dAct 1

ενισχύει μεταναστευτικών και επεμβατικές δυνατότητες του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων μέσω της αλλαγής του υποκυτταρική θέση της β-κατενίνης

Για να αποκαλύψει τους τρόπους με τους οποίους em

DACT1

αυξάνει /TCF-ρυθμιζόμενη έκφραση του γονιδίου της β-κατενίνης, η ακριβής θέση του β-κατενίνης παρατηρήθηκε κάτω από ένα συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (LSCM) με ανοσοφθορισμό. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλότερη έκφραση του

DACT1

όχι μόνο αύξησε τις πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα β-κατενίνης, αλλά επίσης αυξημένο κλάσμα του σχετίζονται με τη μεμβράνη. Η αλλαγή στο επίπεδο της β-κατενίνης συνδεδεμένη με μεμβράνη κλάσμα ήταν η πιο σημαντικό εύρημα (Σχήμα 6Α-D και S1D)

(Α) φωτομικρογραφίες του κενού φορέα και

DACT1

. – υπερεκφράζουν SW480 κύτταρα ανοσοχρώση με ένα αντίσωμα αντι-β-κατενίνης (κόκκινο). (B, C, D) φωτομικρογραφίες ελέγχου siRNA και

DACT1

siRNA σε HCT116, LoVo και ΗΤ29 κύτταρα ανοσοχρώση με ένα αντίσωμα αντι-β-κατενίνης (κόκκινο). (Ε) Εκπρόσωπος κηλίδες των επιπέδων της β-κατενίνης σε μεμβράνη (ΜΕΜ), των πυρηνικών (Nuc), και κυτταροπλασματική (Cyto) κλάσματα και το συνολικό λύματα (Lys) στα κύτταρα SW480. Λαμινίνη Β (πυρηνική έκφραση) και GAPDH (κυτταροπλασματική έκφραση) χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι φόρτωσης. «+» Αντιπροσωπεύει την υπερέκφραση

DACT1

. «-» Είναι κενό φορέα. (F) Εκπρόσωπος κηλίδες των επιπέδων της β-κατενίνης σε μεμβράνη (ΜΕΜ), των πυρηνικών (Nuc), και κυτταροπλασματική (Cyto) κλάσματα και το συνολικό λύματα (Lys) σε κύτταρα HCT116. Λαμινίνη Β (πυρηνική έκφραση) και GAPDH (κυτταροπλασματική έκφραση) χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι φόρτωσης. «+» Αντιπροσωπεύει τον έλεγχο siRNA. «-«. Είναι

DACT1

siRNA

Η

Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα ενδιαφέροντα αποτελέσματα, αποσπάσματα από τον έλεγχο /

DACT1

υπερεκφράζουν SW480 κύτταρα και ελέγχου /

DACT1

-silenced κύτταρα HCT116 χωρίστηκαν σε μεμβράνη, κυτταροπλασματική και πυρηνική κλάσματα. Στη συνέχεια, η σχετική αφθονία του β-κατενίνης σε αυτά τα κλάσματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 6Ε και F). Προηγούμενες μελέτες έχουν καταδείξει ένα σημαντικό ρόλο για β-κατενίνης στην κυτταρική προσκόλληση, ως μέρος ενός συμπλόκου πρωτεΐνης που περιλαμβάνει Ε-καδερίνης [23]. Το πρότυπο έκφρασης Ε-καδερίνης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ήταν αναλλοίωτη με

DACT1

αποσιώπησης ή υπερέκφραση (Σχήμα S3). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα του

DACT1

επηρεάσουν τα επίπεδα β-κατενίνης και β-κατενίνης /TCF-εξαρτώμενη μεταγραφή από την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Wnt. Προτείνουν επίσης την πιθανότητα ότι

DACT1

ενισχύει το μεταναστευτικό και επεμβατικές δυνατότητες του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα μέσω της β-κατενίνης με τη μεσολάβηση σταθεροποίηση του κόμβου προσκόλλησης.

Συσχέτιση

DACT1

και μεμβράνη που σχετίζονται με την έκφραση της β-κατενίνης

in vitro

και

in vivo

η

από τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων, βρήκαμε ότι

DACT1

WAS εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνους του ανθρώπου κόλον και ότι προώθησε το αναπτυξιακό δυναμικό των κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων μέσω αποτελέσματά του στην σηματοδότηση β-κατενίνης. Με βάση αυτά τα ευρήματα, υποθέσαμε ότι

DACT1

και τα επίπεδα έκφρασης του συνδεδεμένη με μεμβράνη β-κατενίνης θα συσχετίζεται θετικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α και Β, τα επίπεδα του

DACT1

και β-κατενίνη στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου συσχετίζονται. Τα υψηλότερα επίπεδα β-κατενίνης στην κυτταρική μεμβράνη παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HCT116 με υψηλά επίπεδα ενδογενούς

DACT1

. Ενδιάμεσα επίπεδα β-κατενίνης στην κυτταρική μεμβράνη και

DACT1

πρωτεΐνες βρέθηκαν σε κύτταρα ΗΤ29. Τόσο συνδεδεμένη με μεμβράνη β-κατενίνης και

DACT1

ήταν ελάχιστα εκφρασμένη σε κύτταρα SW480.

(Α) ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR του

DACT1

έκφραση σε HCT116, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Β) Ανάλυση ανοσοφθορισμού

DACT1

και έκφραση β-κατενίνης σε HCT116, ΗΤ29 και SW480 κυττάρων. Αρχική μεγέθυνση, 40 ×. (C, D) HE χρώση των δειγμάτων του φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου (Ν) και το αδενοκαρκίνωμα (Τ) ιστούς με ένα αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. Αρχική μεγέθυνση, 40 ×. (Ε, F) ανοσοφθορισμού (IF) χρώση των δειγμάτων του φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου (Ν) και το αδενοκαρκίνωμα (Τ) ιστούς με ένα αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. Αρχική μεγέθυνση, 40 ×. (G, H) Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση των δειγμάτων του φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου (Ν) και το αδενοκαρκίνωμα (Τ) ιστούς με ένα αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. Αρχική μεγέθυνση, 40 ×.

Η

Για να μελετηθεί η σχέση μεταξύ

DACT1 συνδεδεμένη με μεμβράνη έκφραση β-κατενίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου περαιτέρω, αναλύσεις ανοσοϊστοχημικές και ανοσοφθορισμού διεξήχθησαν του β-κατενίνης και

στο ανθρώπινο κόλον και φυσιολογικό αδενοκαρκίνωμα ιστούς (οι έξι προαναφερθείσες περιπτώσεις). Παρατηρήσαμε εστιακή χρώση των μεμβρανών που σχετίζονται με β-κατενίνης σε όλες τις έξι όγκους (100%? Σχήμα 7C-Η). Αυτά τα αποτελέσματα συσχετίζονται καλά με τα προηγούμενα αποτελέσματα σε σχέση με την β-κατενίνης έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα του συνδεδεμένη με μεμβράνη β-κατενίνης μπορεί να εξαρτάται από την αυξημένη έκφραση του

DACT1

.

DACT1

αλληλεπιδρά με β-κατενίνης και τα συστατικά του συγκροτήματος καταστροφή των β-κατενίνης για τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης

Δεν ήταν ενδιαφέρονται για την αποσαφήνιση του μηχανισμού με τον οποίο τα αυξημένα επίπεδα του

DACT1

οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της β-κατενίνης. Εν απουσία συνδετήρων Wnt, τα κυτταροπλασματικά επίπεδα β-κατενίνης ρυθμίζονται από το συγκρότημα καταστροφή που περιέχει αξίνη, APC, και την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β (GSK-3β), όπου β-κατενίνης φωσφορυλιώνεται από GSK-3β σε πολλαπλά σερίνη και θρεονίνης σε Ν άκρο του. Η φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης στη συνέχεια ουβικουιτινωμένης, οδηγώντας σε ταχεία αποδόμηση του πρωτεασώματος του [4], [24], [25], [26], [27], [28]. Για να καθοριστεί εάν

DACT1

αυξάνει τα επίπεδα της β-κατενίνης επηρεάζοντας σταθερότητα β-κατενίνης, κύτταρα HCT116 (με ή χωρίς

DACT1

αποσιώπηση) επωάστηκαν με 10 μg /ml κυκλοεξιμιδίου (CHX) για την πρόληψη νέα σύνθεση β-κατενίνης. Στη συνέχεια, τα επίπεδα β-κατενίνης μετρήθηκαν με κηλίδωση Western για να αντανακλούν το ρυθμό αποικοδόμησης πρωτεΐνης β-κατενίνης. Αποσιώπηση του

DACT1

έκφραση αύξησε σημαντικά τον ρυθμό αποικοδόμησης β-κατενίνης, με αποτέλεσμα μια εμφανής μείωση των επιπέδων των υπολοίπων β-κατενίνης (Σχήμα 8Α). Αυτή η επίδραση του

DACT1

για τη σταθερότητα της β-κατενίνης επιβεβαιώθηκε από μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού. Βρήκαμε ότι β-κατενίνης αποδομήθηκε ταχύτερα σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν

DACT1

siRNA παρά σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν ελέγχου

DACT1

siRNA (Σχήμα 8Β).

(Α ) δοκιμασίες κηλίδος Western σε κύτταρα HCT116 διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η σταθερότητα β-κατενίνης. (Β) δοκιμασίες ανοσοφθορισμού σε κύτταρα HCT116 διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η σταθερότητα β-κατενίνης. (Γ) Κυτταρολύματα από κύτταρα SW480 επιμολυσμένα με GFP-

DACT1

υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με αντισώματα αντι-αξίνη, αντι-GSK-3β, ή αντι-β-κατενίνης. Ανοσοσύμπλοκα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και υποβλήθηκαν σε αναλύσεις Western blot με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. Western με ένα αντι-GAPDH αντίσωμα έδειξε ίση φόρτωση. (D) υποκυτταρικά συν-εντοπισμός της ενδογενούς

DACT1

και β-κατενίνης,

DACT1

και GSK-3β στα κύτταρα ΗΤ29. (Ε) Κυτταρολύματα από κύτταρα ΗΤ29 υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με ένα αντι-

DACT1

αντίσωμα. Ανοσοσύμπλοκα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και υποβλήθηκαν σε αναλύσεις Western blot με αντι-GSK-3β, ή αντισώματα αντι-β-κατενίνης. Blotting με ένα αντι-GAPDH αντίσωμα έδειξε ίση φόρτωση.

Η

Για να εξακριβωθεί ο μηχανισμός με τον οποίο

DACT1

επιρροές β-κατενίνης σταθερότητα, εξετάσαμε κατά πόσο ή όχι

DACT1

αλληλεπιδρά με τα συστατικά του πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα που ρυθμίζει σταθερότητα β-κατενίνης. ανάλυση συν-ανοσοκαταβύθισης μας αποκάλυψαν συνεντόπισης του

DACT1

και GSK-3β,

DACT1

και αξίνης σε κύτταρα SW480 σταθερά επιμολυσμένα με GFP-tagged

DACT1

κατασκεύασμα (Εικόνα 8C ). Επιπλέον,

DACT1

δεν αλληλεπιδρούν με β-κατενίνης στα κύτταρα SW480 που υπερεκφράζεται

DACT1

(Σχήμα 8C). Στη συνέχεια εξέτασε την συνεντόπισης του

DACT1

με GSK-3β, και

DACT1

με β-κατενίνης στα κύτταρα ΗΤ29 άγριου τύπου (χωρίς APC ή β-κατενίνης μεταλλάξεις) (Σχήμα 8D-Ε) . Αυτά τα συνεπή αποτελέσματα έδειξαν ότι

DACT1

παρεμβαίνει με την GSK-3β-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης με το συγκρότημα καταστροφή, και

DACT1

επηρεάζει σταθερότητα β-κατενίνης με αλληλεπίδραση με β-κατενίνης.

DACT1

επηρεάζει την υποκυτταρική εντοπισμένη β-κατενίνης μέσω αναστολής της GSK-3β δραστηριότητα

β-κατενίνης είναι γνωστό ότι συσσωρεύονται στον πυρήνα [29] και τα επίπεδα της είναι πιθανολογείται να αυξηθεί κατά την ελασματοπόδια μεμβράνη, μεμβράνη ενώσεις προσφύσεως και βολάν μεμβράνη [30], [31] σε απόκριση προς σηματοδότηση Wnt ή το φάρμακο με τη μεσολάβηση της αναστολής της GSK-3β δραστηριότητα. Επιπλέον, με βάση τα ευρήματά μας, έχουμε σκεφτεί ότι

DACT1

αναστέλλει GSK-3β. Ορισμένες παράγοντες που αναστέλλουν την GSK-3β μέσω της φωσφορυλίωσης του Ser9 αναφερθεί [32], [33]. Παρατηρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης της GSK-3β με φωσφορυλιωμένη Ser9 σε κύτταρα HCT116 (με ή χωρίς

DACT1

αποσιώπηση). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου GSK-3β εις Ser9 ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν ελέγχου siRNA (Σχήμα 9Α και Β). Για να επιβεβαιώσετε ότι

DACT1

ρυθμίζεται το μοτίβο εντοπισμού της β-κατενίνης, μέσω αναστολής της GSK-3β, ελέγξαμε την επίδραση της GSK-3β αναστολή σε κύτταρα HCT116 που εκφράζεται είτε το siRNA ελέγχου ή το

DACT1

siRNA. Παρατηρήσαμε μια σαφή και σημαντική βελτίωση σε κύτταρα που εμφανίζεται χρώση β-κατενίνης με μεμβράνη που συνδέεται μετά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 mM LiC1 για 1 h (Σχήμα 9C και D). Δοκιμάσαμε περαιτέρω την έκφραση του ενεργοποιημένου β-κατενίνης σε SW480 κύτταρα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν την αυξημένη συσσώρευση του μη φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης σε κυτταρόπλασμα και ιδιαίτερα στους πυρήνες των SW480 κύτταρα που υπερεκφράζονται

DACT1

(Σχήμα 9Ε και ΣΤ). Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι

DACT1

επηρεάζει την υποκυτταρική εντόπιση της β-κατενίνης, μέσω της αναστολής της GSK-3β δραστηριότητα.

(Α) Μικροφωτογραφίες ελέγχου siRNA και

DACT1

siRNA εκφράζοντα κύτταρα HCT116 ανοσοχρώση με αντι-φωσφο-GSK-3β (Ser9) αντίσωμα (κόκκινο). Αποσιώπηση του

DACT1

στα κύτταρα HCT116 μειώνει τα επίπεδα της φωσφο-GSK-3β (Ser9). (Β) Αντιπρόσωπος Western blots των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν ελέγχου siRNA και

DACT1

siRNA. Αποσιώπηση του

DACT1

στα κύτταρα HCT116 μειώνει τα επίπεδα της φωσφο-GSK-3β (Ser9). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Κύτταρα HCT116 που εκφράζουν ελέγχου siRNA και

DACT1

siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με GSK-3β ανασταλτικών φαρμάκων (40 mM LiCl). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν και αναλύθηκαν με μικροσκοπία για να ανιχνευθεί η έκφραση του β-κατενίνης. θεραπεία LiCl των κυττάρων HCT116 αυξάνει τα επίπεδα της β-κατενίνης στην πλασματική μεμβράνη. (Δ) Εκπρόσωπος Western blots του LiCl επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν είτε τον έλεγχο siRNA ή

DACT1

siRNA. θεραπεία LiCl των κυττάρων HCT116 αυξάνει τα επίπεδα της β-κατενίνης στην πλασματική μεμβράνη. KDEL χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. 1: Κύτταρα HCT116 που εκφράζουν siRNA ελέγχου που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με 40 mM LiCl για 1 ώρα. 2: Κύτταρα HCT116 που εκφράζουν siRNA ελέγχου που δεν είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με LiCl. 3: HCT116 κύτταρα που εκφράζουν

DACT1

siRNA που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 40 mM LiCl επί 1 ώρα? 4: HCT116 κύτταρα που εκφράζουν

DACT1

siRNA που δεν είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με LiCl. (Ε) φωτομικρογραφίες ελέγχου siRNA και

DACT1

siRNA εκφράζοντα κύτταρα HCT116 ανοσοχρώση με αντι-φωσφο-GSK-3β (Ser9) αντίσωμα (κόκκινο). Αποσιώπηση του

DACT1

στα κύτταρα HCT116 μειώνει τα επίπεδα της φωσφο-GSK-3β (Ser9). (F) Αντιπρόσωπος Western blots των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν ελέγχου siRNA και

DACT1

siRNA. Αποσιώπηση του

DACT1

στα κύτταρα HCT116 μειώνει τα επίπεδα της φωσφο-GSK-3β (Ser9). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Η αυξημένη έκφραση του

DACT1

έχει ογκογόνο λειτουργίες σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Οι μελέτες μας έχουν δείξει ότι

DACT1

υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο παχέος αδενοκαρκινώματα. Το αποτέλεσμα αυτό είναι συνεπές με την προηγούμενη παρατήρηση ότι

DACT1

ρυθμίζεται αυξητικά σε επεμβατικές όγκους του μαστού [34].